Summary
이 논문은 성인 마우스 후근 신경절에 대한 면역 패닝 프로토콜을 설명합니다. 배양 플레이트에 항체를 부착함으로써 비신경 세포를 음성으로 선택하고 제거할 수 있습니다. 우리는 이 프로토콜을 사용하여 뉴런에 대한 배양이 풍부해짐을 보여주며, 조작에 대한 뉴런 반응에 대한 심층 연구를 가능하게 합니다.
Abstract
등근 신경절(DRG)은 척수의 등쪽 뿔에 인접한 말초 구조로, 감각 뉴런의 세포체와 다양한 기타 세포 유형을 수용합니다. 공개된 배양 프로토콜은 종종 섬유아세포, 슈반 세포, 대식세포 및 림프구의 존재에도 불구하고 전체 해리된 DRG 배양을 뉴런으로 언급합니다. 이러한 전체 DRG 배양은 형태 또는 염색을 기반으로 뉴런을 식별할 수 있는 이미징 응용 분야에 충분하지만, 이러한 배양에서 수집된 단백질 또는 RNA 균질액은 주로 뉴런 기원이 아닙니다. 여기서는 배양된 마우스 DRG에 대한 면역패닝 서열을 설명합니다. 이 방법의 목표는 다른 세포 유형을 제거하여 뉴런에 대한 DRG 배양을 풍부하게 하는 것입니다. 면역패닝은 항체를 세포배양접시에 부착시켜 세포형을 제거하는 방법을 말한다. 이 접시를 사용하여 우리는 배양에서 섬유아세포, 면역 세포 및 슈반 세포의 수를 부정적으로 선택하고 줄일 수 있습니다. 이 방법을 사용하면 배양에서 뉴런의 비율을 높일 수 있습니다.
Introduction
등근 신경절(DRG)은 말초 조직을 자극하는 감각 뉴런의 세포체를 수용합니다. 이러한 뉴런을 연구하면 통증과 감각 상태의 기계론적 토대를 이해할 수 있습니다. 그러나 DRG는 뉴런만으로 구성되는 것이 아니라 섬유아세포, 슈반 세포, 대식세포 및 기타 면역 세포도 포함합니다1. 이러한 다양한 세포 유형의 존재에도 불구하고, 전체 DRG 배양물은 종종 문헌에서 뉴런 2,3으로 지칭된다. 이러한 배양은 이미징 또는 유세포 분석에 의한 신경 세포 조사에 여전히 유용하며, 이를 통해 염색, 세포 크기 및/또는 형태에 의한 신경 식별이 가능합니다. 그러나 RNA 또는 단백질 수집을 위해 배양물을 균질화하는 중합효소연쇄반응(PCR) 또는 웨스턴 블로팅과 같은 분석의 경우 비뉴런 세포 유형의 존재가 결과를 방해할 수 있습니다. 따라서 DRG 배양에서 신경 세포의 비율을 증가시킬 필요가 있습니다.
면역패닝은 피질 뉴런, 성상교세포, 희소돌기아교세포 전구체 세포 및 미세아교세포를 포함한 다양한 세포 유형을 정제하는 데 사용되는 기술입니다. 간단히 말해서, 특정 세포에 결합하기 위한 페트리 접시에 세포 표면 마커에 대한 항체를 부착하는 것을 포함하며(그림 1), 관심 있는 세포 유형을 선택하거나 반대하는 데 사용할 수 있습니다 4,5,6. 비뉴런 세포에 대해 선택하기 위한 면역패닝 쥐 배아 DRG는 이전에 Zuchero7에 의해 설명되었습니다. 그러나 마우스 DRG에 특정한 면역패닝 프로토콜을 찾을 수 없었습니다. 이 프로토콜에서 우리는 Zuchero 프로토콜의 기본 테넌트를 기반으로 하지만 대신 면역 패닝 서열을 조정하여 성인 마우스 DRG 배양을 풍부하게 했습니다(그림 2). 이것은 배양에서 확립된 감각 뉴런을 연구하는 강력한 도구입니다. 유전, 질병 및 손상 모델의 성인 마우스를 사용할 수 있으므로 감각 뉴런을 더 특이적으로 연구할 수 있으므로 유리합니다.
