Summary
Ein Tiermodell des erworbenen Hypoparathyreoidismus (HypoPT) ist von entscheidender Bedeutung, um zu verstehen, wie HypoPT die Mineralionenhomöostase beeinflusst, und um die Wirksamkeit neuartiger Behandlungen zu überprüfen. In dieser Arbeit wird eine Technik vorgestellt, mit der ein erworbenes Hypoparathyreoidismus (AHypoPT) Rattenmodell durch Parathyreoidektomie (PTX) unter Verwendung von Kohlenstoffnanopartikeln generiert werden kann.
Abstract
Hypoparathyreoidismus (HypoPT) ist eine seltene Erkrankung der Nebenschilddrüsen, die durch eine verminderte Sekretion oder Potenz des Parathormons (PTH) gekennzeichnet ist, was zu hohen Serumphosphorspiegeln und niedrigen Serumkalziumspiegeln führt. HypoPT resultiert am häufigsten aus einer versehentlichen Schädigung der Drüsen oder ihrer Entfernung während einer Schilddrüsen- oder anderen Fronthalsoperation. Nebenschilddrüsen-/Schilddrüsenoperationen sind in den letzten Jahren häufiger geworden, mit einem entsprechenden Anstieg des Auftretens von HypoPT als postoperative Komplikation. Es besteht ein dringender Bedarf an einem HypoPT-Tiermodell, um die Mechanismen, die den Auswirkungen von HypoPT auf die Mineralionenhomöostase zugrunde liegen, besser zu verstehen und die therapeutische Wirksamkeit neuer Behandlungen zu überprüfen. Hier wird berichtet, dass eine Technik zur Erzeugung einer erworbenen HypoPT bei männlichen Ratten durch die Durchführung einer Parathyreoidektomie (PTX) mit Kohlenstoffnanopartikeln erzeugt wird. Das Rattenmodell ist vielversprechend gegenüber den Mausmodellen des Hypoparathyreoidismus. Wichtig ist, dass die Bindungsregion des menschlichen PTH-Rezeptors eine Sequenzähnlichkeit von 84,2 % mit der Ratte aufweist, was höher ist als die Ähnlichkeit von 73,7 % mit Mäusen. Darüber hinaus wurden die Auswirkungen von Östrogen, das den PTH/PTHrP-Rezeptor-Signalweg beeinflussen kann, bei männlichen Ratten nicht vollständig untersucht. Kohlenstoff-Nanopartikel sind lymphatische Tracer, die die Schilddrüsenlymphknoten schwarz färben, ohne ihre Funktion zu beeinträchtigen, aber sie verfärben die Nebenschilddrüsen nicht, wodurch sie leicht zu erkennen und zu entfernen sind. In dieser Studie waren die PTH-Spiegel im Serum nach PTX nicht nachweisbar, was zu einer signifikanten Hypokalzämie und Hyperphosphatämie führte. Somit kann der klinische Zustand der postoperativen HypoPT im Rattenmodell bemerkenswert dargestellt werden. Kohlenstoff-Nanopartikel-gestütztes PTX kann daher als außerordentlich effektives und leicht implementierbares Modell für die Untersuchung der Pathogenese, Behandlung und Prognose der HypoPT dienen.
Introduction
Parathormon (PTH) wird von den Nebenschilddrüsen ausgeschüttet. Es ist ein wichtiger Modulator des Kalziumhaushalts, hält den Phosphatstoffwechsel aufrecht und ist am Knochenumsatz beteiligt 1,2. Hypoparathyreoidismus (HypoPT) äußert sich durch eine verminderte Sekretion oder einen funktionellen Verlust der PTH. Es handelt sich um eine seltene endokrine Erkrankung mit einer Prävalenz von etwa 9-37 pro 100.000 Personenjahre 3,4,5. Die HypoPT ist gekennzeichnet durch einen verminderten PTH- und Kalziumspiegel im Serum, der von einem erhöhten Serumphosphorspiegel begleitetwird 6,7. Die HypoPT wird nach ihrer Ursache klassifiziert: erworbener Hypoparathyreoidismus (AHypoPT) oder idiopathischer Hypoparathyreoidismus (IHypoPT)8. AHypoPT ist in der klinischen Praxis häufiger anzutreffen; Etwa 75% der AHypoPT-Fälle werden durch eine Resektion oder versehentliche Verletzung der Nebenschilddrüsen bei Schilddrüsenoperationen oder anderen Kopf- und Halsoperationen verursacht. Weitere Ursachen sind Strahlen- und Chemotherapie bei Kopf-Hals-Tumoren und Arzneimitteltoxizität 1,8. Verbesserte diagnostische Methoden und eine Zunahme des Screenings auf Schilddrüsen-assoziierte Erkrankungen haben die Zahl der Schilddrüsenoperationen erhöht. Dies hat zu einem entsprechenden Anstieg der damit verbundenen Nebenschilddrüsenkomplikationen geführt 9,10.
