Summary
Questo articolo descrive un protocollo di immunopanning per i gangli della radice dorsale del topo adulto. Aderendo agli anticorpi alle piastre di coltura, possiamo selezionare e rimuovere negativamente le cellule non neuronali. Mostriamo che le colture sono arricchite per i neuroni utilizzando questo protocollo, consentendo uno studio approfondito delle risposte neuronali alla manipolazione.
Abstract
I gangli delle radici dorsali (DRG) sono strutture periferiche adiacenti al corno dorsale del midollo spinale, che ospitano i corpi cellulari dei neuroni sensoriali e vari altri tipi di cellule. I protocolli di coltura pubblicati spesso si riferiscono a intere colture DRG dissociate come neuronali, nonostante la presenza di fibroblasti, cellule di Schwann, macrofagi e linfociti. Mentre queste colture di DRG intere sono sufficienti per applicazioni di imaging in cui i neuroni possono essere individuati in base alla morfologia o alla colorazione, gli omogenati di proteine o RNA raccolti da queste colture non sono principalmente di origine neuronale. Qui, descriviamo una sequenza di immunopanning per DRG di topo in coltura. L'obiettivo di questo metodo è quello di arricchire le colture DRG per i neuroni rimuovendo altri tipi di cellule. L'immunopanning si riferisce a un metodo di rimozione dei tipi di cellule aderendo agli anticorpi ai piatti di coltura cellulare. Usando questi piatti, possiamo selezionare negativamente e ridurre il numero di fibroblasti, cellule immunitarie e cellule di Schwann in coltura. Questo metodo ci consente di aumentare la percentuale di neuroni nelle colture.
Introduction
I gangli delle radici dorsali (DRG) ospitano i corpi cellulari dei neuroni sensoriali che innervano i tessuti periferici. Lo studio di questi neuroni ci permette di comprendere le basi meccanicistiche del dolore e delle condizioni sensoriali. Tuttavia, i DRG non sono composti solo da neuroni, ma contengono anche fibroblasti, cellule di Schwann, macrofagi e altre cellule immunitarie1. Nonostante la presenza di questi vari tipi cellulari, intere colture di DRG sono spesso indicate in letteratura come neuronali 2,3. Queste colture sono ancora utili per l'indagine neuronale mediante imaging o citometria a flusso, che consentirebbe l'identificazione neuronale mediante colorazione, dimensione cellulare e / o morfologia. Tuttavia, per saggi come la reazione a catena della polimerasi (PCR) o il western blotting, in cui le colture sono omogeneizzate per la raccolta di RNA o proteine, la presenza di tipi di cellule non neuronali può interferire con i risultati. Quindi, vi è la necessità di aumentare la proporzione di cellule neuronali nelle colture DRG.
L'immunopanning è una tecnica utilizzata per purificare una varietà di tipi di cellule, tra cui neuroni corticali, astrociti, cellule precursori degli oligodendrociti e microglia. In parole semplici, implica l'adesione di un anticorpo contro un marcatore di superficie cellulare a una capsula di Petri, destinato a legare determinate cellule (Figura 1), e può essere utilizzato per selezionare a favore o contro i tipi di cellule di interesse 4,5,6. Immunopanning DRG embrionali di ratto da selezionare contro cellule non neuronali è stato descritto in precedenza da Zuchero7. Tuttavia, non siamo stati in grado di trovare un protocollo di immunopanning specifico per i DRG del topo. In questo protocollo, ci basiamo sui tenant di base del protocollo Zuchero, ma invece abbiamo adattato la sequenza immunopanning per arricchire le colture DRG di topo adulto (Figura 2). Questo è un potente strumento per studiare i neuroni sensoriali stabiliti nella cultura. È vantaggioso in quanto consente l'uso di topi adulti da modelli genetici, di malattia e di lesione, in modo che i loro neuroni sensoriali possano essere studiati con maggiore specificità.
