Summary
מאמר זה מתאר פרוטוקול אימונופנינג עבור גרעיני שורש גביים של עכברים בוגרים. על ידי היצמדות נוגדנים לצלחות תרבית, אנו יכולים לבחור ולהסיר באופן שלילי תאים שאינם עצביים. אנו מראים כי התרביות מועשרות עבור תאי עצב באמצעות פרוטוקול זה, המאפשר מחקר מעמיק של תגובות עצביות למניפולציה.
Abstract
גרעיני שורש דורסלי (DRGs) הם מבנים היקפיים הסמוכים לקרן הגבית של חוט השדרה, המאחסנים את גופי התא של נוירונים חושיים, כמו גם סוגים שונים של תאים אחרים. פרוטוקולי תרבית שפורסמו מתייחסים לעתים קרובות לתרביות DRG מנותקות שלמות כנוירונים, למרות נוכחותם של פיברובלסטים, תאי שוואן, מקרופאגים ולימפוציטים. בעוד תרביות DRG שלמות אלה מספיקות ליישומי הדמיה שבהם ניתן להבחין בתאי עצב בהתבסס על מורפולוגיה או צביעה, הומוגנטים של חלבונים או RNA שנאספו מתרביות אלה אינם בעיקר עצביים במקורם. כאן, אנו מתארים רצף אימונופנינג עבור DRG עכברים בתרבית. מטרת שיטה זו היא להעשיר תרביות DRG עבור תאי עצב על ידי הסרת סוגי תאים אחרים. אימונופנינג מתייחס לשיטה להסרת סוגי תאים על ידי היצמדות נוגדנים לצלחות תרבית תאים. באמצעות הכלים האלה אנו יכולים לבחור באופן שלילי ולהפחית את מספר הפיברובלסטים, תאי מערכת החיסון ותאי השוואן בתרבית. שיטה זו מאפשרת לנו להגדיל את אחוז תאי העצב בתרביות.
Introduction
גרעיני השורש הגבי (DRGs) מאכלסים את גופי התאים של נוירוני החישה אשר מעצבבים רקמות היקפיות. חקר תאי העצב האלה מאפשר לנו להבין את היסודות המכניסטיים של כאב ותנאים חושיים. אולם DRGs אינם מורכבים מתאי עצב בלבד, אלא מכילים גם פיברובלסטים, תאי שוואן, מקרופאגים ותאי חיסון אחרים1. למרות נוכחותם של סוגי תאים שונים אלה, תרביות DRG שלמות מכונות לעתים קרובות בספרות נוירונים 2,3. תרביות אלה עדיין שימושיות לחקירה עצבית על ידי הדמיה או ציטומטריית זרימה, אשר תאפשר זיהוי עצבי על ידי צביעה, גודל התא ו / או מורפולוגיה. עם זאת, עבור בדיקות כגון תגובת שרשרת פולימראז (PCR) או כתם מערבי, שבו תרביות הומוגניות עבור RNA או איסוף חלבונים, נוכחות של סוגי תאים שאינם עצביים עלולה להפריע לתוצאות. לפיכך, יש צורך להגדיל את חלקם של תאים עצביים בתרביות DRG.
אימונופנינג היא טכניקה המשמשת לטיהור מגוון סוגי תאים, כולל נוירונים בקליפת המוח, אסטרוציטים, תאים מבשרי אוליגודנדרוציטים ותאי מיקרוגליה. במילים פשוטות, הוא כרוך בהדבקת נוגדן כנגד סמן פני התא לצלוחית פטרי, שנועד לקשור תאים מסוימים (איור 1), וניתן להשתמש בו כדי לבחור בעד או נגד סוגי תאים בעלי עניין 4,5,6. DRG עוברי חולדה אימונופנינג לבחירה כנגד תאים שאינם עצביים תואר בעבר על ידי Zuchero7. עם זאת, לא הצלחנו למצוא פרוטוקול אימונופנינג ספציפי ל- DRG של עכברים. בפרוטוקול הזה אנו מתבססים על הדיירים הבסיסיים של פרוטוקול Zuchero, אולם במקום זאת התאמנו את רצף האימונופנינג כדי להעשיר תרביות DRG של עכברים בוגרים (איור 2). זהו כלי רב עוצמה לחקר נוירונים חושיים מבוססים בתרבית. יש לו יתרון מכיוון שהוא מאפשר שימוש בעכברים בוגרים ממודלים גנטיים, מחלות ופציעות, כך שניתן יהיה לחקור את תאי העצב החושיים שלהם באופן ספציפי יותר.