Um AHypoPT besser untersuchen und die therapeutische Wirksamkeit neuartiger Therapien verifizieren zu können, werden leicht zu etablierende Tiermodelle mit stabilen Eigenschaften benötigt. In früheren Studien wurde über eine Parathyreoidektomie (PTX) an Ratten und Mäusen berichtet 6,11; Aufgrund der extrem geringen Größe der Nebenschilddrüsen und der Variabilität in ihrer anatomischen Verteilung ist die Erfolgsquote in der Praxis jedoch relativ gering. So wird in der Regel eine Thyreo-Parathyreoidektomie (TPTX) (d. h. die vollständige Entfernung der Schilddrüse und der Nebenschilddrüsen) durchgeführt, um die Resektion der Nebenschilddrüsensicherzustellen 12. Die daraus resultierenden niedrigen Thyroxinspiegel können jedoch Studien mit diesem Tiermodell erschweren13. HypoPT-Modelle, die mit anderen Methoden, wie z.B. medikamentöser Stimulation und Geneditierung, etabliert wurden, können die häufigste AHypoPT-Pathogenese nicht adäquat abbilden. Unsere Gruppe verwendete zuvor Knockout-Mausmodelle, um die Nebenschilddrüsen zu markieren und die Entfernung der Nebenschilddrüsen zu ermöglichen, ohne die Schilddrüse und die umgebenden anatomischen Strukturen zu beschädigen14,15. Bei dieser Methode werden jedoch transgene Mausmodelle verwendet, die aufgrund der Paarungs- und Zuchtanforderungen eine längere Entwicklungszeit benötigen.
Daher war es unser Ziel, ein einfach zu generierendes Modell von AHypoPT zu etablieren. In dieser Arbeit wird ein Rattenmodell für PTX beschrieben, das die Markierung von Kohlenstoffnanopartikeln verwendet. Eine Kohlenstoff-Nanopartikel-Suspension von 50 mg/ml, die üblicherweise in der Schilddrüsenchirurgie verwendet wird, verteilt sich nach lokaler Injektion gleichmäßig in den Schilddrüsen16. Die Schilddrüsen verfärben sich schwarz, aber die Nebenschilddrüsen bleiben ungefärbt17, wodurch die Nebenschilddrüsen klar von den Schilddrüsen unterschieden werden und die PTX durchgeführt werden kann, ohne die Schilddrüse zu beeinträchtigen. Diese Methode ist für Ratten unterschiedlichen Alters geeignet. Die Injektion der Kohlenstoff-Nanopartikel-Suspension ist sicher und hat einen vernachlässigbaren Einfluss auf die Schilddrüsenfunktion18. Das in dieser Studie generierte Kohlenstoff-Nanopartikel-markierte PTX-Rattenmodell zeigte während des 4-wöchigen Beobachtungszeitraums signifikante Hypokalzämie- und Hyperphosphatämie-Phänotypen. Somit ist dieses AHypoPT-Modell einfach zu etablieren und hat einen reproduzierbaren Phänotyp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Diese Studie wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee am State Key Laboratory of Oral Diseases der Universität Sichuan genehmigt. Vor dem Experiment wurde die Genehmigung der zuständigen lokalen Behörden eingeholt. Für die vorliegende Studie wurden acht 8-10 Wochen alte männliche Sprague-Dawley (SD) Ratten mit einem Durchschnittsgewicht von 200-250 g verwendet. Die Tiere stammen aus einer kommerziellen Quelle (siehe Materialtabelle). Nahrung und Wasser wurden während des gesamten Versuchszeitraums ad libitum zur Verfügung gestellt.
1. Präoperative Vorbereitung für die Generierung von Kohlenstoff-Nanopartikel-gestützten PTX-Ratten
- Die 8-10 Wochen alten Ratten werden mit einer 2,0%-2,5%igen Isofluran-Inhalation anästhesiert, gefolgt von einer intraperitonealen (i.p.) Injektion von Tribromethanol mit 10 ml/kg Körpergewicht. Gewährleisten Sie eine ausreichende Narkosetiefe, indem Sie das Fehlen des Pupillenlichtreflexes testen. Verwenden Sie Tierarztsalbe auf den Augen, um Trockenheit unter Narkose zu vermeiden.
