Summary
यह पेपर वयस्क माउस पृष्ठीय रूट गैन्ग्लिया के लिए एक इम्यूनोपैनिंग प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। कल्चर प्लेटों के एंटीबॉडी का पालन करके, हम गैर-न्यूरोनल कोशिकाओं को नकारात्मक रूप से चुन और हटा सकते हैं। हम दिखाते हैं कि इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके न्यूरॉन्स के लिए संस्कृतियों को समृद्ध किया जाता है, जिससे हेरफेर के लिए न्यूरोनल प्रतिक्रियाओं के गहन अध्ययन की अनुमति मिलती है।
Abstract
पृष्ठीय रूट गैन्ग्लिया (डीआरजी) रीढ़ की हड्डी के पृष्ठीय सींग से सटे परिधीय संरचनाएं हैं, जो संवेदी न्यूरॉन्स के साथ-साथ विभिन्न अन्य सेल प्रकारों के कोशिका निकायों को घर देती हैं। प्रकाशित संस्कृति प्रोटोकॉल अक्सर फाइब्रोब्लास्ट, श्वान कोशिकाओं, मैक्रोफेज और लिम्फोसाइटों की उपस्थिति के बावजूद, पूरे अलग डीआरजी संस्कृतियों को न्यूरोनल होने के रूप में संदर्भित करते हैं। जबकि ये पूरी डीआरजी संस्कृतियां इमेजिंग अनुप्रयोगों के लिए पर्याप्त हैं जहां न्यूरॉन्स को आकृति विज्ञान या धुंधला होने के आधार पर समझा जा सकता है, इन संस्कृतियों से एकत्र किए गए प्रोटीन या आरएनए होमोजेनेट्स मूल रूप से न्यूरोनल नहीं हैं। यहां, हम सुसंस्कृत माउस डीआरजी के लिए एक इम्यूनोपैनिंग अनुक्रम का वर्णन करते हैं। इस विधि का लक्ष्य अन्य सेल प्रकारों को हटाकर न्यूरॉन्स के लिए डीआरजी संस्कृतियों को समृद्ध करना है। इम्यूनोपैनिंग सेल कल्चर व्यंजनों के एंटीबॉडी का पालन करके सेल प्रकारों को हटाने की एक विधि को संदर्भित करता है। इन व्यंजनों का उपयोग करके, हम संस्कृति में फाइब्रोब्लास्ट, प्रतिरक्षा कोशिकाओं और श्वान कोशिकाओं की संख्या के खिलाफ नकारात्मक रूप से चयन कर सकते हैं और कम कर सकते हैं। यह विधि हमें संस्कृतियों में न्यूरॉन्स के प्रतिशत को बढ़ाने की अनुमति देती है।
Introduction
पृष्ठीय रूट गैन्ग्लिया (डीआरजी) संवेदी न्यूरॉन्स के कोशिका निकायों का घर होता है जो परिधीय ऊतकों को आंतरिक करते हैं। इन न्यूरॉन्स का अध्ययन करने से हमें दर्द और संवेदी स्थितियों के यांत्रिक आधार को समझने की अनुमति मिलती है। हालांकि, डीआरजी में अकेले न्यूरॉन्स शामिल नहीं होते हैं, लेकिन इसमें फाइब्रोब्लास्ट, श्वान कोशिकाएं, मैक्रोफेज और अन्यप्रतिरक्षा कोशिकाएं भी होती हैं। इन विभिन्न सेल प्रकारों की उपस्थिति के बावजूद, पूरे डीआरजी संस्कृतियों को अक्सर साहित्य में न्यूरोनल 2,3 के रूप में संदर्भित किया जाता है। ये संस्कृतियां अभी भी इमेजिंग या फ्लो साइटोमेट्री द्वारा न्यूरोनल जांच के लिए उपयोगी हैं, जो धुंधला, सेल आकार और / या आकृति विज्ञान द्वारा न्यूरोनल पहचान की अनुमति देगा। हालांकि, पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) या वेस्टर्न ब्लॉटिंग जैसे परखों के लिए, जहां संस्कृतियों को आरएनए या प्रोटीन संग्रह के लिए समरूप किया जाता है, गैर-न्यूरोनल सेल प्रकारों की उपस्थिति परिणामों में हस्तक्षेप कर सकती है। इसलिए, डीआरजी संस्कृतियों में न्यूरोनल कोशिकाओं के अनुपात को बढ़ाने की आवश्यकता है।
इम्यूनोपैनिंग एक तकनीक है जिसका उपयोग कॉर्टिकल न्यूरॉन्स, एस्ट्रोसाइट्स, ऑलिगोडेंड्रोसाइट अग्रदूत कोशिकाओं और माइक्रोग्लिया सहित विभिन्न प्रकार के सेल प्रकारों को शुद्ध करने के लिए किया जाता है। सरल शब्दों में, इसमें एक पेट्री डिश के लिए एक सेल सतह मार्कर के खिलाफ एक एंटीबॉडी का पालन करना शामिल है, जिसका उद्देश्य कुछ कोशिकाओं को बांधना है (चित्रा 1), और इसका उपयोग सेल प्रकार के हित 4,5,6 के लिए या उसके खिलाफ चयन करने के लिए किया जा सकता है। गैर-न्यूरोनल कोशिकाओं के खिलाफ चयन करने के लिए इम्यूनोपैनिंग चूहे भ्रूण डीआरजी को पहले ज़ुचेरो7 द्वारा वर्णित किया गया है। हालांकि, हम माउस डीआरजी के लिए विशिष्ट इम्यूनोपैनिंग प्रोटोकॉल खोजने में असमर्थ रहे हैं। इस प्रोटोकॉल में, हम ज़ुचेरो प्रोटोकॉल के मूल किरायेदारों पर निर्माण करते हैं, लेकिन इसके बजाय वयस्क माउस डीआरजी संस्कृतियों को समृद्ध करने के लिए इम्यूनोपैनिंग अनुक्रम को अनुकूलित करते हैं (चित्रा 2)। यह संस्कृति में स्थापित संवेदी न्यूरॉन्स का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। यह फायदेमंद है क्योंकि यह आनुवंशिक, बीमारी और चोट मॉडल से वयस्क चूहों के उपयोग की अनुमति देता है, ताकि उनके संवेदी न्यूरॉन्स का अधिक विशिष्टता के साथ अध्ययन किया जा सके।
