Summary
Dit artikel beschrijft een immunopanningprotocol voor ganglia van de dorsale wortel van volwassen muizen. Door antilichamen aan kweekplaten te hechten, kunnen we niet-neuronale cellen negatief selecteren en verwijderen. We laten zien dat de culturen zijn verrijkt voor neuronen met behulp van dit protocol, waardoor een diepgaande studie van neuronale reacties op manipulatie mogelijk is.
Abstract
Dorsale wortelganglia (DRG's) zijn perifere structuren grenzend aan de dorsale hoorn van het ruggenmerg, die de cellichamen van sensorische neuronen en verschillende andere celtypen huisvesten. Gepubliceerde kweekprotocollen verwijzen vaak naar hele gedissocieerde DRG-culturen als neuronaal, ondanks de aanwezigheid van fibroblasten, Schwann-cellen, macrofagen en lymfocyten. Hoewel deze hele DRG-culturen voldoende zijn voor beeldvormingstoepassingen waarbij neuronen kunnen worden onderscheiden op basis van morfologie of kleuring, zijn eiwit- of RNA-homogenaten die uit deze culturen worden verzameld niet primair neuronaal van oorsprong. Hier beschrijven we een immunopanning-sequentie voor gekweekte muis DRG's. Het doel van deze methode is om DRG-culturen voor neuronen te verrijken door andere celtypen te verwijderen. Immunopanning verwijst naar een methode om celtypen te verwijderen door antilichamen aan celkweekschalen te hechten. Met behulp van deze gerechten kunnen we negatief selecteren tegen en het aantal fibroblasten, immuuncellen en Schwann-cellen in cultuur verminderen. Met deze methode kunnen we het percentage neuronen in culturen verhogen.
Introduction
Dorsale wortelganglia (DRG's) huisvesten de cellichamen van de sensorische neuronen die perifere weefsels innerveren. Het bestuderen van deze neuronen stelt ons in staat om de mechanistische onderbouwing van pijn en sensorische omstandigheden te begrijpen. DRG's bestaan echter niet alleen uit neuronen, maar bevatten ook fibroblasten, Schwann-cellen, macrofagen en andere immuuncellen1. Ondanks de aanwezigheid van deze verschillende celtypen worden hele DRG-culturen in de literatuur vaak neuronaal 2,3 genoemd. Deze culturen zijn nog steeds nuttig voor neuronaal onderzoek door beeldvorming of flowcytometrie, wat neuronale identificatie door kleuring, celgrootte en / of morfologie mogelijk zou maken. Voor assays zoals polymerasekettingreactie (PCR) of western blotting, waarbij culturen worden gehomogeniseerd voor RNA- of eiwitverzameling, kan de aanwezigheid van niet-neuronale celtypen de resultaten echter verstoren. Daarom is het nodig om het aandeel neuronale cellen in DRG-culturen te verhogen.
Immunopanning is een techniek die wordt gebruikt om een verscheidenheid aan celtypen te zuiveren, waaronder corticale neuronen, astrocyten, voorlopercellen van oligodendrocyten en microglia. In eenvoudige bewoordingen gaat het om het hechten van een antilichaam tegen een celoppervlakmarker aan een petrischaal, bedoeld om bepaalde cellen te binden (figuur 1), en het kan worden gebruikt om te selecteren voor of tegen celtypen van belang 4,5,6. Het immunopanniseren van embryonale DRG's bij ratten om te selecteren tegen niet-neuronale cellen is eerder beschreven door Zuchero7. We hebben echter geen immunopanningprotocol kunnen vinden dat specifiek is voor DRG's van muizen. In dit protocol bouwen we voort op de basishuurders van het Zuchero-protocol, maar in plaats daarvan hebben we de immunopanning-sequentie aangepast om DRG-culturen van volwassen muizen te verrijken (figuur 2). Dit is een krachtig hulpmiddel om gevestigde sensorische neuronen in cultuur te bestuderen. Het is voordelig omdat het het gebruik van volwassen muizen uit genetische, ziekte- en letselmodellen mogelijk maakt, zodat hun sensorische neuronen met meer specificiteit kunnen worden bestudeerd.