HINWEIS: Ratten, die 8-10 Wochen alt sind, werden als erwachsene Ratten erkannt. Diese Modellierungsmethode kann jedoch bei Ratten im Alter von nur 7 Tagen angewendet werden. - Bereiten Sie die anästhesierten SD-Ratten auf die Operation vor, indem Sie das Fell der ventralen Halsregion in Rückenlage rasieren. Desinfizieren Sie den Operationsbereich mit Povidon-Jod-Wattebällchen (siehe Materialtabelle).
- Decken Sie das Tier mit chirurgischen Abdecktüchern ab (siehe Materialtabelle) und legen Sie den chirurgischen Bereich frei, um die mikrobielle Kontamination zu minimieren.
2. Parathyreoidektomie (PTX)
- Beginnen Sie in der Mitte zwischen den beiden Ohren und schneiden Sie mit einem chirurgischen Skalpell einen 2 cm langen Schnitt in Längsrichtung zum Schwanz. Präparieren Sie die Faszien- und Fettschicht nacheinander mit einer scharfen, gebogenen, gezackten Pinzette.
- Trennen Sie die paratrachealen Muskeln und legen Sie die Luftröhre mit einer relativ stumpfen Pinzette unter einem Stereomikroskop bei 4-5-facher Vergrößerung frei.
- Lokalisieren Sie den linken und rechten Lappen der schmetterlingsförmigen Schilddrüsen an der Seite der Luftröhre.
- Injizieren Sie 1 μl der Kohlenstoff-Nanopartikel-Suspension (siehe Materialtabelle) mit einer 10-μl-Spritze und einer abgeschrägten 30-G-Nadel unter die Membran der Schilddrüsen. Spülen Sie nach 5 Minuten den Operationsbereich mit Kochsalzlösung, um die zusätzliche Kohlenstoff-Nanopartikel-Suspension zu reinigen, die die Schilddrüsenmembran bedeckt.
Anmerkungen: Der empfohlene Injektionspunkt ist der mesiale Teil des Schilddrüsenlappens, der weniger Blutgefäße aufweist. Eine Kohlenstoff-Nanopartikel-Suspension wird häufig in der Schilddrüsenchirurgie verwendet, da sie die Lymphknoten erkennen kann. Die Schilddrüse zu verfärben und die Nebenschilddrüsen ungefärbt zu lassen, erleichtert die Identifizierung der letzteren. - Stellen Sie sicher, dass sich die Schilddrüsen schwarz verfärben, während die Nebenschilddrüsen in ~5 Minuten ungefärbt bleiben. Beobachten Sie die hervorgehobenen Nebenschilddrüsen unter normalem Licht, entweder mit dem Licht eines Stereomikroskops oder einer Tischlampe.
Anmerkungen: Typischerweise haben Nagetiere zwei tropfenförmige Nebenschilddrüsen, die sich auf der linken und rechten Oberfläche der Schilddrüse befinden. Gelegentlich können sich weitere Nebenschilddrüsen weiter entfernt befinden. - Schneiden Sie die unverfärbten Nebenschilddrüsen mit einer mikrochirurgischen Zange und einer Schere präzise ab. Verwenden Sie sterile Wattebällchen für die Blutstillung oder einen Gelatineschwamm, wenn es mehr Blutungen gibt.
- Schließen Sie die Muskeln, Fettschichten und die Haut Schicht für Schicht mit einer unterbrochenen horizontalen Matratzennaht mit 6-0 Polyglactin 910-Nähten (siehe Materialtabelle).
- Führen Sie für die Scheingruppe alle Schritte der präoperativen Vorbereitung und PTX mit Ausnahme von Schritt 2.6 durch. Betäuben Sie die Ratten und trennen Sie das Gewebe über der Luftröhre. Lokalisieren Sie die Nebenschilddrüsen, aber entfernen Sie sie nicht. Führen Sie zusammen mit den Ratten der PTX-Gruppe eine postoperative Genesung und Beobachtung durch.