यह प्रोटोकॉल वयस्क माउस डीआरजी संस्कृतियों में न्यूरॉन्स के अनुपात को बढ़ाने के इच्छुक पाठकों के लिए फायदेमंद है। हालांकि, इम्यूनोपैनिंग चरणों को भी छोड़ा जा सकता है, और इस प्रोटोकॉल का उपयोग पूरे डीआरजी संस्कृतियों के लिए भी किया जा सकता है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
सभी पशु प्रयोगों को अल्बर्टा स्वास्थ्य विज्ञान पशु देखभाल और उपयोग समिति (प्रोटोकॉल 0000274) विश्वविद्यालय से अनुमोदन के साथ किया गया था।
1. अभिकर्मक तैयारी
- दिन 1 के लिए, निम्नलिखित अभिकर्मकों को तैयार करें: सेल कल्चर ग्रेड पानी; पॉली-डी-लाइसिन- 100 μg / mL की स्टॉक एकाग्रता के लिए 50 मिलीलीटर कल्चर ग्रेड पानी में पूरी बोतल को पुनर्गठित करके एक स्टॉक तैयार करें, 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, और 10 μg / mL की अंतिम एकाग्रता के लिए कल्चर ग्रेड पानी में स्टॉक 1: 10 को पतला करें; ट्रिस-एचसीएल-कल्चर ग्रेड पानी में पाउडर ट्रिस हाइड्रोक्लोराइड को 500 एमएम (50 एमएल में 3.94 ग्राम), पीएच 9.5 की स्टॉक एकाग्रता में घोलकर, फ़िल्टर स्टरलाइज़ (0.22 μm), 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करके, और 50 mM की अंतिम एकाग्रता के लिए कल्चर ग्रेड पानी में स्टॉक 1:10 को पतला करके एक स्टॉक तैयार करें; द्वितीयक एंटीबॉडी (बकरी विरोधी चूहा, -खरगोश, और -माउस)।
- दिन 2 के लिए, निम्नलिखित अभिकर्मक तैयार करें।
- सेल कल्चर ग्रेड सीए 2 +, एमजी2 + मुक्त हैंक के संतुलित नमक समाधान (एचबीएसएस; एचबीएसएस-/-), और सेल कल्चर ग्रेड डी-फॉस्फेट बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) सीए 2 + और एमजी2 + के साथ। एक लैमिनिन स्टॉक एलिकोट तैयार करें और प्राप्त करने के तुरंत बाद -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें; बाँझ HBSS में स्टॉक को पतला करें - / - काम करने वाले स्टॉक के लिए 10 μg / mL की अंतिम एकाग्रता तक।
- डी-पीबीएस (पीएच 7.4) के 7.5 एमएल में 400 मिलीग्राम बीएसए को घोलकर 4% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) स्टॉक तैयार करें, मात्रा को 10 एमएल तक लाएं, फ़िल्टर स्टरलाइज़ (0.22 μm), एलिकोट और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। डी-पीबीएस के 14.25 एमएल में 4% बीएसए के 750 μL को पतला करके 0.2% बीएसए तैयार करें।
- डीएनएस की 12,500 इकाइयों में अर्ल के संतुलित नमक समाधान (ईबीएसएस) के 1 मिलीलीटर को जोड़कर 0.4% डीएनएस स्टॉक तैयार करें, फ़िल्टर स्टरलाइज़ (0.22 μm), एलिकोट और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। डी-पीबीएस के 27 एमएल में 0.2% बीएसए के 3 एमएल और 0.4% डीएनएके 100 μL जोड़कर पैनिंग बफर (0.02% बीएसए) तैयार करें। प्राथमिक एंटीबॉडी तैयार करें (सीडी 45, पीडीजीआरएफ, ओ 4)।
नोट: यह प्रोटोकॉल एक ओ 4 हाइब्रिडोमा8,9 का उपयोग करता है, हालांकि, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ओ 4 एंटीबॉडी का 10 μg भी उपयुक्त होगा। - एचबीएसएस के 5 मिलीलीटर में संयोजन कोलेजनेस (50 मिलीग्राम) की एक बोतल को घोलकर संयोजन कोलेजनेस स्टॉक तैयार करें, और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। 500 μL गर्म संयोजन कोलेजनेस और 50 μL गर्म 0.4% DNase को 4.5 mL HBSS-/- में जोड़कर प्रति दो चूहों के लिए एक कार्यशील स्टॉक तैयार करें।
- डी-पीबीएस के 150 एमएल में 3 ग्राम बीएसए जोड़कर कम ओवोम्यूकोइड तैयार करें, फिर 3 ग्राम ट्रिप्सिन अवरोधक जोड़ें और घुलने के लिए मिलाएं। पीएच को 7.4 पर समायोजित करें और डी-पीबीएस के साथ मात्रा को 200 एमएल तक लाएं। फ़िल्टर करें, निष्फल करें, 1 एमएल एलिकोट तैयार करें, और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। विच्छेदन के दिन, काम करने वाले समाधान के लिए डी-पीबीएस के 9 एमएल में 1 एमएल कम ओवोम्यूकोइड मिलाएं।
- 50 एमएल एचबीएसएस में 7.5 ग्राम बीएसए को घोलकर 15% बीएसए तैयार करें - (पूरी तरह से घुलने के लिए शेकर पर रखें), फ़िल्टर करें, निष्फल करें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
- 23.2 एमएल डीएमईएम, 23.2 एमएल न्यूरोबेसल मीडियम, 500 μएल ग्लूटामैक्स, 500 μL सोडियम पाइरूवेट, 500 μL पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (आगमन के तुरंत बाद एलिकोट और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें), 500 μL इंसुलिन (5 μg / mL अंतिम), 500 μL SATO (5 μg / mL अंतिम) जोड़कर 50 mL न्यूरॉन मीडिया तैयार करें। और बी 27 + के 1,000 μL (प्राप्त करने पर -20 डिग्री सेल्सियस पर तुरंत एलिकोट और स्टोर करें)।