Dit protocol is voordelig voor lezers die het aandeel neuronen in DRG-culturen van volwassen muizen willen vergroten. De immunopanningstappen kunnen echter ook worden weggelaten en dit protocol kan ook worden gebruikt voor hele DRG-culturen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven werden uitgevoerd met goedkeuring van de University of Alberta Health Sciences Animal Care and Use Committee (protocol 0000274).
1. Reagensbereiding
- Bereid voor dag 1 de volgende reagentia voor: water van celkweekkwaliteit; poly-D-lysine-bereid een bouillon door de hele fles te reconstitueren in 50 ml water van cultuurkwaliteit tot een stamconcentratie van 100 μg/ml, bewaren bij 4 °C en de bouillon 1:10 verdunnen in water van cultuurkwaliteit tot een eindconcentratie van 10 μg/ml; tris-HCl-bereid een bouillon door trishydrochloride in poedervorm op te lossen in water van cultuurkwaliteit tot een stamconcentratie van 500 mM (3,94 g in 50 ml), pH 9,5, filtersteriliseren (0,22 μm), opslaan bij 4 °C en de bouillon 1:10 verdunnen in water van cultuurkwaliteit tot een eindconcentratie van 50 mM; secundaire antilichamen (geit anti-rat, -konijn en -muis).
- Bereid voor dag 2 de volgende reagentia voor.
- Bereid celkweekkwaliteit Ca 2+, Mg2+-vrije Hank's gebalanceerde zoutoplossing (HBSS; HBSS-/-), en D-fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) van celkweekkwaliteit met Ca 2+ en Mg2+. Bereid een laminine stock aliquot en bewaar bij -80 °C onmiddellijk na ontvangst; verdun de grondstof in steriele HBSS-/- tot een eindconcentratie van 10 μg/ml voor de werkvoorraad.
- Bereid 4% runderserumalbumine (BSA) bouillon door 400 mg BSA op te lossen in 7,5 ml D-PBS (pH 7,4), breng het volume op 10 ml, filter steriliseren (0,22 μm), aliquot en bewaren bij -20 °C. Bereid 0,2% BSA door 750 μL 4% BSA te verdunnen in 14,25 ml D-PBS.
- Bereid 0,4% DNAse-bouillon door 1 ml Earle's gebalanceerde zoutoplossing (EBSS) per 12.500 eenheden DNAse toe te voegen, filter steriliseren (0,22 μm), aliquot en bewaren bij -20 °C. Bereid panningbuffer (0,02% BSA) voor door 3 ml 0,2% BSA en 100 μl 0,4% DNAse toe te voegen aan 27 ml D-PBS. Bereid primaire antilichamen voor (CD45, PDGRFβ, O4).
OPMERKING: Dit protocol gebruikt een O4-hybridoom8,9, maar 10 μg van een in de handel verkrijgbaar O4-antilichaam zou ook geschikt zijn. - Bereid de combinatiecollagenasebouillon door een fles combinatiecollagenase (50 mg) op te lossen in 5 ml HBSS-/-, aliquot, en bewaar bij -20 °C. Bereid een werkvoorraad per twee muizen door 500 μL verwarmd combinatiecollagenase en 50 μL opgewarmde 0,4% DNase toe te voegen aan 4,5 ml HBSS-/-.
- Bereid laag ovomucoïde door 3 g BSA toe te voegen aan 150 ml D-PBS, voeg vervolgens 3 g trypsineremmer toe en meng om op te lossen. Stel de pH in op 7,4 en breng het volume op 200 ml met D-PBS. Filter steriliseren, bereid 1 ml aliquots en bewaar bij -20 °C. Combineer op de dag van dissectie 1 ml laag ovomucoïde in 9 ml D-PBS voor de werkoplossing.
- Bereid 15% BSA door 7,5 g BSA op te lossen in 50 ml HBSS-/- (plaats op een shaker om volledig op te lossen), filter steriliseren en bewaren bij 4 °C.