3. Postoperative Genesung und Beobachtung
- Legen Sie die Ratten nach der Operation auf eine thermostatische Heizdecke (37 °C), um ihre Körpertemperatur aufrechtzuerhalten. Als postoperative Analgesie wird Buprenorphinhydrochlorid 0,01 mg/kg subkutan (s.c) alle 12 h injiziert. Bringen Sie die Ratten in einen sterilen Käfig, wenn sie anfangen, sich zu bewegen und zu krabbeln.
- Beobachten Sie die Ratten postoperativ 2 h lang. Bringen Sie die Ratten in den Aufzuchtraum zurück, beobachten Sie sie routinemäßig und zeichnen Sie ihren Zustand auf.
- 7 Tage nach der Operation werden 10 μl Blut aus der Schwanzvene entnommen. Messen Sie das Serum-Ca2+, das Serum-Pi und das Serum-PTH mit geeigneten handelsüblichen Kits (siehe Materialtabelle). Eine erfolgreiche Parathyreoidektomie führt zu einem reduzierten ionisierten Serum-Ca2+-SD-Wert von 2+ , der niedriger ist als bei scheinoperierten Ratten (9,00 mmol/L, n = 16).
HINWEIS: Für die statistische Analyse wurde eine Statistik- und Grafiksoftware (siehe Materialtabelle) verwendet. Ein Schüler-t-Test wurde verwendet, um die Serum- und Harnparameter zwischen der Schein- und der PTX-Gruppe zu vergleichen. p < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Die Serum- und Urinwerte Ca2+ und Pi sowie der Serumharnstoff und das Kreatinin wurden mit handelsüblichen Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen (siehe Materialtabelle). Das Serum-C-Telopeptid von Kollagen Typ I und Osteocalcin wurde mit kommerziell erhältlichen ELISA-Kits gemessen (siehe Materialtabelle).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Die Lage und Anzahl der Nebenschilddrüsen wurden zunächst bei Ratten unter dem Präpariermikroskop beobachtet. Vor der Injektion von Kohlenstoff-Nanopartikeln waren die Schilddrüsen durchscheinend rot gefärbt und die Nebenschilddrüsen waren unter dem Mikroskop kaum zu unterscheiden (Abbildung 1A). Nach der Injektion der Nanopartikel waren die Schilddrüsen schwarz gefärbt, während die Nebenschilddrüsen ungefärbt blieben (Abbildung 1B). Die sorgfältige Präparation der hellen Nebenschilddrüsen ließ die Schilddrüsen unberührt (Abbildung 1C). Im Allgemeinen waren die Nebenschilddrüsen über die lateralen oder hinteren Ränder der Schilddrüsen verteilt.
Abbildung 1: Das Erscheinungsbild der Schilddrüse und der Nebenschilddrüsen während der chirurgischen Eingriffe. (A) Die Schilddrüsen (weiß gestrichelte Linie) befinden sich lateral der Luftröhre. (B,C) Die Schilddrüsen zeigten nach der Injektion der Kohlenstoff-Nanopartikel eine schwarze Färbung (weiße gestrichelte Linie), während die Nebenschilddrüsen (gelbe gestrichelte Linie) eine helle Farbe aufwiesen. Maßstabsbalken = 2 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Die Operationszeit von der präoperativen Vorbereitung bis zum Abschluss der PTX betrug ca. 20 min. Die 4-Wochen-Überlebensrate der postoperativen Ratten betrug 90,9% (60/66). Es wurde beobachtet, dass die PTX-Ratten 1 Woche nach der Operation bucklig waren. Eine scheingesteuerte Kontrollgruppe wurde gleichzeitig eingerichtet, indem alle Schritte des Protokolls mit Ausnahme von Schritt 2.6 ausgeführt wurden. Alle überlebenden, mit Kohlenstoffnanopartikeln markierten PTX-Ratten wiesen einen niedrigeren mittleren ionisiertenCa2+ -Spiegel auf, der 2 SD niedriger war als der der scheinoperierten Gruppe. Der Hypoparathyreoidismus-Phänotyp bei den mit Kohlenstoffnanopartikeln markierten PTX-Ratten, der sich durch reduziertes Serumkalzium, erhöhtes Serumphosphat und unentdecktes PTH zeigte, blieb während des 4-wöchigen Beobachtungszeitraums konstant.