이 프로토콜은 성인 마우스 DRG 배양에서 뉴런의 비율을 증가시키려는 독자에게 유리합니다. 그러나, 면역패닝 단계는 또한 생략될 수 있고, 이 프로토콜은 또한 전체 DRG 배양에 사용될 수 있다.
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Protocol
모든 동물 실험은 앨버타 대학교 보건 과학 동물 관리 및 사용 위원회(프로토콜 0000274)의 승인을 받아 수행되었습니다.
1. 시약 준비
- 1일째 되는 날, 다음의 시약을 준비한다: 세포 배양 등급 물; 폴리-D-라이신-배양 등급 물 50mL에 전체 병을 100μg/mL의 스톡 농도로 재구성하여 스톡을 준비하고, 4°C에서 저장하고, 스톡 1:10을 배양 등급 물에 10μg/mL의 최종 농도로 희석합니다. 트리스-HCl-분말 트리스 하이드로클로라이드를 500 mM(50 mL 중 3.94 g)의 스톡 농도로 배양 등급 물에 용해시켜 스톡을 제조하고, pH 9.5, 필터 멸균(0.22 μm), 4°C에서 저장하고, 스톡을 배양 등급 물에 1:10으로 최종 농도 50 mM로 희석하고; 2차 항체(염소 항쥐, 토끼 및 쥐).
- 2일차에는 다음 시약을 준비합니다.
- 세포 배양 등급 Ca2+,Mg2+가 없는 행크의 균형 잡힌 염 용액(HBSS; HBSS-/-), 및Ca2+ 및Mg2+를 갖는 세포 배양 등급 D-포스페이트 완충 식염수(PBS). 라미닌 스톡 분취액을 제조하고, 수령 즉시 -80°C에서 보관하고; 작업 재고를 위해 멸균 HBSS-/-의 재고를 최종 농도 10μg/mL로 희석합니다.
- 400mg의 BSA를 7.5mL의 D-PBS(pH 7.4)에 용해시켜 4% 소혈청알부민(BSA) 스톡을 준비하고, 부피를 10mL로 가져오고, 필터 멸균(0.22μm), 분취액을 측정하고, -20°C에서 보관한다. 14.25mL의 D-PBS에 4% BSA 750μL를 희석하여 0.2% BSA를 준비합니다.
- DNAse 12,500 단위당 Earle's balanced salt solution(EBSS) 1mL를 첨가하여 0.4% DNAse 스톡을 준비하고, 필터 멸균(0.22μm), 분취액을 추출하고, -20°C에서 보관합니다. 27mL의 D-PBS에 3mL의 0.2% BSA와 100μL의 0.4% DNAse를 추가하여 패닝 완충액(0.02% BSA)을 준비합니다. 1차 항체(CD45, PDGRFβ, O4)를 준비합니다.
참고: 이 프로토콜은 O4 하이브리도마 8,9를 사용하지만 상업적으로 이용 가능한 O4 항체 10μg도 적절합니다. - 조합 콜라게나제(50mg)를 HBSS-/-, 분취액 5mL에 용해시켜 조합 콜라게나제 스톡을 준비하고 -20°C에서 보관합니다. 4.5mL의 HBSS-/-에 500μL의 가온된 조합 콜라게나제와 50μL의 가온된 0.4% DNase를 첨가하여 마우스 2마리당 작업 스톡을 준비합니다.
- D-PBS 150mL에 BSA 3g을 첨가하여 저오보뮤코이드를 준비한 후 트립신 억제제 3g을 첨가하여 혼합하여 용해시킨다. pH를 7.4로 조정하고 D-PBS를 사용하여 부피를 최대 200mL로 가져옵니다. 필터 멸균, 1mL 분취량을 준비하고, -20°C에서 보관한다. 해부 당일, 9mL의 D-PBS에 1mL의 저 오보뮤코이드를 합쳐 작업 용액을 만듭니다.
- 50mL의 HBSS-/-에 7.5g의 BSA를 용해시켜 15% BSA를 준비하고(완전히 용해되도록 셰이커에 올려놓음), 여과 멸균하고, 4°C에서 보관합니다.