- एमएल (100 एमएल में 50 मिलीग्राम) की एकाग्रता के लिए कल्चर ग्रेड पानी में घुलकर इंसुलिन स्टॉक तैयार करें, पीएच को 7.4 में समायोजित करें, फ़िल्टर स्टरलाइज़ (0.22 μm), 500 μL एलिकोट तैयार करें, और -20 °C पर स्टोर करें।
- प्रोजेस्टेरोन के 20 μL (इथेनॉल के 100 μL में 2.5 मिलीग्राम), 800 μL सोडियम सेलेनाइट (10 मिलीलीटर न्यूरोबेसल मीडिया में 4 मिलीग्राम + 1 एन एनएओएच के 10 μL), 800 मिलीग्राम बीएसए, 800 मिलीग्राम ट्रांसफरिन, 128 मिलीग्राम पुट्रेसीन डायहाइड्रोक्लोराइड, और 80 एमएल न्यूरोबेसल के संयोजन से एसएटीओ स्टॉक तैयार करें। फ़िल्टर स्टरलाइज़ (0.22 μm), 500 μL एलिकोट तैयार करें, और -20 °C पर स्टोर करें। ताजा प्रोजेस्टेरोन और सोडियम सेलेनाइट समाधान बनाना आवश्यक है।
- न्यूरोबेसल माध्यम में 5 मिलीग्राम / एमएल (10 एमएल में 50 मिलीग्राम) की स्टॉक एकाग्रता में घोलकर एन-एसिटाइल-एल-सिस्टीन (एनएसी) स्टॉक के 50 μL तैयार करें, फ़िल्टर स्टरलाइज़ (0.22 μm), एलिकोट और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
- दिन 4 और 5 के लिए, निम्नलिखित अभिकर्मक तैयार करें।
- 1,000 एमएल पानी में 21.8 ग्राम सोडियम फॉस्फेट डिबासिक (एनए 2 एचपीओ 4) और 8.34 ग्राम सोडियम फॉस्फेट मोनोबैसिक डाइहाइड्रेट (एनएएच 2 पीओ4) को घोलकर0.2एम फॉस्फेट बफर (पीबी) तैयार करें। पीएच को 7.4 पर समायोजित करें और कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
- 8% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) निम्नानुसार तैयार करें: एक फ्यूम हुड में, 50 मिलीलीटर पानी को 55 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें, गर्मी बंद करें, और लगातार हिलाते हुए 8 ग्राम पीएफए प्रिल्स जोड़ें। समाधान साफ होने तक 1 एन एनएओएच ड्रॉपवाइज जोड़ें, फिर 0.2 एम पीबी के 40 एमएल जोड़ें, और स्पष्ट होने तक हिलाना जारी रखें। समाधान को कमरे के तापमान पर ठंडा करें, पीएच को 7.4 तक समायोजित करें, और मात्रा को 0.2 एमपीबी के साथ 100 एमएल तक लाएं। छानकर 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 सप्ताह तक स्टोर करें।
- संस्कृति ग्रेड डी-पीबीएस में 0.2% ट्राइटन एक्स -100 (1 एमएल ट्राइटन + 500 एमएल डी-पीबीएस) जोड़कर डी-पीबीएस + ट्राइटन एक्स -100 (पीबीएसटीएक्स) तैयार करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। ब्लॉकिंग समाधान तैयार करें, जो पीबीएसटीएक्स में 1% सामान्य गधा सीरम (एनडीएस) है। समय से पहले, एनडीएस + 9 एमएल पीबीएसटीएक्स के 1 एमएल तैयार किए जा सकते हैं और 10 एमएल एलिकोट में -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किए जा सकते हैं।
- एंटीबॉडी समाधान तैयार करें जो पीबीएस टीएक्स में 0.2% एनडीएस / 0.2% बीएसए है: एनडीएस के 200 μL + 200 मिलीग्राम बीएसए + पीबीएसटीएक्स के 9.6 एमएल; समय से पहले तैयार किया जा सकता है और 10 एमएल एलिकोट में -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
2. उपकरण सेटअप
- निम्नलिखित उपकरण स्थापित करें: बाँझ सेल कल्चर बायोसेफ्टी कैबिनेट, माइक्रोपिपेट सेट, सीरोलॉजिकल पिपेट और पिपेट गन, 10 सेमी पेट्री व्यंजन, प्लेटिंग के लिए वांछित सेल कल्चर व्यंजन (यहां, इमेजिंग के लिए 24-अच्छी तरह से काले ग्लास-बॉटम प्लेटों का उपयोग किया गया था), 15 एमएल और 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब, विच्छेदन उपकरण (अर्थात्: लैमिनेक्टॉमी और तंत्रिका ट्रिमिंग के लिए ठीक स्प्रिंग कैंची, ठीक बल, और एक रेजर ब्लेड, 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी का स्नान, 70 μm सेल छन्नी, सेंट्रीफ्यूज (300 x g पर 10 मिनट) 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों के लिए एडेप्टर, ट्राइपैन ब्लू और हेमोसाइटोमीटर, फ्यूम हुड और चुंबकीय हिलाने वाली गर्म प्लेट।
3. प्रायोगिक विधि
- दिन 1: व्यंजन ों की तैयारी
- एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में, कुएं के तल को कवर करने के लिए पर्याप्त पॉली-डी-लाइसिन के साथ वांछित संस्कृति की सतह को कोट करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर स्टोर करें। यहां, इमेजिंग के लिए 24-वेल ग्लास-बॉटम प्लेटों का उपयोग किया गया था, और इस प्रकार पॉली-डी-लाइसिन के 300 μL का उपयोग किया गया था।
- एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में, पैनिंग व्यंजन तैयार करें: सीडी 45 डिश के लिए, 10 सेमी पेट्री डिश में 10 एमएल वर्किंग ट्रिस-एचसीएल समाधान और 30 μL बकरी एंटी-रैट आईजीजी जोड़ें; पीडीजीएफआर डिश के लिए, 10 सेमी पेट्री डिश में 10 एमएल वर्किंग ट्रिस-एचसीएल समाधान और 30 μL बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी जोड़ें; ओ 4 हाइब्रिडोमा डिश के लिए, 10 सेमी पेट्री डिश में 10 एमएल वर्किंग ट्रिस-एचसीएल समाधान और 30 μL बकरी एंटी-माउस आईजीजी जोड़ें। सुनिश्चित करें कि समाधान पूरे पकवान क्षेत्र को कवर करता है और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ देता है।
- दिन 2: विच्छेदन, ट्रिट्यूरेशन और इम्यूनोपैनिंग।
- पॉली-डी-लाइसिन को एस्पिरेट करें, प्लेटों को टिशू कल्चर पानी से तीन बार धोएं, ढक्कन को खुला झुकाएं, और सतह को पूरी तरह से जैव सुरक्षा कैबिनेट में सूखने दें। प्रत्येक कुएं के तल को कोट करने के लिए प्लेटों पर पर्याप्त लैमिनिन लागू करें, और 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में रखें। 24-वेल प्लेटों के लिए, 200 μL पर्याप्त है।
- पैनिंग व्यंजन तैयार करना समाप्त करें। प्रत्येक डिश को डी-पीबीएस के साथ धोएं और प्राथमिक एंटीबॉडी के 10 μg के साथ इनक्यूबेट करें। कम से कम 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर बैठने दें।
- सीडी 45 डिश के लिए, 0.2% बीएसए के 5 एमएल और सीडी 45 प्राथमिक के 20 μL जोड़ें; पीडीजीएफआर डिश के लिए, 0.2% बीएसए के 5 एमएल और पीडीजीएफआर के 15.4 μL जोड़ें; ओ 4 डिश के लिए, 0.2% बीएसए के 3 एमएल, ओ 4 हाइब्रिडोमा के 2 एमएल, और 4% बीएसए के अतिरिक्त 100 μL जोड़ें (यह सुनिश्चित करने के लिए कि अंतिम बीएसए एकाग्रता 0.2% पर बनी रहे)।
- 0.1 एमएल / किलोग्राम सोडियम पेंटोबार्बिटोल (प्रति 10 सेमी इम्यूनोपैनिंग डिश) का उपयोग करके एक से चार चूहों को इच्छामृत्यु दें। हमने 8-10 सप्ताह की उम्र में C57BL/6 चूहों का उपयोग किया। दोनों लिंगों का उपयोग किया गया और एक दूसरे से अलग सुसंस्कृत किया गया। 30 मिलीलीटर ठंडे 0.9% खारा के साथ जानवर को गर्म करें।
- सामने और पिछले पंजे को स्टायरोफोम चरण में पिन करें और रीढ़ की हड्डी के स्तंभ को पीछे से उजागर करने के लिए एक साफ रेजर ब्लेड का उपयोग करें। रीढ़ की हड्डी को उजागर करने के लिए पृष्ठीय रीढ़ की हड्डी के दोनों ओर लगभग आधे रास्ते में कट करके, स्तंभ के पृष्ठीय आधे हिस्से को हटाकर, लैमिनेक्टॉमी करें। या तो धीरे से नसों को काटें और रीढ़ की हड्डी को हटा दें, या धीरे से कॉर्ड को साइड में धक्का दें, तंत्रिका अखंडता को बनाए रखें।
- रीढ़ की हड्डी के स्तंभ के दोनों ओर से सभी डीआरजी को खोजने और हटाने के लिए रीढ़ की हड्डी की जड़ों (या तो कटी हुई या रीढ़ की हड्डी से जुड़ी) का उपयोग करें। प्रत्येक डीआरजी से तंत्रिका मलबे को ट्रिम करें क्योंकि इसे हटा दिया जाता है (संस्कृति में अधिक तंत्रिका मलबे से खराब संस्कृति अस्तित्व हो सकता है)। बर्फ पर 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में 15 मिलीलीटर एचबीएसएस में डीआरजी एकत्र करें।
नोट: ध्यान दें कि ऊतक को खुली हवा में विच्छेदित किया जाता है, लेकिन एक बार जब डीआरजी को ट्यूब में जोड़ा जाता है तो उन्हें बाँझ माना जाना चाहिए और केवल जैव सुरक्षा कैबिनेट में हेरफेर किया जाना चाहिए। - विच्छेदन के अंत से लगभग 30 मिनट पहले (मोटे तौर पर अंतिम माउस शुरू करते समय) पानी के स्नान में स्टेमक्सीम 1 और 0.4% डीएनएस के जमे हुए स्टॉक रखें। उन्हें शंक्वाकार ट्यूब के निचले हिस्से में बसने की अनुमति दें, फिर जैव सुरक्षा कैबिनेट में प्रोटोकॉल जारी रखें।
- <1 एमएल तरल प्राप्त करने के लिए सक्शन के बजाय पिपेट का उपयोग करें, और ~ 100 μL तरल छोड़ दें ताकि ऊतक खोने का खतरा न हो।
- 1 मिलीलीटर एचबीएसएस के साथ तीन बार धोएं। ऊतक में 5 एमएल काम करने वाले स्टेमक्सीम समाधान जोड़ें। ढक्कन को एक पारदर्शी फिल्म के साथ कवर करें और ट्यूब को 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट पानी के स्नान में इसके किनारे पर तैरें।
- एंजाइम में इनक्यूबेशन के बाद, ट्यूब में कम ओवो अवरोधक समाधान के 1 एमएल जोड़ें। कोशिकाओं को पी 1000 पिपेट के साथ धीरे से 10-15 बार ट्रिट्यूरेट करें। ऊतक के टुकड़ों को व्यवस्थित होने दें।