Questo protocollo è vantaggioso per i lettori che cercano di aumentare la proporzione di neuroni nelle colture DRG di topo adulto. Tuttavia, le fasi di immunopanning possono anche essere omesse e questo protocollo può essere utilizzato anche per intere colture DRG.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti con l'approvazione del Comitato per la cura e l'uso degli animali delle scienze della salute dell'Università di Alberta (protocollo 0000274).
1. Preparazione del reagente
- Per il giorno 1, preparare i seguenti reagenti: acqua per coltura cellulare; poli-D-lisina-preparare un materiale madre ricostituendo l'intera bottiglia in 50 mL di acqua per coltura fino a una concentrazione di 100 μg/ml, conservare a 4 °C e diluire il brodo 1:10 in acqua di coltura fino a una concentrazione finale di 10 μg/ml; tris-HCl-preparare un materiale di riserva sciogliendo il tris cloridrato in polvere in acqua di coltura fino a raggiungere una concentrazione di 500 mM (3,94 g in 50 ml), pH 9,5, sterilizzare con filtro (0,22 μm), conservare a 4 °C e diluire il materiale madre 1:10 in acqua di coltura fino a una concentrazione finale di 50 mM; anticorpi secondari (capra anti-ratto, -coniglio e -topo).
- Per il giorno 2, preparare i seguenti reagenti.
- Preparare la soluzione salina bilanciata di Hank di grado Ca 2+, senza Mg2+ (HBSS; HBSS-/-), e soluzione salina tamponata con fosfato D di grado di coltura cellulare (PBS) con Ca 2+ e Mg2+. Preparare un'aliquota di riserva di laminina e conservare a -80 °C immediatamente dopo la ricezione; diluire il materiale madre in HBSS-/- sterile fino ad una concentrazione finale di 10 μg/mL per il materiale di lavorazione.
- Preparare il 4% di sieroalbumina bovina (BSA) sciogliendo 400 mg di BSA in 7,5 mL di D-PBS (pH 7,4), portare il volume a 10 mL, sterilizzare il filtro (0,22 μm), aliquote e conservare a -20 °C. Preparare lo 0,2% di BSA diluendo 750 μL di BSA al 4% in 14,25 mL di D-PBS.
- Preparare lo 0,4% di scorte di DNAse aggiungendo 1 mL di soluzione salina bilanciata (EBSS) di Earle per 12.500 unità di DNAse, sterilizzare con filtro (0,22 μm), aliquote e conservare a -20 °C. Preparare il tampone di panning (0,02% BSA) aggiungendo 3 ml di BSA allo 0,2% e 100 μL di DNAsi allo 0,4% in 27 ml di D-PBS. Preparare anticorpi primari (CD45, PDGRFβ, O4).
NOTA: Questo protocollo utilizza un ibridoma O48,9, tuttavia, 10 μg di un anticorpo O4 disponibile in commercio sarebbero anche appropriati. - Preparare il brodo di collagenasi di associazione sciogliendo un flacone di collagenasi di associazione (50 mg) in 5 mL di HBSS-/-, aliquota e conservare a -20 °C. Preparare uno stock di lavoro per due topi aggiungendo 500 μL di collagenasi combinata riscaldata e 50 μL di DNasi riscaldata allo 0,4% a 4,5 mL di HBSS-/-.
- Preparare ovomucoidi bassi aggiungendo 3 g di BSA a 150 ml di D-PBS, quindi aggiungere 3 g di inibitore della tripsina e mescolare per sciogliere. Regolare il pH a 7,4 e portare il volume fino a 200 ml con D-PBS. Sterilizzare con il filtro, preparare 1 mL di aliquote e conservare a -20 °C. Il giorno della dissezione, combinare 1 mL di ovomucoide basso in 9 mL di D-PBS per la soluzione di lavoro.
- Preparare il 15% di BSA sciogliendo 7,5 g di BSA in 50 mL di HBSS-/- (porre su uno shaker per sciogliere completamente), sterilizzare il filtro e conservare a 4 °C.