- Bereid 50 ml neuronmedia door toevoeging van 23,2 ml DMEM, 23,2 ml neurobasaal medium, 500 μl glutamax, 500 μl natriumpyruvaat, 500 μl penicilline/streptomycine (aliquot onmiddellijk bij aankomst en bewaren bij -20 °C), 500 μl insuline (5 μg/ml finale), 500 μl SATO, 50 μl N-acetyl-L-cysteïne (NAC; 5 μg/ml definitief), en 1.000 μL B27+ (onmiddellijk aliquoteren en bewaren bij -20 °C bij ontvangst).
- Bereid de insulinevoorraad voor door op te lossen in water van cultuurkwaliteit tot een concentratie van 0,5 mg / ml (50 mg in 100 ml), stel de pH in op 7,4, filter steriliseren (0,22 μm), bereid 500 μL aliquots en bewaar bij -20 °C.
- Bereid de SATO-voorraad door 20 μL progesteron (2,5 mg in 100 μL ethanol), 800 μL natriumseleniet (4 mg in 10 ml neurobasale media + 10 μL 1 N NaOH), 800 mg BSA, 800 mg transferrine, 128 mg putrescinedihydrochloride en 80 ml neurobasaal te combineren. Filter steriliseren (0,22 μm), 500 μL aliquots bereiden en bewaren bij -20 °C. Het is essentieel om verse progesteron- en natriumselenietoplossingen te maken.
- Bereid 50 μL N-acetyl-L-cysteïne (NAC) voorraad door op te lossen in neurobasaal medium tot een stamconcentratie van 5 mg / ml (50 mg in 10 ml), filtersteriliseren (0, 22 μm), aliquot en bewaren bij -20 °C.
- Bereid voor dag 4 en 5 de volgende reagentia voor.
- Bereid 0,2 M fosfaatbuffer (PB) door 21,8 g natriumfosfaatdibasisch (Na 2 HPO 4) en 8,34 g natriumfosfaat monobasisch dihydraat (NaH2PO4) op te lossen in 1.000 ml water. Stel de pH in op 7,4 en bewaar bij kamertemperatuur.
- Bereid 8% paraformaldehyde (PFA) als volgt: verwarm in een zuurkast 50 ml water tot 55 °C, zet het vuur uit en voeg 8 g PFA-prils toe, voortdurend roerend. Voeg druppelsgewijs 1 N NaOH toe totdat de oplossing begint te klaren, voeg dan 40 ml 0,2 M PB toe en blijf roeren tot het helder is. Koel de oplossing af tot kamertemperatuur, stel de pH in op 7,4 en breng het volume op 100 ml met 0,2 M PB. Filtreer en bewaar bij 4 °C gedurende maximaal 2 weken.
- Bereid D-PBS + Triton X-100 (PBSTX) voor door 0,2% Triton X-100 toe te voegen in cultuurkwaliteit D-PBS (1 ml Triton + 500 ml D-PBS). Bewaren bij 4 °C. Bereid een blokkeringsoplossing, die 1% normaal ezelserum (NDS) in PBSTX is. Van tevoren kan 1 ml NDS + 9 ml PBSTX worden bereid en opgeslagen bij -20 °C in aliquots van 10 ml.
- Bereid antilichaamoplossing van 0,2% NDS/0,2% BSA in PBS TX: 200 μL NDS + 200 mg BSA + 9,6 ml PBSTX; kan van tevoren worden bereid en bij -20 °C in aliquots van 10 ml worden bewaard.
2. Apparatuur instellen
- Stel de volgende apparatuur in: steriele celkweek bioveiligheidskast, micropipetset, serologische pipetten en pipetpistool, petrisalen van 10 cm, gewenste celkweekschalen voor beplating (hier werden 24-well zwarte glasbodemplaten gebruikt voor beeldvorming), 15 ml en 50 ml conische buizen, dissectiegereedschappen (namelijk: fijne veerschaar voor laminectomie en zenuwtrimmen, fijne tang, en een scheermesje), waterbad ingesteld op 37 °C, 70 μm celzeef, centrifuge (10 min bij 300 x g) met adapters voor 15 ml conische buizen, trypan blauw en hemocytometer, zuurkast en magnetische roerende hete plaat.
