Summary
يتم تقديم بروتوكول للعزل المريح وعالي الإنتاجية وإثراء الرؤوس الغدية المطاردة و trichomes اللاطئة من Cannabis sativa. يعتمد البروتوكول على استخراج جاف وغير عازل للترايكهومات باستخدام النيتروجين السائل والثلج الجاف والمناخل المصنوعة من النايلون فقط وهو مناسب لاستخراج الحمض النووي الريبي والتحليل النسخي.
Abstract
تقدم هذه الورقة بروتوكولا للعزل المريح وعالي الإنتاجية وإثراء الرؤوس الغدية المطاردة والثلاثية اللاطئة من Cannabis sativa. يتم تحديد مسارات التخليق الحيوي للقنب واستقلاب التربين المتطاير بشكل أساسي في trichomes القنب ، و trichomes المعزولة مفيدة لتحليل النسخ. البروتوكولات الحالية لعزل trichomes الغدية للتوصيف النسخي غير مريحة وتوفر رؤوس trichome للخطر وكمية منخفضة نسبيا من trichomes معزولة. علاوة على ذلك ، يعتمدون على أجهزة باهظة الثمن ووسائط عزل تحتوي على مثبطات البروتين لتجنب تدهور الحمض النووي الريبي. يقترح البروتوكول الحالي الجمع بين ثلاثة تعديلات فردية للحصول على كمية كبيرة من التريكومات الغدية المعزولة والمطاردة اللاطئة من النورات الأنثوية الناضجة C. sativa وأوراق المروحة ، على التوالي. يتضمن التعديل الأول استبدال النيتروجين السائل بوسط العزل التقليدي لتسهيل مرور الترايكهوم عبر المناخل الدقيقة. يتضمن التعديل الثاني استخدام الثلج الجاف لفصل trichomes عن مصدر النبات. يتضمن التعديل الثالث تمرير المادة النباتية على التوالي من خلال خمسة غرابيل دقيقة ذات أحجام مسام متناقصة. أظهر التصوير المجهري فعالية تقنية العزل لكلا النوعين من الترايشوم. بالإضافة إلى ذلك ، كانت جودة الحمض النووي الريبي المستخرج من trichomes المعزولة مناسبة لتحليل النسخ النهائي.
Introduction
trichomes الغدية هي هياكل تشبه الشعر موجودة في النباتات التي تحتوي على العديد من المستقلبات الثانوية1 وتمثل بنكا قيما لجينات وإنزيمات التخليق الحيوي الجديدة2. في القنب ، يتم توطين التخليق الحيوي للمستقلبات الثانوية الهامة ، القنب 3 والتربين4 ، في trichomes. بالنظر إلى دور trichomes في تحديد جودة القنب للاستخدامات الطبية والترفيهية على حد سواء ، فإن دراسة التعبير الجيني trichome ذات أهمية. لتوصيف التعبير عن الجينات الخاصة بالتريشومي ، يجب أولا عزل trichomes ذات الأهمية. تم وصف بروتوكولات عزل Trichome لأول مرة في وقت مبكر من عام 19925 ، وقد تمت مراجعة أحدث تطوراتها مؤخرا2. بشكل عام ، يمكن تقسيم بروتوكولات استخراج trichomes الغدية للتوصيف النسخي إلى خطوتين متسلسلتين متميزتين. تتضمن الخطوة الأولى فصلا ماديا شاملا للترايكهوم عن الأنسجة النباتية. يمكن تنفيذ هذه الخطوة باستخدام الثلج الجاف5 ، أو الخرز الزجاجي بجهاز تجاري 6,7 ، أو طحن المادة النباتية مقابل غربال شبكي8 ، أو دوامة الأنسجة النباتية في مخزن عازلللعزل 9. تتضمن الخطوة الثانية فصلا أكثر دقة للترايكهومات ذات الأهمية عن بقايا النباتات المجهرية و / أو أنواع trichome الأخرى. يمكن تنفيذ هذه الخطوة باستخدام الطرد المركزي المتدرج الكثافة 8,10 أو المناخل بأحجام مختلفة 7,9. نظرا للحساسية الشديدة للحمض النووي الريبي في الأنسجة المصنعة للعوامل المهينة ، عادة ما يتم إجراء هاتين الخطوتين المتتابعتين في وسط عزل الجليد البارد ، غالبا في وجود مثبطات البروتين4.
تتطلب بروتوكولات عزل trichome التقليدية ، بالإضافة إلى درجات الحرارة الباردة الجليدية ، كميات كبيرة من وسط العزل لضمان إجراء استخراج فعال. ينتج عن الجمع بين هذه المكونات عملية عزل شاقة وتستغرق وقتا طويلا وتعيق الإنتاجية العالية. لذلك ، من المحتمل أن يكون تقديم بروتوكول عزل ثلاثي الرؤوس بديل مباشر وسهل الاستخدام مفيدا لمختلف الجوانب المرتبطة بتوصيف trichome. تهدف هذه الورقة إلى تقديم بروتوكول بديل لعزل trichomes المسكرة والغدد اللاطئة من القنب ساتيفا من خلال الجمع بين عدة عناصر من البروتوكولات التقليدية ودمجها. تشمل هذه العناصر الثلج الجاف5 ، ومرور trichomes عبر العديد من المناخل الدقيقة ذات أحجام المسام المتناقصة 7,9 ، واستبدال النيتروجين السائل (LN) بوسط العزل8.