- Preparare 50 mL di media neuronale aggiungendo 23,2 mL di DMEM, 23,2 mL di mezzo neurobasale, 500 μL di glutamax, 500 μL di piruvato di sodio, 500 μL di penicillina/streptomicina (aliquota immediatamente all'arrivo e conservare a -20 °C), 500 μL di insulina (5 μg/mL finale), 500 μL di SATO, 50 μL di N-acetil-L-cisteina (NAC; 5 μg/mL finale), e 1.000 μL di B27+ (aliquota immediata e conservare a -20 °C al momento della ricezione).
- Preparare il brodo di insulina sciogliendolo in acqua di coltura ad una concentrazione di 0,5 mg/ml (50 mg in 100 ml), regolare il pH a 7,4, sterilizzare il filtro (0,22 μm), preparare 500 μL di aliquote e conservare a -20 °C.
- Preparare lo stock SATO combinando 20 μL di progesterone (2,5 mg in 100 μL di etanolo), 800 μL di selenito di sodio (4 mg in 10 mL di terreno neurobasale + 10 μL di 1 N NaOH), 800 mg di BSA, 800 mg di transferrina, 128 mg di putrescina dicloridrato e 80 mL di neurobasale. Sterilizzare con filtro (0,22 μm), preparare aliquote da 500 μL e conservare a -20 °C. È essenziale preparare soluzioni fresche di progesterone e selenito di sodio.
- Preparare 50 μL di N-acetil-L-cisteina (NAC) sciogliendo in mezzo neurobasale fino a una concentrazione di 5 mg/ml (50 mg in 10 ml), sterilizzare con filtro (0,22 μm), aliquote e conservare a -20 °C.
- Per i giorni 4 e 5, preparare i seguenti reagenti.
- Preparare un tampone fosfato 0,2 M (PB) sciogliendo 21,8 g di fosfato bibasico di sodio (Na 2 HPO 4) e 8,34 g di fosfato monobasico diidrato di sodio(NaH2PO4) in 1.000 ml di acqua. Regolare il pH a 7,4 e conservare a temperatura ambiente.
- Preparare la paraformaldeide (PFA) all'8% come segue: in una cappa aspirante, riscaldare 50 ml di acqua a 55 °C, spegnere il fuoco e aggiungere 8 g di granuli PFA, mescolando continuamente. Aggiungere 1 N NaOH goccia a goccia fino a quando la soluzione inizia a schiarirsi, quindi aggiungere 40 mL di 0,2 M PB e continuare a mescolare fino a quando non è limpido. Raffreddare la soluzione a temperatura ambiente, regolare il pH a 7,4 e portare il volume a 100 ml con 0,2 M PB. Filtrare e conservare a 4 °C per un massimo di 2 settimane.
- Preparare D-PBS + Triton X-100 (PBSTX) aggiungendo lo 0,2% di Triton X-100 in grado di coltura D-PBS (1 mL di Triton + 500 mL di D-PBS). Conservare a 4 °C. Preparare la soluzione di blocco, che è siero d'asino normale all'1% (NDS) in PBSTX. In anticipo, 1 mL di NDS + 9 mL di PBSTX possono essere preparati e conservati a -20 °C in aliquote da 10 ml.
- Preparare la soluzione anticorpale che è 0,2% NDS / 0,2% BSA in PBSTX : 200 μL di NDS + 200 mg BSA + 9,6 mL di PBSTX; può essere preparato in anticipo e conservato a -20 °C in aliquote da 10 ml.
2. Configurazione dell'attrezzatura
- Installare le seguenti apparecchiature: armadio di biosicurezza per colture cellulari sterili, set di micropipette, pipette sierologiche e pistola per pipette, piastre di Petri da 10 cm, piastre di coltura cellulare desiderate per la placcatura (qui sono state utilizzate piastre con fondo in vetro nero a 24 pozzetti per l'imaging), tubi conici da 15 ml e 50 ml, strumenti di dissezione (vale a dire: forbici a molla fine per laminectomia e taglio nervoso, pinze sottili, e una lama di rasoio), bagnomaria a 37 °C, filtro cellulare da 70 μm, centrifuga (10 min a 300 x g) con adattatori per tubi conici da 15 ml, blu tripano ed emocitometro, cappa aspirante e piastra riscaldante magnetica.