3. Experimentele methode
- Dag 1: bereiding van gerechten
- Bedek in een bioveiligheidskast het gewenste kweekoppervlak met voldoende poly-D-lysine om de bodem van de put te bedekken. Een nacht bewaren bij 4 °C. Hier werden 24-well glasbodemplaten gebruikt voor beeldvorming, en dus werd 300 μL poly-D-lysine gebruikt.
- Bereid in een bioveiligheidskast de pannenschalen voor: voeg voor de CD45-schaal 10 ml werkende tris-HCl-oplossing en 30 μL geitenanti-rat IgG toe aan een petrischaal van 10 cm; voeg voor de PDGFRβ-schaal 10 ml werkende tris-HCl-oplossing en 30 μl geit anti-konijn IgG toe aan een petrischaal van 10 cm; voeg voor de O4 hybridomaschaal 10 ml werkende tris-HCl-oplossing en 30 μL geitenantimuis IgG toe aan een petrischaal van 10 cm. Zorg ervoor dat de oplossing het hele schoteloppervlak bedekt en laat het een nacht bij 4 °C staan.
- Dag 2: dissectie, trituratie en immunopanning
- Zuig de poly-D-lysine op, was de platen drie keer met weefselkweekwater, kantel het deksel open en laat het oppervlak volledig drogen in een bioveiligheidskast. Breng voldoende laminine aan op de platen om de bodem van elke put te coaten en plaats in een incubator bij 37 °C. Voor de 24-putplaten is 200 μL voldoende.
- Maak de panning dishes klaar. Was elk gerecht met D-PBS en incubeer met 10 μg primair antilichaam. Laat minstens 2 uur op kamertemperatuur zitten.
- Voeg voor de CD45-schaal 5 ml 0,2% BSA en 20 μL CD45 primair toe; voeg voor de PDGFRβ-schaal 5 ml 0,2% BSA en 15,4 μl PDGFRβ toe; voeg voor de O4-schaal 3 ml 0,2% BSA, 2 ml O4-hybridoom en nog eens 100 μL 4% BSA toe (om ervoor te zorgen dat de uiteindelijke BSA-concentratie op 0,2% blijft).
- Euthanaseer één tot vier muizen met 0,1 ml / kg natriumpentobarbitol (per immunopanningschaal van 10 cm). We gebruikten C57BL/6 muizen van 8-10 weken oud. Beide geslachten werden afzonderlijk van elkaar gebruikt en gekweekt. Perfuseer het dier met 30 ml koude 0,9% zoutoplossing.
- Speld de voor- en achterpoten vast aan een piepschuimen stadium en gebruik een schoon scheermesje om de wervelkolom van achteren bloot te leggen. Voer een laminectomie uit door ongeveer halverwege diep aan weerszijden van de dorsale wervelkolom te snijden, waarbij de dorsale helft van de kolom wordt verwijderd om het ruggenmerg bloot te leggen. Snijd voorzichtig de zenuwen door en verwijder het ruggenmerg, of duw het koord voorzichtig naar de zijkant, waardoor de integriteit van de zenuw behouden blijft.
- Gebruik de spinale zenuwwortels (afgehakt of bevestigd aan het ruggenmerg) om alle DRG's aan weerszijden van de wervelkolom te vinden en te verwijderen. Snijd het zenuwafval van elke DRG af terwijl het wordt verwijderd (meer zenuwresten in de cultuur kunnen leiden tot een slechte overleving van de cultuur). Verzamel de DRG's in 15 ml HBSS-/- in een conische buis van 15 ml op ijs.
OPMERKING: Merk op dat het weefsel in de open lucht wordt ontleed, maar zodra de DRG's aan de buis zijn toegevoegd, moeten ze als steriel worden behandeld en alleen in een bioveiligheidskast worden gemanipuleerd. - Plaats bevroren voorraden stamxyme 1 en 0,4% DNAse in een waterbad, ongeveer 30 minuten voor het einde van de dissecties (ongeveer bij het starten van de laatste muis). Laat ze op de bodem van de conische buis bezinken en zet het protocol vervolgens voort in een bioveiligheidskast.
- Zuig het grootste deel van de HBSS-/- uit de DRG's. Gebruik een pipet in plaats van zuigkracht om <1 ml vloeistof te krijgen en laat ~ 100 μL vloeistof achter om geen risico te lopen weefsel te verliezen.