7 Tage nach der Operation waren die Serum-Ca2+- und PTH-Spiegel bei den PTX-Ratten im Vergleich zur Scheingruppe signifikant reduziert (Ca2+ = 4,97 mmol/L ± 0,99 mmol/L vs. 8,98 mmol/L ± 0,58 mmol/L, p < 0,05; PTH = 13,13 pg/ml ± 6,58 v pg/ml s. 313,06 pg/ml ± 75,24 pg/ml, p < 0,05). Das Serum-Pi war nach der PTX-Operation signifikant erhöht (Pi = 13,90 mmol/L ± 1,77 mmol/L vs. 7,46 mmol/L ± 1,28 mmol/L). Die Serumspiegel von Harnstoff und Kreatinin waren 7 Tage nach der PTX-Operation zwischen der Schein- und der PTX-Gruppe vergleichbar (Harnstoff = 8,71 mmol/L ± 0,81 mmol/L vs. 8,84 mmol/L ± 0,89 mmol/L, p > 0,05; Kreatinin = 49,03 μmol/L ± 13,14 μmol/L vs. 53,15 μmol/L ± 18,28 μmol/L, p > 0,05). 14 Tage nach der PTX-Operation waren dieCa2+- und Pi-Spiegel im Urin signifikant reduziert (Ca 2+ = 2,33 mmol/L ± 0,53 mmol/L vs. 7,18 mmol/L ±4,27 mmol/L, p < 0,05; Pi = 2,40 mmol/L ± 1,90 mmol/L vs. 5,29 mmol/L ± 1,52 mmol/L, p < 0,05) (Abbildung 2).
Abbildung 2: Serum-Ca2+-, Pi-, PTH-, Harnstoff- und Kreatininspiegel sowie Ca2+- und Pi-Spiegel im Urin nach Kohlenstoff-Nanopartikel-unterstützter Parathyreoidektomie. (A) Die PTX-Ratten zeigten über den 4-wöchigen Beobachtungszeitraum eine stabile Hypokalzämie und Hyperphosphatämie (N = 4). (B) Serum-PTH war bei den PTX-Ratten 7 Tage nach der Operation nicht nachweisbar (N = 8). (C,D) Die Serumspiegel von Harnstoff und Kreatinin waren 7 Tage nach der Operation zwischen der Schein- und der PTX-Gruppe vergleichbar (N = 5). (E,F) DieCa2+- und Pi-Spiegel im Urin waren 14 Tage nach der PTX-Operation signifikant reduziert (N = 8). Die Fehlerbalken geben die Standardabweichung an. Abkürzungen: PTX = Parathyreoidektomie; Ca++ = ionisiertes Calcium im Serum; PTH = Parathormon; Pi = ionisierter Phosphor im Serum. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Es zeigten sich keine signifikanten Unterschiede im Körpergewicht zwischen der PTX- und der Scheingruppe am postoperativen Tag 7 (POD7), POD14 und POD28 (Körpergewicht an POD0 = 256,40 g ± 4,76 g vs. 252,56 g ± 6,69 g, p > 0,05; Körpergewicht an POD7 = 266,00 g ± 6,93 g vs. 257,44 g ± 30,56 g, p > 0,05; Körpergewicht an POD14 = 294,80 g ± 25,90 g vs. 288,22 g ± 37,35 g, p > 0,05; Körpergewicht an POD28 = 327,75 g ± 24,82 g vs. 324,17 g ± 57,97 g, p > 0,05). Darüber hinaus war das Serum-C-Telopeptid von Typ-I-Kollagen (CTX-1) an POD28 statistisch erniedrigt (CTX-1 = 82,03 pg/ml ± 8,98 pg/ml vs. 100,33 pg/ml ± 6,36 pg/ml, p < 0,05). Das Serumosteocalcin zeigte keinen signifikanten Unterschied bei POD28 (Osteocalcin = 913,66 pg/ml ± 378,03 pg/ml vs. 1066,17 pg/ml ± 549,80 pg/ml, p > 0,05) (Abbildung 3).