3. Metodo sperimentale
- Giorno 1: preparazione dei piatti
- In un armadio di biosicurezza, rivestire la superficie di coltura desiderata con abbastanza poli-D-lisina per coprire il fondo del pozzetto. Conservare per una notte a 4 °C. Qui, per l'imaging sono state utilizzate lastre con fondo di vetro a 24 pozzetti e quindi sono stati utilizzati 300 μL di poli-D-lisina.
- In un armadio di biosicurezza, preparare i piatti di panning: per il piatto CD45, aggiungere 10 ml di soluzione tris-HCl funzionante e 30 μL di IgG anti-ratto di capra in una capsula di Petri da 10 cm; per il piatto PDGFRβ, aggiungere 10 ml di soluzione di tris-HCl funzionante e 30 μL di IgG anti-coniglio di capra in una capsula di Petri da 10 cm; per il piatto di ibridoma O4, aggiungere 10 ml di soluzione tris-HCl funzionante e 30 μL di IgG anti-topo di capra in una capsula di Petri da 10 cm. Assicurarsi che la soluzione copra l'intera area del piatto e lasciare a 4 °C durante la notte.
- Giorno 2: dissezione, triturazione e immunopanning
- Aspirare la poli-D-lisina, lavare le piastre tre volte con acqua di coltura tissutale, aprire il coperchio e lasciare asciugare completamente la superficie in un armadio di biosicurezza. Applicare una quantità sufficiente di laminina sulle piastre per rivestire il fondo di ciascun pozzetto e metterle in un'incubatrice a 37 °C. Per le piastre a 24 pozzetti sono sufficienti 200 μL.
- Finisci di preparare i piatti panoramici. Lavare ogni piatto con D-PBS e incubare con 10 μg di anticorpo primario. Lasciare riposare a temperatura ambiente per almeno 2 ore.
- Per il piatto CD45, aggiungere 5 ml di BSA allo 0,2% e 20 μL di CD45 primario; per il piatto PDGFRβ, aggiungere 5 mL di BSA allo 0,2% e 15,4 μL di PDGFRβ; per la capsula O4, aggiungere 3 ml di BSA allo 0,2%, 2 ml di ibridoma O4 e altri 100 μL di BSA al 4% (per garantire che la concentrazione finale di BSA rimanga allo 0,2%).
- Eutanasia da uno a quattro topi usando 0,1 mL/kg di pentobarbitolo di sodio (per piatto immunopanning da 10 cm). Abbiamo usato topi C57BL / 6 a 8-10 settimane di età. Entrambi i sessi sono stati usati e coltivati separatamente l'uno dall'altro. Perfondere l'animale con 30 ml di soluzione salina fredda allo 0,9%.
- Appuntare le zampe anteriori e posteriori a uno stadio di polistirolo e utilizzare una lama di rasoio pulita per esporre la colonna vertebrale dal retro. Eseguire una laminectomia facendo tagli circa a metà strada profonda su entrambi i lati della colonna vertebrale dorsale, rimuovendo la metà dorsale della colonna, per esporre il midollo spinale. Tagliare delicatamente i nervi e rimuovere il midollo spinale, o spingere delicatamente il cavo di lato, mantenendo l'integrità del nervo.
- Utilizzare le radici nervose spinali (recise o attaccate al midollo spinale) per trovare e rimuovere tutti i DRG da entrambi i lati della colonna vertebrale. Tagliare i detriti nervosi da ciascun DRG mentre viene rimosso (più detriti nervosi nella coltura possono portare a una scarsa sopravvivenza della cultura). Raccogliere i DRG in 15 mL di HBSS-/- in un tubo conico da 15 mL su ghiaccio.