إن حداثة بروتوكول عزل trichome الحالي ، مقارنة بالبروتوكولات التقليدية ، تقدم بعدة طرق. هذا البروتوكول مناسب ، لأنه لا يتطلب مكونات خطرة. يمكن إجراء العملية في المختبر بأقل قدر من الاحتياطات وتسهل الإنتاجية العالية. يضمن استبدال LN بوسط عزل السائل القياسي سلامة trichomes طوال عملية العزل ، مما يتيح التحليل النسخي اللاحق. عند تسامي LN والثلج الجاف ، تترك trichomes المعزولة خالية من المخلفات الضارة. علاوة على ذلك ، فإن ميل LN إلى التسامي في درجة حرارة الغرفة يسمح باستخدامه السخي في جميع أنحاء البروتوكول. في المقابل ، فإن استخدام كميات كبيرة من وسيط العزل التقليدي يولد صعوبات عملية في التعامل معها. أخيرا ، يقلل البروتوكول من فصل خلية القرص عن بنية الرأس الهشة المتبقية للثلاثي الغدي ، مما يتيح الاحتفاظ بمحتوى مساحة الرأس.
يتم تقديم هذا البروتوكول بطريقة مفصلة خطوة بخطوة مصممة للمساعدة في الممارسة الفنية لعزل C. sativa غدية trichomes. يوفر البروتوكول سير عمل يمكن التحكم فيه ينتج عنه ترايكهومات معزولة ذات تركيز عال ونقاء مناسبين للتحليل الجزيئي النهائي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: تألفت المادة النباتية المستخدمة في هذه الدراسة من أربع سلالات C. sativa ARO-Volcani (CS-11 و CS-12 و CS-13 و CS-14) التي نمت في مركز البركان ، إسرائيل ، كما هو موضح في مكان آخر11. تم عزل trichomes المطاردة الغدي من النورات المزهرة الناضجة ، وتم عزل trichomes اللاطئة الغدية من أوراق المروحة الكبيرة من النباتات الأم الناضجة غير المزهرة. تم اختيار جميع المواد النباتية حديثا وتخزينها على الفور عند -80 درجة مئوية.
تنبيه: يتم استخدام الثلج الجاف و LN في جميع أنحاء البروتوكول. هذه المواد خطرة للغاية. يمكن أن تحتوي trichomes المعزولة على جزيئات ثلج جاف يمكن أن تخلق ضغطا خطيرا للغاز عند إدخالها في أنابيب محكمة الغلق ؛ لذلك ، يجب ثقب جميع القبعات بالإبرة. ينصح بشدة باستخدام نظارات واقية وملابس معملية مناسبة وقفازات للتعامل مع درجات حرارة منخفضة للغاية.
1. الإعداد للفصل الأولي للترايكهومات من المواد النباتية
- سحق كتلة ثلج جاف إلى رقائق صغيرة ناعمة باستخدام مطرقة وجسم مسطح صلب في حاوية بلاستيكية سعة 5 لتر.
- غربلة رقائق الثلج الجاف الناعم (أصغر من 5 مم) من الثلج الجاف غير المسحوق بمصفاة كبيرة (عبر مسام أصغر من 5 مم) في حاوية بلاستيكية أخرى سعة 5 لتر. صب ما يقرب من 200 سم3 (علامة 200 مل) من رقائق الثلج الجاف في دورق زجاجي مستقيم سعة 1 لتر.
- أضف ما يصل إلى 10 جم من نورات C. sativa المجمدة (من الآن فصاعدا يشار إليها باسم المواد النباتية) على الطبقة الأولى من الثلج الجاف المسحوق ، وقم بتغطيتها بطبقة إضافية من 200 سم3 من الثلج الجاف المسحوق ناعما.
- قم بتغطية فتحة الدورق الزجاجي سعة 1 لتر بطبقتين إلى ثلاث طبقات من ناموسية باب الشاشة 1 مم ، وقم بتثبيتها على الجوانب الخارجية للكوب الزجاجي بأشرطة مطاطية (الشكل 1).
- صب LN في حاوية كبيرة مستديرة القاع من الفولاذ المقاوم للصدأ (انظر جدول المواد) ، حيث سيتم جمع trichomes المعزولة.
- أدخل شبكة 350 ميكرومتر في مصفاة غربال / غربال الدقيق لتغطية شبكة غربال الدقيق من الأسفل (الشكل 2). في حالة توفر منخل دقيق بحلقة بلاستيكية قابلة للفصل ، أدخل شبكة 350 ميكرومتر بحيث يتم تثبيتها أسفل شبكة غربال الدقيق. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فقم بتأمين شبكة 350 ميكرومتر في محيط منخل الدقيق باستخدام الأربطة المطاطية.
- ضع منخل الدقيق فوق الحاوية الكبيرة المستديرة السفلية المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ المملوءة ب LN (الشكل 3). تأكد من أن عرض الحاوية يتجاوز عرض غربال الدقيق لتقليل فقد الكتلة المنخل خارج الحاوية المستديرة السفلية المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ.
2. فصل trichomes عن المواد النباتية
- رج الكوب سعة 1 لتر مع توجيه فتحته لأسفل نحو غربال الدقيق كما لو كنت تستخدم شاكر ملح كبير (الشكل 4).
- ضع الدورق الزجاجي سعة 1 لتر جانبا كل 2-3 دقائق للسماح بغربلة الثلج الجاف المسحوق والمواد النباتية المتراكمة على منخل الدقيق.
- نخل منخل الدقيق أفقيا لتسهيل مرور المادة النباتية إلى LN في حاوية الفولاذ المقاوم للصدأ ذات القاع المستدير أدناه.
- أضف LN إلى حاوية الفولاذ المقاوم للصدأ والثلج الجاف المسحوق إلى الدورق الزجاجي سعة 1 لتر عندما تنخفض مستوياته. قم بتجديد المواد النباتية المستخدمة في الدورق الزجاجي ب 10 جم إضافية من المواد النباتية الطازجة عند استنفاد المواد النباتية الموجودة في غربال الدقيق. عادة لا يلزم تكرار التجديد أكثر من مرتين.
