Summary
מודל בבעלי חיים של היפופאראתירואידיזם נרכש (HypoPT) חיוני להבנת האופן שבו HypoPT משפיע על הומאוסטזיס של יונים מינרליים ולאימות היעילות של טיפולים חדשניים. כאן, מוצגת טכניקה ליצירת מודל חולדה היפופאראתירואידיזם נרכש (AHypoPT) על ידי כריתת בלוטת התריס (PTX) באמצעות ננו-חלקיקי פחמן.
Abstract
היפופאראתירואידיזם (HypoPT) היא מחלה נדירה המערבת את בלוטות יותרת התריס המאופיינת בהפרשה או עוצמה מופחתת של הורמון יותרת התריס (PTH), מה שמוביל לרמות זרחן גבוהות בסרום ולרמות סידן נמוכות בסרום. היפופט נובע לרוב מנזק מקרי לבלוטות או הסרתן במהלך בלוטת התריס או ניתוח צוואר קדמי אחר. ניתוחי בלוטת התריס הפכו נפוצים יותר בשנים האחרונות, עם עלייה מקבילה בהופעת היפופט כסיבוך לאחר הניתוח. יש צורך קריטי במודל בעלי חיים של HypoPT כדי להבין טוב יותר את המנגנונים העומדים בבסיס ההשפעות של HypoPT על הומאוסטזיס יונים מינרליים ולאמת את היעילות הטיפולית של טיפולים חדשניים. כאן, דווח על טכניקה ליצירת HypoPT נרכש בחולדות זכרים על ידי ביצוע כריתת בלוטת התריס (PTX) באמצעות ננו-חלקיקי פחמן. מודל החולדות מראה הבטחה גדולה על פני מודלים עכבריים של היפופאראתירואידיזם. חשוב לציין שלאזור הקישור של קולטן PTH האנושי יש דמיון של 84.2% ברצף עם זה של החולדה, שהוא גבוה יותר מהדמיון של 73.7% המשותף לעכברים. יתר על כן, ההשפעות של אסטרוגן, אשר יכול להשפיע על מסלול איתות קולטן PTH/PTHrP, לא נחקרו במלואן בחולדות זכרים. ננו-חלקיקי פחמן הם נותבי לימפה המכתימים את בלוטות הלימפה של בלוטת התריס בשחור מבלי להשפיע על תפקודן, אך הם אינם מכתימים את בלוטות יותרת התריס, מה שמקל על זיהויים והסרתם. במחקר זה, רמות PTH בסרום היו בלתי ניתנות לגילוי לאחר PTX, וזה הביא היפוקלצמיה משמעותית היפרפוספטמיה. לפיכך, המצב הקליני של HypoPT לאחר הניתוח יכול להיות מיוצג להפליא במודל חולדה. PTX בסיוע פחמן ננו-חלקיקים יכול, אם כן, לשמש כמודל יעיל במיוחד וקל ליישום לחקר הפתוגנזה, הטיפול והפרוגנוזה של HypoPT.
Introduction
הורמון יותרת התריס (PTH) מופרש על ידי בלוטות יותרת התריס. זהו אפנן עיקרי של מאזן הסידן, שומר על מטבוליזם פוספט, ומשתתף בתחלופת עצם 1,2. היפופאראתירואידיזם (HypoPT) מתבטא בירידה בהפרשה או אובדן תפקודי של PTH. זוהי הפרעה אנדוקרינית נדירה, עם שכיחות של כ 9-37 לכל 100,000 שנות אדם 3,4,5. HypoPT מאופיין בירידה ברמות PTH בסרום ובסידן המלווה בעלייה בזרחן בסרום 6,7. HypoPT מסווג על פי הגורם לו: היפופאראתירואידיזם נרכש (AHypoPT) או היפופאראתירואידיזם אידיופתי (IHypoPT)8. AHypoPT נפוץ יותר בפרקטיקה הקלינית; כ-75% ממקרי AHypoPT נגרמים כתוצאה מכריתה או פציעה בשוגג של בלוטות יותרת התריס במהלך ניתוחי בלוטת התריס או ניתוחי ראש וצוואר אחרים. סיבות אחרות כוללות הקרנות וכימותרפיה לגידולי ראש וצוואר ורעילות תרופות 1,8. שיטות אבחון משודרגות ועלייה בבדיקות סקר למחלות הקשורות לבלוטת התריס הגדילו את מספר הפעולות הכירורגיות של בלוטת התריס. זה הוביל לעלייה מקבילה בסיבוכים הקשורים בלוטת יותרת התריס 9,10.