- समाधान के शीर्ष 2-3 एमएल (विघटित कोशिकाओं वाले) को ताजा कम ओवोम्यूकोइड समाधान में स्थानांतरित करें। तब तक दोहराएं जब तक ऊतक पूरी तरह से अलग न हो जाए और कोई दृश्य मान खंड न रह जाए।
- कमरे के तापमान पर 300 x g पर 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज। पिछले 1 एमएल के लिए सक्शन के बजाय पिपेट का उपयोग करके सुपरनैटेंट को फिर से हटा दें, ~ 100 μL छोड़ दें, और 1 एमएल पैनिंग बफर में सेल गोली को फिर से निलंबित कर दें।
- मिश्रण करने के लिए धीरे से पिपेट। 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब पर 1 एमएल पैनिंग बफर के साथ 70 μm सेल छन्नी को प्री-वेट करें। सेल छन्नी के माध्यम से सेल समाधान को फ़िल्टर करें।
- 1 एमएल पैनिंग बफर के साथ ट्यूब को धोएं, फिर छन्नी (3 एमएल फिल्ट्रेट) से गुजरें। माइलिन मलबे को हटाने के लिए 15% बीएसए कुशन के 2 एमएल के शीर्ष पर सेल सस्पेंशन को धीरे से (एक समय में 1 एमएल) परत करें। एक 2 एमएल कुशन दो चूहों के लिए प्रभावी है, और 3 एमएल चार चूहों के लिए प्रभावी है।
- लेयरिंग के लिए, ट्यूब में बीएसए के 2 एमएल रखें, बीएसए के साथ ट्यूब के किनारों को बंद करें और धीरे से कोट करें। फिर, ट्यूब के किनारे के खिलाफ पाइपिंग करके, शीर्ष के सेल निलंबन को धीरे से परत करें।
- 10 मिनट के लिए 300 x g पर कमरे के तापमान पर सेंट्रीफ्यूज (धीमी गति से त्वरण और मंदी)। शीर्ष पर स्पष्ट तरल को हटाने के लिए पी 1000 पिपेट का उपयोग करें, बीच में माइलिन चरण, और बीएसए, एक समय में 1 एमएल (प्रत्येक एमएल के बीच में युक्तियां बदलना)। ~ 100 μL बीएसए छोड़ दें ताकि गोली को परेशान न किया जा सके।
- पैनिंग बफर के 5 एमएल जोड़ें और ट्यूब को 37 डिग्री सेल्सियस, 10% सीओ2 इनक्यूबेटर में 30-45 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। यह एंटीजन पुनर्प्राप्ति के लिए अनुमति देता है। गैस विनिमय की अनुमति देने के लिए कैप को ढीला करना सुनिश्चित करें।
- सीडी 45 डिश को डी-पीबीएस के साथ तीन बार धोएं। अंतिम कुल्ला डालें। सेल सस्पेंशन को सीडी 45 डिश में डालें।
- कमरे के तापमान पर कुल 20 मिनट के लिए सीडी 45 डिश पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें, 10 मिनट के बिंदु पर धीरे से घूमें ताकि कोशिकाओं को एंटीबॉडी तक समान पहुंच मिल सके।
- डी-पीबीएस के साथ तीन बार पीडीजीएफआर डिश को धोएं और अंतिम कुल्ला डालें। अनबाउंड कोशिकाओं को सीडी 45 डिश से पीडीजीएफआर डिश में स्थानांतरित करें।
- सीडी 45 डिश को धीरे से हिलाएं और इसे एक कोण पर रखें। अनबाउंड कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए डिश के ऊपर सेल सस्पेंशन के 1 एमएल को धीरे से पिपेट करें। शेष सेल निलंबन को पीडीजीएफआर प्लेट में स्थानांतरित करने के लिए इसे पीडीजीएफआर डिश और पिपेट में डालें।
- कमरे के तापमान पर कुल 20 मिनट के लिए पीडीजीएफआर प्लेट को इनक्यूबेट करें, 10 मिनट के बिंदु पर धीरे से घूमें ताकि कोशिकाओं को एंटीबॉडी तक समान पहुंच मिल सके।
- डी-पीबीएस के साथ ओ 4 डिश को तीन बार कुल्ला करें और अंतिम कुल्ला डालें। चरण 3.2.19 के समान विधि का उपयोग करके पीडीजीएफआर डिश से ओ 4 डिश में अनबाउंड कोशिकाओं को स्थानांतरित करें। कमरे के तापमान पर कुल 20 मिनट के लिए ओ 4 प्लेट को इनक्यूबेट करें, 10 मिनट के बिंदु पर धीरे से घूमें ताकि कोशिकाओं को एंटीबॉडी तक समान पहुंच मिल सके।
- सेल निलंबन को 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें और 300 x g पर 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें। वांछित मात्रा में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें, और सेल व्यवहार्यता के लिए ट्राइपैन ब्लू के साथ 1: 1 पतला करें। हेमोसाइटोमीटर के साथ मध्यम से बड़ी कोशिकाओं की गणना करें (यह संस्कृति में न्यूरॉन्स की संख्या के सर्वोत्तम प्रतिनिधित्व की अनुमति देगा)।
- लैमिनिन को हटा दें और वांछित घनत्व पर कोशिकाओं को प्लेट करें। प्लेट को लैमिनिन हटाने और चढ़ाना के बीच सूखने न दें, और कोशिकाओं को तुरंत जोड़ें।
- न्यूरोनल संवर्धन के लिए परिमाणित कोशिकाओं (चित्रा 3) को 25 μL कल्चर माध्यम (1.2.7 में वर्णित) में 500 न्यूरॉन्स के साथ 24-वेल प्लेटों में प्रति अच्छी तरह से कल्चर करें और 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। कुओं को 500 μL की अंतिम मात्रा में भर दें।