- كرر الخطوات 2.1-2.4 حتى يتم جمع كمية كافية من trichomes المخصبة في حاوية الفولاذ المقاوم للصدأ ذات القاع المستدير. بشكل عام ، 20 جم من المواد النباتية الطازجة كافية لاستخراج الحمض النووي الريبي وتحليل النسخ.
- تحقق من وجود مادة تشبه المسحوق الأبيض (تتكون من بقايا النبات ، و trichomes الغدية ، والثلج الجاف المجروش) في قاع حاوية الفولاذ المقاوم للصدأ المغمورة في LN. ستساعد الملاحظة المجهرية في تحديد ما إذا كان قد تم جمع كمية كافية من trichomes ؛ ومع ذلك ، قد تعيق هذه الخطوة تدفق البروتوكول. عادة ، يكفي 10-20 جم من المواد النباتية الأولية لمعظم العزلات ؛ ومع ذلك ، قد تكون هناك اختلافات في كثافة trichome للنباتات.
ملاحظة: من هذه النقطة، يمكن إيقاف التجربة مؤقتا وإعادة تشغيلها لاحقا. إذا تم إيقافه مؤقتا لفترة قصيرة ، فيجب إضافة كميات كافية من LN بحيث تظل trichomes مغمورة. بدلا من ذلك ، يمكن جمع trichomes وتخزينها في -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر لاستخدامها لاحقا ، كما هو موضح في الخطوة 5.
3. فصل trichomes الرأسية الغدية (المطاردة واللاطئة) عن أنواع trichome الأخرى ، مثل trichomes منتفخة و cystolithic ، والحطام
- أضف كمية صغيرة من LN إلى وعاء صغير نظيف من الفولاذ المقاوم للصدأ مستدير القاع.
- قم بطي غربال دقيق 40 سم × 40 سم بحجم شبكة 150 ميكرومتر مرتين للحصول على طية 20 سم × 20 سم ، وافتحه. تأكد من أنه يشبه الشكل المخروطي (الشكل 5).
- ثبت مخروط الشبكة على حافة الحاوية المستديرة السفلية المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ باستخدام واحد أو اثنين من مشابك الغسيل بحيث يكون الجزء المفتوح من المخروط في وضع مستقيم ويتم غمر الجزء المدبب جزئيا في LN.
- صب برفق LN والمواد الشبيهة بالمسحوق الأبيض من الخطوة 2.6 في مخروط الغربال الدقيق.
- ضع فرشاة عريضة برفق لجمع ونقل أي مادة نباتية متبقية من الحاوية الأولى إلى مخروط شبكي 150 ميكرومتر.
- أضف المزيد من LN إلى الحاوية الأولى ، وكرر حركة التنظيف بالفرشاة حتى يتم نقل جميع المواد النباتية إلى مخروط الغربال الدقيق.
- افصل مشابك الغسيل بعناية عن غطاء الحاوية ، وافتح مخروط الغربال الصغير بحيث توجد trichomes في منتصف الغربال الصغير المفتوح. امسك جميع الزوايا الأربع للغربال الصغير معا بحيث يظل الجزء الأوسط الذي يحتوي على trichomes مغمورا في LN (الشكل 6).
- أثناء إمساك جميع الزوايا الأربع للمنخل الصغير ، اغمس المنخل الصغير برفق وهزه في LN في الحاوية الفولاذية كما لو كنت تغرس كيس الشاي. استمر في حركة الغمس / الاهتزاز (الرأسية والأفقية) لمدة 1 دقيقة. هناك مقايضة بين جودة العزلة والكمية. قد تؤدي حركات الغمس الأطول إلى كميات أكبر من trichomes ، ولكن قد تكون درجة عزلها أسوأ. بشكل عام ، يوصى باستخدام 1 دقيقة على أنها كافية لكل من الجودة والكمية.
ملاحظة: حركة الغربلة هذه هي الجزء الأكثر أهمية في البروتوكول ويجب تنفيذها وفقا لذلك. - اختياري: اغرف حطام النبات غير المنخل و trichomes الأكبر (لا يزال مغمورا في LN) التي يتم لفها في وسط الغربال الصغير في أنبوب اختبار 13 مل أو 50 مل ، وتخزينها في -80 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل.
تنبيه: لتجنب تراكم الغاز المضغوط (من الثلج الجاف وبقايا LN) ، قم بثقب ثقب في غطاء أنبوب الاختبار بإبرة معقمة. يمكن استبدال الغطاء بمجرد انخفاض الضغط ، والذي عادة ما يكون بعد 24 ساعة.
4. تمرير trichomes من خلال المناخل الدقيقة من تناقص حجم المسام
- قم بنقل trichomes المنخل المغمور في LN في الجزء السفلي من حاوية الفولاذ المقاوم للصدأ الصغيرة ذات القاع المستدير بالتتابع من خلال المناخل الدقيقة ذات أحجام المسام المتناقصة (105 ميكرومتر ، 80 ميكرومتر ، 65 ميكرومتر ، و 50 ميكرومتر) ، بنفس الطريقة الموضحة في الخطوة 3.
5. مجموعة من trichomes المطلوبة
- قم بإزالة trichomes المرغوبة المغمورة في LN وملفوفة في غربال دقيق 50 ميكرومتر باستخدام ملعقة مبردة مسبقا (في LN). ضعها على طبق نظيف.
ملاحظة: في مرحلة العزل النهائية هذه ، يتم جمع trichomes المطلوبة من الغربال. - انقل بسرعة trichomes الشبيهة بالمسحوق إلى أنبوب 1.5 مل مبرد مسبقا عبر ملعقة مبردة مسبقا أو مغرفة يتم إدخالها في الأنبوب (الشكل 7). قم بتخزين الأنابيب على الفور عند -80 درجة مئوية لمزيد من الدراسات.
ملاحظة: يرد مخطط سير عمل تخطيطي يصور بروتوكول العزل بالكامل في الشكل 8.
