Summary
מוצג פרוטוקול לבידוד והעשרה נוחים ובעלי תפוקה גבוהה של גבעול קפיטט בלוטי וטריכומות ססיל מקנאביס סאטיבה. הפרוטוקול מבוסס על מיצוי יבש ללא חיץ של טריכומות באמצעות חנקן נוזלי בלבד, קרח יבש ומסננות ניילון ומתאים למיצוי RNA וניתוח שעתוק (transcriptomic analysis).
Abstract
מאמר זה מציג פרוטוקול לבידוד והעשרה נוחים ובעלי תפוקה גבוהה של גבעול קפיטט בלוטי וטריכומות ססיליות מקנאביס סאטיבה. המסלולים הביוסינתטיים למטבוליזם של קנבינואידים וטרפנים נדיפים ממוקמים בעיקר בטריכומות הקנאביס , וטריכומות מבודדות מועילות לניתוח תעתיק. הפרוטוקולים הקיימים לבידוד טריכומות בלוטות לאפיון שעתוק אינם נוחים ומספקים ראשי טריכומות פגומים וכמות נמוכה יחסית של טריכומות מבודדות. יתר על כן, הם מסתמכים על מכשירים יקרים ואמצעי בידוד המכילים מעכבי חלבון כדי למנוע פירוק RNA. הפרוטוקול הנוכחי מציע לשלב שלושה שינויים נפרדים כדי להשיג כמות גדולה של גבעול קפיטט בלוטי מבודד וטריכומות ססיליות מתפרחות נקביות בוגרות של C. sativa ועלי מניפה, בהתאמה. השינוי הראשון כרוך בהחלפת חנקן נוזלי באמצעי הבידוד הקונבנציונלי כדי להקל על מעבר הטריכומות דרך המיקרו-מסננות. השינוי השני כרוך בשימוש בקרח יבש כדי לנתק את הטריכומות ממקור הצמח. השינוי השלישי כרוך בהעברת החומר הצמחי ברציפות דרך חמש מיקרו-מסננות בגודל נקבוביות הולך ופוחת. הדמיה מיקרוסקופית הדגימה את יעילות טכניקת הבידוד עבור שני סוגי הטריכומות. בנוסף, איכות הרנ"א שהופק מהטריכומות המבודדות התאימה לניתוח שעתוק במורד הזרם.
Introduction
טריכומות בלוטות הן מבנים דמויי שיער הנמצאים בצמחים המכילים מטבוליטים שניוניים רבים1 ומייצגים בנק רב ערך של גנים ואנזימים ביוסינתטיים חדשים2. בקנאביס, הביוסינתזה של המטבוליטים המשניים החשובים, קנבינואידים3 וטרפנים4, ממוקמת בטריכומות. בהתחשב בתפקידם של הטריכומות בקביעת איכות הקנאביס הן לשימושים רפואיים והן לשימושים פנאי, המחקר של ביטוי גנים של טריכומות הוא מעניין. כדי לאפיין את הביטוי של גנים ספציפיים לטריכומות, יש לבודד תחילה את הטריכומות המעניינות. פרוטוקולי בידוד טריכומות תוארו לראשונה כבר בשנת 19925, וההתפתחויות האחרונות שלהם נסקרו לאחרונה2. באופן כללי, ניתן לחלק פרוטוקולים לחילוץ טריכומות בלוטות לאפיון שעתוק לשני שלבים עוקבים נפרדים. השלב הראשון כולל הפרדה פיזית יסודית של הטריכומות מרקמת הצמח. שלב זה יכול להתבצע על ידי שימוש בקרח יבש5, חרוזי זכוכית עם מכשיר מסחרי 6,7, טחינת החומר הצמחי כנגד מסננת רשת8, או ערבול רקמת הצמח בחיץ בידוד9. השלב השני כולל הפרדה מעודנת יותר של הטריכומות המעניינות משאריות הצמח המיקרוסקופי ו/או מסוגי הטריכומות האחרים. שלב זה יכול להתבצע באמצעות צנטריפוגה שיפוע צפיפות 8,10 או מסננות בגדלים שונים 7,9. בשל הרגישות הקיצונית של RNA ברקמות מעובדות לחומרים משפילים, שני שלבים עוקבים אלה מתבצעים בדרך כלל בתווך בידוד קר כקרח, לעתים קרובות בנוכחות מעכבי חלבון4.