פרוטוקול זה מועיל לקוראים המעוניינים להגדיל את שיעור תאי העצב בתרביות DRG של עכברים בוגרים. עם זאת, ניתן גם להשמיט את שלבי האימונופנינג, ופרוטוקול זה יכול לשמש גם עבור תרביות DRG שלמות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו באישור הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת אלברטה (פרוטוקול 0000274).
1. הכנת מגיב
- ליום הראשון, הכינו את הריאגנטים הבאים: מים בדרגת תרבית תאים; פולי-D-ליזין-להכין מלאי על ידי הרכבה מחדש של הבקבוק כולו ב 50 מ"ל של מים כיתה תרבית לריכוז מלאי של 100 מיקרוגרם / מ"ל, לאחסן ב 4 ° C, ולדלל את המלאי 1: 10 במים כיתה תרבית לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם / מ"ל; tris-HCl-להכין ציר על ידי המסת אבקת tris hydrochloride במים כיתה תרבית לריכוז מלאי של 500 mM (3.94 גרם ב 50 מ"ל), pH 9.5, לסנן לעקר (0.22 מיקרומטר), לאחסן ב 4 °C, ולדלל את המלאי 1:10 במים כיתה תרבית לריכוז סופי של 50 mMM; נוגדנים משניים (עז נגד חולדה, -ארנב ועכבר).
- ליום השני, הכינו את הריאגנטים הבאים.
- הכינו תמיסת מלח מאוזנת ללא תרבית תאים Ca 2+, Mg2+ ללא האנק (HBSS; HBSS-/-), ומלח חוצץ D-פוספט בדרגת תרבית תאים (PBS) עם Ca 2+ ו-Mg2+. להכין aliquot מלאי למינין ולאחסן ב -80 °C מיד עם קבלתו; לדלל את המלאי HBSS סטרילי -/- לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם / מ"ל עבור מלאי עובד.
- הכינו מלאי אלבומין בסרום בקר 4% (BSA) על ידי המסת 400 מ"ג BSA ב-7.5 מ"ל של D-PBS (pH 7.4), הביאו את הנפח ל-10 מ"ל, סננו חיטוי (0.22 מיקרומטר), עלו ואחסנו בטמפרטורה של -20°C. הכן 0.2% BSA על ידי דילול 750 μL של 4% BSA ב 14.25 מ"ל של D-PBS.
- הכינו מלאי DNAse של 0.4% על ידי הוספת 1 מ"ל של תמיסת מלח מאוזנת של ארל (EBSS) לכל 12,500 יחידות DNAse, סננו עיקרו (0.22 מיקרומטר), עלו ואחסנו בטמפרטורה של -20°C. הכן מאגר גלילה רציפה (0.02% BSA) על-ידי הוספת 3 מ"ל של 0.2% BSA ו-100 μL של 0.4% DNAse ב-27 מ"ל של D-PBS. הכנת נוגדנים ראשוניים (CD45, PDGRFβ, O4).
הערה: פרוטוקול זה משתמש ב- O4 hybridoma8,9, עם זאת, 10 מיקרוגרם של נוגדן O4 זמין מסחרית יהיה מתאים גם כן. - הכינו את ציר הקולגנאז המשולב על ידי המסת בקבוק של קולגנאז משולב (50 מ"ג) ב-5 מ"ל של HBSS-/-, aliquot, ואחסנו בטמפרטורה של -20°C. הכינו מלאי עבודה לכל שני עכברים על ידי הוספת 500 μL של collagenase משולב מחומם ו-50 μL של 0.4% DNase מחומם ל-4.5 מ"ל של HBSS-/-.
- הכן ovomucoid נמוך על ידי הוספת 3 גרם של BSA ל 150 מ"ל של D-PBS, ולאחר מכן להוסיף 3 גרם של מעכב טריפסין ולערבב כדי להמיס. כוונן את ה- pH ל- 7.4 והבא את עוצמת הקול עד 200 מ"ל עם D-PBS. לסנן לעקר, להכין 1 מ"ל aliquots, ולאחסן ב -20 ° C. ביום הדיסקציה, שלב 1 מ"ל של ovomucoid נמוך ב 9 מ"ל של D-PBS לפתרון העבודה.
- הכינו 15% BSA על ידי המסת 7.5 גרם BSA ב-50 מ"ל HBSS-/- (הניחו על שייקר להתמוססות מלאה), סננו סטריליזציה ואחסנו בטמפרטורה של 4°C.