NOTA: Si noti che il tessuto viene sezionato all'aria aperta, ma una volta aggiunti i DRG al tubo devono essere trattati come sterili e manipolati solo in un armadio di biosicurezza. - Mettere le scorte congelate di stemxyme 1 e 0,4% DNAse a bagnomaria, circa 30 minuti prima della fine delle dissezioni (all'incirca quando si avvia l'ultimo topo). Lasciare che si depositino sul fondo del tubo conico, quindi continuare il protocollo in un armadio di biosicurezza.
- Aspirare la maggior parte dell'HBSS-/- dai DRG. Utilizzare una pipetta piuttosto che aspirare per ottenere <1 ml di liquido e lasciare ~ 100 μL di liquido in modo da non rischiare di perdere tessuto.
- Lavare tre volte con 1 mL di HBSS-/-. Aggiungere 5 ml di soluzione di stelo funzionante al tessuto. Coprire il coperchio con una pellicola trasparente e far galleggiare il tubo su un lato a bagnomaria impostato a 37 °C per 1 ora.
- Dopo l'incubazione nell'enzima, aggiungere 1 mL di soluzione a basso inibitore ovo al tubo. Triturare delicatamente le cellule con una pipetta p1000 10-15 volte. Lasciare che i pezzi di tessuto si depositino.
- Trasferire i primi 2-3 mL di soluzione (contenenti cellule dissociate) in una soluzione ovomucoide fresca a basso contenuto di ovomucoidi. Ripetere fino a quando il tessuto è completamente dissociato e non rimangono pezzi visibili.
- Centrifugare per 10 min a 300 x g a temperatura ambiente. Sifonare nuovamente il surnatante usando una pipetta anziché aspirare per l'ultimo 1 ml, lasciando ~100 μL, e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di tampone di panning.
- Pipettare delicatamente per mescolare. Pre-bagnare un filtro cellulare da 70 μm con 1 mL di tampone panoramico su un tubo conico da 50 ml. Filtrare la soluzione cellulare attraverso il filtro cellulare.
- Lavare il tubo con 1 mL di tampone panoramico, quindi passare attraverso il filtro (3 mL di filtrato). Sovrapporre delicatamente la sospensione cellulare (1 mL alla volta) sopra 2 mL di un cuscino BSA al 15% per rimuovere i residui di mielina. Un cuscino da 2 ml è efficace per due topi e 3 ml è efficace per quattro topi.
- Per la stratificazione, posizionare i 2 ml di BSA nel tubo, chiudere e rivestire delicatamente i lati del tubo con BSA. Quindi, stratificare delicatamente la sospensione cellulare della parte superiore, mediante pipettaggio contro il lato del tubo.
- Centrifugare a temperatura ambiente a 300 x g per 10 minuti (accelerazione e decelerazione lente). Utilizzare una pipetta P1000 per rimuovere il liquido trasparente sulla parte superiore, la fase mielinica intermedia e la BSA, 1 mL alla volta (cambiando le punte tra ogni mL). Lasciare ~100 μL di BSA per non disturbare il pellet.
- Aggiungere 5 ml di tampone panoramico e incubare il tubo in un incubatore a 37 °C, 10% CO2 per 30-45 minuti. Ciò consente il recupero dell'antigene. Assicurati di allentare il tappo per consentire lo scambio di gas.
- Lavare il piatto CD45 tre volte con D-PBS. Versare il risciacquo finale. Decantare la sospensione cellulare nel piatto CD45.
- Incubare le cellule sul piatto CD45 per un totale di 20 minuti a temperatura ambiente, roteando delicatamente al punto di 10 minuti per consentire alle cellule un accesso uguale all'anticorpo.
- Risciacquare il piatto PDGFRβ tre volte con D-PBS e versare il risciacquo finale. Trasferire le cellule non legate dal piatto CD45 al piatto PDGFRβ.