- DMEM 23.2mL, Neurobasal 배지 23.2mL, 글루타맥스 500μL, 피루브산나트륨 500μL, 페니실린/스트렙토마이신 500μL(도착 즉시 분취 및 -20°C에서 보관), 인슐린 500μL(최종 5μg/mL), SATO 500μL, N-아세틸-L-L-시스테인(NAC, 최종 5μg/mL), 및 1,000 μL의 B27+(즉시 분취 및 수령 시 -20°C에서 보관).
- 0.5mg/mL(100mL에 50mg) 농도의 배양 등급수에 용해시켜 인슐린 스톡을 준비하고, pH를 7.4로 조정하고, 필터 멸균(0.22μm)하고, 500μL 분취액을 준비하고, -20°C에서 보관합니다.
- 프로게스테론 20μL(에탄올 100μL에 2.5mg), 아셀렌산나트륨 800μL(신경기저 배지 10mL에 4mg + 1N NaOH 10μL), BSA 800mg, 트랜스페린 800mg, 퓨트레신 이염산염 128mg 및 신경기저 80mL를 혼합하여 SATO 스톡을 준비합니다. 필터 멸균(0.22 μm), 분취량 500 μL를 준비하고, -20 °C에서 보관한다. 신선한 프로게스테론과 아셀렌 산 나트륨 용액을 만드는 것이 필수적입니다.
- 5mg/mL(10mL 중 50mg)의 스톡 농도로 neurobasal 배지에 용해하여 50μL의 N-아세틸-L-시스테인(NAC) 스톡을 준비하고, 필터 멸균(0.22μm), 분취액을 추출하고, -20°C에서 보관합니다.
- 4일차와 5일차에는 다음 시약을 준비합니다.
- 21.8g의 인산나트륨 이염기성(Na2HPO4)과 8.34g의 인산나트륨 일염기성 이수화물(NaH2PO4)을 1,000mL의 물에 용해시켜 0.2M 인산완충액(PB)을 준비한다. pH를 7.4로 조정하고 실온에서 보관하십시오.
- 다음과 같이 8 % 파라 포름 알데히드 (PFA)를 준비하십시오 : 흄 후드에서 물 50mL를 55 °C로 데우고 열을 끄고 PFA 프릴 8g을 넣고 계속 저어줍니다. 용액이 맑아지기 시작할 때까지 1N NaOH를 적가한 다음 0.2M PB 40mL를 넣고 투명해질 때까지 계속 저어줍니다. 용액을 실온으로 냉각하고 pH를 7.4로 조정하고 0.2M PB로 부피를 최대 100mL로 가져옵니다. 여과하여 4°C에서 최대 2주 동안 보관합니다.
- 배양 등급 D-PBS(트리톤 1mL + D-PBS 500mL)에 0.2% 트리톤 X-100을 첨가하여 D-PBS + 트리톤 X-100(PBSTX)을 준비합니다. 4 °C에서 보관하십시오. PBSTX에서 1% 정상 당나귀 혈청(NDS)인 차단 용액을 준비합니다. 미리 1mL의 NDS + 9mL의 PBSTX 를 제조하여 10mL 분취액으로 -20°C에서 저장할 수 있습니다.
- PBS TX 중 0.2% NDS/0.2% BSA인 항체 용액 준비: NDS 200μL + BSA 200mg + PBSTX 9.6mL; 미리 준비하여 -20°C에서 10mL 분취량으로 보관할 수 있습니다.
2. 장비 설정
- 멸균 세포 배양 생물 안전 캐비닛, 마이크로피펫 세트, 혈청학적 피펫 및 피펫 건, 10cm 페트리 접시, 도금을 위해 원하는 세포 배양 접시(여기서는 이미징을 위해 24웰 검은색 유리 바닥 플레이트가 사용됨), 15mL 및 50mL 원추형 튜브, 해부 도구(예: 추궁 절제술 및 신경 트리밍을 위한 미세 스프링 가위, 미세 집게, 및 면도날), 37°C로 설정된 수조, 70μm 세포 여과기, 15mL 원뿔형 튜브용 어댑터가 있는 원심분리기(300 x g에서 10분), 트리판 블루 및 혈구계, 흄 후드 및 자기 교반 핫 플레이트.