פרוטוקולי בידוד טריכומות קונבנציונליים דורשים, בנוסף לטמפרטורות הקרות כקרח, כמויות גדולות של אמצעי בידוד כדי להבטיח הליך חילוץ יעיל. השילוב של רכיבים אלה גורם לתהליך בידוד מפרך וגוזל זמן המעכב תפוקה גבוהה. הצגת פרוטוקול בידוד טריכומות חלופי פשוט וידידותי למשתמש עשויה אפוא להועיל להיבטים שונים הקשורים לאפיון הטריכומות. המאמר הנוכחי נועד להציע פרוטוקול חלופי לבידוד טריכומות קפיטט גבעול ובלוטות ססיל מקנאביס סאטיבה על ידי שילוב ושילוב של מספר אלמנטים מהפרוטוקולים הקונבנציונליים. יסודות אלה כוללים קרח יבש5, העברת הטריכומות דרך מספר מיקרו-מסננות עם גודל נקבוביות קטן 7,9, והחלפת חנקן נוזלי (LN) בתווך הבידוד8.
החידוש של פרוטוקול בידוד הטריכומות הנוכחי, בהשוואה לפרוטוקולים קונבנציונליים, בא לידי ביטוי במספר דרכים. פרוטוקול זה נוח, שכן הוא אינו דורש רכיבים מסוכנים. ההליך יכול להתבצע במעבדה עם אמצעי זהירות מינימליים ומאפשר תפוקה גבוהה. החלפת LN במדיום בידוד הנוזלים הסטנדרטי מבטיחה את שלמות הטריכומות לאורך כל תהליך הבידוד, ומאפשרת ניתוח שעתוק עוקב. עם סובלימציה של LN וקרח יבש, הטריכומות המבודדות נותרות ללא שאריות מזיקות. יתר על כן, הנטייה של LN לסובלימציה בטמפרטורת החדר מאפשרת שימוש נדיב בו לאורך כל הפרוטוקול. לעומת זאת, שימוש בכמויות גדולות של אמצעי בידוד קונבנציונלי יוצר קשיים מעשיים בטיפול בו. לבסוף, הפרוטוקול מקטין את ההפרדה של תא הדיסק ממבנה הראש השביר הנותר של הטריכומה הבלוטתית, ומאפשר שמירה על תכולת מרחב הראש.
פרוטוקול זה מוצג בצורה מפורטת שלב אחר שלב שנועד לסייע לפרקטיקה הטכנית של בידוד טריכומות קפיטט בלוטות C. sativa. הפרוטוקול מספק זרימת עבודה ניתנת לניהול המביאה לטריכומות מבודדות עם ריכוז גבוה וטוהר המתאימים לאנליזה מולקולרית במורד הזרם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: החומר הצמחי ששימש במחקר זה כלל ארבעה זנים של C. sativa ARO-Volcani (CS-11, CS-12, CS-13 ו-CS-14) שגודלו במרכז וולקני, ישראל, כמתואר במקום אחר11. טריכומות גבעולות קפיטט בלוטות בודדו מתפרחות פורחות בוגרות, וטריכומות ססיל קפיטט בלוטות בודדו מעלי מניפה גדולים מצמחי אם בוגרים שאינם פורחים. כל החומר הצמחי נקטף טרי ואוחסן מיד ב -80 מעלות צלזיוס.
אזהרה: קרח יבש ו-LN משמשים לאורך כל הפרוטוקול. חומרים אלה מסוכנים ביותר. הטריכומות המבודדות יכולות להכיל חלקיקי קרח יבש שיכולים ליצור לחץ גז מסוכן כאשר הם מוחדרים לצינורות אטומים; לכן, כל הכובעים צריכים להיות מנוקבים במחט. מומלץ מאוד להשתמש במשקפי מגן, ללבוש מעבדה מתאים וכפפות לטיפול בטמפרטורות נמוכות במיוחד.
1. הכנה להפרדה ראשונית של טריכומות מהחומר הצמחי
- מרסקים גוש קרח יבש לפתיתים קטנים ועדינים בעזרת פטיש וחפץ שטוח קשיח במיכל פלסטיק בנפח 5 ליטר.