6. مراقبة وتحليل trichomes المنقى
- ضع كمية صغيرة (10 ملغ) من trichomes المعزولة على شريحة مجهرية باستخدام ملعقة مبردة مسبقا (عبر LN). أضف قطرة ماء ، وراقب مباشرة على المجهر الضوئي دون تلطيخ. قم بتقييم درجة العزل والتلوث الإجمالية باستخدام تكبيرات منخفضة (10x) وعالية (40x). يتم تقدير التخصيب بصريا من خلال الكمية النسبية من trichomes فيما يتعلق بالأنسجة غير trichome ، كما هو موضح في الشكل 9.
- إجراء استخراج الحمض النووي الريبي وتحليل الجودة من 50 ملغ من C. ساتيفا غدية معزولة تطارد trichomes و trichomes.
ملاحظة: تم استخدام مجموعة استخراج تجارية (انظر جدول المواد) تستخدم استراتيجية قائمة على poly-A لتنقية mRNA لاستخراج الحمض النووي الريبي.- أعد تعليق 50 مجم من trichomes المعزولة في محلول التحلل ، دوامة لمدة 30 ثانية ، صوتنة في وحدة تنظيف بالموجات فوق الصوتية الباردة عند 35 كيلو هرتز لمدة 5 دقائق ، واستخراج mRNA من العينات وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
- لتقدير سلامة الحمض النووي الريبي المستخرج من trichomes ، حدد تركيز الحمض النووي الريبي ، والكمية الإجمالية ، وقيم رقم سلامة الحمض النووي الريبي (RIN) باستخدام نظام مختبر على رقاقة (انظر جدول المواد).
- إجراء تحليل RNAseq لكسور trichome (اختياري). يمكن إجراء تحليل RNAseq وتحليلات المعلوماتية الحيوية للقراءات المتسلسلة من خلال خدمات الاستعانة بمصادر خارجية القياسية
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
التعديل الرئيسي المتضمن في هذا البروتوكول مقارنة ببروتوكولات العزل التقليدية trichome هو استبدال وسيط العزل القياسي ب LN. يسمح استخدام LN كوسيط عزل بسير عمل مريح ، لأنه طالما أن العينات مغمورة في LN ، فمن غير المحتمل أن يحدث تدهور أيضي. علاوة على ذلك ، نظرا لأن البروتوكول يتجنب المكونات الخطرة (مثل حمض أورينتريكربوكسيليك و β-ميركابتوإيثانول) المستخدمة في وسط عزل trichome التقليدي ، فإن العمل لا يقتصر على غطاء كيميائي. ومع ذلك ، من المهم اتخاذ الاحتياطات اللازمة أثناء التعامل مع الثلج الجاف و LN.
ولتقييم مزايا البروتوكول الحالي، قورنت نتائج عزل الثلاثي الثلاثي من البروتوكول الحالي بتلك التي تم الحصول عليها باستخدام إجراء عزل ترايشوم التقليدي (الذي استخدم عازلا مائيا، وخرز زجاجي، وغربالا دقيقا لعزل ترايكومي)12، في البداية باستخدام مجهر ضوئي. توضح مقارنة المكونات من مراحل العزل المختلفة عبر فحص المجهر الضوئي زيادة درجة عزل trichome مع تقدم عملية العزل. في المرحلة الأولى من عملية العزل (غربال دقيق 105-150 ميكرومتر) ، كانت قطع أنسجة الأوراق سائدة في الجزء المعزول (الشكل 9 أ) ، على عكس منتج العزل النهائي ، الذي كان يتكون بالكامل تقريبا من ترايكهومات معزولة (الشكل 9 ج). يجب توخي الحذر للتحقق من خلو العينات المعزولة من التلوث (الشكل 9 ب).
على الرغم من أن كثافة trichome لم يتم تحديدها كميا في هذه الدراسة ، إلا أنه يمكن ملاحظة جودة الرؤوس الغدية المعزولة و trichomes اللاطئة في خطوة العزل النهائية في الشكل 10. يمكن مقارنة النقاء بتلك التي تم الحصول عليها باستخدام عزل trichome باستخدام البروتوكول التقليدي12 (الشكل 10C). في البروتوكول الحالي ، يتم الاحتفاظ بهيكل رأس trichome المطارد الدقيق ، وتكون الرؤوس الكاملة لل trichome المطاردة المعزولة مرئية (الشكل 10D) ، بينما باستخدام البروتوكول التقليدي ، يكون هيكل رأس trichome الكامل مفقودا ، ولا توجد سوى خلايا القرص (الشكل 10E). يمكن أيضا زيادة المحصول بشكل كبير لأن استخدام الثلج الجاف و LN يتجنب حد المواد النباتية التي يمكن استخراجها. ميزة إضافية لبروتوكولنا غير المائي هي أنه يستخدم الثلج الجاف و LN فقط ، وبالتالي ، لا يتم ترك أي مكونات متبقية من وسط العزل بمجرد تبخرها. يمنع استخدام LN إطلاق المستقلبات الثانوية اللزجة التي يمكن أن تؤدي إلى تجميع trichomes13. في البروتوكول الحالي ، تم استرداد trichomes المعزولة في خطوة العزل النهائية كمسحوق ناعم جاف.
ومن المرجح أن تكون درجات الحرارة المنخفضة للغاية التي يتم الحفاظ عليها في جميع أنحاء البروتوكول الحالي كافية لتحقيق أهداف الوسائط العازلة التقليدية - منع تدهور الحمض النووي الريبي (طالما ظلت العينات مغمورة) وتسهيل التطبيقات الجزيئية النهائية. من أجل التحقق من صحة هذا الافتراض ، استخلصنا الحمض النووي الريبي من trichomes المعزولة وقدرنا سلامة الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعات متاحة تجاريا. تشير قيم RIN العالية التي تم الحصول عليها (9.4 إلى 10) وكروماتوغرافيا الهلام المميزة (الشكل 11) بوضوح إلى سلامة عالية للحمض النووي الريبي. تم تحليل عينات الحمض النووي الريبي بشكل أكبر بواسطة RNAseq ، وتم الحصول على قراءات عالية الجودة >20 M من جميع المكتبات.