- Agitare delicatamente il piatto CD45 e appoggiarlo ad angolo. Pipettare delicatamente 1 mL della sospensione cellulare sul piatto per raccogliere le cellule non legate. Decantare nel piatto PDGFRβ e pipetta per trasferire la sospensione cellulare rimanente sulla piastra PDGFRβ.
- Incubare la piastra PDGFRβ per un totale di 20 minuti a temperatura ambiente, ruotando delicatamente al punto di 10 minuti per consentire alle cellule un accesso uguale all'anticorpo.
- Risciacquare il piatto O4 tre volte con D-PBS e versare il risciacquo finale. Trasferire le celle non legate dal piatto PDGFRβ al piatto O4 usando lo stesso metodo del punto 3.2.19. Incubare la piastra di O4 per un totale di 20 minuti a temperatura ambiente, roteando delicatamente al punto di 10 minuti per consentire alle cellule un accesso uguale all'anticorpo.
- Trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 mL e centrifugare per 10 minuti a 300 x g. Risospendere le cellule nel volume desiderato e diluire 1:1 con tripano blu per la vitalità cellulare. Contare le cellule medio-grandi con un emocitometro (questo consentirà la migliore rappresentazione del numero di neuroni nella coltura).
- Rimuovere la laminina e placcare le cellule alla densità desiderata. Non lasciare asciugare la piastra tra la rimozione della laminina e la placcatura e aggiungere immediatamente le cellule.
- Coltura delle cellule quantificate per l'arricchimento neuronale (Figura 3) con 500 neuroni in 25 μL di terreno di coltura (descritto in 1.2.7) per pozzetto in piastre da 24 pozzetti e incubazione a 37 °C per 30 minuti. Inondare i pozzi fino a un volume finale di 500 μL.
- Giorno 4: fissazione immunocitochimica (ICC), blocco e primaria
- Dopo 48 ore di crescita, aggiungere 500 μL/pozzetto (o volume equivalente al mezzo nel pozzetto) di PFA all'8% per 15 minuti a temperatura ambiente per fissare le cellule. Se si desidera l'analisi dei media, si può risolvere direttamente con il 4% di PFA. Tuttavia, non abbiamo testato questo.
- Lavare le cellule con D-PBS tre volte. Nota, abbiamo tenuto queste cellule in coltura senza cambio di terreno per un massimo di 72 ore, ma ipotizziamo che potrebbero sopravvivere più a lungo, in particolare se il mezzo è cambiato a metà.
- Rimuovere il lavaggio finale e aggiungere una soluzione bloccante sufficiente per pozzetto per coprire completamente le cellule. Bloccare per 30 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere la soluzione bloccante e aggiungere l'anticorpo primario nella soluzione anticorpale: β3-tubulina ad una diluizione 1:1.000. Sigillare la piastra con pellicola trasparente e incubare per una notte a 4 °C.
NOTA: Si potrebbe considerare la colorazione con PDGFRβ per l'assenza di fibroblasti, CD45 per l'assenza di cellule immunitarie, P0 o PMP22 per l'assenza di mielina o fabp7 per la glia satellita.
- Giorno 5: ICC secondario
- Lavare le cellule con D-PBS tre volte. Rimuovere il lavaggio finale e aggiungere anticorpi secondari nella soluzione anticorpale: anti-coniglio 488 a una diluizione 1:500 e DAPI a una diluizione 1:2.000. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente, al riparo dalla luce.
- Lavare con D-PBS tre volte. Aggiungi abbastanza D-PBS per coprire il fondo del pozzo e l'immagine. La piastra può essere sigillata con pellicola trasparente, protetta dalla luce e conservata a 4 °C per un massimo di 2 settimane.