- להכין 50 מ"ל של מדיה נוירון על ידי הוספת 23.2 מ"ל של DMEM, 23.2 מ"ל של מדיום neurobasal, 500 μL של glutamax, 500 μL של pyruvate נתרן, 500 μL של פניצילין/סטרפטומיצין (aliquot מיד עם ההגעה לאחסן ב -20 ° C), 500 μL של אינסולין (5 מיקרוגרם / מ"ל סופי), 500 μL של SATO, 50 μL של N-אצטיל-L-ציסטאין (NAC; 5 מיקרוגרם / מ"ל סופי), ו-1,000 μL של B27+ (יש לאחסן מיד בטמפרטורה של -20°C עם קבלתו).
- הכינו את מלאי האינסולין על ידי המסה במים בדרגת תרבית לריכוז של 0.5 מ"ג/מ"ל (50 מ"ג ב-100 מ"ל), התאימו את ה-pH ל-7.4, סננו סטריליזציה (0.22 מיקרומטר), הכינו אליציטוטים של 500 מיקרוליטר ואחסנו בטמפרטורה של -20°C.
- הכן את מלאי SATO על ידי שילוב של 20 μL של פרוגסטרון (2.5 מ"ג ב 100 μL של אתנול), 800 μL של נתרן סלניט (4 מ"ג ב 10 מ"ל של מדיה neurobasal + 10 μL של 1 N NaOH), 800 מ"ג של BSA, 800 מ"ג של transferrin, 128 מ"ג של putrescine dihydrochloride, ו 80 מ"ל של neurobasal. מסננים לעקר (0.22 מיקרומטר), להכין 500 μL aliquots, ולאחסן ב -20 ° C. חיוני להכין פתרונות פרוגסטרון ונתרן סלניט טריים.
- הכן 50 μL של ציר N-אצטיל-L-ציסטאין (NAC) על ידי המסה בתווך נוירובזאלי לריכוז מלאי של 5 מ"ג / מ"ל (50 מ"ג ב -10 מ"ל), לעקר (0.22 מיקרומטר), aliquot, ולאחסן ב -20 ° C.
- עבור יום 4 ו -5, הכינו את הריאגנטים הבאים.
- הכן חיץ פוספט 0.2 M (PB) על ידי המסת 21.8 גרם של נתרן פוספט dibasic (Na 2 HPO 4) ו8.34 גרם של נתרן פוספט monobasic dihydrate (NaH2PO4) ב 1,000 מ"ל של מים. יש לכוונן את רמת החומציות ל-7.4 ולאחסן בטמפרטורת החדר.
- הכינו 8% paraformaldehyde (PFA) כדלקמן: במכסה אדים, חם 50 מ"ל של מים ל 55 ° C, לכבות את החום, ולהוסיף 8 גרם של PRILLS PFA, תוך ערבוב מתמיד. מוסיפים 1 N NaOH טיפה עד שהתמיסה מתחילה להתנקות, ואז מוסיפים 40 מ"ל של 0.2 M PB, וממשיכים לערבב עד נקי. קררו את התמיסה לטמפרטורת החדר, התאימו את ה-pH ל-7.4 והביאו את עוצמת הקול ל-100 מ"ל עם PB של 0.2 M. יש לסנן ולאחסן בטמפרטורה של 4°C למשך עד שבועיים.
- הכן D-PBS + Triton X-100 (PBSTX) על ידי הוספת 0.2% Triton X-100 בדירוג תרבית D-PBS (1 מ"ל של Triton + 500 מ"ל של D-PBS). יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C. הכינו תמיסת חסימה, שהיא 1% סרום חמור רגיל (NDS) ב- PBSTX. מראש, 1 מ"ל של NDS + 9 מ"ל של PBSTX ניתן להכין ולאחסן ב -20 °C ב 10 מ"ל aliquots.
- הכן תמיסת נוגדנים שהיא 0.2% NDS/0.2% BSA ב- PBS TX: 200 μL של NDS + 200 מ"ג BSA + 9.6 מ"ל של PBSTX; ניתן להכין מראש ולאחסן ב -20 °C ב 10 מ"ל aliquots.
2. הגדרת ציוד
- הגדר את הציוד הבא: ארון בטיחות ביולוגית בתרבית תאים סטרילית, סט מיקרופיפטה, פיפטות סרולוגיות ואקדח פיפטה, צלחות פטרי 10 ס"מ, צלחות תרבית תאים רצויות לציפוי (כאן, לוחות זכוכית שחורים 24 באר שימשו להדמיה), צינורות חרוטי 15 מ"ל ו -50 מ"ל, כלי דיסקציה (כלומר: מספריים קפיציים עדינים ללמינקטומיה וחיתוך עצבים, מלקחיים עדינים, וסכין גילוח), אמבט מים המוגדר ל 37 ° C, מסננת תאים 70 מיקרומטר, צנטריפוגה (10 דקות ב 300 x גרם) עם מתאמים עבור צינורות חרוטי 15 מ"ל, כחול טריפאן והמוציטומטר, מכסה אדים ופלטת ערבוב מגנטית.