- מסננים את פתיתי הקרח היבש הדק (קטן מ-5 מ"מ) מהקרח היבש הלא כתוש בעזרת מסננת גדולה (דרך נקבוביות קטנות מ-5 מ"מ) למיכל פלסטיק נוסף בנפח 5 ליטר. יוצקים כ-200 ס"מ3 (200 מ"ל) מפתיתי הקרח היבשים לתוך זכוכית זקופה בנפח 1 ליטר.
- מוסיפים עד 10 גרם של תפרחות C. sativa קפואות (מעתה והלאה מכונות חומר צמחי) על השכבה הראשונה של קרח יבש כתוש, ומכסים בשכבה נוספת של 200 ס"מ3 של קרח יבש כתוש דק.
- כסו את הפתח של זכוכית 1 ליטר בשתיים עד שלוש שכבות של כילה נגד יתושים של דלת מסך 1 מ"מ, והדקו אותה לצדדים החיצוניים של הזכוכית באמצעות גומיות (איור 1).
- יוצקים LN לתוך מיכל נירוסטה גדול בעל תחתית עגולה (ראה טבלת חומרים), שם ייאספו הטריכומות המבודדות.
- הכניסו רשת של 350 מיקרומטר למסננת קמח/מסננת כדי לכסות את רשת ניפוי הקמח מלמטה (איור 2). אם קיימת מסננת קמח עם טבעת פלסטיק ניתקת, הכניסו את הרשת בגודל 350 מיקרומטר כך שתהיה מאובטחת מתחת לרשת של מסננת הקמח. אם לא, הדקו את הרשת בגודל 350 מיקרומטר להיקף מסננת הקמח בעזרת גומיות.
- הניחו את מסננת הקמח מעל מיכל הנירוסטה הגדול בעל התחתית העגולה המלאה ב-LN (איור 3). ודא שרוחב המיכל עולה על זה של מסנן הקמח כדי למזער את אובדן המסה המנופה מחוץ למיכל הנירוסטה בתחתית העגולה.
2. הפרדת טריכומות מהחומר הצמחי
- נערו את ה-1 ליטר כשהפתח שלה מכוון כלפי מטה לכיוון מסננת הקמח כמו באמצעות שייקר מלח גדול (איור 4).
- הניחו בצד את הזכוכית בנפח 1 ליטר כל 2-3 דקות כדי לאפשר ניפוי של הקרח היבש הכתוש והחומר הצמחי שהצטבר על מסננת הקמח.
- לנפות את מסננת הקמח אופקית כדי להקל על המעבר של החומר הצמחי לתוך LN במיכל נירוסטה עגול למטה למטה.
- הוסף LN למיכל הנירוסטה וקרח יבש כתוש לכוס זכוכית 1 ליטר כאשר מפלסיהם נמוכים. לחדש את החומר הצמחי המשומש בכוס הזכוכית עם 10 גרם נוספים של חומר צמחי טרי כאשר החומר הצמחי על מסננת הקמח מתרוקן. החידוש בדרך כלל לא צריך לחזור על עצמו יותר מפעמיים.
- חזור על שלבים 2.1-2.4 עד לאיסוף כמות מספקת של טריכומות מועשרות במיכל הנירוסטה בתחתית העגולה. בדרך כלל, 20 גרם של חומר צמחי טרי מספיק עבור מיצוי RNA וניתוח תעתוק.
- ודא שיש חומר דמוי אבקה לבנה (המורכבת מפסולת צמחים, טריכומות בלוטות וקרח יבש כתוש) בתחתית מיכל הנירוסטה השקוע ב- LN. תצפית מיקרוסקופית תסייע לקבוע אם נאספה כמות מספקת של טריכומות; עם זאת, שלב זה עלול לחסום את זרימת הפרוטוקול. בדרך כלל, 10-20 גרם של חומר צמחי ראשוני מספיק עבור רוב הבידודים; עם זאת, ייתכנו הבדלים בצפיפות הטריכומות של הצמחים.
הערה: מנקודה זו, ניתן להשהות את הניסוי ולהפעיל אותו מחדש מאוחר יותר. אם משהה לזמן קצר, יש להוסיף כמויות מספיקות של LN כך שהטריכומות יישארו שקועות. לחלופין, ניתן לאסוף את הטריכומות ולאחסן אותן בטמפרטורה של 80°C למשך עד 3 חודשים לשימוש מאוחר יותר, כמתואר בשלב 5.