- दिन 4: इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री (आईसीसी) निर्धारण, ब्लॉकिंग और प्राथमिक
- 48 घंटे की वृद्धि के बाद, कोशिकाओं को ठीक करने के लिए कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 8% पीएफए के 500 μL / वेल (या कुएं में मीडिया के बराबर मात्रा) जोड़ें। यदि मीडिया विश्लेषण वांछित है, तो कोई सीधे 4% पीएफए के साथ ठीक कर सकता है। हालांकि, हमने इसका परीक्षण नहीं किया है।
- डी-पीबीएस के साथ कोशिकाओं को तीन बार धोएं। ध्यान दें, हमने इन कोशिकाओं को अधिकतम 72 घंटे के लिए मीडिया परिवर्तन के बिना संस्कृति में रखा है, लेकिन अनुमान है कि वे लंबे समय तक जीवित रह सकते हैं, खासकर अगर मीडिया आधा बदल गया है।
- अंतिम धोने को हटा दें और कोशिकाओं को पूरी तरह से कवर करने के लिए प्रति अच्छी तरह से पर्याप्त ब्लॉकिंग समाधान जोड़ें। कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए ब्लॉक करें। अवरुद्ध समाधान को हटा दें और एंटीबॉडी समाधान में प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें: 1: 1,000 कमजोर पड़ने पर 3-ट्यूबुलिन। प्लेट को पारदर्शी फिल्म के साथ सील करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
नोट: फाइब्रोब्लास्ट ्स की अनुपस्थिति के लिए पीडीजीएफआर, प्रतिरक्षा कोशिकाओं की अनुपस्थिति के लिए सीडी 45, माइलिन की अनुपस्थिति के लिए पी 0 या पीएमपी 22, या सैटेलाइट ग्लिया के लिए फैबपी 7 के साथ धुंधला होने पर विचार किया जा सकता है।
- दिन 5: आईसीसी सेकेंडरी
- डी-पीबीएस के साथ कोशिकाओं को तीन बार धोएं। अंतिम धोने को हटा दें और एंटीबॉडी समाधान में द्वितीयक एंटीबॉडी जोड़ें: एंटी-खरगोश 488 1:500 कमजोर पड़ने पर और डीएपीआई 1: 2,000 कमजोर पड़ने पर। प्रकाश से सुरक्षित, कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
- डी-पीबीएस से तीन बार धोएं। कुएं के तल और छवि को कवर करने के लिए पर्याप्त डी-पीबीएस जोड़ें। प्लेट को पारदर्शी फिल्म के साथ सील किया जा सकता है, प्रकाश से संरक्षित किया जा सकता है, और 2 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
डीएपीआई और 3-ट्यूबुलिन से सना हुआ निश्चित कोशिकाओं को तब एक कॉन्फोकल उच्च सामग्री स्क्रीनिंग सिस्टम के साथ चित्रित किया गया था। छवियों का विश्लेषण उपयुक्त वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर का उपयोग करके डीएपीआई-पॉजिटिव कोशिकाओं के प्रतिशत को निर्धारित करने के लिए किया गया था जो 3-ट्यूबुलिन (चित्रा 3) के साथ सह-लेबल किए गए थे। पूरे डीआरजी संस्कृतियों में 42.36% ± 6.4% 33-ट्यूबुलिन धुंधलापन निर्धारित किया गया था, और इम्यूनोपैन्ड डीआरजी संस्कृतियों में 71.44% ±7.43% 3-ट्यूबुलिन धुंधला होना निर्धारित किया गया था। यह इम्यूनोपैनिंग (पी < 0.0001, अप्रकाशित टी-टेस्ट) के साथ न्यूरोनल संवर्धन में उल्लेखनीय वृद्धि का खुलासा करता है।
चित्रा 1: इम्यूनोपैनिंग मूल बातें। एक द्वितीयक एंटीबॉडी को रात भर एक कल्चर डिश का पालन किया जाता है, और प्राथमिक एंटीबॉडी तब पेश किए जाते हैं। यह रुचि की कोशिकाओं को सतह एंटीजन द्वारा प्लेट से जोड़ने की अनुमति देता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: नकारात्मक चयन द्वारा वयस्क माउस डीआरजी न्यूरॉन इम्यूनोपैनिंग। डीआरजी को एक एकल सेल समाधान में कटाया, अलग और तनावपूर्ण किया जाता है। माइलिन मलबे को बीएसए कुशन के माध्यम से सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा हटा दिया जाता है। सेल निलंबन को तब तीन इम्यूनोपैनिंग व्यंजनों (सीडी 45, पीडीजीएफआर और ओ 4) में पारित किया जाता है ताकि न्यूरॉन्स के लिए समृद्ध संस्कृति प्राप्त की जा सके। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: इम्यूनोपैनिंग द्वारा डीआरजी कल्चर न्यूरोनल संवर्धन। निश्चित संस्कृतियों को न्यूरॉन्स के लिए 3-ट्यूबुलिन और सभी नाभिकों के लिए डीएपीआई से दाग दिया गया था। (ए) एक संपूर्ण (गैर-इम्यूनोपेन्ड) संस्कृति की प्रतिनिधि छवि। (बी) एक इम्यूनोपैन्ड संस्कृति की प्रतिनिधि छवि। (सी) कुल डीएपीआई-पॉजिटिव कोशिकाओं के प्रतिशत के रूप में 3-ट्यूबुलिन-पॉजिटिव कोशिकाओं का परिमाणीकरण। पट्टियाँ माध्य ± मानक त्रुटि माध्य (SEM) इंगित करती हैं. = पी < 0.0001, अप्रकाशित टी-टेस्ट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