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Representative Results
Le cellule fisse colorate con DAPI e β3-tubulina sono state quindi visualizzate con un sistema di screening confocale ad alto contenuto. Le immagini sono state analizzate utilizzando un software commerciale adatto per determinare la percentuale di cellule DAPI-positive che hanno co-marcato con β3-tubulina (Figura 3). Le colture DRG intere sono state determinate per avere il 42,36% ± il 6,4% di colorazione β3-tubulina e le colture di DRG immunopannate sono state determinate per avere il 71,44% ±7,43% di colorazione β3-tubulina. Ciò rivela un aumento significativo dell'arricchimento neuronale con immunopanning (p < 0,0001, test t spaiato).
Figura 1: Nozioni di base sull'immunopanning. Un anticorpo secondario viene aderito a un piatto di coltura durante la notte e vengono quindi introdotti anticorpi primari. Ciò consente alle cellule di interesse di essere attaccate alla piastra da un antigene di superficie. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Immunopanning del neurone DRG del topo adulto mediante selezione negativa. I DRG vengono raccolti, dissociati e filtrati in una soluzione a singola cellula. I detriti di mielina vengono rimossi mediante centrifugazione attraverso un cuscino BSA. La sospensione cellulare viene quindi fatta passare attraverso tre piastre immunopanning (CD45, PDGFRβ e O4) per ottenere una coltura arricchita per i neuroni. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Arricchimento neuronale della coltura DRG mediante immunopanning. Le colture fisse sono state colorate con β3-tubulina per i neuroni e DAPI per tutti i nuclei. (A) Immagine rappresentativa di un'intera coltura (non immunoprotetta). (B) Immagine rappresentativa di una coltura immunopedica. (C) Quantificazione delle cellule β3-tubulina-positive come percentuale delle cellule DAPI-positive totali. Le barre indicano la media ± la media dell'errore standard (SEM). = p < 0,0001, test t non accoppiato. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
Questo protocollo di immunopanning aumenta la proporzione di cellule neuronali nelle colture primarie di DRG. Per i migliori risultati, le dissezioni dovrebbero essere eseguite in modo tempestivo e i DRG dovrebbero essere tagliati dai nervi in eccesso. La fase di dissociazione deve essere attentamente monitorata e non deve superare 1 ora, per evitare che le cellule subiscano stress inutili. Per quanto riguarda specificamente l'immunopanning, ogni piastra deve essere ruotata delicatamente a metà strada per consentire alle cellule di avere accesso agli anticorpi rivestiti. Le piastre dovrebbero anche essere visualizzate al microscopio di coltura dopo che la sospensione di cellule neuronali è stata raccolta per garantire che le cellule non neuronali si siano legate.
Una limitazione nell'uso di topi adulti è la natura consolidata dei DRG. L'incapacità di rimuovere tutti i tipi di cellule non neuronali lascia circa il 30% della coltura come non neuronale (Figura 3). Mentre possiamo dissociare e ridurre la popolazione di cellule immunitarie, fibroblasti e cellule di Schwann dalle colture, la glia satellite può essere estremamente difficile da dissociare dai neuroni. Ipotizziamo anche che questi neuroni potrebbero avere una scarsa sopravvivenza senza il supporto metabolico fornito dalla glia satellite10. Mentre il nostro tentativo di colorare queste cellule usando GFAP è fallito a causa della scarsa specificità anticorpale, una direzione futura potrebbe essere quella di colorare queste cellule usando fabp7. Abbiamo tentato di rimuovere le cellule non neuronali CD9-positive come la glia satellite durante la risoluzione dei problemi di questo protocollo. Tuttavia, nella piastra CD9, è stato riscontrato che molti neuroni erano attaccati alla piastra. Ipotizziamo che i neuroni di topo possano avere qualche espressione di CD9. Infatti, la letteratura sulle vescicole extracellulari da cellule simili a neuroni di topo impiega CD9 come marcatore11. Se si potesse trovare un anticorpo panning più adatto per ridurre la proporzione di glia satellita, si potrebbe prendere in considerazione un'ulteriore integrazione con fattori di crescita come NGF, BDNF o NT3 per contrastare la perdita di queste cellule di supporto.