3. הפרדת טריכומות קפיטטות בלוטות (גבעול וססיל) מסוגי טריכומות אחרים, כגון טריכומות בולבוסיות וציסטוליות, ופסולת
- הוסיפו כמות קטנה של LN למיכל נירוסטה קטן ונקי בעל תחתית עגולה.
- קפלו פעמיים מסננת מיקרו בגודל 40X40 ס"מ עם רשת בגודל 150 מיקרומטר כדי לקבל קיפול בגודל 20X20 ס"מ, ופתחו אותה. ודאו שהוא דומה לצורה דמוית חרוט (איור 5).
- הצמידו את חרוט הרשת לקצה מיכל הנירוסטה בעל התחתית העגולה בעזרת סיכת כביסה אחת או שתיים, כך שהחלק הפתוח של החרוט זקוף וחלקו המחודד שקוע בחלקו ב-LN.
- שפכו בעדינות את ה-LN ואת החומר דמוי האבקה הלבנה משלב 2.6 לתוך חרוט המסננת הזעיר.
- יש למרוח בעדינות מברשת רחבה כדי לאסוף ולהעביר את שאריות החומר הצמחי מהמכל הראשון לתוך חרוט הרשת בגודל 150 מיקרומטר.
- מוסיפים עוד LN למיכל הראשון, וחוזרים על תנועת ההברשה עד שכל החומר הצמחי מועבר לחרוט המיקרו-מסננת.
- נתקו בזהירות את סיכת הכביסה ממכסה המיכל, ופתחו את חרוט המיקרו-מסננת כך שהטריכומות ממוקמות באמצע מסננת המיקרו הפתוחה. החזיקו את כל ארבע הפינות של המסננת הזעירה יחד, כך שהחלק האמצעי שמכיל את הטריכומות יישאר שקוע ב-LN (איור 6).
- בעודכם אוחזים בכל ארבע פינות המסננת הזעירה, טבלו ונערו בעדינות את המסננת הזעירה ב-LN במיכל הפלדה כאילו אתם מחדירים שקיק תה. המשך בתנועת טבילה/ניעור (אנכית ואופקית) למשך דקה אחת. יש פשרה בין איכות הבידוד לכמות. תנועות טבילה ארוכות יותר עלולות לגרום לכמויות גדולות יותר של טריכומות, אך דרגת הבידוד שלהן עשויה להיות נמוכה יותר. בסך הכל, דקה אחת מומלצת כמתאימה הן לאיכות והן לכמות.
הערה: תנועת ניפוי זו היא החלק הקריטי ביותר בפרוטוקול ויש לבצע אותה בהתאם. - אופציונלי: יש לגרוף את שאריות הצמחים הלא מנופות ואת הטריכומות הגדולות יותר (שעדיין שקועות ב-LN) העטופות במרכז המסננת הזעירה לתוך מבחנה של 13 מ"ל או 50 מ"ל, ולאחסן בטמפרטורה של -80°C לשימוש עתידי.
אזהרה: כדי למנוע הצטברות של גז בלחץ (מהקרח היבש ושאריות LN), נקב חור במכסה המבחנה באמצעות מחט מעוקרת. ניתן להחליף את הפקק לאחר הפחתת הלחץ, שזה בדרך כלל לאחר 24 שעות.
4. העברת טריכומות דרך מסננות זעירות של גודל נקבוביות הולך ופוחת
- העבירו את הטריכומות המסוננות השקועות ב-LN בתחתית מיכל הנירוסטה הקטן בעל התחתית העגולה ברצף דרך מיקרו-מסננות עם גודל נקבוביות הולך וקטן (105 מיקרומטר, 80 מיקרומטר, 65 מיקרומטר ו-50 מיקרומטר), באותו אופן שהוצג בשלב 3.
5. איסוף הטריכומות הרצויות
- מוציאים את הטריכומות הרצויות השקועות ב-LN ועטופות במיקרו-מסננת בגודל 50 מיקרומטר בעזרת כף מקוררת מראש (ב-LN). מניחים אותם על צלחת נקייה.
