Summary

Generering af hypoparathyroide rotter via carbon-nanopartikelassisteret parathyroidektomi

Published: July 14, 2023
doi:

Summary

En dyremodel for erhvervet hypoparathyroidisme (HypoPT) er afgørende for at forstå, hvordan HypoPT påvirker mineralionhomeostase og for at verificere effektiviteten af nye behandlinger. Her præsenteres en teknik til at generere en erhvervet hypoparathyroidisme (AHypoPT) rottemodel ved parathyroidektomi (PTX) ved hjælp af kulstofnanopartikler.

Abstract

Hypoparathyroidisme (HypoPT) er en sjælden sygdom, der involverer biskjoldbruskkirtlerne, der er karakteriseret ved en reduceret sekretion eller styrke af parathyroideahormonet (PTH), hvilket fører til høje serumfosforniveauer og lave serumcalciumniveauer. HypoPT skyldes oftest utilsigtet skade på kirtlerne eller deres fjernelse under skjoldbruskkirtlen eller anden forreste halskirurgi. Parathyroidea/thyreoideakirurgi er blevet mere almindelig i de senere år med en tilsvarende stigning i forekomsten af hypoPT som en postoperativ komplikation. Der er et kritisk behov for en HypoPT-dyremodel for bedre at forstå de mekanismer, der ligger til grund for virkningerne af HypoPT på mineralionhomeostase og for at verificere den terapeutiske effektivitet af nye behandlinger. Her rapporteres en teknik til at skabe erhvervet HypoPT hos hanrotter ved at udføre parathyroidektomi (PTX) ved hjælp af kulstofnanopartikler. Rottemodellen viser stort løfte over musemodellerne for hypoparathyroidisme. Det er vigtigt, at den humane PTH-receptorbindingsregion har en sekvenslighed på 84,2% med rottens, hvilket er højere end den 73,7% lighed, der deles med mus. Desuden er virkningerne af østrogen, som kan påvirke PTH / PTHrP-receptorsignalvejen, ikke blevet undersøgt fuldt ud hos hanrotter. Kulstofnanopartikler er lymfesporstoffer, der pletter skjoldbruskkirtlens lymfeknuder sorte uden at påvirke deres funktion, men de pletter ikke biskjoldbruskkirtlerne, hvilket gør dem lette at identificere og fjerne. I denne undersøgelse var serum-PTH-niveauer ikke påviselige efter PTX, og dette resulterede i signifikant hypokalcæmi og hyperfosfatæmi. Således kan den kliniske tilstand af postoperativ hypoPT være bemærkelsesværdigt repræsenteret i rottemodellen. Carbon-nanopartikelassisteret PTX kan derfor tjene som en ekstraordinært effektiv og let implementerbar model til undersøgelse af patogenese, behandling og prognose for HypoPT.

Introduction

Parathyroideahormon (PTH) udskilles af biskjoldbruskkirtlerne. Det er en vigtig modulator af calciumbalancen, opretholder fosfatmetabolisme og deltager i knogleomsætning 1,2. Hypoparathyroidisme (HypoPT) manifesterer sig som nedsat sekretion eller funktionelt tab af PTH. Det er en sjælden endokrin lidelse med en prævalens på ca. 9-37 pr. 100.000 personår 3,4,5. HypoPT er karakteriseret ved nedsat serum PTH og calciumniveauer ledsaget af øget serumfosfor 6,7. HypoPT klassificeres ud fra årsagen: erhvervet hypoparathyroidisme (AHypoPT) eller idiopatisk hypoparathyroidisme (IHypoPT)8. AHypoPT er mere almindeligt forekommende i klinisk praksis; omkring 75% af AHypoPT tilfælde er forårsaget af resektion eller utilsigtet skade på biskjoldbruskkirtlerne under skjoldbruskkirtlen kirurgi eller andre hoved og hals operationer. Andre årsager omfatter strålebehandling og kemoterapi for hoved- og halstumorer og lægemiddeltoksicitet 1,8. Opgraderede diagnostiske metoder og en stigning i screening for skjoldbruskkirtel-associerede sygdomme har øget antallet af skjoldbruskkirtlen kirurgiske operationer. Dette har ført til en tilsvarende stigning i de relaterede komplikationeri biskjoldbruskkirtlen 9,10.