Questo protocollo di immunopanning può migliorare l'accuratezza delle letture neuronali da campioni di colture DRG omogenee aumentando la percentuale di cellule neuronali in coltura. Fornisce inoltre una via per la coltura di neuroni DRG di topo adulto, consentendo un'indagine approfondita dei fenotipi neuronali in modelli murini genetici, di malattia e di lesioni.
L'immunopanning è anche uno strumento altamente personalizzabile. Ad esempio, il marcatore della superficie cellulare isolectina-B4 potrebbe essere impiegato per selezionare specificamente i nocicettori di topo non peptidergici. L'immunopanning può anche essere utilizzato per arricchire altre colture primarie, tra cui neuroni corticali, microglia, astrociti e cellule precursori degli oligodendrociti. È un potente strumento che può ampliare le applicazioni delle colture cellulari primarie.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da un Project Grant del Canadian Institutes of Health Research (FRN-162434) e da un Discovery Grant della MS Society of Canada (EGID-3761). Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Sun e il Cross Cancer Institute per la formazione e l'uso del sistema ImageXpress.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 um Syringe filters | Fisher | 723-2520 | |
| 100 mm petri dishes | ThermoFisher | FB0875712 | |
| 24 well black glass-bottom plates | Cellvis | P24-1.5H-N | |
| 70 um cell strainer | Cedarlane | 15-1070-1(BI) | |
| B27+ supplement | Gibco | A3582801 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A7906 | for 15% BSA cushion, and ICC (heat shock fraction ≥98%) |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A4161 | for 4% BSA for immunopanning, and SATO for media (essentially globulin free, suitable for cell culture, ≥99%) |
| CD45 antibody | BD Pharmigen | 550539 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| DMEM | Gibco | 11960069 | |
| DNAse | Worthington | LS002007 | for stemxyme solution and panning buffer |
| D-PBS | Sigma Aldrich | D8662 | |
| EBSS | Sigma Aldrich | E6267 | for DNAse solution |
| Filter paper P8 grade | ThermoFisher | 09-795K | for 8% PFA |
| Glutamax | ThermoFisher | 35050061 | |
| goat-anti-mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 115-005-020 | for O4 dish |
| goat-anti-rabbit 488 | Invitrogen | A11008 | |
| goat-anti-rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | 115-005-003 | for PDGFRB dish |
| goat-anti-rat IgG | Jackson Immunoresearch | 115-005-044 | for CD45 dish |
| HBSS -/- | Sigma Aldrich | 14175145 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I2643 | |
| laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma Aldrich | A8199 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103049 | |
| Normal Donkey Serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| O4 antibody | n/a | n/a | Hybridoma |
| Ovomucoid trypsin inhibitor | Cedarlane | LS003086 | for low ovo |
| paraformaldehyde prills | Sigma Aldrich | 441244 | for 8% PFA |
| PDGFRB antibody | Abcam | AB32570 | |
| penicillin/ streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich | P6407 | |
| Progesterone | Sigma Aldrich | P8783 | for SATO |
| Putrescine dihydrochrloride | Sigma Aldrich | P5780 | for SATO |
| Sodium phosphate dibasic | Fisher | S374-1 | for 0.2 M PB |
| Sodium Phosphate monobasic dihydrate | Sigma Aldrich | 04269 | for 0.2 M PB |
| Sodium Pyruvate | ThermoFisher | 11360070 | |
| Sodium Selenite | Sigma Aldrich | S5261 | for SATO |
| Stemxyme I | Cedarlane | LS004107 | for tissue dissociation; combination collagenase |
| Transferrin | Sigma Aldrich | T1147 | for SATO |
| Tris-HCl | Millipore Sigma | T5941 | |
| trypan blue | Gibco | 15250-061 | |
| β3-Tubulin | Sigma-Aldrich | T2200 |
References
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- Perner, C., Sokol, C. L. Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release. STAR Protocols. 2 (1), 100333 (2021).
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