הערה: בשלב בידוד סופי זה, הטריכומות הרצויות נאספות מהמסננת. - העבירו במהירות את הטריכומות דמויות האבקה לתוך צינור 1.5 מ"ל שכותרתו מקורר מראש באמצעות מרית מקוררת מראש או כף מדידה המוחדרת לתוך הצינורית (איור 7). אחסן את הצינורות מיד ב -80 ° C למחקרים נוספים.
הערה: תרשים זרימת עבודה סכמטי המתאר את פרוטוקול הבידוד כולו מוצג באיור 8.
6. תצפית וניתוח של הטריכומות המטוהרות
- הניחו כמות קטנה (10 מ"ג) של טריכומות מבודדות על מגלשת מיקרוסקופ באמצעות מרית מקוררת מראש (באמצעות LN). מוסיפים טיפת מים, ומתבוננים ישירות במיקרוסקופ אור ללא כתמים. הערך את דרגת הבידוד והזיהום הכוללת באמצעות הגדלות נמוכות (פי 10) וגבוהות (פי 40). ההעשרה נאמדת חזותית על ידי הכמות היחסית של טריכומות ביחס לרקמה שאינה טריכומה, כפי שניתן לראות באיור 9.
- לבצע מיצוי RNA וניתוח איכות מ 50 מ"ג של C. sativa בלוטות מבודדות גבעול קפיטט וטריכומות sessile.
הערה: ערכת מיצוי מסחרית (ראה טבלת חומרים) המשתמשת באסטרטגיה מבוססת פולי-A של טיהור mRNA שימשה למיצוי RNA.- יש להשהות מחדש 50 מ"ג מהטריכומות המבודדות בתמיסת הליזיס, מערבולת למשך 30 שניות, לבצע סוניקציה ביחידת ניקוי על-קולית קרה כקרח במהירות 35 קילוהרץ למשך 5 דקות, ולחלץ את ה-mRNA מהדגימות בהתאם לפרוטוקול היצרן (ראה טבלת חומרים).
- כדי להעריך את שלמות הרנ"א המופק מהטריכומות, יש לקבוע את ריכוז הרנ"א, את הכמות הכוללת ואת ערכי מספר שלמות הרנ"א (RIN) באמצעות מערכת מעבדה על שבב (ראו טבלת חומרים).
- בצע ניתוח RNAseq של שברי הטריכומה (אופציונלי). ניתוח RNAseq וניתוח ביואינפורמטיקה של קריאות רציפות יכול להתבצע על ידי שירותי מיקור חוץ סטנדרטיים
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
השינוי העיקרי הכלול בפרוטוקול זה בהשוואה לפרוטוקולי בידוד טריכומות קונבנציונליים הוא החלפת אמצעי הבידוד הסטנדרטי ב- LN. השימוש ב- LN כאמצעי בידוד מאפשר זרימת עבודה רגועה, מכיוון שכל עוד הדגימות שקועות ב- LN, לא סביר שתתרחש השפלה מטבולית. יתר על כן, מכיוון שהפרוטוקול נמנע מהרכיבים המסוכנים (כלומר, חומצה aurintricarboxylic ו- β-mercaptoethanol) המשמשים במדיום בידוד טריכומה מסורתי, העבודה אינה מוגבלת למכסה מנוע כימי. עם זאת, חשוב לנקוט באמצעי הזהירות הדרושים בעת הטיפול בקרח יבש ו- LN.
כדי להעריך את היתרונות של הפרוטוקול הנוכחי, תוצאות בידוד הטריכומות מהפרוטוקול הנוכחי הושוו לאלה שהתקבלו באמצעות הליך בידוד טריכום קונבנציונלי (שהשתמש בחיץ מימי, חרוזי זכוכית ומסננת עדינה לבידוד טריכומות)12, בתחילה באמצעות מיקרוסקופ אור. השוואה בין המרכיבים משלבי בידוד שונים באמצעות בדיקת מיקרוסקופ אור ממחישה את מידת הבידוד הגוברת של הטריכומות ככל שתהליך הבידוד מתקדם. בשלב הראשוני של תהליך הבידוד (105-150 מיקרו-מסננת), חתיכות של רקמת עלה היו דומיננטיות בחלק המבודד (איור 9A), בניגוד לתוצר הבידוד הסופי, שהורכב כמעט כולו מטריכומות מבודדות (איור 9C). יש להקפיד לוודא שהדגימות המבודדות נקיות מזיהום (איור 9B).