3. 실험방법
- 1 일차 : 요리 준비
- 생물 안전 캐비닛에서 웰 바닥을 덮을 수 있을 만큼 충분한 폴리-D-라이신으로 원하는 배양 표면을 코팅합니다. 4 °C에서 하룻밤 동안 보관하십시오. 여기서, 24-웰 유리 바닥 플레이트가 이미징에 사용되었고, 따라서 300 μL의 폴리-D-라이신이 사용되었다.
- 생물 안전 캐비닛에서 패닝 접시를 준비하십시오 : CD45 접시의 경우 10cm의 페트리 접시에 10mL의 작업 tris-HCl 용액과 30μL의 염소 항 쥐 IgG를 추가합니다. PDGFRβ 접시의 경우 10mL의 작업 tris-HCl 용액과 30μL의 염소 항토끼 IgG를 10cm 페트리 접시에 추가합니다. O4 하이브리도마 접시의 경우 10cm 페트리 접시에 10mL의 작업 tris-HCl 용액과 30μL의 염소 항-마우스 IgG를 추가합니다. 용액이 전체 접시 영역을 덮는지 확인하고 밤새 4°C에서 둡니다.
- 2일차: 해부, 분쇄 및 면역 패닝
- 폴리-D-라이신을 흡인하고, 조직 배양수로 플레이트를 세 번 세척하고, 뚜껑을 기울이고, 생물 안전 캐비닛에서 표면이 완전히 건조되도록 합니다. 플레이트에 충분한 라미닌을 도포하여 각 웰의 바닥을 코팅하고 37°C의 인큐베이터에 넣습니다. 24웰 플레이트의 경우 200μL이면 충분합니다.
- 패닝 접시 준비를 마칩니다. 각 접시를 D-PBS로 세척하고 10μg의 1차 항체로 배양합니다. 실온에서 최소 2시간 동안 그대로 두십시오.
- CD45 접시의 경우 5mL의 0.2% BSA와 20μL의 CD45 1차를 추가합니다. PDGFRβ 접시에 0.2% BSA 5mL와 PDGFRβ 15.4μL를 추가합니다. O4 접시의 경우 0.2% BSA 3mL, O4 하이브리도마 2mL 및 4% BSA 100μL를 추가합니다(최종 BSA 농도가 0.2%로 유지되도록 하기 위해).
- 0.1mL/kg 소듐 펜토바르비톨(10cm 면역패닝 접시당)을 사용하여 1-4마리의 마우스를 안락사시킵니다. 우리는 8-10주령에 C57BL/6 마우스를 사용했습니다. 남녀 모두 서로 분리되어 사용되고 배양되었습니다. 차가운 0.9 % 식염수 30mL로 동물을 관류하십시오.
- 앞발과 뒷발을 스티로폼 단계에 고정하고 깨끗한 면도날을 사용하여 뒤에서 척추를 노출시킵니다. 척수를 노출시키기 위해 등쪽 척추의 양쪽을 절반 정도 깊이 절개하고 기둥의 등쪽 절반을 제거하여 추궁 절제술을 수행합니다. 부드럽게 신경을 자르고 척수를 제거하거나 코드를 부드럽게 옆으로 밀어 신경 무결성을 유지하십시오.
- 척수 신경 뿌리(절단되거나 척수에 부착됨)를 사용하여 척추 양쪽에서 모든 DRG를 찾아 제거합니다. 각 DRG에서 신경 파편이 제거될 때 다듬습니다(배양에 신경 파편이 많을수록 배양 생존율이 저하될 수 있음). 얼음 위의 15mL 원뿔형 튜브에 있는 15mL의 HBSS-/-에 DRG를 수집합니다.