من أجل التحقق من صحة ذلك ، في الواقع ، يتم إثراء mRNA من جزء trichomes المعزول في الجينات المعبر عنها trichome ، قارنا نتائج التعبير الجيني لدينا للإزهار و trichomes المطاردة المعزولة المقابلة للنتائج السابقة التي قدمها Livingston et al.14 ، والتي ميزت التعبير الجيني للترايكهومات المنقاة من القنب (مقتبسة من الجدول التكميلي 1 ). يتكون بروتوكولهم من المزج في المخزن المائي ، والترشيح من خلال المناخل ، وأخيرا تنقية trichome باستخدام تدرج Percoll. تم وصف الجينات المعبر عنها ترايشوم بأنها الأكثر ارتباطا (p > 0.95) مع التعبير الجيني لسينسيز حمض القنب (CBDAS) ، وهي علامة جينية خاصة ب trichome14. تظهر مقارنة التعبير الجيني بين النتائج التي تم الحصول عليها مع البروتوكول الحالي وتلك المقدمة في Livingston et al.14 أن الجينات ال 12 الأكثر إثراء في جزء trichome الخاص بنا قد تم إثراؤها أيضا في دراسة Livingston et al. 14 ، بما في ذلك جين علامة trichome CBDAS (الجدول 1). ومن الجدير بالذكر أنه تم الحصول على نسبة تخصيب أعلى بكثير من البروتوكول الحالي. تؤكد هذه النتائج صحة البروتوكول الحالي لدراسة التعبير الجيني المخصب بالتريشومي.
بالإضافة إلى ذلك ، قارنا بيانات التعبير لخمسة جينات أكتين من القنب ، حيث يستخدم الأكتين بشكل متكرر كجين مرجعي لدراسات النسخ (الجدول 2). كانت نتائجنا لكل من trichomes المطاردة واللاطئة المعزولة قابلة للمقارنة مع تلك التي أبلغت عنها دراسة Livingston et al.14.
وأخيرا، قمنا بحساب التعبير وبيانات إثراء التريكوم لجينات عائلة البروتين المرتبط بالكلوروفيل أ-ب، والتي يفترض أنها ليست غنية بالتريكومي (الجدول 3). في الواقع ، أظهر الأعضاء ال 12 في عائلة الجينات هذه عامل إثراء trichome من <1 ، بمثابة عنصر تحكم سلبي لتخصيب trichome. تشير هذه النتائج المجمعة إلى أنماط التعبير الفريدة للكسور النورية والثلاثية المعزولة وتدعم سلامة وجودة جزء trichome المعزول.
الشكل 1: إعداد تحميل الدورق الزجاجي سعة 1 لتر. يتم تثبيت شبكة باب الشاشة مقاس 1 مم على جوانب الدورق الزجاجي عبر عدد قليل من الأربطة المطاطية (غير معروضة). يجب تحميل الدورق الزجاجي سعة 1 لتر في وضع رأسي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: إعداد منخل الدقيق. تم تجهيز غربال الدقيق بغربال دقيق 350 ميكرومتر عبر أشرطة مطاطية في الأسفل (غير معروض). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: إعداد الخطوة الأولى من عزل trichome. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: إعداد الكأس الزجاجية الزجاجية. الدورق الزجاجي مزود بثلاث طبقات من شبكة باب الشاشة (البعوض) مقاس 1 مم مثبتة عبر أشرطة مطاطية عند الفتحة. تشير فتحة الكأس الزجاجية إلى الأسفل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: إعداد الهيكل المخروطي المنخل الدقيق المستخدم في عزل trichome. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 6: إعداد حركة الغمس والاهتزاز للغربال الدقيق الذي يحتوي على ترايكهومات معزولة. يجب أن تشبه الحركة الأفقية / الرأسية ضخ كيس الشاي. الإعداد متطابق لكل حجم شبكة مستخدم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: الإعداد لنقل الترايكهومات المعزولة النهائية. يتم نقل الترايكهومات المعزولة النهائية إلى أنبوب يسمى 1.5 mL. يجب تبريد جميع الأواني مسبقا باستخدام LN. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 8: مخطط انسيابي يوضح البروتوكول. عزل trichomes الرأس الغدي من C. تتضمن Sativa ثلاث خطوات: (1) الانفصال الأولي للترايكهومز عن مصدر النبات والمرور عبر غربالين (1 مم و 350 ميكرومتر) ، (2) تمرير المادة النباتية عبر خمسة مناخل صغيرة ذات أحجام مسام متناقصة (150 ميكرومتر ، 105 ميكرومتر ، 80 ميكرومتر ، 65 ميكرومتر ، و 50 ميكرومتر) ، و (3) جمع trichomes المعزولة في أنبوب 1.5 مل مبرد مسبقا. وبالمثل يمكن جمع الأنسجة المحتفظ بها من أي من مراحل الغربال الدقيق. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 9: صور مجهرية للترايكهومات المعزولة باستخدام البروتوكول الحالي . (أ ، ب ، ج) ثلاثية الرؤوس الغدية اللاطئة من أوراق مروحة C. sativa. (أ) منتصف العزل ، من المناخل الدقيقة ذات أحجام المسام التي تتراوح من 105 ميكرومتر إلى 150 ميكرومتر. لاحظ الاحتفاظ بكميات كبيرة من المواد الخضراء غير trichome. (ب) نهاية العزل ، من المناخل الدقيقة ذات أحجام المسام التي تتراوح من 50 ميكرومتر إلى 65 ميكرومتر ، الملوثة بمصدر نباتي (السهم الأحمر) ، و (ج) خالية من التلوث. أشرطة المقياس = (أ) 100 ميكرومتر ، (ب ، ج) 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 10: صور مجهرية للترايكهومات المعزولة. (أ، ب) ترايكهومات رأسية غدية من C. sativa: (أ) النوع المطارد ، معزول باستخدام البروتوكول الحالي ، و (ب) النوع اللاطئ ، معزول باستخدام البروتوكول الحالي. (ج) ترايكهومز مطاردة معزولة باستخدام بروتوكول تقليدي. الغلة المنخفضة وعدم وجود رؤوس غير منقوصة من trichomes واضحة. (د، ه) ترايكهومات رأسية غدية مطاردة معزولة باستخدام (د) البروتوكول الحالي و (ه) البروتوكول التقليدي. (F) ترايكهومات غدية مطاردة معزولة من 65 ميكرومتر إلى 105 ميكرومتر من المناخل الدقيقة (عن قرب). لاحظ العزلة العالية للترايكهومات المطاردة ، مع رؤوس منفصلة وأجزاء ساق. تشير الأسهم الحمراء إلى trichomes من العصر الحجري الكيسي ، وتشير الأسهم الزرقاء إلى عدد قليل من أجزاء الساق من trichomes المطاردة الغدي ، وتشير الأسهم الصفراء إلى خلايا القرص المنفصلة. أشرطة المقياس = (A ، C ، D ، E ، F) 100 ميكرومتر ، (ب) 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 11: تحليل سلامة الحمض النووي الريبي المستخرج من trichomes. الكروماتوجرافيا والمواد الهلامية لعينات الحمض النووي الريبي المستخرجة من الرؤوس الغدية المطاردة والثلاثية اللاطئة المعزولة باستخدام البروتوكول الحالي. نتائج الحمض النووي الريبي من (A-D) ثلاثية الرؤوس المطاردة لخطوط الأصناف الأربعة المستخدمة في هذه الدراسة ، CS-11 و CS-12 و CS-13 و CS-14 على التوالي ، و (E-H) trichomes اللاطئة ، CS-11 ، CS-12 ، CS-13 ، و CS-14. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1: مقارنة التعبير الجيني المخصب بالتريشومي الذي تم الحصول عليه باستخدام RNAseq باستخدام البروتوكول الحالي للنتائج التي حصل عليها ليفينغستون وآخرون 14. تم اختيار الجينات ال 12 التي تظهر أعلى ارتباط بتعبير سينسيز حمض القنب (CBDAS) بواسطة Livingston et al.14 (من بيانات الجدول التكميلي S4 ، التي تم تكييفها بإذن من ناشري Wiley) ، والتي تعتبر علامة جينية خاصة ب trichome ، للمقارنة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول 2: مقارنة التعبير الجيني (FPKM) لخمسة جينات أكتين من القنب من trichomes المطاردة واللاطئة المعزولة من البروتوكول الحالي (بيانات التعبير الجيني الخاصة بنا من صنف القنب CS-1111 (Var CS-11)) مع النتائج المنشورة سابقا مقتبسة من Livingston et al.14. تم تقديم نتائج Livingston et al.14 بناء على الجينوم المرجعي Finola FN ، وترجمت بياناتهم إلى الجينوم المرجعي CS10.2. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول 3: التعبير الجيني (FPKM) لجينات ربط كلوروفيل القنب a-b للنورات الكاملة و trichomes المطاردة المعزولة من البروتوكول الحالي (بيانات التعبير الجيني الخاصة بنا من Var CS-11). الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
مقارنة ببروتوكولات عزل trichome المتاحة حاليا ، تم وصف تعديلين رئيسيين في البروتوكول الحالي. وتشمل هذه انفصال trichomes عن المواد النباتية باستخدام الثلج الجاف في الخطوة الأولية واستبدال LN للوسط العازل السائل شائع الاستخدام. يعتمد التعديل الأول لتنقية C. sativa trichome على بروتوكول سابق أدخل استخدام الثلج الجاف المجروش لفصل trichomes عن pedicels إبرة الراعي5. بينما تستخدم بروتوكولات عزل trichome التقليدية عموما أنبوب اختبار صغير (50 مل) ، تم استخدام دورق زجاجي سعة 1 لتر في هذه الدراسة مع كمية سخية من الثلج الجاف المسحوق ، مما يسمح بمعالجة كمية أكبر من المواد النباتية الأولية (حتى 10 جم). علاوة على ذلك ، في البروتوكول الحالي ، تم إدخال ممرين إضافيين من trichomes من خلال المناخل الدقيقة في خطوة العزل الأولى. تستخدم الخطوة الأولى حركة رأسية قوية تشبه هزاز الملح لأعلى ولأسفل ، وتستخدم الخطوة الثانية حركة غربلة أفقية من خلال المنخل الصغير في غربال الدقيق. يقترح الجمع بين حركات الغربلة الأفقية والرأسية لتعزيز الفصل المعزز بناء على حجم وشكل trichome.
التعديل الثاني الأكثر أهمية يعالج وسط العزل الذي يتم فيه المرور عبر المناخل الدقيقة. في البروتوكول الحالي ، يتم استبدال وسط العزل المائي التقليدي بالكامل ب LN. استخدم البروتوكولالسابق 8 أيضا LN في الخطوة الأولى لعزل trichome ، وفصل trichomes عن المادة النباتية (عن طريق صريف مادة الزهرة ضد غربال شبكي) ، لكنه استمر مع استخراج المخزن المؤقت السائل وفصل كثافة Percoll. إن استبدال LN بدلا من وسيط العزل التقليدي يلغي الحاجة إلى إجراءات خاصة مرتبطة بالمكونات السامة لوسط العزل التقليدي ، مما يسمح بسير عمل مريح وإنتاجية عالية.