- Was drie keer met 1 ml HBSS-/-. Voeg 5 ml werkende stamxyme-oplossing toe aan het weefsel. Bedek het deksel met een transparante film en laat de buis op zijn kant drijven in een waterbad dat is ingesteld op 37 °C gedurende 1 uur.
- Voeg na incubatie in het enzym 1 ml low ovo inhibitor-oplossing toe aan de buis. Trituleer de cellen voorzichtig met een p1000-pipet 10-15 keer. Laat de weefselbrokken bezinken.
- Breng de bovenste 2-3 ml oplossing (met gedissocieerde cellen) over in een verse oplossing met een laag ovomucoïde gehalte. Herhaal dit totdat het weefsel volledig is gedissocieerd en er geen zichtbare brokken overblijven.
- Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 300 x g bij kamertemperatuur. Hevel het supernatant opnieuw af, gebruik een pipet in plaats van zuigkracht voor de laatste 1 ml, waardoor ~ 100 μL overblijft, en resuspensie van de celpellet in 1 ml panningbuffer.
- Pipetter voorzichtig om te mengen. Maak een 70 μm celzeef voor met 1 ml panningbuffer over een conische buis van 50 ml. Filter de celoplossing door de celzeef.
- Was de tube met 1 ml panningbuffer en ga vervolgens door de zeef (3 ml filtraat). Leg de celsuspensie voorzichtig (1 ml per keer) op 2 ml van een 15% BSA-kussen om myelineresten te verwijderen. Een kussen van 2 ml is effectief voor twee muizen en 3 ml is effectief voor vier muizen.
- Voor gelaagdheid, plaats de 2 ml BSA in de buis, sluit en bedek de zijkanten van de buis voorzichtig met BSA. Leg vervolgens voorzichtig een laag op de celsuspensie van de bovenkant, door tegen de zijkant van de buis te pipetteren.
- Centrifugeer bij kamertemperatuur bij 300 x g gedurende 10 minuten (langzame versnelling en vertraging). Gebruik een P1000-pipet om de heldere vloeistof bovenop te verwijderen, de myelinefase ertussen en de BSA, 1 ml per keer (wisselende tips tussen elke ml). Laat ~100 μL BSA staan om de pellet niet te verstoren.
- Voeg 5 ml panningbuffer toe en incubeer de buis in een 37 °C, 10% CO 2-incubator gedurende 30-45 minuten. Dit maakt het mogelijk om antigeen op te halen. Zorg ervoor dat u de dop losmaakt om gasuitwisseling mogelijk te maken.
- Was de CD45 schaal drie keer met D-PBS. Giet de laatste spoeling eraf. Decanteer de celsuspensie in de CD45-schaal.
- Incubeer de cellen op de CD45-schaal gedurende in totaal 20 minuten bij kamertemperatuur en draai zachtjes op het 10 minutenpunt om de cellen gelijke toegang tot het antilichaam te geven.
- Spoel de PDGFRβ-schaal drie keer af met D-PBS en giet de laatste spoeling af. Breng de niet-gebonden cellen over van de CD45-schotel naar de PDGFRβ-schotel.
- Schud de CD45-schaal voorzichtig en zet hem schuin omhoog. Pipetteer voorzichtig 1 ml van de celsuspensie over de schaal om ongebonden cellen te verzamelen. Decanteer het in de PDGFRβ-schaal en pipet om de resterende celsuspensie over te brengen naar de PDGFRβ-plaat.
- Incubeer de PDGFRβ-plaat gedurende in totaal 20 minuten bij kamertemperatuur en draai zachtjes op het 10 minutenpunt om de cellen gelijke toegang tot het antilichaam te geven.
- Spoel de O4-schaal drie keer af met D-PBS en giet de laatste spoeling af. Breng de niet-gebonden cellen van de PDGFRβ-schotel over naar de O4-schotel met dezelfde methode als in stap 3.2.19. Incubeer de O4-plaat gedurende in totaal 20 minuten bij kamertemperatuur en draai zachtjes op het 10 minutenpunt om de cellen gelijke toegang tot het antilichaam te geven.