3. שיטה ניסיונית
- יום 1: הכנת מנות
- בארון בטיחות ביולוגית, צפו את משטח התרבית הרצוי בכמות מספקת של פולי-D-ליזין כדי לכסות את תחתית הבאר. יש לאחסן למשך הלילה ב-4°C. כאן, לוחות זכוכית תחתונים 24 באר שימשו להדמיה, ולכן 300 μL של poly-D-ליזין שימש.
- בארון בטיחות ביולוגית, הכינו את הכלים הפנורמיים: עבור צלחת CD45, להוסיף 10 מ"ל של תמיסת tris-HCl עובד ו 30 μL של IgG נגד חולדות עיזים לצלחת פטרי 10 ס"מ; עבור צלחת PDGFRβ, להוסיף 10 מ"ל של פתרון tris-HCl עובד ו 30 μL של עיזים נגד ארנב IgG צלחת פטרי 10 ס"מ; עבור צלחת O4 hybridoma, יש להוסיף 10 מ"ל של תמיסת tris-HCl עובדת ו-30 μL של IgG נגד עכבר עיזים לצלחת פטרי בקוטר 10 ס"מ. ודא שהתמיסה מכסה את כל שטח התבשיל והשאר ב -4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- יום 2: דיסקציה, טריטורציה ואימונופנינג
- שאפו את הפולי-D-ליזין, שטפו את הצלחות שלוש פעמים במי תרבית רקמות, הטו את המכסה פתוח ואפשרו למשטח להתייבש לחלוטין בארון בטיחות ביולוגית. החל מספיק למינין על הצלחות כדי לצפות את החלק התחתון של כל באר, ומניחים באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס. עבור צלחות 24 באר, 200 μL מספיק.
- מסיימים להכין את הכלים הגלילה. לשטוף כל צלחת עם D-PBS ולדגור עם 10 מיקרוגרם של נוגדן ראשוני. אפשר לשבת בטמפרטורת החדר לפחות שעתיים.
- עבור צלחת CD45, להוסיף 5 מ"ל של 0.2% BSA ו 20 μL של CD45 ראשוני; עבור צלחת PDGFRβ, להוסיף 5 מ"ל של 0.2% BSA ו 15.4 μL של PDGFRβ; עבור צלחת O4, הוסף 3 מ"ל של 0.2% BSA, 2 מ"ל של O4 hybridoma, ועוד 100 μL של 4% BSA (כדי להבטיח את ריכוז BSA הסופי נשאר על 0.2%).
- הרדימו עכבר אחד עד ארבעה באמצעות 0.1 מ"ל/ק"ג נתרן פנטוברביטול (לכל צלחת אימונופנינג בקוטר 10 ס"מ). השתמשנו בעכברי C57BL/6 בגיל 8-10 שבועות. שני המינים שימשו ותורבתו בנפרד זה מזה. לערבב את החיה עם 30 מ"ל של קר 0.9% מלוחים.
- הצמד את הכפות הקדמיות והאחוריות לשלב קלקר והשתמש בסכין גילוח נקי כדי לחשוף את עמוד השדרה מאחור. בצע כריתת למינקטומיה על ידי ביצוע חתכים בעומק של כמחצית הדרך משני צדי עמוד השדרה הגבי, הסרת החצי הגבי של העמודה, כדי לחשוף את חוט השדרה. או לחתוך בעדינות את העצבים ולהסיר את חוט השדרה, או בעדינות לדחוף את החוט הצידה, שמירה על שלמות העצבים.
- השתמש בשורשי עצב עמוד השדרה (קטועים או מחוברים לחוט השדרה) כדי למצוא ולהסיר את כל ה- DRGs משני צדי עמוד השדרה. חתוך את פסולת העצבים מכל DRG כאשר הוא מוסר (יותר פסולת עצבית בתרבית עלולה להוביל להישרדות נמוכה בתרבית). אסוף את DRGs ב 15 מ"ל של HBSS-/- בצינור חרוטי 15 מ"ל על קרח.
הערה: שים לב שהרקמה מנותחת באוויר הפתוח, אך ברגע שמוסיפים את ה- DRG לצינור יש להתייחס אליהם כסטריליים ולטפל בהם רק בארון בטיחות ביולוגית. - הניחו מלאי קפוא של stemxyme 1 ו-0.4% DNAse באמבט מים, כ-30 דקות לפני סיום הנתיחות (בערך בעת הפעלת העכבר האחרון). אפשר להם לשקוע לתחתית הצינור החרוטי, ולאחר מכן להמשיך את הפרוטוקול בארון בטיחות ביולוגית.