알림: 조직은 야외에서 해부되지만 DRG가 튜브에 추가되면 멸균 상태로 취급해야 하며 생물 안전 캐비닛에서만 조작해야 합니다. - 해부가 끝나기 약 30분 전에 stemxyme 1 및 0.4% DNAse의 냉동 스톡을 수조에 넣습니다(대략 마지막 마우스를 시작할 때). 원뿔형 튜브의 바닥에 안착되도록 한 다음 생물 안전 캐비닛에서 프로토콜을 계속하십시오.
- DRG에서 대부분의 HBSS-/-를 흡인합니다. 흡입 대신 피펫을 사용하여 <1mL의 액체를 얻고 조직 손실 위험이 없도록 ~100μL 액체를 남겨 둡니다.
- HBSS-/- 1mL로 3회 세척한다. 5mL의 작업 줄기 용액을 조직에 추가합니다. 투명 필름으로 뚜껑을 덮고 37°C로 설정된 수조에서 1시간 동안 튜브를 옆으로 눕힙니다.
- 효소에서 배양 한 후 저 OVO 억제제 용액 1mL를 튜브에 넣습니다. p1000 피펫으로 세포를 부드럽게 10-15회 분쇄합니다. 조직 덩어리가 가라앉도록 합니다.
- 상단 2-3mL의 용액(해리된 세포 포함)을 신선한 저오보뮤코이드 용액으로 옮깁니다. 조직이 완전히 해리되고 눈에 보이는 덩어리가 남지 않을 때까지 반복합니다.
- 실온에서 300 x g 에서 10분 동안 원심분리합니다. 마지막 1mL를 흡입하는 대신 피펫을 사용하여 상청액을 다시 사이펀하고 ~100μL를 남기고 세포 펠릿을 1mL의 패닝 버퍼에 재현탁합니다.
- 부드럽게 피펫으로 섞습니다. 50mL 원뿔형 튜브 위에 1mL의 패닝 버퍼로 70μm 셀 스트레이너를 미리 적십니다. 세포 여과기를 통해 세포 용액을 여과합니다.
- 1mL의 패닝 버퍼로 튜브를 세척한 다음 여과기(여과액 3mL)를 통과시킵니다. 세포 현탁액을 15% BSA 쿠션 2mL 위에 부드럽게(한 번에 1mL) 겹쳐 미엘린 파편을 제거합니다. 2mL 쿠션은 2마리의 생쥐에게 효과적이며 3mL는 4마리의 생쥐에게 효과적입니다.
- 겹겹이 쌓 기 위해 2mL의 BSA를 튜브에 넣고 닫은 다음 튜브 측면을 BSA로 부드럽게 코팅합니다. 그런 다음 튜브의 측면에 피펫팅하여 상단의 세포 현탁액을 부드럽게 겹칩니다.
- 300 x g 의 실온에서 10분 동안 원심분리(느린 가속 및 감속). P1000 피펫을 사용하여 상단의 투명한 액체, 그 사이의 미엘린 상, BSA를 한 번에 1mL씩 제거합니다(각 mL 사이에서 팁 변경). 펠릿을 방해하지 않도록 ~100 μL의 BSA를 그대로 두십시오.
- 5 mL의 패닝 버퍼를 첨가하고, 튜브를 37°C, 10%CO2 인큐베이터에서 30-45분 동안 인큐베이션한다. 이를 통해 항원 검색이 가능합니다. 가스 교환이 가능하도록 캡을 느슨하게 하십시오.
- CD45 접시를 D-PBS로 세 번 세척합니다. 마지막 헹굼을 따르십시오. 세포 현탁액을 CD45 접시에 디캔팅합니다.
- 실온에서 총 20분 동안 CD45 접시 상에서 세포를 인큐베이션하고, 세포가 항체에 동등하게 접근할 수 있도록 10분 지점에서 부드럽게 소용돌이치게 한다.
- PDGFRβ 접시를 D-PBS로 세 번 헹구고 마지막 헹굼을 붓습니다. 결합되지 않은 세포를 CD45 디쉬로부터 PDGFRβ 디쉬로 옮긴다.
- CD45 접시를 부드럽게 흔들어 비스듬히 받쳐줍니다. 1mL의 세포 현탁액을 접시 위에 부드럽게 피펫팅하여 결합되지 않은 세포를 수집합니다. 이를 PDGFRβ 디쉬에 넣고 피펫팅하여 남은 세포 현탁액을 PDGFRβ 플레이트로 옮긴다.