- Breng de celsuspensie over in een conische buis van 15 ml en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 300 x g. Resuspendeer de cellen in het gewenste volume en verdun 1:1 met trypan blue voor de levensvatbaarheid van de cel. Tel middelgrote tot grote cellen met een hemocytometer (dit zorgt voor de beste weergave van het aantal neuronen in de cultuur).
- Verwijder het laminine en plaats de cellen op de gewenste dichtheid. Laat de plaat niet drogen tussen het verwijderen van laminine en het plateren en voeg de cellen onmiddellijk toe.
- Kweek de gekwantificeerde cellen voor neuronale verrijking (figuur 3) met 500 neuronen in 25 μL kweekmedium (beschreven in 1.2.7) per put in 24-putplaten en incubeer bij 37 °C gedurende 30 minuten. Overspoel de putten tot een eindvolume van 500 μL.
- Dag 4: immunocytochemie (ICC) fixatie, blokkering en primaire
- Voeg na 48 uur groei 500 μL/put (of volume gelijk aan de media in de put) van 8% PFA toe gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur om de cellen te fixeren. Als media-analyse gewenst is, kan men direct fixeren met 4% PFA. We hebben dit echter niet getest.
- Was de cellen drie keer met D-PBS. Merk op dat we deze cellen maximaal 72 uur in cultuur hebben gehouden zonder mediaverandering, maar veronderstellen dat ze langer zouden kunnen overleven, vooral als de media half worden vervangen.
- Verwijder de laatste wasbeurt en voeg voldoende blokkerende oplossing per put toe om de cellen volledig te bedekken. Blok gedurende 30 minuten op kamertemperatuur. Verwijder de blokkerende oplossing en voeg primair antilichaam toe in antilichaamoplossing: β3-tubuline in een verdunning van 1:1.000. Sluit de plaat af met transparante folie en incubeer een nacht bij 4 °C.
OPMERKING: Men zou kunnen overwegen om te kleuren met PDGFRβ voor de afwezigheid van fibroblasten, CD45 voor de afwezigheid van immuuncellen, P0 of PMP22 voor de afwezigheid van myeline, of fabp7 voor satellietglia.
- Dag 5: ICC secundair
- Was de cellen drie keer met D-PBS. Verwijder de laatste wasbeurt en voeg secundaire antilichamen toe in antilichaamoplossing: anti-konijn 488 bij een verdunning van 1:500 en DAPI bij een verdunning van 1:2.000. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht.
- Was drie keer met D-PBS. Voeg voldoende D-PBS toe om de bodem van de put en de afbeelding te bedekken. De plaat kan worden afgedicht met transparante folie, beschermd tegen licht en tot 2 weken bij 4 °C worden bewaard.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De vaste cellen gekleurd met DAPI en β3-tubuline werden vervolgens in beeld gebracht met een confocaal screeningssysteem met een hoog gehalte. Beelden werden geanalyseerd met behulp van geschikte commerciële software om het percentage DAPI-positieve cellen te bepalen dat samen met β3-tubuline werd gelabeld (figuur 3). Hele DRG-culturen bleken 42,36% ± 6,4% β3-tubulinekleuring te hebben en immunogepaneerde DRG-culturen bleken 71,44% ±7,43% β3-tubulinekleuring te hebben. Dit onthult een significante toename van neuronale verrijking met immunopanning (p < 0,0001, ongepaarde t-test).