יש צורך במודלים בעלי חיים מבוססים בקלות עם מאפיינים יציבים כדי לחקור טוב יותר את AHypoPT ולאמת את היעילות הטיפולית של טיפולים חדשניים. כריתת בלוטת התריס (PTX) המבוצעת על חולדות ועכברים דווחה במחקרים קודמים 6,11; עם זאת, בשל גודלן הקטן מאוד של בלוטות יותרת התריס והשונות בפיזורן האנטומי, אחוזי ההצלחה נמוכים יחסית בפועל. לכן, thyro-parathyroidectomy (TPTX) (כלומר, הסרה מוחלטת של בלוטת התריס ואת בלוטות יותרת התריס) מבוצעת בדרך כלל כדי להבטיח את כריתה של בלוטות יותרת התריס12. עם זאת, רמות התירוקסין הנמוכות כתוצאה מכך עלולות לסבך מחקרים עם מודל בעלי חיים זה13. מודלים של HypoPT שהוקמו בשיטות אחרות, כגון גירוי תרופות ועריכת גנים, אינם יכולים לייצג כראוי את הפתוגנזה הנפוצה ביותר של AHypoPT. הקבוצה שלנו השתמשה בעבר במודלים של עכברי נוקאאוט כדי לתייג את בלוטות יותרת התריס ולאפשר הסרה של בלוטות יותרת התריס מבלי לפגוע בבלוטות התריס ובמבנים האנטומיים שמסביב14,15. עם זאת, שיטה זו משתמשת במודלים של עכברים טרנסגניים, הדורשים זמן התפתחות ארוך יותר בשל דרישות ההזדווגות והרבייה.
לכן, שאפנו להקים מודל שנוצר בקלות של AHypoPT. מחקר זה מתאר מודל חולדות עבור PTX באמצעות תיוג ננו-חלקיקי פחמן. תרחיף ננו-חלקיקי פחמן של 50 מ"ג/מ"ל, המשמש בדרך כלל בניתוחי בלוטת התריס, מתחלק באופן שווה בבלוטות התריס לאחר הזרקה מקומית16. בלוטות התריס הופכות שחורות, אך בלוטות יותרת התריס נותרות ללא כתמים17, ובכך מבדילות בבירור את בלוטות יותרת התריס מבלוטות התריס ומאפשרות לבצע את PTX מבלי להשפיע על בלוטות התריס. שיטה זו מתאימה לחולדות בגילאים שונים. הזרקת תרחיף ננו-חלקיקי הפחמן בטוחה ויש לה השפעה זניחה על תפקוד בלוטת התריס18. מודל החולדות PTX עם תווית ננו-חלקיקי פחמן שנוצר במחקר זה הראה פנוטיפים משמעותיים של היפוקלצמיה והיפרפוספטמיה במהלך תקופת התצפית בת 4 השבועות. לפיכך, מודל AHypoPT זה קל להקים ויש לו פנוטיפ לשחזור.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
מחקר זה אושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדת המפתח הממלכתית למחלות אוראליות, אוניברסיטת סצ'ואן. התקבל אישור מסוכנויות מקומיות רלוונטיות לפני הניסוי. במחקר הנוכחי נעשה שימוש בשמונה חולדות Sprague-Dawley (SD) זכרים בני 8-10 שבועות, במשקל ממוצע של 200-250 גרם. בעלי החיים התקבלו ממקור מסחרי (ראו טבלת חומרים). מזון ומים סופקו עד לליביטום , לאורך כל תקופת הניסוי.
1. הכנה טרום ניתוחית ליצירת חולדות PTX בסיוע פחמן ננו-חלקיקי
- הרדימו חולדות בנות 8-10 שבועות באמצעות שאיפת איזופלורן של 2.0%-2.5%, ולאחר מכן הזרקה תוך-צפקית (כלומר של טריברומואתנול) במשקל גוף של 10 מ"ל/ק"ג. להבטיח עומק מספיק של הרדמה על ידי בדיקת היעדר רפלקס האור אישונים. יש להשתמש במשחה וטרינרית על העיניים כדי למנוע יובש בזמן הרדמה.