- PDGFRβ 플레이트를 실온에서 총 20분 동안 인큐베이션하고, 세포가 항체에 동등하게 접근할 수 있도록 10분 지점에서 부드럽게 소용돌이치게 합니다.
- D-PBS로 O4 접시를 세 번 헹구고 마지막 헹굼을 붓습니다. 단계 3.2.19에서와 동일한 방법을 사용하여 결합되지 않은 세포를 PDGFRβ 디쉬에서 O4 디쉬로 옮깁니다. 실온에서 총 20분 동안 O4 플레이트를 배양하고 세포가 항체에 동등하게 접근할 수 있도록 10분 지점에서 부드럽게 소용돌이칩니다.
- 세포 현탁액을 15mL 원뿔형 튜브로 옮기고 300 x g에서 10분 동안 원심분리합니다. 세포를 원하는 부피로 재현탁하고 세포 생존율을 위해 트리판 블루로 1:1로 희석합니다. 혈구계로 중대형 세포를 계산합니다(이렇게 하면 배양 중인 뉴런 수를 가장 잘 표현할 수 있음).
- 라미닌을 제거하고 원하는 밀도로 세포를 플레이트합니다. 라미닌 제거와 도금 사이에 플레이트가 건조되지 않도록 하고 즉시 셀을 추가하십시오.
- 24-웰 플레이트에서 웰당 25μL의 배양 배지(1.2.7에 기술됨)에 500개의 뉴런을 사용하여 뉴런 농축을 위해 정량화된 세포(그림 3)를 배양하고 37°C에서 30분 동안 인큐베이션합니다. 웰을 500 μL의 최종 부피로 플러딩합니다.
- 4일차: 면역세포화학(ICC) 고정, 차단 및 1차
- 48시간 성장 후 실온에서 15분 동안 8% PFA의 500μL/웰(또는 웰의 배지에 해당하는 부피)을 추가하여 세포를 고정합니다. 매체 분석이 필요한 경우 4% PFA로 직접 고정할 수 있습니다. 그러나 우리는 이것을 테스트하지 않았습니다.
- 세포를 D-PBS로 3회 세척한다. 참고로, 우리는 이러한 세포를 최대 72시간 동안 배지 교체 없이 배양 상태로 유지했지만, 특히 배지가 반쯤 교체된 경우 더 오래 생존할 수 있다는 가설을 세웠습니다.
- 최종 세척을 제거하고 세포를 완전히 덮을 수 있도록 웰당 충분한 차단 용액을 추가합니다. 실온에서 30 분 동안 차단하십시오. 차단 용액을 제거하고 항체 용액에 1차 항체를 추가합니다: β3-튜불린을 1:1,000 희석합니다. 플레이트를 투명 필름으로 밀봉하고 4°C에서 밤새 배양합니다.
참고: 섬유아세포가 없는 경우 PDGFRβ, 면역 세포가 없는 경우 CD45, 미엘린이 없는 경우 P0 또는 PMP22, 위성 아교세포가 없는 경우 fabp7로 염색하는 것을 고려할 수 있습니다.
- 5일차: ICC 중고등부
- 세포를 D-PBS로 3회 세척한다. 최종 세척을 제거하고 항체 용액에 2차 항체를 추가합니다: 항-토끼 488 1:500 희석 및 DAPI 1:2,000 희석. 빛으로부터 보호되는 실온에서 30 분 동안 배양하십시오.
- D-PBS로 세 번 세척하십시오. 우물의 바닥을 덮을 만큼 충분한 D-PBS를 추가하고 이미지를 만듭니다. 플레이트는 투명 필름으로 밀봉하고 빛으로부터 보호하며 4°C에서 최대 2주 동안 보관할 수 있습니다.