Figuur 1: Immunopanning basics. Een secundair antilichaam wordt 's nachts aan een kweekschaal gehecht en primaire antilichamen worden vervolgens geïntroduceerd. Hierdoor kunnen de cellen van belang aan de plaat worden bevestigd door een oppervlakteantigeen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Volwassen muis DRG neuron immunopanning door negatieve selectie. DRG's worden geoogst, gedissocieerd en gezeefd tot een oplossing met één cel. Myelineresten worden verwijderd door centrifugeren via een BSA-kussen. De celsuspensie wordt vervolgens over drie immunopanningschotels (CD45, PDGFRβ en O4) geleid om een cultuur te bereiken die is verrijkt voor neuronen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: DRG-cultuur neuronale verrijking door immunopanning. Vaste culturen werden gekleurd met β3-tubuline voor neuronen en DAPI voor alle kernen. (A) Representatief beeld van een hele (niet-geimmunopaneerde) cultuur. (B) Representatief beeld van een immunogepaneerde cultuur. (C) Kwantificering van β3-tubuline-positieve cellen als percentage van het totale DAPI-positieve cellen. Balken geven het gemiddelde ± standaard foutgemiddelde (SEM) aan. = p < 0,0001, ongepaarde t-toets. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit immunopanningprotocol verhoogt het aandeel neuronale cellen in drg-primaire culturen. Voor de beste resultaten moeten dissecties tijdig worden uitgevoerd en moeten DRG's worden ontdaan van overtollige zenuwen. De dissociatiestap moet zorgvuldig worden gecontroleerd en mag niet langer zijn dan 1 uur om onnodige stress te voorkomen. Met betrekking tot de immunopanning in het bijzonder, moet elke plaat halverwege voorzichtig worden gedraaid om de cellen toegang te geven tot de gecoate antilichamen. De platen moeten ook onder een kweekmicroscoop worden bekeken nadat de neuronale celsuspensie is verzameld om ervoor te zorgen dat niet-neuronale cellen zijn gebonden.
Een beperking in het gebruik van volwassen muizen is de gevestigde aard van de DRG's. Een onvermogen om alle niet-neuronale celtypen te verwijderen, laat ongeveer 30% van de cultuur als niet-neuronaal achter (figuur 3). Hoewel we de populatie van immuuncellen, fibroblasten en Schwann-cellen van de culturen kunnen dissociëren en verminderen, kunnen satellietglia buitengewoon moeilijk te dissociëren zijn van neuronen. We veronderstellen ook dat deze neuronen een slechte overleving zouden kunnen hebben zonder de metabole ondersteuning van satellietglia10. Hoewel onze poging om voor deze cellen te kleuren met behulp van GFAP mislukte vanwege slechte antilichaamspecificiteit, kan een toekomstige richting zijn om voor deze cellen te kleuren met fabp7. We hebben geprobeerd CD9-positieve niet-neuronale cellen zoals satellietglia te verwijderen bij het oplossen van problemen met dit protocol. In de CD9-plaat bleek echter dat veel neuronen aan de plaat waren bevestigd. We veronderstellen dat muisneuronen enige CD9-expressie kunnen hebben. In feite gebruikt extracellulaire vesikelliteratuur van muisneuronachtige cellen CD9 als marker11. Als een meer geschikt panning-antilichaam kan worden gevonden om het aandeel satellietglia te verminderen, zou men aanvullende suppletie met groeifactoren zoals NGF, BDNF of NT3 kunnen overwegen om het verlies van deze ondersteunende cellen tegen te gaan.
Dit immunopanningprotocol kan de nauwkeurigheid van neuronale uitlezingen van homogene DRG-cultuurmonsters verbeteren door het aandeel neuronale cellen in cultuur te vergroten. Het biedt ook een manier om DRG-neuronen van volwassen muizen te kweken, waardoor een diepgaand onderzoek van neuronale fenotypen in genetische, ziekte- en letselmuismodellen mogelijk is.