הערה: חולדות בנות 8-10 שבועות מוכרות כחולדות בוגרות. עם זאת, שיטת דוגמנות זו יכולה לשמש על חולדות צעירות כמו 7 ימים. - הכינו את חולדות SD המורדמות לניתוח על ידי גילוח הפרווה של אזור הצוואר הגחוני במצב שכיבה. יש לחטא את אזור הניתוח באמצעות כדורי צמר גפן פובידון-יוד (ראו טבלת חומרים).
- כסו את בעל החיים בווילונות כירורגיים (ראו טבלת חומרים), וחשפו את אזור הניתוח, במטרה למזער זיהום מיקרוביאלי.
2. כריתת בלוטת התריס (PTX)
- מתחילים בנקודת האמצע בין שתי האוזניים, וחותכים חתך אורכי של 2 ס"מ לכיוון הזנב באמצעות אזמל כירורגי. נתחו את הפאשיה ואת שכבת השומן ברצף בעזרת מלקחיים חדים, מעוקלים ומשוננים.
- הפרידו את השרירים הפארא-טרכאליים, וחשפו את קנה הנשימה באמצעות מלקחיים קהים יחסית תחת מיקרוסקופ סטריאופוני בהגדלה של פי 4-5.
- אתר את האונות השמאלית והימנית של בלוטות התריס בצורת פרפר לצד קנה הנשימה.
- יש להזריק 1 μL של תרחיף ננו-חלקיקי פחמן (ראה טבלת חומרים) מתחת לקרום בלוטות התריס באמצעות מזרק 10 μL עם מחט משופעת 30 גרם. לאחר 5 דקות, השקו את האזור הניתוחי במי מלח כדי לנקות את תרחיף ננו-חלקיקי הפחמן הנוסף המכסה את קרום בלוטת התריס.
הערה: נקודת ההזרקה המומלצת היא החלק המזיאלי של אונת בלוטת התריס, שבו יש פחות כלי דם. תרחיף ננו-חלקיקי פחמן נפוץ בניתוחי בלוטת התריס בשל יכולתו לזהות את בלוטות הלימפה. צביעת בלוטות התריס והשארת בלוטות יותרת התריס ללא כתמים מקלה על זיהויים של האחרונים. - בדוק כדי לוודא כי בלוטות התריס להפוך שחור בעוד בלוטות יותרת התריס להישאר מוכתמים ~ 5 דקות. התבונן בבלוטות יותרת התריס המודגשות תחת אור רגיל באמצעות אור של מיקרוסקופ סטריאו או מנורת שולחן.
הערה: בדרך כלל, למכרסמים יש שתי בלוטות יותרת התריס בצורת טיפה הממוקמות על פני השטח השמאלי והימני של בלוטות התריס. לעיתים, בלוטות יותרת התריס נוספות עשויות להיות ממוקמות רחוק יותר. - חותכים במדויק את בלוטות יותרת התריס לא מוכתמות עם מלקחיים מיקרו-כירורגיים ומספריים. השתמש כדורי צמר גפן סטרילי עבור hemostasis או ספוג ג 'לטין אם יש יותר דימום.
- סגרו את השרירים, שכבות השומן והעור, שכבה אחר שכבה, בתפר מזרן אופקי קטוע באמצעות 6-0 תפרים פוליגלקטין 910 (ראו טבלת חומרים).
- עבור קבוצת דמה, בצע את כל השלבים של ההכנה הטרום ניתוחית ו- PTX למעט שלב 2.6. מרדימים את החולדות, ומפרידים את הרקמות מעל קנה הנשימה. אתר את בלוטות יותרת התריס אך אל תסיר אותן. לבצע התאוששות לאחר הניתוח ותצפית יחד עם חולדות של קבוצת PTX.
3. התאוששות לאחר הניתוח ותצפית
- לאחר הניתוח, הניחו את החולדות על שמיכה חשמלית תרמוסטטית (37°C) כדי לשמור על חום גופם. להזריק buprenorphine hydrochloride 0.01 מ"ג / ק"ג תת עורית (s.c) כל 12 שעות כמו שיכוך כאבים לאחר הניתוח. מעבירים את החולדות לכלוב סטרילי כשהן מתחילות לזוז ומנסות לזחול.
- התבוננו מקרוב בחולדות לאחר הניתוח במשך שעתיים. החזירו את החולדות לחדר הגידול, צפו בהן באופן שגרתי ותיעדו את מצבן.