- שאפו את רוב HBSS-/- מה- DRGs. השתמשו בפיפטה במקום בשאיבה כדי לקבל <1 מ"ל נוזל, והשאירו ~ 100 μL נוזל כדי לא להסתכן באיבוד רקמות.
- יש לשטוף שלוש פעמים עם 1 מ"ל HBSS-/-. הוסף 5 מ"ל של פתרון stemxyme עובד לרקמה. מכסים את המכסה בסרט שקוף וצפים את הצינור על צדו באמבט מים המוגדר ל -37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת.
- לאחר הדגירה באנזים, הוסף 1 מ"ל של תמיסת מעכבי אובו נמוכה לצינור. שלשו את התאים בעדינות עם פיפטה p1000 10-15 פעמים. הניחו לגושי הרקמה לשקוע.
- העבר את 2-3 מ"ל העליון של תמיסה (המכילה תאים מנותקים) לתמיסת אובומוקואיד נמוכה טרייה. חזור על הפעולה עד שהרקמה מנותקת לחלוטין ולא נשארים גושים נראים לעין.
- צנטריפוגה למשך 10 דקות ב 300 x גרם בטמפרטורת החדר. סיפון את supernatant שוב, באמצעות פיפטה במקום יניקה עבור 1 מ"ל האחרון, משאיר ~ 100 μL, ו resuspend את גלולת התא ב 1 מ"ל של חיץ גלילה.
- פיפטה עדינה לערבוב. הרטיבו מראש מסננת תאים של 70 מיקרומטר עם 1 מ"ל של חיץ גלילה מעל צינור חרוטי של 50 מ"ל. סנן את תמיסת התא דרך מסננת התא.
- לשטוף את הצינור עם 1 מ"ל של חיץ panning, ולאחר מכן לעבור דרך מסננת (3 מ"ל של תסנין). הניחו את תרחיף התא בעדינות (1 מ"ל בכל פעם) על גבי 2 מ"ל של כרית BSA 15% כדי להסיר פסולת מיאלין. כרית של 2 מ"ל יעילה לשני עכברים, ו-3 מ"ל יעילה לארבעה עכברים.
- לשכבות, הניחו את 2 מ"ל BSA בצינור, סגרו וציפו בעדינות את דפנות הצינור ב-BSA. לאחר מכן, שכב בעדינות את תרחיף התא של החלק העליון, על ידי pipeting על הצד של הצינור.
- צנטריפוגה בטמפרטורת החדר ב 300 x גרם במשך 10 דקות (האצה והאטה). השתמש פיפטה P1000 כדי להסיר את הנוזל הצלול על גבי, את שלב המיאלין שביניהם, ואת BSA, 1 מ"ל בכל פעם (שינוי קצוות בין כל מ"ל). השאר ~ 100 μL של BSA כדי לא להפריע את הכדור.
- הוסף 5 מ"ל של חיץ גלילה ודגר את הצינור ב 37 ° C, 10% CO2 אינקובטור במשך 30-45 דקות. זה מאפשר שליפת אנטיגן. הקפד לשחרר את המכסה כדי לאפשר החלפת גז.
- שטפו את צלחת CD45 שלוש פעמים עם D-PBS. יוצקים את השטיפה הסופית. דקרו את תרחיף התא לתוך צלחת CD45.
- לדגור על התאים על צלחת CD45 במשך סך של 20 דקות בטמפרטורת החדר, מערבלים בעדינות בנקודה 10 דקות כדי לאפשר לתאים גישה שווה לנוגדן.
- שטפו את תבנית PDGFRβ שלוש פעמים עם D-PBS ושפכו את השטיפה הסופית. העבר את התאים הלא מאוגדים מצלחת CD45 לצלחת PDGFRβ.
- נערו בעדינות את צלחת CD45 והעמידו אותה בזווית. פיפטה עדינה 1 מ"ל של התא השעיה מעל צלחת לאסוף תאים לא קשורים. דקקו אותו לתוך צלחת PDGFRβ ופיפטה כדי להעביר את תרחיף התא הנותר לצלחת PDGFRβ.
- יש לדגור על צלחת PDGFRβ למשך 20 דקות בסך הכל בטמפרטורת החדר, תוך ערבול עדין בנקודה של 10 דקות כדי לאפשר לתאים גישה שווה לנוגדן.