यह इम्यूनोपैनिंग प्रोटोकॉल डीआरजी प्राथमिक संस्कृतियों में न्यूरोनल कोशिकाओं के अनुपात को बढ़ाता है। सर्वोत्तम परिणामों के लिए, विच्छेदन समय पर किया जाना चाहिए, और डीआरजी को अतिरिक्त नसों की छंटनी की जानी चाहिए। कोशिकाओं को अनावश्यक तनाव से रोकने के लिए पृथक्करण चरण की सावधानीपूर्वक निगरानी की जानी चाहिए, और 1 घंटे से अधिक नहीं होनी चाहिए। विशेष रूप से इम्यूनोपैनिंग के संबंध में, प्रत्येक प्लेट को धीरे-धीरे आधे बिंदु पर घुमाया जाना चाहिए ताकि कोशिकाओं को लेपित एंटीबॉडी तक पहुंच मिल सके। प्लेटों को न्यूरोनल सेल निलंबन एकत्र करने के बाद एक संस्कृति माइक्रोस्कोप के तहत भी देखा जाना चाहिए ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि गैर-न्यूरोनल कोशिकाएं बंधी हुई हैं।
वयस्क चूहों के उपयोग में एक सीमा डीआरजी की स्थापित प्रकृति है। सभी गैर-न्यूरोनल सेल प्रकारों को हटाने में असमर्थता गैर-न्यूरोनल के रूप में संस्कृति का लगभग 30% छोड़ देती है (चित्रा 3)। जबकि हम संस्कृतियों से प्रतिरक्षा कोशिकाओं, फाइब्रोब्लास्ट और श्वान कोशिकाओं की आबादी को अलग और कम कर सकते हैं, उपग्रह ग्लिया को न्यूरॉन्स से अलग करना बेहद मुश्किल हो सकता है। हम यह भी अनुमान लगाते हैं कि उपग्रह ग्लिया10 द्वारा प्रदान किए गए चयापचय समर्थन के बिना इन न्यूरॉन्स का खराब अस्तित्व हो सकता है। जबकि जीएफएपी का उपयोग करके इन कोशिकाओं के लिए दाग लगाने का हमारा प्रयास खराब एंटीबॉडी विशिष्टता के कारण विफल रहा, भविष्य की दिशा फैबपी 7 का उपयोग करके इन कोशिकाओं के लिए दाग लगाने की हो सकती है। हमने इस प्रोटोकॉल का समस्या निवारण करते समय उपग्रह ग्लिया जैसे सीडी 9-पॉजिटिव गैर-न्यूरोनल कोशिकाओं को हटाने का प्रयास किया। हालांकि, सीडी 9 प्लेट में, यह पाया गया कि प्लेट से कई न्यूरॉन्स जुड़े हुए थे। हम अनुमान लगाते हैं कि माउस न्यूरॉन्स में कुछ सीडी 9 अभिव्यक्ति हो सकती है। वास्तव में, माउस न्यूरॉन जैसी कोशिकाओं से बाह्य पुटिका साहित्य सीडी 9 को मार्कर11 के रूप में नियोजित करता है। यदि उपग्रह ग्लिया के अनुपात को कम करने के लिए एक अधिक उपयुक्त पैनिंग एंटीबॉडी पाया जा सकता है, तो इन सहायक कोशिकाओं के नुकसान का मुकाबला करने के लिए एनजीएफ, बीडीएनएफ, या एनटी 3 जैसे विकास कारकों के साथ अतिरिक्त पूरक पर विचार किया जा सकता है।
यह इम्यूनोपैनिंग प्रोटोकॉल संस्कृति में न्यूरोनल कोशिकाओं के अनुपात को बढ़ाकर समरूप डीआरजी संस्कृति नमूनों से न्यूरोनल रीडआउट की सटीकता में सुधार कर सकता है। यह वयस्क माउस डीआरजी न्यूरॉन्स को कल्चर करने के लिए एक एवेन्यू भी प्रदान करता है, जिससे आनुवंशिक, बीमारी और चोट माउस मॉडल में न्यूरोनल फेनोटाइप ्स की गहन जांच की अनुमति मिलती है।
इम्यूनोपैनिंग भी एक अत्यधिक अनुकूलन योग्य उपकरण है। उदाहरण के लिए, सेल सतह मार्कर आइसोलेक्टिन-बी 4 को विशेष रूप से गैर-पेप्टाइडर्जिक माउस नोसिसेप्टर्स के लिए चयन करने के लिए नियोजित किया जा सकता है। इम्यूनोपैनिंग का उपयोग कॉर्टिकल न्यूरॉन्स, माइक्रोग्लिया, एस्ट्रोसाइट्स और ऑलिगोडेंड्रोसाइट अग्रदूत कोशिकाओं सहित अन्य प्राथमिक संस्कृतियों को समृद्ध करने के लिए भी किया जा सकता है। यह एक शक्तिशाली उपकरण है जो प्राथमिक सेल संस्कृतियों के अनुप्रयोगों को व्यापक बना सकता है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखकों के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।
Acknowledgments
इस काम को कनाडाई स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान (एफआरएन -162434) से एक परियोजना अनुदान और कनाडा के एमएस सोसाइटी (ईजीआईडी -3761) से डिस्कवरी अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। सन और क्रॉस कैंसर इंस्टीट्यूट को इमेजएक्सप्रेस सिस्टम के प्रशिक्षण और उपयोग के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 um Syringe filters | Fisher | 723-2520 | |
| 100 mm petri dishes | ThermoFisher | FB0875712 | |
| 24 well black glass-bottom plates | Cellvis | P24-1.5H-N | |
| 70 um cell strainer | Cedarlane | 15-1070-1(BI) | |
| B27+ supplement | Gibco | A3582801 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A7906 | for 15% BSA cushion, and ICC (heat shock fraction ≥98%) |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A4161 | for 4% BSA for immunopanning, and SATO for media (essentially globulin free, suitable for cell culture, ≥99%) |