- יש לשאוב 10 מיקרוליטר דם מווריד הזנב 7 ימים לאחר הניתוח. מדדו את הסרום Ca+2, סרום Pi וסרום PTH באמצעות ערכות מסחריות מתאימות (ראו טבלת חומרים). כריתת בלוטת התריס מוצלחת מייצרת נסיוב מופחת Ca2+ מיונן רמה 2 SD נמוך מזה של חולדות המופעלות על ידי דמה (9.00 mmol / L, n = 16).
הערה: תוכנת סטטיסטיקה וגרפים (ראה טבלת חומרים) שימשה לניתוח סטטיסטי. מבחן t של סטודנט שימש להשוואת הפרמטרים של הסרום והשתן בין קבוצות הדמה וה- PTX. P < 0.05 נחשב מובהק סטטיסטית. בסרום ובשתן Ca2+ ו-Pi וסרום אוריאה וקריאטינין נמדדו בערכות מסחריות בהתאם להוראות היצרן (ראו טבלת חומרים). סרום C-telopeptide של קולגן מסוג I ואוסטיאוקלצין נמדדו עם ערכות ELISA זמינות מסחרית (ראה טבלת חומרים).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
המיקום והמספר של בלוטות יותרת התריס נצפו בתחילה בחולדות תחת מיקרוסקופ דיסקציה. לפני הזרקת ננו-חלקיקי הפחמן, בלוטות התריס היו בצבע אדום שקוף, ובלוטות יותרת התריס כמעט ולא ניתן היה להבחין במיקרוסקופ (איור 1A). לאחר הזרקת הננו-חלקיקים, בלוטות התריס היו מוכתמות בשחור, בעוד שבלוטות יותרת התריס נותרו ללא כתמים (איור 1B). הדיסקציה הזהירה של בלוטות יותרת התריס הבהירות הותירה את בלוטות התריס ללא פגע (איור 1C). בדרך כלל, בלוטות יותרת התריס היו מפוזרות על פני הקצוות הרוחביים או האחוריים של בלוטות התריס.
איור 1: המראה של בלוטת התריס ובלוטות יותרת התריס במהלך ההליכים הכירורגיים. (A) בלוטות התריס (קו לבן מקווקו) ממוקמות לרוחב קנה הנשימה. (ב,ג) בלוטות התריס הראו כתמים שחורים (קו מקווקו לבן) לאחר הזרקת ננו-חלקיקי הפחמן, בעוד שבלוטות יותרת התריס (קו מקווקו צהוב) הציגו צבע בהיר. פסי קנה מידה = 2 מ"מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
זמן הפעולה מההכנה לפני הניתוח ועד להשלמת PTX היה כ-20 דקות. שיעור ההישרדות של החולדות לאחר הניתוח במשך 4 שבועות היה 90.9% (60/66). חולדות PTX נצפו עם גב גיבן שבוע לאחר הניתוח. קבוצת בקרה המופעלת על ידי דמה הוקמה בו זמנית על ידי ביצוע כל השלבים בפרוטוקול למעט שלב 2.6. לכל חולדות הפחמן ששרדו עם תווית PTX הייתה רמת Ca2+ מיוננת ממוצעת נמוכה יותר, שהייתה נמוכה ב-2 SD מזו של הקבוצה המופעלת על ידי דמה. הפנוטיפ של היפופאראתירואידיזם בחולדות PTX המסומנות בננו-חלקיקי פחמן, המתבטא בירידה בסידן בסרום, פוספט גבוה בסרום ו-PTH שלא זוהה, נשאר יציב במהלך תקופת הניטור בת 4 השבועות.