- שטפו את צלחת O4 שלוש פעמים עם D-PBS ושפכו את השטיפה הסופית. העבר את התאים הלא מאוגדים מצלחת PDGFRβ לצלחת O4 באותה שיטה כמו בשלב 3.2.19. יש לדגור על צלחת O4 למשך 20 דקות בסך הכל בטמפרטורת החדר, תוך ערבול עדין בנקודת 10 הדקות כדי לאפשר לתאים גישה שווה לנוגדן.
- העבר את מתלה התא לצינור חרוטי 15 מ"ל וצנטריפוגה למשך 10 דקות ב 300 x גרם. השהה מחדש את התאים בנפח הרצוי, ודלל 1:1 עם כחול טריפאן לקיום התא. לספור תאים בינוניים עד גדולים עם המוציטומטר (זה יאפשר את הייצוג הטוב ביותר של מספר נוירונים בתרבית).
- מוציאים את הלמינין ולוחצים את התאים בצפיפות הרצויה. אין לאפשר לצלחת להתייבש בין הסרת למינין וציפוי, ומוסיפים את התאים מיד.
- תרממו את התאים המכומתים להעשרה עצבית (איור 3) עם 500 תאי עצב ב-25 מיקרוליטר של תווך תרבית (המתואר ב-1.2.7) לכל באר בצלחות של 24 בארות ודגרו בטמפרטורה של 37°C במשך 30 דקות. להציף את הבארות לנפח סופי של 500 μL.
- יום 4: קיבוע אימונוציטוכימיה (ICC), חסימה וראשוניות
- לאחר 48 שעות של גידול, הוסף 500 μL / באר (או נפח שווה ערך למדיה בבאר) של 8% PFA במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר כדי לתקן את התאים. אם רוצים ניתוח מדיה, אפשר לתקן עם 4% PFA ישירות. עם זאת, לא בדקנו זאת.
- לשטוף את התאים עם D-PBS שלוש פעמים. שימו לב, שמרנו את התאים האלה בתרבית ללא שינוי מדיה למשך 72 שעות לכל היותר, אך אנו משערים שהם יוכלו לשרוד זמן רב יותר, במיוחד אם המדיה תשרוד למחצה.
- הסר את השטיפה הסופית והוסף מספיק פתרון חסימה לכל באר כדי לכסות את התאים לחלוטין. חוסמים למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את הפתרון החוסם והוסף נוגדן ראשוני בתמיסת נוגדנים: β3-tubulin בדילול של 1:1,000. אוטמים את הצלחת בסרט שקוף ודגרים למשך הלילה ב-4°C.
הערה: אפשר לשקול צביעה עם PDGFRβ עבור היעדר פיברובלסטים, CD45 עבור היעדר תאים חיסוניים, P0 או PMP22 עבור היעדר מיאלין, או fabp7 עבור גליה בלוויין.
- יום 5: בית הדין המשני
- לשטוף את התאים עם D-PBS שלוש פעמים. מוציאים את השטיפה הסופית ומוסיפים נוגדנים משניים בתמיסת נוגדנים: אנטי ארנב 488 בדילול 1:500 ו- DAPI בדילול 1:2,000. יש לדגור במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור.
- יש לשטוף עם D-PBS שלוש פעמים. הוסף מספיק D-PBS כדי לכסות את תחתית הבאר, ותמונה. ניתן לאטום את הצלחת בסרט שקוף, להגן עליה מפני אור ולאחסן אותה בטמפרטורה של 4°C למשך עד שבועיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
התאים הקבועים המוכתמים ב- DAPI וב- β3-tubulin צולמו לאחר מכן באמצעות מערכת סינון קונפוקלית בעלת תוכן גבוה. התמונות נותחו באמצעות תוכנה מסחרית מתאימה כדי לקבוע את אחוז התאים החיוביים ל-DAPI שתויגו יחד עם β3-tubulin (איור 3). בתרביות DRG שלמות נמצאו 42.36% ± 6.4% צביעת β3-טובולין, ובתרביות DRG אימונופוניות נמצאו 71.44% ±7.43% צביעת β3-טובולין. זה מגלה עלייה משמעותית בהעשרה עצבית עם immunopanning (p < 0.0001, unpaired t test).