אף על פי שצפיפות הטריכומות לא כומתה במחקר זה, ניתן לראות את האיכות של גבעול הקפיטט הבלוטי המבודד והטריכומות הססיליות בשלב הבידוד הסופי באיור 10. ניתן להשוות את הטוהר לזה המתקבל עם בידוד טריכומות באמצעות פרוטוקול קונבנציונלי12 (איור 10C). בפרוטוקול הנוכחי נשמר מבנה ראש הטריכומה הגבעול העדין, וכל הראשים של הטריכומות המבודדות נראים לעין (איור 10D), בעוד שבפרוטוקול הקונבנציונלי חסר מבנה ראש הטריכומה השלם, ורק תאי הדיסק נוכחים (איור 10E). התשואה יכולה גם להיות מוגברת מאוד מאז השימוש קרח יבש LN מייתר את הגבול של חומר צמחי שניתן לחלץ. יתרון נוסף של הפרוטוקול הלא-מימי שלנו הוא שהוא משתמש רק בקרח יבש וב-LN, ולכן לא נותרים רכיבים שיוריים של מדיום הבידוד ברגע שהם מתאדים. שימוש ב-LN מונע שחרור של מטבוליטים משניים דביקים שיכולים להוביל לצבירה של הטריכומות13. בפרוטוקול הנוכחי, הטריכומות המבודדות בשלב הבידוד הסופי נמצאו כאבקה דקה יבשה.
הטמפרטורות הנמוכות מאוד הנשמרות לאורך הפרוטוקול הנוכחי עשויות להספיק כדי לעמוד ביעדים של מדיית חיץ קונבנציונלית המונעת פירוק RNA (כל עוד הדגימות נשמרות שקועות) ולהקל על יישומים מולקולריים במורד הזרם. כדי לאמת הנחה זו, חילצנו רנ"א מהטריכומות המבודדות והערכנו את שלמות הרנ"א באמצעות ערכות מסחריות. ערכי RIN גבוהים המתקבלים (9.4 עד 10) וכרומטוגרפיית ג'ל ייחודית (איור 11) מצביעים בבירור על שלמות RNA גבוהה. דגימות הרנ"א נותחו עוד יותר על ידי RNAseq, וקריאות באיכות גבוהה של >20 M התקבלו מכל הספריות.
על מנת לאמת כי אכן ה-mRNA ממקטע הטריכומות המבודדות מועשר בגנים המבוטאים בטריכומות, השווינו את תוצאות ביטוי הגנים שלנו עבור התפרחת והטריכומות המבודדות התואמות לתוצאות קודמות שהוצגו על ידי ליווינגסטון ועמיתיו 14, אשר אפיינו את ביטוי הגנים של טריכומות מטוהרות של קנאביס (נלקח מטבלה 1 המשלימה שלהם ). הפרוטוקול שלהם כלל מיזוג בחיץ מימי, סינון דרך מסננות, ולבסוף טיהור טריכומות באמצעות שיפוע פרקול. גנים המבוטאים בטריכומות אופיינו כגנים בעלי המתאם הגבוה ביותר (p > 0.95) עם ביטוי הגן של חומצה קנאבידיולית סינתאז (CBDAS), סמן גן ספציפי לטריכומה14. השוואת ביטוי הגנים בין התוצאות שהתקבלו בפרוטוקול הנוכחי לבין אלה שהוצגו ב- Livingston et al.14 מראה כי 12 הגנים המועשרים ביותר בחלק הטריכום שלנו הועשרו גם במחקר ליווינגסטון ואחרים14, כולל גן סמן הטריכומה CBDAS (טבלה 1). יש לציין כי מהפרוטוקול הנוכחי התקבל יחס העשרה גבוה משמעותית. תוצאות אלה מאשרות את תוקפו של הפרוטוקול הנוכחי לחקר ביטוי גנים מועשרים בטריכומות.
בנוסף, השווינו את נתוני הביטוי של חמישה גנים של אקטין בקנאביס, שכן אקטין משמש לעתים קרובות כגן ייחוס למחקרי שעתוק (טבלה 2). התוצאות שלנו הן עבור גבעול בודד והן עבור טריכומות ססיליות היו דומות לאלה שדווחו על ידי מחקר ליווינגסטון ועמיתיו14.