Let etablerede dyremodeller med stabile egenskaber er nødvendige for bedre at undersøge AHypoPT og verificere den terapeutiske effektivitet af nye behandlinger. Parathyroidektomi (PTX) udført på rotter og mus er blevet rapporteret i tidligere studier 6,11; På grund af den ekstremt lille størrelse af biskjoldbruskkirtlerne og variabiliteten i deres anatomiske fordeling er succesraten imidlertid relativt lav i praksis. Således udføres thyro-parathyroidektomi (TPTX) (dvs. den totale fjernelse af skjoldbruskkirtlen og biskjoldbruskkirtlerne) sædvanligvis for at sikre resektion af biskjoldbruskkirtlerne12. Imidlertid kan de resulterende lave thyroxinniveauer komplicere undersøgelser med denne dyremodel13. HypoPT-modeller etableret ved andre metoder, såsom lægemiddelstimulering og genredigering, kan ikke korrekt repræsentere den mest almindelige AHypoPT-patogenese. Vores gruppe brugte tidligere knockout-musemodeller til at mærke biskjoldbruskkirtlerne og tillade fjernelse af biskjoldbruskkirtlerne uden at beskadige skjoldbruskkirtlen og omgivende anatomiske strukturer14,15. Denne metode anvender imidlertid transgene musemodeller, som kræver en længere udviklingstid på grund af parrings- og avlskravene.

Derfor sigtede vi mod at etablere en let genereret model af AHypoPT. Denne undersøgelse beskriver en rottemodel for PTX ved hjælp af kulstofnanopartikelmærkning. En kulstofnanopartikelsuspension på 50 mg / ml, som almindeligvis anvendes i skjoldbruskkirtelkirurgi, fordeles jævnt i skjoldbruskkirtlen efter lokal injektion16. Skjoldbruskkirtlen bliver sort, men biskjoldbruskkirtlerne efterlades ufarvede17, hvilket tydeligt adskiller biskjoldbruskkirtlerne fra skjoldbruskkirtlen og gør det muligt at udføre PTX uden at påvirke skjoldbruskkirtlen. Denne metode er velegnet til rotter i forskellige aldre. Injektionen af carbon nanopartikel suspension er sikker og har en ubetydelig effekt på skjoldbruskkirtlenfunktion 18. Den kulstofnanopartikelmærkede PTX-rottemodel, der blev genereret i denne undersøgelse, viste signifikante hypokalcæmi- og hyperfosfatæmifænotyper i løbet af den 4 ugers observationsperiode. Således er denne AHypoPT-model let at etablere og har en reproducerbar fænotype.

Protocol

Denne undersøgelse blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee ved State Key Laboratory of Oral Diseases, Sichuan University. Tilladelse blev indhentet fra relevante lokale agenturer før eksperimentet. Otte 8-10 uger gamle hanrotter af Sprague-Dawley (SD) med en gennemsnitsvægt på 200-250 g blev anvendt til denne undersøgelse. Dyrene blev hentet fra en kommerciel kilde (se materialetabel). Mad og vand blev leveret ad libitum i hele forsøgsperioden. <p class="jove_title…

Representative Results

Placeringen og antallet af biskjoldbruskkirtler blev oprindeligt observeret hos rotter under et dissektionsmikroskop. Før carbonnanopartikelinjektionen var skjoldbruskkirtlen en gennemskinnelig rød farve, og biskjoldbruskkirtlerne kunne næppe skelnes under mikroskopet (figur 1A). Efter nanopartikelinjektionen blev skjoldbruskkirtlen farvet sort, mens biskjoldbruskkirtlerne forblev ufarvede (figur 1B). Den omhyggelige dissektion af de lyse biskjoldbruskkirtler…