איור 1: יסודות האימונופנינג. נוגדן משני מודבק לצלחת תרבית בן לילה, ולאחר מכן מכניסים נוגדנים ראשוניים. זה מאפשר לתאים המעניינים להיות מחוברים לצלחת על ידי אנטיגן פני השטח. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: אימונופנציה של נוירון DRG של עכבר בוגר על-ידי ברירה שלילית. DRGs נקצרים, מנותקים ומתוחים לתמיסה של תא יחיד. פסולת המיאלין מוסרת על ידי צנטריפוגה דרך כרית BSA. לאחר מכן מתרחיף התאים מועבר דרך שלוש צלחות אימונופנינג (CD45, PDGFRβ ו-O4) כדי להשיג תרבית מועשרת לנוירונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: העשרה עצבית של תרבית DRG על-ידי אימונופנינג. תרביות קבועות הוכתמו עם β3-tubulin עבור נוירונים, ו- DAPI עבור כל הגרעינים. (A) תמונה מייצגת של תרבות שלמה (לא חיסונית). (B) דימוי מייצג של תרבית אימונופנמית. (C) כימות של תאים חיוביים ל-β3-טובולין כאחוז מסך התאים החיוביים ל-DAPI. עמודות מציינות ממוצע ± ממוצע שגיאה סטנדרטי (SEM). = p < 0.0001, מבחן t לא מזווג. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול אימונופנינג זה מגדיל את שיעור התאים העצביים בתרביות ראשוניות של DRG. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, דיסקציות צריך להיעשות במועד, DRGs צריך להיות גזוז של עצבים עודפים. שלב הדיסוציאציה צריך להיות מנוטר בקפידה, ולא יעלה על 1 שעות, כדי למנוע את התאים מתח מיותר. לגבי האימונופנינג באופן ספציפי, כל צלחת צריכה להיות מעורבלת בעדינות בנקודת אמצע הדרך כדי לאפשר לתאים גישה לנוגדנים המצופים. יש לראות את הלוחות גם תחת מיקרוסקופ תרבית לאחר שתרחיף התא העצבי נאסף כדי להבטיח שתאים שאינם עצביים נקשרו.
מגבלה בשימוש בעכברים בוגרים היא האופי המבוסס של DRGs. חוסר יכולת להסיר את כל סוגי התאים הלא-עצביים משאיר בערך 30% מהתרבית כלא-עצבית (איור 3). בעוד שאנו יכולים לנתק ולהפחית את אוכלוסיית תאי החיסון, הפיברובלסטים ותאי שוואן מהתרביות, גליית לוויין עשויה להיות קשה מאוד לניתוק מתאי עצב. אנו גם משערים שלתאי עצב אלה יכולה להיות הישרדות גרועה ללא התמיכה המטבולית המסופקת על ידי גליה לווינית10. בעוד שהניסיון שלנו להכתים תאים אלה באמצעות GFAP נכשל בגלל ספציפיות נוגדנים ירודה, כיוון עתידי עשוי להיות להכתים תאים אלה באמצעות fabp7. ניסינו להסיר תאים לא עצביים חיוביים ל- CD9 כגון גליית לוויין בעת פתרון בעיות בפרוטוקול זה. עם זאת, בצלחת CD9, נמצא כי נוירונים רבים היו מחוברים לצלחת. אנו משערים שלתאי עצב של עכברים עשוי להיות ביטוי CD9 כלשהו. למעשה, ספרות שלפוחית חוץ-תאית מתאים דמויי נוירונים של עכבר משתמשת ב-CD9 כסמן11. אם ניתן למצוא נוגדן גלילה מתאים יותר שיפחית את שיעור גליית הגלימה הלוויינית, ניתן לשקול תוספת עם גורמי גדילה כגון NGF, BDNF או NT3 כדי לנטרל את אובדן התאים התומכים הללו.
פרוטוקול אימונופנינג זה יכול לשפר את הדיוק של קריאות עצביות מדגימות תרבית DRG הומוגניות על ידי הגדלת חלקם של תאי עצב בתרבית. הוא גם מספק דרך לתרבית נוירוני DRG של עכברים בוגרים, ומאפשר חקירה מעמיקה של פנוטיפים עצביים במודלים גנטיים, מחלות ועכברים פצועים.