לאחר 7 ימים לאחר הניתוח, רמות Ca 2+ ו-PTH בסרום הופחתו באופן משמעותי בחולדות PTX בהשוואה לקבוצת הדמה (Ca2+ = 4.97 mmol / L ± 0.99 mmol / L לעומת 8.98 mmol / L ± 0.58 mmol / L, p < 0.05; PTH = 13.13 pg/mL ± 6.58 v pg/mL s. 313.06 pg/mL ± 75.24 pg/mL, p < 0.05). Pi בסרום גדל באופן משמעותי לאחר ניתוח PTX (Pi = 13.90 mmol / L ± 1.77 mmol / L לעומת 7.46 mmol / L ± 1.28 mmol / L). רמות האוריאה והקריאטינין בסרום היו דומות בין קבוצות הדמה וה-PTX 7 ימים לאחר ניתוח PTX (אוריאה = 8.71 מילימול/ל' ± 0.81 מילימול/ל' לעומת 8.84 מילימול/ל' ± 0.89 מילימול/ל', p > 0.05; קריאטינין = 49.03 מיקרומול/ל' ± 13.14 מיקרומול/ל' לעומת 53.15 מיקרומול/ל' ± 18.28 מיקרומול/ל', עמ' > 0.05). לאחר 14 יום לאחר ניתוח PTX, רמות Ca 2+ ו- Pi בשתן הופחתו באופן משמעותי (Ca 2+ = 2.33 mmol / L ± 0.53 mmol / L לעומת 7.18 mmol / L ±4.27 mmol / L, p < 0.05; Pi = 2.40 mmol / L ± 1.90 mmol / L לעומת 5.29 mmol / L ± 1.52 mmol / L, p < 0.05) (איור 2).
איור 2: רמות Ca+, Pi, PTH, אוריאה וקראטינין בסרום ורמות Ca2+ ו-Pi בשתן לאחר כריתת בלוטת התריס בסיוע פחמן ננו-חלקיקים. (A) חולדות PTX הציגו היפוקלצמיה יציבה והיפרפוספטמיה במהלך תקופת התצפית בת 4 השבועות (N = 4). (B) PTH בסרום לא היה ניתן לגילוי בחולדות PTX 7 ימים לאחר הניתוח (N = 8). (ג,ד) רמות הסרום של אוריאה וקריאטינין היו דומות בין קבוצות דמה ו- PTX 7 ימים לאחר הניתוח (N = 5). (ה,ו) רמות Ca2+ ו- Pi בשתן הופחתו באופן משמעותי 14 יום לאחר ניתוח PTX (N = 8). קווי השגיאה מציינים את סטיית התקן. קיצורים: PTX = parathyroidectomy; Ca++ = סידן מיונן בסרום; PTH = הורמון יותרת התריס; Pi = זרחן מיונן בסרום. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
לא היו הבדלים משמעותיים במשקל הגוף בין קבוצות PTX וקבוצות דמה ביום 7 לאחר הניתוח (POD7), POD14 ו- POD28 (משקל גוף ב- POD0 = 256.40 גרם ± 4.76 גרם לעומת 252.56 גרם ± 6.69 גרם, p > 0.05; משקל גוף ב- POD7 = 266.00 גרם ± 6.93 גרם לעומת 257.44 גרם ± 30.56 גרם, p > 0.05; משקל גוף ב- POD14 = 294.80 גרם ± 25.90 גרם לעומת 288.22 גרם ± 37.35 גרם, עמ' > 0.05; משקל גוף על POD28 = 327.75 גרם ± 24.82 גרם לעומת 324.17 גרם ± 57.97 גרם, p > 0.05). יתר על כן, סרום C-telopeptide של קולגן מסוג I (CTX-1) ירד סטטיסטית על POD28 (CTX-1 = 82.03 pg/mL ± 8.98 pg/mL לעומת 100.33 pg/mL ± 6.36 pg/mL, p < 0.05). אוסטיאוקלצין בסרום לא הראה הבדל משמעותי ב-POD28 (אוסטיאוקלצין = 913.66 pg/mL ± 378.03 pg/mL לעומת 1066.17 pg/mL ± 549.80 pg/mL, p > 0.05) (איור 3).