Discussion

Epidemiologiske rapporter viser, at påvisning af skjoldbruskkirtelsygdomme er steget betydeligt, og antallet af relaterede udførte operationer er steget tilsvarende19,20. Forekomsten af postkirurgisk hypoparathyroidisme er ca. 7,6%8,21, mens den øgede sygelighed af erhvervet hypoparathyroidisme har fået denne sjældne sygdom til at få større forskningsopmærksomhed. Det er derfor særlig vigtigt at …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde blev støttet af NSFC-bevilling 81800928, forskningsfinansiering fra West China School / Hospital of Stomatology Sichuan University (nr. RCDWJS2021-1) og State Key Laboratory of Oral Diseases Open Funding-tilskud SKLOD-R013.

Materials

0.9% Sodium Chloride Solution Kelun Co. Sichuan, China
10 µL 30G NanoFil Syringe WPI
6-0 polyglactin 910 suture with needle Ethicon, Inc J510G
Calcium LiquiColor test EKF 0155-225 For Ca2+ analysis
Carbon Nanoparticles Suspension Injection Lummy, Chongqing, China H20073246 1 mL : 50 mg
Creatinine (Cr) Assay kit ( sarcosine oxidase ) Jiancheng, Nanjing, China C011-2-1 For creatinine analysis
Disposable Scalpel Shinva, China
Dumstar Biology forceps Shinva, China
Micro Dissecting Spring Scissors Shinva, China
MicroVue Rat intact PTH ELISA Immunotopics 30-2531 For the measurement of PTH in rat serum
Needle Holder Shinva, China
Phosphorus Liqui-UV test EKF 0830-125 For Pi analysis
Ply gauze Weian Co. Henan, China
Povidone-Iodine Yongan pharmaceutical Co.Ltd. Chengdu, China
Prism 9.0 (statistics and graphing software) GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/
Rat C-telopeptide of type I collagen (CTX-I) ELISA Kit CUSABIO, Wuhan, China CSB-E12776r For CTX-I analysis
Rat Osteocalcin/Bone Gla Protein (OT/BGP) ELISA Kit CUSABIO, Wuhan, China CSB-E05129r For osteocalcin analysis
Safety Single Edge Razor Blades American Safety Razor Company 66-0089
Sprague-Dawley Rats 8 to 10 weeks old
Surgical Incise Drapes Liangyou Co. Sichuan, China
Urea Assay Kit Jiancheng, Nanjing, China C013-2-1 For urea analysis