| CD45 antibody | BD Pharmigen | 550539 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| DMEM | Gibco | 11960069 | |
| DNAse | Worthington | LS002007 | for stemxyme solution and panning buffer |
| D-PBS | Sigma Aldrich | D8662 | |
| EBSS | Sigma Aldrich | E6267 | for DNAse solution |
| Filter paper P8 grade | ThermoFisher | 09-795K | for 8% PFA |
| Glutamax | ThermoFisher | 35050061 | |
| goat-anti-mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 115-005-020 | for O4 dish |
| goat-anti-rabbit 488 | Invitrogen | A11008 | |
| goat-anti-rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | 115-005-003 | for PDGFRB dish |
| goat-anti-rat IgG | Jackson Immunoresearch | 115-005-044 | for CD45 dish |
| HBSS -/- | Sigma Aldrich | 14175145 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I2643 | |
| laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma Aldrich | A8199 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103049 | |
| Normal Donkey Serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| O4 antibody | n/a | n/a | Hybridoma |
| Ovomucoid trypsin inhibitor | Cedarlane | LS003086 | for low ovo |
| paraformaldehyde prills | Sigma Aldrich | 441244 | for 8% PFA |
| PDGFRB antibody | Abcam | AB32570 | |
| penicillin/ streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich | P6407 | |
| Progesterone | Sigma Aldrich | P8783 | for SATO |
| Putrescine dihydrochrloride | Sigma Aldrich | P5780 | for SATO |
| Sodium phosphate dibasic | Fisher | S374-1 | for 0.2 M PB |
| Sodium Phosphate monobasic dihydrate | Sigma Aldrich | 04269 | for 0.2 M PB |
| Sodium Pyruvate | ThermoFisher | 11360070 | |
| Sodium Selenite | Sigma Aldrich | S5261 | for SATO |
| Stemxyme I | Cedarlane | LS004107 | for tissue dissociation; combination collagenase |
| Transferrin | Sigma Aldrich | T1147 | for SATO |
| Tris-HCl | Millipore Sigma | T5941 | |
| trypan blue | Gibco | 15250-061 | |
| β3-Tubulin | Sigma-Aldrich | T2200 |
References
- Haberberger, R. V., Barry, C., Dominguez, N., Matusica, D.
- Perner, C., Sokol, C. L. Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release. STAR Protocols. 2 (1), 100333 (2021).
- Lin, Y. T., Chen, J. C. Dorsal root ganglia isolation and primary culture to study neurotransmitter release. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (140), e57569 (2018).
- Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).
- Nolle, A., et al. Enrichment of Glial Cells From Human Post-mortem Tissue for Transcriptome and Proteome Analysis Using Immunopanning. Frontiers in Cellular Neuroscience. 15, 772011 (2021).
- Barres, B. A. Designing and troubleshooting immunopanning protocols for purifying neural cells. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (12), 1342-1347 (2014).
- Zuchero, J. B. Purification of dorsal root ganglion neurons from rat by immunopanning. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (8), 826-838 (2014).
- Sommer, I., Schachner, M. Monoclonal antibodies (O1 to O4) to oligodendrocyte cell surfaces: an immunocytological study in the central nervous system. Developmental Biology. 83 (2), 311-327 (1981).
- Sommer, I., Schachner, M. Cell that are O4 antigen-positive and O1 antigen-negative differentiate into O1 antigen-positive oligodendrocytes. Neuroscience Letters. 29 (2), 183-188 (1982).
- Hanani, M. Satellite glial cells in sensory ganglia: from form to function. Brain Research. Brain Research Reviews. 48 (3), 457-476 (2005).
- Viveiros, A., et al. In-cell labeling coupled to direct analysis of extracellular vesicles in the conditioned medium to study extracellular vesicles secretion with minimum sample processing and particle loss. Cells. 11 (3), 351 (2022).