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Representative Results
그런 다음 DAPI와 β3-튜불린으로 염색된 고정된 세포를 공초점 고함량 스크리닝 시스템으로 이미지화했습니다. β3-튜불린과 공동 표지된 DAPI 양성 세포의 비율을 결정하기 위해 적절한 상용 소프트웨어를 사용하여 이미지를 분석했습니다(그림 3). 전체 DRG 배양물은 42.36% ± 6.4% β3-튜불린 염색을 갖는 것으로 측정되었고, 면역팬 DRG 배양물은 71.44% ±7.43% β3-튜불린 염색을 갖는 것으로 측정되었습니다. 이것은 면역패닝으로 뉴런 농축이 유의하게 증가했음을 보여줍니다(p < 0.0001, unpaired t-test).
그림 1: 면역패닝 기본 사항. 2차 항체를 하룻밤 동안 배양 접시에 부착한 다음 1차 항체를 도입합니다. 이것은 관심있는 세포가 표면 항원에 의해 플레이트에 부착되도록합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 음성 선택에 의한 성인 마우스 DRG 뉴런 면역패닝. DRG는 수확, 해리 및 단일 세포 용액으로 변형됩니다. 미엘린 파편은 BSA 쿠션을 통해 원심분리에 의해 제거됩니다. 그런 다음 세포 현탁액을 3개의 면역패닝 접시(CD45, PDGFRβ 및 O4)에 통과시켜 뉴런이 풍부한 배양을 달성합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 면역패닝에 의한 DRG 배양 신경 농축. 고정된 배양물은 뉴런에 대해 β3-튜불린으로, 모든 핵에 대해 DAPI로 염색되었습니다. (A) 전체(비면역팬닝) 배양의 대표 이미지. (B) 면역팬 배양의 대표 이미지. (C) β3-튜불린 양성 세포를 전체 DAPI 양성 세포의 백분율로 정량화. 막대는 표준 오차 평균(SEM)± 평균을 나타냅니다. = p < 0.0001, unpaired t-검정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 면역패닝 프로토콜은 DRG 일차 배양에서 신경 세포의 비율을 증가시킵니다. 최상의 결과를 얻으려면 적시에 해부를 수행해야하며 DRG는 과도한 신경을 잘라야합니다. 해리 단계는 주의 깊게 모니터링해야 하며 세포가 불필요한 스트레스를 받지 않도록 1시간을 초과해서는 안 됩니다. 구체적으로 면역패닝과 관련하여, 각 플레이트는 세포가 코팅된 항체에 접근할 수 있도록 중간 지점에서 부드럽게 소용돌이쳐야 합니다. 플레이트는 또한 비신경 세포가 결합했는지 확인하기 위해 신경 세포 현탁액을 수집한 후 배양 현미경으로 관찰해야 합니다.
성인 마우스의 사용에 대한 제한은 DRG의 확립 된 특성입니다. 모든 비뉴런 세포 유형을 제거할 수 없기 때문에 배양액의 약 30%가 비뉴런 세포로 남게 됩니다(그림 3). 배양물에서 면역 세포, 섬유아세포 및 슈반 세포의 개체군을 분리하고 줄일 수 있지만 위성 신경교는 뉴런에서 분리하기가 매우 어려울 수 있습니다. 우리는 또한 이러한 뉴런이 위성 glia10에 의해 제공되는 대사 지원 없이는 생존율이 낮을 수 있다는 가설을 세웠습니다. GFAP를 사용하여 이러한 세포를 염색하려는 시도는 항체 특이성이 낮아 실패했지만, 향후 방향은 fabp7을 사용하여 이러한 세포를 염색하는 것일 수 있습니다. 우리는 이 프로토콜의 문제를 해결할 때 위성 신경교세포와 같은 CD9 양성 비신경 세포를 제거하려고 시도했습니다. 그러나, CD9 플레이트에서는 많은 뉴런이 플레이트에 부착되어 있음이 발견되었다. 우리는 마우스 뉴런이 일부 CD9 발현을 가질 수 있다는 가설을 세웁니다. 사실, 마우스 뉴런 유사 세포의 세포외 소포 문헌은 CD9를 마커11로 사용합니다. 위성 아교세포의 비율을 감소시키는 데 더 적합한 패닝 항체가 발견될 수 있다면 이러한 지지 세포의 손실을 막기 위해 NGF, BDNF 또는 NT3와 같은 성장 인자를 추가로 보충하는 것을 고려할 수 있습니다.