Immunopanning is ook een zeer aanpasbare tool. De celoppervlakmarker isolectine-B4 kan bijvoorbeeld worden gebruikt om specifiek te selecteren op niet-peptiderge muisnociceptoren. Immunopanning kan ook worden gebruikt om andere primaire culturen te verrijken, waaronder corticale neuronen, microglia, astrocyten en voorlopercellen van oligodendrocyten. Het is een krachtig hulpmiddel dat de toepassingen van primaire celculturen kan verbreden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door een Project Grant van de Canadian Institutes of Health Research (FRN-162434) en een Discovery Grant van de MS Society of Canada (EGID-3761). De auteurs willen Dr. Sun en het Cross Cancer Institute bedanken voor de training en het gebruik van het ImageXpress-systeem.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 um Syringe filters | Fisher | 723-2520 | |
| 100 mm petri dishes | ThermoFisher | FB0875712 | |
| 24 well black glass-bottom plates | Cellvis | P24-1.5H-N | |
| 70 um cell strainer | Cedarlane | 15-1070-1(BI) | |
| B27+ supplement | Gibco | A3582801 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A7906 | for 15% BSA cushion, and ICC (heat shock fraction ≥98%) |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A4161 | for 4% BSA for immunopanning, and SATO for media (essentially globulin free, suitable for cell culture, ≥99%) |
| CD45 antibody | BD Pharmigen | 550539 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| DMEM | Gibco | 11960069 | |
| DNAse | Worthington | LS002007 | for stemxyme solution and panning buffer |
| D-PBS | Sigma Aldrich | D8662 | |
| EBSS | Sigma Aldrich | E6267 | for DNAse solution |
| Filter paper P8 grade | ThermoFisher | 09-795K | for 8% PFA |
| Glutamax | ThermoFisher | 35050061 | |
| goat-anti-mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 115-005-020 | for O4 dish |
| goat-anti-rabbit 488 | Invitrogen | A11008 | |
| goat-anti-rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | 115-005-003 | for PDGFRB dish |
| goat-anti-rat IgG | Jackson Immunoresearch | 115-005-044 | for CD45 dish |
| HBSS -/- | Sigma Aldrich | 14175145 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I2643 | |
| laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma Aldrich | A8199 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103049 | |
| Normal Donkey Serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| O4 antibody | n/a | n/a | Hybridoma |
| Ovomucoid trypsin inhibitor | Cedarlane | LS003086 | for low ovo |
| paraformaldehyde prills | Sigma Aldrich | 441244 | for 8% PFA |
| PDGFRB antibody | Abcam | AB32570 | |
| penicillin/ streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich | P6407 | |
| Progesterone | Sigma Aldrich | P8783 | for SATO |
| Putrescine dihydrochrloride | Sigma Aldrich | P5780 | for SATO |
| Sodium phosphate dibasic | Fisher | S374-1 | for 0.2 M PB |
| Sodium Phosphate monobasic dihydrate | Sigma Aldrich | 04269 | for 0.2 M PB |
| Sodium Pyruvate | ThermoFisher | 11360070 | |
| Sodium Selenite | Sigma Aldrich | S5261 | for SATO |
| Stemxyme I | Cedarlane | LS004107 | for tissue dissociation; combination collagenase |
| Transferrin | Sigma Aldrich | T1147 | for SATO |
| Tris-HCl | Millipore Sigma | T5941 | |
| trypan blue | Gibco | 15250-061 | |
| β3-Tubulin | Sigma-Aldrich | T2200 |
References
- Haberberger, R. V., Barry, C., Dominguez, N., Matusica, D.
- Perner, C., Sokol, C. L. Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release. STAR Protocols. 2 (1), 100333 (2021).
- Lin, Y. T., Chen, J. C. Dorsal root ganglia isolation and primary culture to study neurotransmitter release. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (140), e57569 (2018).
- Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).
- Nolle, A., et al. Enrichment of Glial Cells From Human Post-mortem Tissue for Transcriptome and Proteome Analysis Using Immunopanning. Frontiers in Cellular Neuroscience. 15, 772011 (2021).
- Barres, B. A. Designing and troubleshooting immunopanning protocols for purifying neural cells. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (12), 1342-1347 (2014).
- Zuchero, J. B. Purification of dorsal root ganglion neurons from rat by immunopanning. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (8), 826-838 (2014).
- Sommer, I., Schachner, M. Monoclonal antibodies (O1 to O4) to oligodendrocyte cell surfaces: an immunocytological study in the central nervous system. Developmental Biology. 83 (2), 311-327 (1981).
- Sommer, I., Schachner, M. Cell that are O4 antigen-positive and O1 antigen-negative differentiate into O1 antigen-positive oligodendrocytes. Neuroscience Letters. 29 (2), 183-188 (1982).
- Hanani, M. Satellite glial cells in sensory ganglia: from form to function. Brain Research. Brain Research Reviews. 48 (3), 457-476 (2005).
- Viveiros, A., et al. In-cell labeling coupled to direct analysis of extracellular vesicles in the conditioned medium to study extracellular vesicles secretion with minimum sample processing and particle loss. Cells. 11 (3), 351 (2022).