Abbildung 3: Körpergewicht, C-Telopeptid des Typ-I-Kollagens im Blut und Osteocalcinspiegel nach Kohlenstoff-Nanopartikel-assistierter Parathyreoidektomie. (A) Es gab keine signifikanten Unterschiede im Körpergewicht zwischen der PTX- und der Scheingruppe auf POD7, POD14 und POD28 (N = 14). (B) Die PTX-Ratten zeigten eine statistische Abnahme des Serum-C-Telopeptids von Typ-I-Kollagen (N = 4). (C) Es zeigten sich keine signifikanten Unterschiede in den Serum-Osteocalcin-Spiegeln (N = 5). Die Fehlerbalken geben die Standardabweichung an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Epidemiologische Berichte deuten darauf hin, dass die Erkennung von Schilddrüsenerkrankungen deutlich zugenommen hat und die Zahl der damit verbundenen Operationen entsprechend zugenommen hat19,20. Die Inzidenzrate des postoperativen Hypoparathyreoidismus liegt bei etwa 7,6 %8,21, während die erhöhte Morbidität des erworbenen Hypoparathyreoidismus dazu geführt hat, dass diese seltene Erkrankung größere Aufmerksamkeit in der Forschung erregt hat. Daher ist es besonders wichtig, ein geeignetes Tiermodell zu etablieren, um die Pathogenese der Krankheit zu untersuchen und die Ergebnisse neuer therapeutischer Behandlungen zu testen. Derzeit stehen jedoch nur begrenzte Tiermodelle zur Verfügung. Darüber hinaus sind die Erfolgsrate, die Überlebensrate und die Schwierigkeit chirurgischer Eingriffe bei der Herstellung solcher Modelle nach wie vor problematisch. Unsere Gruppe hat bereits über zwei HypoPT-Modelle bei Mäusen berichtet. Bei PTHcre+/Rosa-mTmG-Mäusen wurden die Nebenschilddrüsen fluoreszenzmarkiert, um die Nebenschilddrüsen genau zu präparieren, und diese Methode war auch hilfreich, um Nebenschilddrüsen mit abnormaler anatomischer Verteilung zu finden, um die Erfolgsrate der Operation zu verbessern14. Ein weiterer Modellierungsansatz verwendete transgene Mäuse, bei denen Nebenschilddrüsenzellen mit Diphtherietoxin angegriffen werden konnten. Die Nebenschilddrüsen konnten dann durch die systemische Gabe des Diphtherietoxins zerstört werden, ohne dass eine Operation erforderlich war14,15. Die oben genannten Methoden erfordern jedoch umfangreiche Kreuzungen von transgenen Mäusen, was zu einem relativ hohen Zeit- und Kostenaufwand führt. Darüber hinaus kann die systemische Verabreichung von Diphtherietoxin weitreichende Nebenwirkungen haben. Derzeit ist die Thyreo-Parathyreoidektomie (TPTX) das übliche Verfahren, um die Resektion der Nebenschilddrüsen zu gewährleisten12. Obwohl die Technik einfach durchzuführen ist und eine hohe Erfolgsquote hat, kann die Schädigung der Schilddrüse nicht ignoriert werden. Der mögliche Einfluss einer Verletzung oder Zerstörung der Schilddrüse auf die experimentellen Ergebnisse könnte erheblich sein, was bedeutet, dass dies eine wesentliche Einschränkung aller Studien auf diesem Gebiet darstellt21,22.
In der aktuellen Studie wurde eine Kohlenstoff-Nanopartikel-Suspension, die in der klinischen Praxis üblicherweise zur Visualisierung der Schilddrüse verwendet wird, injiziert, um die PTX-Operation zu verbessern. Diese Methode ist sicher, schnell und sehr praktikabel. Es kann die Schilddrüsen effektiv mit einer schwarzen Färbung markieren und die Nebenschilddrüsen ungefärbt lassen, was die präzise Identifizierung und Dissektion der Nebenschilddrüsen ermöglicht und gleichzeitig eine Verletzung der Schilddrüse vermeidet. Diese Markierungsmethode hat den gleichen Effekt wie die Fluoreszenzmarkierung von transgenen Mäusen, ist aber nicht durch den Genotyp begrenzt. Darüber hinaus beträgt die Operationszeit von Kohlenstoff-Nanopartikel-gestütztem PTX etwa 20 Minuten, was im Vergleich zu der 2-stündigen Operation, die für die 5-ALA-Fluoreszenzidentifikation erforderlich ist, Zeit spart23. Darüber hinaus kann diese Modellierungsmethode aufgrund der Biosicherheit der Kohlenstoff-Nanopartikel24 bei Ratten im Alter von nur 7 Tagen angewendet werden. Ein wichtiger Schritt, der während der Operation zu beachten ist, ist, dass die Dosierung der Kohlenstoff-Nanopartikel-Suspension an das Gewicht der Ratten angepasst werden kann. Das Volumen der in dieser Studie verwendeten Kohlenstoff-Nanopartikel-Suspension (1 μL) reicht für eine Operation an erwachsenen Ratten aus, selbst wenn eine gewisse Menge in der Spritze verloren geht. Die Verteilung aller Nebenschilddrüsen ist für Anfänger schwer zu erkennen, und viel Übung wird empfohlen.