איור 3: משקל גוף, C-telopeptide בדם של קולגן מסוג I, ורמות אוסטיאוקלצין לאחר כריתת בלוטת התריס בסיוע פחמן ננו-חלקיקים. (A) לא היו הבדלים משמעותיים במשקל הגוף בין קבוצות PTX וקבוצות דמה ב-POD7, POD14 ו-POD28 (N=14). (B) חולדות PTX הציגו ירידה סטטיסטית בטלופפטיד C-telopeptide בסרום של קולגן מסוג I (N = 4). (C) לא היו הבדלים משמעותיים ברמות אוסטיאוקלצין בסרום (N = 5). קווי השגיאה מציינים את סטיית התקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
דוחות אפידמיולוגיים מצביעים על כך שאיתור מחלות בלוטת התריס גדל באופן משמעותי, ומספר הניתוחים הקשורים שבוצעו גדל בהתאם19,20. שיעור ההיארעות של היפופאראתירואידיזם לאחר ניתוח הוא כ 7.6%8,21, בעוד התחלואה המוגברת של היפופאראתירואידיזם נרכש גרמה למחלה נדירה זו לזכות בתשומת לב מחקרית רבה יותר. לכן, חשוב במיוחד לבסס מודל מתאים של בעלי חיים כדי לחקור את הפתוגנזה של המחלה, כמו גם לבחון את התוצאות של טיפולים טיפוליים חדשניים. עם זאת, נכון לעכשיו, ישנם מודלים מוגבלים של בעלי חיים זמינים. יתר על כן, אחוזי ההצלחה, שיעור ההישרדות והקושי של הליכים כירורגיים לייצר מודלים כאלה נותרו בעייתיים. הקבוצה שלנו דיווחה בעבר על שני מודלים של HypoPT בעכברים. בעכברי PTHcre+/Rosa-mTmG, בלוטות יותרת התריס סומנו באופן פלואורסצנטי כדי לסייע בניתוח מדויק של בלוטות יותרת התריס, ושיטה זו סייעה גם למציאת בלוטות יותרת התריס עם פיזור אנטומי חריג כדי לשפר את שיעור ההצלחה של ניתוח14. גישת מידול אחרת השתמשה בעכברים טרנסגניים, שבהם תאי בלוטת יותרת התריס יכולים להיות ממוקדים על ידי רעלן דיפתריה. בלוטות יותרת התריס יכולות להיהרס על ידי מתן מערכתי של רעלן הדיפתריה ללא צורך בניתוח14,15. עם זאת, השיטות הנ"ל דורשות הכלאה נרחבת של עכברים טרנסגניים, וכתוצאה מכך דרישות זמן ועלות גבוהות יחסית. יתר על כן, מתן מערכתי של רעלן דיפתריה עלול להיות תופעות לוואי נרחבות. נכון לעכשיו, thyro-parathyroidectomy (TPTX) הוא ההליך הרגיל המבוצע כדי להבטיח כריתה של בלוטות יותרת התריס12. למרות שהטכניקה מבוצעת בקלות ויש לה אחוזי הצלחה גבוהים, לא ניתן להתעלם מהנזק לבלוטות התריס. ההשפעה הפוטנציאלית של פגיעה או הרס של בלוטות התריס על תוצאות הניסוי עשויה להיות משמעותית, כלומר זוהי מגבלה עיקרית של כל המחקרים בתחום זה21,22.
במחקר הנוכחי, הוזרק תרחיף ננו-חלקיקי פחמן, המשמש בדרך כלל להדמיית בלוטות התריס בפרקטיקה קלינית, כדי לשפר את ניתוח PTX. שיטה זו בטוחה, מהירה וישימה ביותר. הוא יכול לסמן ביעילות את בלוטות התריס בכתם שחור ולהשאיר את בלוטות יותרת התריס ללא כתמים, מה שמאפשר זיהוי ודיסקציה מדויקים של בלוטות יותרת התריס תוך הימנעות מפגיעה בבלוטות התריס. לשיטת תיוג זו יש השפעה זהה לזו שהושגה באמצעות תיוג פלואורסצנטי של עכברים טרנסגניים, אך אינה מוגבלת על ידי הגנוטיפ. יתר על כן, זמן הניתוח של PTX בסיוע פחמן ננו-חלקיקים הוא בסביבות 20 דקות, מה שחוסך זמן בהשוואה לניתוח של שעתיים הנדרש לזיהוי פלואורסצנטי 5-ALA23. בנוסף, בשל הביטחון הביולוגי של ננו-חלקיקי פחמן24, ניתן להשתמש בשיטת מידול זו על חולדות בנות 7 ימים. אחד השלבים הקריטיים שיש לציין במהלך הניתוח הוא שניתן להתאים את המינון של תרחיף ננו-חלקיקי הפחמן בהתאם למשקל החולדות. נפח תרחיף ננו-חלקיקי הפחמן ששימש במחקר זה (1 μL) מספיק לניתוח בחולדות בוגרות, גם אם כמות מסוימת הולכת לאיבוד במזרק. הפיזור של כל בלוטות יותרת התריס קשה למתחילים לזהות, ומומלץ להתאמן הרבה.