References

  1. Bilezikian, J. P., et al. Hypoparathyroidism in the adult: Epidemiology, diagnosis, pathophysiology, target-organ involvement, treatment, and challenges for future research. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (10), 2317-2337 (2011).
  2. Bilezikian, J. P. Hypoparathyroidism. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 105 (6), 1722-1736 (2020).
  3. Underbjerg, L., Sikjaer, T., Mosekilde, L., Rejnmark, L. Postsurgical hypoparathyroidism-Risk of fractures, psychiatric diseases, cancer, cataract, and infections. Journal of Bone and Mineral Research. 29 (11), 2504-2510 (2014).
  4. Underbjerg, L., Sikjaer, T., Mosekilde, L., Rejnmark, L. The epidemiology of nonsurgical hypoparathyroidism in Denmark: A nationwide case finding study. Journal of Bone and Mineral Research. 30 (9), 1738-1744 (2015).
  5. Astor, M. C., et al. Epidemiology and health-related quality of life in hypoparathyroidism in Norway. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 101 (8), 3045-3053 (2016).
  6. Rodriguez-Ortiz, M. E., et al. Calcium deficiency reduces circulating levels of FGF23. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (7), 1190-1197 (2012).
  7. Davies, B. M., Gordon, A. H., Mussett, M. V. A plasma calcium assay for parathyroid hormone, using parathyroidectomized rats. The Journal of Physiology. 125 (2), 383-395 (1954).
  8. Clarke, B. L., et al. Epidemiology and diagnosis of hypoparathyroidism. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 101 (6), 2284-2299 (2016).
  9. Liu, Y., Shan, Z. Expert consensus on diagnosis and treatment for elderly with thyroid diseases in China. Aging Medicine. 4 (2), 70-92 (2021).
  10. Sulejmanovic, M., Cickusic, A. J., Salkic, S., Bousbija, F. M. Annual incidence of thyroid disease in patients who first time visit department for thyroid diseases in Tuzla Canton. Materia Socio-Medica. 31 (2), 130-134 (2019).
  11. Liao, H. W., et al. Relationship between fibroblast growth factor 23 and biochemical and bone histomorphometric alterations in a chronic kidney disease rat model undergoing parathyroidectomy. PloS One. 10 (7), 0133278 (2015).
  12. Russell, P. S., Gittes, R. F. Parathyroid transplants in rats: A comparison of their survival time with that of skin grafts. The Journal of Experimental Medicine. 109 (6), 571-588 (1959).
  13. Sakai, A., et al. Osteoclast development in immobilized bone is suppressed by parathyroidectomy in mice. Journal of Bone and Mineral Metabolism. 23 (1), 8-14 (2005).
  14. Bi, R., Fan, Y., Luo, E., Yuan, Q., Mannstadt, M. Two techniques to create hypoparathyroid mice: parathyroidectomy using GFP glands and diphtheria-toxin-mediated parathyroid ablation. Journal of Visualized Experiments. (121), e55010 (2017).
  15. Bi, R., et al. Diphtheria toxin- and GFP-based mouse models of acquired hypoparathyroidism and treatment with a long-acting parathyroid hormone analog. Journal of Bone and Mineral Research. 31 (5), 975-984 (2016).
  16. Huang, Y., et al. Carbon nanoparticles suspension injection for photothermal therapy of xenografted human thyroid carcinoma in vivo. MedComm. 1 (2), 202-210 (2020).
  17. Zhang, R. J., Chen, Y. L., Deng, X., Yang, H. Carbon nanoparticles for thyroidectomy and central lymph node dissection for thyroid cancer. The American Surgeon. , (2022).
  18. Long, M., et al. A carbon nanoparticle lymphatic tracer protected parathyroid glands during radical thyroidectomy for papillary thyroid non-microcarcinoma. Surgical Innovation. 24 (1), 29-34 (2017).
  19. Li, Y., et al. Efficacy and safety of long-term universal salt iodization on thyroid disorders: Epidemiological evidence from 31 provinces of mainland China. Thyroid. 30 (4), 568-579 (2020).
  20. Powers, J., Joy, K., Ruscio, A., Lagast, H. Prevalence and incidence of hypoparathyroidism in the United States using a large claims database. Journal of Bone and Mineral Research. 28 (12), 2570-2576 (2013).
  21. Zihao, N., et al. Promotion of allogeneic parathyroid cell transplantation in rats with hypoparathyroidism. Gland Surgery. 10 (12), 3403-3414 (2021).
  22. Goncu, B., et al. Xenotransplantation of microencapsulated parathyroid cells as a potential treatment for autoimmune-related hypoparathyroidism. Experimental and Clinical Transplantation. , (2021).
  23. Jung, S. Y., et al. Standardization of a physiologic hypoparathyroidism animal model. PLoS One. 11 (10), 0163911 (2016).
  24. Chen, W., Lv, Y., Xie, R., Xu, D., Yu, J. Application of lymphatic mapping to recognize and protect parathyroid in thyroid carcinoma surgery by using carbon nanoparticles. Journal of Clinical Otorhinolaryngology, Head, and Neck Surgery. 28 (24), 1918-1920 (1924).

Play Video

Cite This Article
Song, Y., Li, P., Lyu, P., Yu, Y., Chen, X., Cui, C., Bi, R., Fan, Y. Generation of Hypoparathyroid Rats via Carbon-Nanoparticle-Assisted Parathyroidectomy. J. Vis. Exp. (197), e64611, doi:10.3791/64611 (2023).

View Video