이 면역패닝 프로토콜은 배양에서 신경 세포의 비율을 증가시켜 균질한 DRG 배양 샘플에서 신경 판독의 정확도를 향상시킬 수 있습니다. 또한 성인 마우스 DRG 뉴런을 배양할 수 있는 방법을 제공하여 유전, 질병 및 손상 마우스 모델에서 뉴런 표현형을 심층적으로 조사할 수 있습니다.
면역 패닝은 또한 고도로 사용자 정의 가능한 도구입니다. 예를 들어, 세포 표면 마커 isolectin-B4는 비펩티드성 마우스 통각수용체를 특이적으로 선택하는 데 사용될 수 있습니다. 면역패닝은 또한 피질 뉴런, 미세아교세포, 성상세포 및 희소돌기아교세포 전구체 세포를 포함한 다른 1차 배양을 풍부하게 하는 데 사용할 수 있습니다. 이는 일차 세포 배양의 응용 분야를 확대할 수 있는 강력한 도구입니다.
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Disclosures
저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 작업은 캐나다 보건 연구소 (FRN-162434)의 프로젝트 보조금과 캐나다 MS 협회 (EGID-3761)의 디스커버리 보조금으로 지원되었습니다. 저자는 ImageXpress 시스템의 교육과 사용에 대해 Sun 박사와 Cross Cancer Institute에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 um Syringe filters | Fisher | 723-2520 | |
| 100 mm petri dishes | ThermoFisher | FB0875712 | |
| 24 well black glass-bottom plates | Cellvis | P24-1.5H-N | |
| 70 um cell strainer | Cedarlane | 15-1070-1(BI) | |
| B27+ supplement | Gibco | A3582801 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A7906 | for 15% BSA cushion, and ICC (heat shock fraction ≥98%) |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A4161 | for 4% BSA for immunopanning, and SATO for media (essentially globulin free, suitable for cell culture, ≥99%) |
| CD45 antibody | BD Pharmigen | 550539 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| DMEM | Gibco | 11960069 | |
| DNAse | Worthington | LS002007 | for stemxyme solution and panning buffer |
| D-PBS | Sigma Aldrich | D8662 | |
| EBSS | Sigma Aldrich | E6267 | for DNAse solution |
| Filter paper P8 grade | ThermoFisher | 09-795K | for 8% PFA |
| Glutamax | ThermoFisher | 35050061 | |
| goat-anti-mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 115-005-020 | for O4 dish |
| goat-anti-rabbit 488 | Invitrogen | A11008 | |
| goat-anti-rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | 115-005-003 | for PDGFRB dish |
| goat-anti-rat IgG | Jackson Immunoresearch | 115-005-044 | for CD45 dish |
| HBSS -/- | Sigma Aldrich | 14175145 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I2643 | |
| laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma Aldrich | A8199 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103049 | |
| Normal Donkey Serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| O4 antibody | n/a | n/a | Hybridoma |
| Ovomucoid trypsin inhibitor | Cedarlane | LS003086 | for low ovo |
| paraformaldehyde prills | Sigma Aldrich | 441244 | for 8% PFA |
| PDGFRB antibody | Abcam | AB32570 | |
| penicillin/ streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich | P6407 | |
| Progesterone | Sigma Aldrich | P8783 | for SATO |
| Putrescine dihydrochrloride | Sigma Aldrich | P5780 | for SATO |
| Sodium phosphate dibasic | Fisher | S374-1 | for 0.2 M PB |
| Sodium Phosphate monobasic dihydrate | Sigma Aldrich | 04269 | for 0.2 M PB |
| Sodium Pyruvate | ThermoFisher | 11360070 | |
| Sodium Selenite | Sigma Aldrich | S5261 | for SATO |
| Stemxyme I | Cedarlane | LS004107 | for tissue dissociation; combination collagenase |
| Transferrin | Sigma Aldrich | T1147 | for SATO |
| Tris-HCl | Millipore Sigma | T5941 | |
| trypan blue | Gibco | 15250-061 | |
| β3-Tubulin | Sigma-Aldrich | T2200 |
References
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