Die aktuelle Studie weist einige Einschränkungen auf. Zum Beispiel ist es unmöglich, entfernte Nebenschilddrüsen zu identifizieren, die nicht mit der Schilddrüse verbunden sind, mit Kohlenstoff-Nanopartikeln. Wenn die Serumparameter nach der Operation unverändert bleiben, kann dies darauf hindeuten, dass einige entfernte Nebenschilddrüsen vorhanden waren und nicht entfernt wurden. Die für die optimale Differenzierung und Identifizierung der Nebenschilddrüsen erforderliche Färbezeit wurde nicht gemessen; Die Schilddrüsen wurden jedoch innerhalb von 5 Minuten nach der Verabreichung der Nanopartikel richtig gefärbt und behielten die Färbung während des gesamten chirurgischen Eingriffs. Die Funktion der Schilddrüsen während der Nachbeobachtungszeit wurde in dieser Studie nicht erfasst. In unserer vorherigen Studie, in der ein transgenes Mausmodell zur Identifizierung und Entfernung der Nebenschilddrüsen verwendet wurde, konnte jedoch gezeigt werden, dass die Schilddrüsenfunktion erhalten bleibt15. Auch die Toleranz der Ratten gegenüber den Kohlenstoff-Nanopartikeln wurde in dieser Studie nicht getestet; Diese Nanopartikel wurden jedoch kommerziell als Arzneimittel in klinischen Operationen eingesetzt16. Im Allgemeinen ermöglicht diese Methode den Forschern, ein Tier mit einem gewünschten Genotyp und Operationszeitpunkt auszuwählen. Letztendlich wird erwartet, dass dieser Ansatz nützliche Rattenmodelle für erworbenen Hypoparathyreoidismus liefern wird.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch das NSFC-Stipendium 81800928, die Forschungsförderung der West China School/Hospital of Stomatology der Sichuan University (Nr. RCDWJS2021-1) und das State Key Laboratory of Oral Diseases Open Funding Grant SKLOD-R013 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium Chloride Solution | Kelun Co. Sichuan, China | ||
| 10 µL 30G NanoFil Syringe | WPI | ||
| 6-0 polyglactin 910 suture with needle | Ethicon, Inc | J510G | |
| Calcium LiquiColor test | EKF | 0155-225 | For Ca2+ analysis |
| Carbon Nanoparticles Suspension Injection | Lummy, Chongqing, China | H20073246 | 1 mL : 50 mg |
| Creatinine (Cr) Assay kit ( sarcosine oxidase ) | Jiancheng, Nanjing, China | C011-2-1 | For creatinine analysis |
| Disposable Scalpel | Shinva, China | ||
| Dumstar Biology forceps | Shinva, China | ||
| Micro Dissecting Spring Scissors | Shinva, China | ||
| MicroVue Rat intact PTH ELISA | Immunotopics | 30-2531 | For the measurement of PTH in rat serum |
| Needle Holder | Shinva, China | ||
| Phosphorus Liqui-UV test | EKF | 0830-125 | For Pi analysis |
| Ply gauze | Weian Co. Henan, China | ||
| Povidone-Iodine | Yongan pharmaceutical Co.Ltd. Chengdu, China | ||
| Prism 9.0 (statistics and graphing software) | GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ | |
| Rat C-telopeptide of type I collagen (CTX-I) ELISA Kit | CUSABIO, Wuhan, China | CSB-E12776r | For CTX-I analysis |
| Rat Osteocalcin/Bone Gla Protein (OT/BGP) ELISA Kit | CUSABIO, Wuhan, China | CSB-E05129r | For osteocalcin analysis |
| Safety Single Edge Razor Blades | American Safety Razor Company | 66-0089 | |
| Sprague-Dawley Rats | 8 to 10 weeks old | ||
| Surgical Incise Drapes | Liangyou Co. Sichuan, China | ||
| Urea Assay Kit | Jiancheng, Nanjing, China | C013-2-1 | For urea analysis |
References
- Bilezikian, J. P., et al. Hypoparathyroidism in the adult: Epidemiology, diagnosis, pathophysiology, target-organ involvement, treatment, and challenges for future research. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (10), 2317-2337 (2011).
- Bilezikian, J. P.
- Underbjerg, L., Sikjaer, T., Mosekilde, L., Rejnmark, L. Postsurgical hypoparathyroidism-Risk of fractures, psychiatric diseases, cancer, cataract, and infections. Journal of Bone and Mineral Research. 29 (11), 2504-2510 (2014).