למחקר הנוכחי יש כמה מגבלות. לדוגמה, אי אפשר לזהות בלוטות פאראתירואיד מרוחקות שאינן מחוברות לבלוטת התריס באמצעות ננו-חלקיקי פחמן. אם הפרמטרים בסרום נשארים ללא שינוי לאחר הניתוח, זה עשוי להצביע על כך שכמה בלוטות יותרת התריס המרוחקות היו קיימות ולא הוסרו. לא נמדדה תקופת הצביעה הנדרשת להבחנה ולזיהוי אופטימליים של בלוטות יותרת התריס; עם זאת, בלוטות התריס הוכתמו כראוי תוך 5 דקות ממתן ננו-חלקיקים ושמרו על הכתם במהלך כל ההליך הכירורגי. תפקוד בלוטות התריס במהלך תקופת המעקב לא נרשם במחקר זה. עם זאת, במחקר הקודם שלנו, שכלל שימוש במודל עכבר מהונדס כדי לזהות ולהסיר את בלוטות יותרת התריס, תפקוד בלוטת התריס הוכח כשמור15. גם סבילות החולדות לננו-חלקיקי פחמן לא נבדקה במחקר זה; עם זאת, ננו-חלקיקים אלה שימשו באופן מסחרי כתרופות בניתוחים קליניים16. בדרך כלל, שיטה זו מאפשרת לחוקרים לבחור בעל חיים עם גנוטיפ רצוי ונקודת זמן פעולה. בסופו של דבר, גישה זו צפויה לספק מודלים שימושיים של חולדות עבור היפופאראתירואידיזם נרכש.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי 81800928 מענק NSFC, מימון מחקר מבית הספר / בית החולים לסטומטולוגיה במערב סין אוניברסיטת סצ'ואן (מס 'RCDWJS2021-1), ומענק המימון הפתוח של מעבדת מפתח המדינה למחלות פה SKLOD-R013.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium Chloride Solution | Kelun Co. Sichuan, China | ||
| 10 µL 30G NanoFil Syringe | WPI | ||
| 6-0 polyglactin 910 suture with needle | Ethicon, Inc | J510G | |
| Calcium LiquiColor test | EKF | 0155-225 | For Ca2+ analysis |
| Carbon Nanoparticles Suspension Injection | Lummy, Chongqing, China | H20073246 | 1 mL : 50 mg |
| Creatinine (Cr) Assay kit ( sarcosine oxidase ) | Jiancheng, Nanjing, China | C011-2-1 | For creatinine analysis |
| Disposable Scalpel | Shinva, China | ||
| Dumstar Biology forceps | Shinva, China | ||
| Micro Dissecting Spring Scissors | Shinva, China | ||
| MicroVue Rat intact PTH ELISA | Immunotopics | 30-2531 | For the measurement of PTH in rat serum |
| Needle Holder | Shinva, China | ||
| Phosphorus Liqui-UV test | EKF | 0830-125 | For Pi analysis |
| Ply gauze | Weian Co. Henan, China | ||
| Povidone-Iodine | Yongan pharmaceutical Co.Ltd. Chengdu, China | ||
| Prism 9.0 (statistics and graphing software) | GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ | |
| Rat C-telopeptide of type I collagen (CTX-I) ELISA Kit | CUSABIO, Wuhan, China | CSB-E12776r | For CTX-I analysis |
| Rat Osteocalcin/Bone Gla Protein (OT/BGP) ELISA Kit | CUSABIO, Wuhan, China | CSB-E05129r | For osteocalcin analysis |
| Safety Single Edge Razor Blades | American Safety Razor Company | 66-0089 | |
| Sprague-Dawley Rats | 8 to 10 weeks old | ||
| Surgical Incise Drapes | Liangyou Co. Sichuan, China | ||
| Urea Assay Kit | Jiancheng, Nanjing, China | C013-2-1 | For urea analysis |
References
- Bilezikian, J. P., et al. Hypoparathyroidism in the adult: Epidemiology, diagnosis, pathophysiology, target-organ involvement, treatment, and challenges for future research. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (10), 2317-2337 (2011).
- Bilezikian, J. P.
- Underbjerg, L., Sikjaer, T., Mosekilde, L., Rejnmark, L. Postsurgical hypoparathyroidism-Risk of fractures, psychiatric diseases, cancer, cataract, and infections. Journal of Bone and Mineral Research. 29 (11), 2504-2510 (2014).