Immunopanning הוא גם כלי להתאמה אישית מאוד. לדוגמה, סמן פני התא isolectin-B4 עשוי לשמש כדי לבחור עבור nociceptors עכבר שאינם פפטידרגיים במיוחד. אימונופנינג יכול לשמש גם להעשרת תרביות ראשוניות אחרות, כולל נוירונים בקליפת המוח, מיקרוגליה, אסטרוציטים ותאים מקדימים של אוליגודנדרוציטים. זהו כלי רב עוצמה שיכול להרחיב את היישומים של תרביות תאים ראשוניות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענק פרויקט מהמכונים הקנדיים לחקר הבריאות (FRN-162434) ומענק גילוי מהאגודה לטרשת נפוצה של קנדה (EGID-3761). המחברים רוצים להודות לד"ר סאן ולמכון קרוס סרטן על ההכשרה והשימוש במערכת ImageXpress.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 um Syringe filters | Fisher | 723-2520 | |
| 100 mm petri dishes | ThermoFisher | FB0875712 | |
| 24 well black glass-bottom plates | Cellvis | P24-1.5H-N | |
| 70 um cell strainer | Cedarlane | 15-1070-1(BI) | |
| B27+ supplement | Gibco | A3582801 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A7906 | for 15% BSA cushion, and ICC (heat shock fraction ≥98%) |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A4161 | for 4% BSA for immunopanning, and SATO for media (essentially globulin free, suitable for cell culture, ≥99%) |
| CD45 antibody | BD Pharmigen | 550539 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| DMEM | Gibco | 11960069 | |
| DNAse | Worthington | LS002007 | for stemxyme solution and panning buffer |
| D-PBS | Sigma Aldrich | D8662 | |
| EBSS | Sigma Aldrich | E6267 | for DNAse solution |
| Filter paper P8 grade | ThermoFisher | 09-795K | for 8% PFA |
| Glutamax | ThermoFisher | 35050061 | |
| goat-anti-mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 115-005-020 | for O4 dish |
| goat-anti-rabbit 488 | Invitrogen | A11008 | |
| goat-anti-rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | 115-005-003 | for PDGFRB dish |
| goat-anti-rat IgG | Jackson Immunoresearch | 115-005-044 | for CD45 dish |
| HBSS -/- | Sigma Aldrich | 14175145 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I2643 | |
| laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma Aldrich | A8199 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103049 | |
| Normal Donkey Serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| O4 antibody | n/a | n/a | Hybridoma |
| Ovomucoid trypsin inhibitor | Cedarlane | LS003086 | for low ovo |
| paraformaldehyde prills | Sigma Aldrich | 441244 | for 8% PFA |
| PDGFRB antibody | Abcam | AB32570 | |
| penicillin/ streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich | P6407 | |
| Progesterone | Sigma Aldrich | P8783 | for SATO |
| Putrescine dihydrochrloride | Sigma Aldrich | P5780 | for SATO |
| Sodium phosphate dibasic | Fisher | S374-1 | for 0.2 M PB |
| Sodium Phosphate monobasic dihydrate | Sigma Aldrich | 04269 | for 0.2 M PB |
| Sodium Pyruvate | ThermoFisher | 11360070 | |
| Sodium Selenite | Sigma Aldrich | S5261 | for SATO |
| Stemxyme I | Cedarlane | LS004107 | for tissue dissociation; combination collagenase |
| Transferrin | Sigma Aldrich | T1147 | for SATO |
| Tris-HCl | Millipore Sigma | T5941 | |
| trypan blue | Gibco | 15250-061 | |
| β3-Tubulin | Sigma-Aldrich | T2200 |
References
- Haberberger, R. V., Barry, C., Dominguez, N., Matusica, D.
- Perner, C., Sokol, C. L. Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release. STAR Protocols. 2 (1), 100333 (2021).
- Lin, Y. T., Chen, J. C. Dorsal root ganglia isolation and primary culture to study neurotransmitter release. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (140), e57569 (2018).
- Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).
- Nolle, A., et al. Enrichment of Glial Cells From Human Post-mortem Tissue for Transcriptome and Proteome Analysis Using Immunopanning. Frontiers in Cellular Neuroscience. 15, 772011 (2021).
- Barres, B. A. Designing and troubleshooting immunopanning protocols for purifying neural cells. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (12), 1342-1347 (2014).
- Zuchero, J. B. Purification of dorsal root ganglion neurons from rat by immunopanning. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (8), 826-838 (2014).
- Sommer, I., Schachner, M. Monoclonal antibodies (O1 to O4) to oligodendrocyte cell surfaces: an immunocytological study in the central nervous system. Developmental Biology. 83 (2), 311-327 (1981).
- Sommer, I., Schachner, M. Cell that are O4 antigen-positive and O1 antigen-negative differentiate into O1 antigen-positive oligodendrocytes. Neuroscience Letters. 29 (2), 183-188 (1982).
- Hanani, M. Satellite glial cells in sensory ganglia: from form to function. Brain Research. Brain Research Reviews. 48 (3), 457-476 (2005).
- Viveiros, A., et al. In-cell labeling coupled to direct analysis of extracellular vesicles in the conditioned medium to study extracellular vesicles secretion with minimum sample processing and particle loss. Cells. 11 (3), 351 (2022).