- Underbjerg, L., Sikjaer, T., Mosekilde, L., Rejnmark, L. The epidemiology of nonsurgical hypoparathyroidism in Denmark: A nationwide case finding study. Journal of Bone and Mineral Research. 30 (9), 1738-1744 (2015).
- Astor, M. C., et al. Epidemiology and health-related quality of life in hypoparathyroidism in Norway. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 101 (8), 3045-3053 (2016).
- Rodriguez-Ortiz, M. E., et al. Calcium deficiency reduces circulating levels of FGF23. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (7), 1190-1197 (2012).
- Davies, B. M., Gordon, A. H., Mussett, M. V. A plasma calcium assay for parathyroid hormone, using parathyroidectomized rats. The Journal of Physiology. 125 (2), 383-395 (1954).
- Clarke, B. L., et al.
- Liu, Y., Shan, Z. Expert consensus on diagnosis and treatment for elderly with thyroid diseases in China. Aging Medicine. 4 (2), 70-92 (2021).
- Sulejmanovic, M., Cickusic, A. J., Salkic, S., Bousbija, F. M. Annual incidence of thyroid disease in patients who first time visit department for thyroid diseases in Tuzla Canton. Materia Socio-Medica. 31 (2), 130-134 (2019).
- Liao, H. W., et al. Relationship between fibroblast growth factor 23 and biochemical and bone histomorphometric alterations in a chronic kidney disease rat model undergoing parathyroidectomy. PloS One. 10 (7), 0133278 (2015).
- Russell, P. S., Gittes, R. F. Parathyroid transplants in rats: A comparison of their survival time with that of skin grafts. The Journal of Experimental Medicine. 109 (6), 571-588 (1959).
- Sakai, A., et al. Osteoclast development in immobilized bone is suppressed by parathyroidectomy in mice. Journal of Bone and Mineral Metabolism. 23 (1), 8-14 (2005).
- Bi, R., Fan, Y., Luo, E., Yuan, Q., Mannstadt, M. Two techniques to create hypoparathyroid mice: parathyroidectomy using GFP glands and diphtheria-toxin-mediated parathyroid ablation. Journal of Visualized Experiments. (121), e55010 (2017).
- Bi, R., et al. Diphtheria toxin- and GFP-based mouse models of acquired hypoparathyroidism and treatment with a long-acting parathyroid hormone analog. Journal of Bone and Mineral Research. 31 (5), 975-984 (2016).
- Huang, Y., et al. Carbon nanoparticles suspension injection for photothermal therapy of xenografted human thyroid carcinoma in vivo. MedComm. 1 (2), 202-210 (2020).
- Zhang, R. J., Chen, Y. L., Deng, X., Yang, H. Carbon nanoparticles for thyroidectomy and central lymph node dissection for thyroid cancer. The American Surgeon. , (2022).
- Long, M., et al. A carbon nanoparticle lymphatic tracer protected parathyroid glands during radical thyroidectomy for papillary thyroid non-microcarcinoma. Surgical Innovation. 24 (1), 29-34 (2017).
- Li, Y., et al. Efficacy and safety of long-term universal salt iodization on thyroid disorders: Epidemiological evidence from 31 provinces of mainland China. Thyroid. 30 (4), 568-579 (2020).
- Powers, J., Joy, K., Ruscio, A., Lagast, H. Prevalence and incidence of hypoparathyroidism in the United States using a large claims database. Journal of Bone and Mineral Research. 28 (12), 2570-2576 (2013).
- Zihao, N., et al. Promotion of allogeneic parathyroid cell transplantation in rats with hypoparathyroidism. Gland Surgery. 10 (12), 3403-3414 (2021).
- Goncu, B., et al. Xenotransplantation of microencapsulated parathyroid cells as a potential treatment for autoimmune-related hypoparathyroidism. Experimental and Clinical Transplantation. , (2021).
- Jung, S. Y., et al. Standardization of a physiologic hypoparathyroidism animal model. PLoS One. 11 (10), 0163911 (2016).
- Chen, W., Lv, Y., Xie, R., Xu, D., Yu, J. Application of lymphatic mapping to recognize and protect parathyroid in thyroid carcinoma surgery by using carbon nanoparticles. Journal of Clinical Otorhinolaryngology, Head, and Neck Surgery. 28 (24), 1918-1920 (1924).