تعتمد إحدى السمات الرئيسية للبروتوكول الحالي على ميل الثلج الجاف و LN إلى التسامي بسرعة في درجة حرارة الغرفة. تتيح هذه الميزة تطبيقها السخي طوال عملية العزل. في المقابل ، فإن استخدام كمية كبيرة من المخزن المؤقت التقليدي للعزل سيؤدي إلى تعقيدات فنية تتعلق بالتعامل مع أحجامه الكبيرة.
في حين أن عملية العزل في البروتوكول الحالي تعزز الاحتفاظ ببنية الرأس الهشة للثلاثي المطارد الغدي ، فإن البروتوكولات التقليدية تعزز فصل خلايا القرص عن مادة الغدة المتبقية ، والتي يمكن غسلها بسهولة ، تاركة خلايا القرص فقط. يمكن رؤية هذه الظاهرة بوضوح في نتائجنا التي تقارن بروتوكول العزل التقليدي ببروتوكولنا الجديد (الشكل 10D ، E). إلى جانب الملاحظة المجهرية ، يشير تحليل جودة الحمض النووي الريبي المستخرج من trichomes (المعزول باستخدام هذا البروتوكول) بوضوح إلى أنه يتم الاحتفاظ بسلامة الحمض النووي الريبي أثناء عملية العزل وأنه مناسب للتحليل النسخي.
علاوة على ذلك ، تشير نتائج التعبير الجيني من جزء trichome المعزول إلى أن الكسر غني للغاية في الجينات المعبر عنها trichome الراسخة (الجدول 1) ، وبالمثل ، أن الجينات غير المعبر عنها trichome غير ممثلة (الجدول 3).
القيد الرئيسي للبروتوكول الحالي هو ملاءمته الحصرية لعزل trichomes وفقا لميلها للمرور عبر المناخل الدقيقة. بينما لا يمكن تطبيق البروتوكول مباشرة على عزل trichome باستخدام تدرج الكثافة ، إلا أنه مناسب لعزل trichomes قبل خطوة تدرج الكثافة ، إذا لزم الأمر. في هذه الدراسة ، لم تخضع trichomes المعزولة باستخدام هذا البروتوكول لتوصيف بروتيني ، ويجب التحقق من ملاءمتها لمثل هذا التطبيق. ومع ذلك ، نظرا لأن عينات الحمض النووي الريبي المستخرجة من كل من trichomes المطاردة واللاطئة لم تظهر أي تدهور ، كما هو موضح في chomatographs وقيم RIN العالية ، يمكن افتراض أن trichomes المعزولة مع البروتوكول الحالي من المرجح أن تلبي المتطلبات اللازمة للتحليل البروتيني.
درجة العزلة (من مصدر النبات الأولي وأنواع أخرى من trichomes) من trichomes اللاطئة الغدي من أوراق المروحة عالية جدا ، حيث تفتقر أوراق المروحة إلى نوع trichome المطارد الغدي15,16 ، ويتم عزل trichomes الكيسي والمنتفخ بسهولة عن trichomes اللاطئة بسبب الاختلافات الهيكلية والحجم. ومع ذلك ، فيما يتعلق بعزل trichomes من النوع المطارد من النوع الغدي ، فمن الأفضل معالجة درجة عزلها كإثراء ، حيث أن مصدر النبات ، الإزهار الأنثوي الناضج ، يحتوي على جميع أنواع trichome الأربعة ، بالإضافة إلى نوع ما قبل الساق14. من المنطقي أن معظم trichomes الرأسية الغدية المعزولة هي من النوع المطارد ، حيث أن موقعها المرتفع (فيما يتعلق ب trichomes اللاطئة المرتبطة بالبشرة) يعزز احتمال اصطدامها بجسيم ثلج جاف والانفصال عن النبات. علاوة على ذلك ، يعتبر المنعطف الذي يربط الرأس وأجزاء الساق من trichome المطارد نقطة ضعف مرتبطة بانقطاع رأس الغدة17. وبالتالي ، سيكون من الدقيق الإشارة إلى جزء trichome المطارد على أنه جزء عالي التخصيب مع تلوث منخفض محتمل من النوع اللاطئ. ومع ذلك ، لم يتم إجراء مزيد من التحليل للتحقق من صحة هذا الافتراض.