- Underbjerg, L., Sikjaer, T., Mosekilde, L., Rejnmark, L. The epidemiology of nonsurgical hypoparathyroidism in Denmark: A nationwide case finding study. Journal of Bone and Mineral Research. 30 (9), 1738-1744 (2015).
- Astor, M. C., et al. Epidemiology and health-related quality of life in hypoparathyroidism in Norway. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 101 (8), 3045-3053 (2016).
- Rodriguez-Ortiz, M. E., et al. Calcium deficiency reduces circulating levels of FGF23. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (7), 1190-1197 (2012).
- Davies, B. M., Gordon, A. H., Mussett, M. V. A plasma calcium assay for parathyroid hormone, using parathyroidectomized rats. The Journal of Physiology. 125 (2), 383-395 (1954).
- Clarke, B. L., et al.
- Liu, Y., Shan, Z. Expert consensus on diagnosis and treatment for elderly with thyroid diseases in China. Aging Medicine. 4 (2), 70-92 (2021).
- Sulejmanovic, M., Cickusic, A. J., Salkic, S., Bousbija, F. M. Annual incidence of thyroid disease in patients who first time visit department for thyroid diseases in Tuzla Canton. Materia Socio-Medica. 31 (2), 130-134 (2019).
- Liao, H. W., et al. Relationship between fibroblast growth factor 23 and biochemical and bone histomorphometric alterations in a chronic kidney disease rat model undergoing parathyroidectomy. PloS One. 10 (7), 0133278 (2015).
- Russell, P. S., Gittes, R. F. Parathyroid transplants in rats: A comparison of their survival time with that of skin grafts. The Journal of Experimental Medicine. 109 (6), 571-588 (1959).
- Sakai, A., et al. Osteoclast development in immobilized bone is suppressed by parathyroidectomy in mice. Journal of Bone and Mineral Metabolism. 23 (1), 8-14 (2005).
- Bi, R., Fan, Y., Luo, E., Yuan, Q., Mannstadt, M. Two techniques to create hypoparathyroid mice: parathyroidectomy using GFP glands and diphtheria-toxin-mediated parathyroid ablation. Journal of Visualized Experiments. (121), e55010 (2017).
- Bi, R., et al. Diphtheria toxin- and GFP-based mouse models of acquired hypoparathyroidism and treatment with a long-acting parathyroid hormone analog. Journal of Bone and Mineral Research. 31 (5), 975-984 (2016).
- Huang, Y., et al. Carbon nanoparticles suspension injection for photothermal therapy of xenografted human thyroid carcinoma in vivo. MedComm. 1 (2), 202-210 (2020).
- Zhang, R. J., Chen, Y. L., Deng, X., Yang, H. Carbon nanoparticles for thyroidectomy and central lymph node dissection for thyroid cancer. The American Surgeon. , (2022).
- Long, M., et al. A carbon nanoparticle lymphatic tracer protected parathyroid glands during radical thyroidectomy for papillary thyroid non-microcarcinoma. Surgical Innovation. 24 (1), 29-34 (2017).
- Li, Y., et al. Efficacy and safety of long-term universal salt iodization on thyroid disorders: Epidemiological evidence from 31 provinces of mainland China. Thyroid. 30 (4), 568-579 (2020).
- Powers, J., Joy, K., Ruscio, A., Lagast, H. Prevalence and incidence of hypoparathyroidism in the United States using a large claims database. Journal of Bone and Mineral Research. 28 (12), 2570-2576 (2013).
- Zihao, N., et al. Promotion of allogeneic parathyroid cell transplantation in rats with hypoparathyroidism. Gland Surgery. 10 (12), 3403-3414 (2021).
- Goncu, B., et al. Xenotransplantation of microencapsulated parathyroid cells as a potential treatment for autoimmune-related hypoparathyroidism. Experimental and Clinical Transplantation. , (2021).
- Jung, S. Y., et al. Standardization of a physiologic hypoparathyroidism animal model. PLoS One. 11 (10), 0163911 (2016).
- Chen, W., Lv, Y., Xie, R., Xu, D., Yu, J. Application of lymphatic mapping to recognize and protect parathyroid in thyroid carcinoma surgery by using carbon nanoparticles. Journal of Clinical Otorhinolaryngology, Head, and Neck Surgery. 28 (24), 1918-1920 (1924).