לבסוף, חישבנו את נתוני הביטוי והעשרת הטריכומות עבור הגנים ממשפחת החלבונים קושרי הכלורופיל a-b, שככל הנראה אינם מועשרים בטריכומות (טבלה 3). ואכן, 12 בני משפחת גנים זו הראו מקדם העשרת טריכומות של <1, המשמש כבקרה שלילית להעשרת טריכומות. תוצאות משולבות אלה מצביעות על דפוסי הביטוי הייחודיים של התפרחת ושברי הטריכומות המבודדים ותומכות בשלמות ואיכות הטריכומות של מקטע הטריכומה המבודד.
איור 1: הגדרה לטעינת זכוכית 1 ליטר. רשת דלת המסך בקוטר 1 מ"מ מאובטחת לצידי הזכוכית באמצעות מספר גומיות (לא מוצגות). יש לטעון את הזכוכית בנפח 1 ליטר במצב זקוף. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הגדרת מסננת הקמח. מסננת הקמח מצוידת במסננת מיקרו של 350 מיקרומטר באמצעות גומיות בתחתית (לא מוצגת). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הגדרת השלב הראשון של בידוד טריכומות. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: הגדרת כד הזכוכית. הזכוכית מצוידת בשלוש שכבות של רשת דלת רשת (יתוש) בקוטר 1 מ"מ המאובטחת באמצעות גומיות בפתח. פתח הכד מצביע כלפי מטה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: הגדרת מבנה חרוט מיקרו-מסננת המשמש לבידוד טריכומות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: הכנה לתנועת הטבילה והניעור של המסננת הזעירה המכילה טריכומות מבודדות. התנועה האופקית/אנכית צריכה להידמות לעירוי שקיק תה. ההתקנה זהה עבור כל גודל רשת שינוי שנעשה בו שימוש. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: היערכות להעברת הטריכומות המבודדות הסופיות. הטריכומות המבודדות הסופיות מועברות לצינור מסומן בנפח 1.5 מ"ל. כל הכלים צריכים להיות מקוררים מראש עם LN. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 8: תרשים זרימה המתאר את הפרוטוקול. בידוד טריכומות קפיטטות בלוטות מ-C. סאטיבה כוללת שלושה שלבים: (1) ניתוק ראשוני של הטריכומות ממקור הצמח ומעבר דרך שתי מסננות (1 מ"מ ו-350 מיקרומטר), (2) העברת החומר הצמחי דרך חמש מיקרו-מסננות בגודל נקבוביות הולך וקטן (150 מיקרומטר, 105 מיקרומטר, 80 מיקרומטר, 65 מיקרומטר ו-50 מיקרומטר), ו-(3) איסוף הטריכומות המבודדות לתוך צינור 1.5 מ"ל מקורר מראש. רקמה שמורה מכל אחד משלבי המסננת הזעירה עשויה להיאסף באופן דומה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 9: תמונות מיקרוסקופיות של הטריכומות המבודדות באמצעות הפרוטוקול הנוכחי. (A,B,C) טריכומות ססיל קפיטט בלוטתי מעלי מניפה של C. sativa. (A) בידוד אמצעי, ממיקרו-מסננות עם גודל נקבוביות הנע בין 105 מיקרומטר ל-150 מיקרומטר. שימו לב לשמירה של כמויות גדולות של חומר ירוק, שאינו טריכומה. (B) סיום הבידוד, ממיקרו-מסננות שגודל הנקבוביות שלהן נע בין 50 מיקרומטר ל-65 מיקרומטר, מזוהם במקור צמחי (חץ אדום), ו-(C) ללא זיהום. פסי קנה מידה = (A) 100 מיקרומטר, (B,C) 50 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 10: תמונות מיקרוסקופיות של הטריכומות המבודדות. (A,B) טריכומות קפיטטות בלוטות מ-C. sativa: (A) סוג גבעול, מבודד באמצעות הפרוטוקול הנוכחי, ו-(B) סוג ססילי, מבודד באמצעות הפרוטוקול הנוכחי. (C) טריכומות עוקבות שבודדו באמצעות פרוטוקול קונבנציונלי. התשואה