ولم يتحدد بعد مدى ملاءمة البروتوكول الحالي لاستخراج الترايكهومات الغدية من الأنواع النباتية الأخرى. من المفترض أن تساهم الكثافة العالية للتريكومومي في C. sativa في نجاح البروتوكول الحالي. ومع ذلك ، يبدو من غير المحتمل أن يكون هذا هو السبب الوحيد ، حيث يمكن معالجة مصدر مادة نباتية كبير نسبيا (يصل إلى 10 جم لكل دورة عزل) بشكل فعال. قدمت دراسات أخرى بروتوكولات مفصلة لعزل أنواع مختلفة من trichome من النباتات الأخرى ، على سبيل المثال ، trichomes أوراق الوردة من Arabidopsis thaliana18،19. في حين أن قابلية تطبيق البروتوكول الحالي لعزل أنواع ترايشوم أخرى لم تدرس في هذا العمل ، فإن العناصر المقدمة في هذا العمل ، وخاصة استبدال LN بمخزن العزل ، من المرجح أن تحسن عملية عزل trichome.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
يقر المؤلفون بالدعم المالي من CannabiVar Ltd. تم توفير جميع المواد النباتية بسخاء من قبل البروفيسور هينانيت كولتاي من مركز البراكين ، إسرائيل.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bioanalyzer RNA Pico 6000 chip | Agilent, Germany | Reorder number 5067-1513 | Lab-on-a-chip system |
| Transsonic-310 | Elma, Germany | D-78224 | Ultrasonic cleaning unit |
| TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 | Illumina, USA | RS-122-2001 | Sample preperation for RNA sequencing library |
| Spectrum Plant Total RNA Kit | SIGMA-ALDRICH, USA | STRN50-1KT | Plant Total RNA Kit |
| Nylon micro-sieve with a mesh size of 350 µm (40 x 40 cm or larger than the circumference of the flour sifter) | Sinun Tech, Israel | r0350n350210 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size of 150 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0150n360465 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 105 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0105n320718 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 80 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0080n370465 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 65 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0065n340715 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 50 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0080n370465 | Nylon screen aperture |
| Up to 10 g of frozen plant material (stored in -80 oC or liquid nitrogen) | |||
| Suitable gloves for handling low temperatures | |||
| Safety goggles | |||
| 1 mm screen door (mosquito) mesh (strip of 30 x 100 cm) | |||
| Large strainer (colander) with holes approximately 5 mm | |||
| 1 L glass beaker | |||
| 1 block of dry ice (0.5-1 kg) | |||
| Hammer and hard flat object | |||
| Two 5 L plastic containers | |||
| Rubber bands | |||
| Large flour sifter or sieve strainer- preferably one with a detachable plastic ring on the circumference | |||
| Several large and small round bottom stainless steel containers. One of them should be larger than the flour sifter's circumference (approximately 40 cm in diameter), to minimize the loss of the sifted mass outside the round bottome stainless steel container | |||
| Pre-chilled (via liquid nitrogen) stainless steel spoon, spatula, and scoopula | |||
| Clean plate | |||
| Several clothespins | |||
| Pre-chilled (via liquid nitrogen) labeled 1.5 mL tubes with holes poked on the lid with a sterile needle | |||
| Two containers of liquid nitrogen | |||
| 1 cm wide painting brush |
References
- Schilmiller, A. L., Last, R. L., Pichersky, E. Harnessing plant trichome biochemistry for the production of useful compounds. Plant Journal for Cell & Molecular Biology. 54 (4), 702-709 (2008).
- Liu, Y., Jing, S. X., Luo, S. H., Li, S. H. Non-volatile natural products in plant glandular trichomes: chemistry, biological activities and biosynthesis. Natural Product Reports. 36 (4), 626-665 (2019).
- Fairbairn, J. W. The trichomes and glands of Cannabis sativa L. UN Bulletin on Narcotics. 23, 29-33 (1972).
- Booth, J. K., Page, J. E., Bohlmann, J. Terpene synthases from Cannabis sativa. PLoS One. 12 (3), 0173911 (2017).
- Yerger, E. H., et al. A rapid method for isolating glandular trichomes. Plant Physiology. 99 (1), 1-7 (1992).
- Gershenzon, J., Maffei, M. M., Croteau, R. Biochemical and histochemical localization of monoterpene biosynthesis in the glandular trichomes of spearmint (Mentha spicata). Plant Physiology. 89 (4), 1351-1357 (1989).
- Gershenzon, J., et al. Isolation of secretory cells from plant glandular trichomes and their use in biosynthetic studies of monoterpenes and other gland products. Analytical Biochemistry. 200 (1), 130-138 (1992).
- Conneely, L. J., Mauleon, R., Mieog, J., Barkla, B. J., Kretzschmar, T. Characterization of the Cannabis sativa glandular trichome proteome. PLoS One. 16 (4), 0242633 (2021).
- Liu, Y., Zhu, P., Cai, S., Haughn, G., Page, J. E. Three novel transcription factors involved in cannabinoid biosynthesis in Cannabis sativa L. Plant Molecular Biology. 106 (1-2), 49-65 (2021).
- Slone, J. H., Kelsey, R. G. Isolation and purification of glandular secretory cells from Artemisia tridentata (ssp. vaseyana) by Percoll density gradient centrifugation. American Journal of Botany. 72 (9), 1445-1451 (1985).
- Namdar, D., et al. Terpenoids and Phytocannabinoids Co-Produced in Cannabis Sativa Strains Show Specific Interaction for Cell Cytotoxic Activity. Molecules. 24 (17), 3031 (2019).
- McDowell, E. T., et al. Comparative functional genomic analysis of Solanum glandular trichome types. Plant Physiology. 155 (1), 524-539 (2011).
- Bergau, N., Santos, A. N., Henning, A., Balcke, G. U., Tissier, A. Autofluorescence as a signal to sort developing glandular trichomes by flow cytometry. Frontiers in Plant Science. 7, 949 (2016).
- Livingston, S. J., et al. Cannabis glandular trichomes alter morphology and metabolite content during flower maturation. The Plant Journal. 101 (1), 37-56 (2019).
- Turner, J. C., Hemphill, J. K., Mahlberg, P. G. Gland distribution and cannabinoid content in clones of Cannabis sativa L. American Journal of Botany. 64 (6), 687-693 (1977).
- Turner, J. C., Hemphill, J. K., Mahlberg, P. G. Quantitative determination of cannabinoids in individual glandular trichomes of Cannabis sativa L. (Cannabaceae). American Journal of Botany. 65 (10), 1103-1106 (1978).
- Hammond, C. T., Mahlberg, P. G. Morphology of glandular hairs of Cannabis sativa from scanning electron microscopy. American Journal of Botany. 60 (6), 524-528 (1973).
- Marks, M. D., et al. A new method for isolating large quantities of Arabidopsis trichomes for transcriptome, cell wall, and other types of analyses. The Plant Journal. 56 (3), 483-492 (2008).
- Huebbers, J. W., et al. An advanced method for the release, enrichment and purification of high-quality Arabidopsis thaliana rosette leaf trichomes enables profound insights into the trichome proteome. Plant Methods. 18 (1), 12 (2022).