הנמוכה והמחסור בראשי הטריכומות הבלתי מתפשרים ניכרים. (ד,ה) טריכומות קפיטטות בלוטות גבעול בודדו באמצעות (D) הפרוטוקול הנוכחי ו-(E) הפרוטוקול הקונבנציונלי. (F) טריכומות גבעולות בלוטות שבודדו בין 65 מיקרומטר ל-105 מיקרו-מסננות (תקריב). שימו לב לבידוד הגבוה של טריכומות גבעוליות, עם ראשים מנותקים וחלקי גבעול. החיצים האדומים מציינים טריכומות ציסטוליות, החצים הכחולים מציינים כמה חלקי גבעול מהטריכומות הגבעולות של הבלוטות, והחצים הצהובים מציינים תאי דיסק מופרדים. פסי קנה מידה = (A,C,D,E,F) 100 מיקרומטר, (B) 50 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 11: ניתוח שלמות הרנ"א המופק מהטריכומות. כרומטוגרפיות וג'לים של דגימות RNA שחולצו מגבעול קפיטט בלוטי וטריכומות ססיל שבודדו באמצעות הפרוטוקול הנוכחי. תוצאות עבור הרנ"א מ-(A-D) הטריכומות הגבעולות של ארבעת קווי הזנים ששימשו במחקר זה, CS-11, CS-12, CS-13 ו-CS-14, בהתאמה, ו-(E-H) הטריכומות הססיליות, CS-11, CS-12, CS-13 ו-CS-14. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
טבלה 1: השוואה בין ביטוי הגן המועשר בטריכומה שהתקבל באמצעות RNAseq באמצעות הפרוטוקול הנוכחי לתוצאות שהתקבלו על ידי Livingston et al.14. 12 הגנים המציגים את המתאם הגבוה ביותר לביטוי חומצה קנאבידיולית סינתאז (CBDAS) על ידי ליווינגסטון ועמיתיו 14 (מתוך נתוני הטבלה המשלימים שלהם S4, שהותאמו באישור המו"לים של ויילי), הנחשבים לסמן גן ספציפי לטריכומה, נבחרו להשוואה. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 2: השוואה בין ביטוי הגנים (FPKM) של חמישה גנים של אקטין קנאביס של טריכומות גבעול וססיל מבודדים מהפרוטוקול הנוכחי (נתוני ביטוי הגנים שלנו ממגוון הקנאביס CS-1111 (Var CS-11)) עם תוצאות שפורסמו בעבר שאומצו מליווינגסטון ואחרים 14. התוצאות של Livingston et al.14 הוצגו בהתבסס על גנום הייחוס Finola FN, והנתונים שלהם תורגמו לגנום הייחוס CS10.2. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 3: ביטוי גנים (FPKM) של גנים קושרי קנאביס כלורופיל A-B של תפרחות שלמות וטריכומות גבעול מבודדות מהפרוטוקול הנוכחי (נתוני ביטוי הגנים שלנו מ- Var CS-11). אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בהשוואה לפרוטוקולי בידוד הטריכומות הקיימים כיום, שני שינויים עיקריים מתוארים בפרוטוקול הנוכחי. אלה כוללים ניתוק של הטריכומות מהחומר הצמחי באמצעות קרח יבש בשלב הראשוני והחלפת LN בתווך החיץ הנוזלי הנפוץ. השינוי הראשון לטיהור טריכומות C. sativa מבוסס על פרוטוקול מוקדם יותר שהציג שימוש בקרח יבש כתוש כדי לנתק את הטריכומות מדוקרניום5. בעוד שפרוטוקולי בידוד טריכומות מסורתיים משתמשים בדרך כלל במבחנה קטנה (50 מ"ל), במחקר זה נעשה שימוש בכד זכוכית 1 ליטר עם כמות נדיבה של קרח יבש כתוש, המאפשר עיבוד נפח גדול יותר של חומר צמחי ראשוני (עד 10 גרם). יתר על כן, בפרוטוקול הנוכחי הוכנסו שני מעברים נוספים של הטריכומות דרך מיקרו-מסננות בשלב הבידוד הראשון. השלב הראשון משתמש בתנועה אנכית מעלה ומטה נמרצת דמוית מלח, והשני משתמש בתנועת ניפוי אופקית דרך מסננת המיקרו במסננת הקמח. תנועות הניפוי האופקיות והאנכיות המשולבות מוצעות כדי לקדם הפרדה משופרת בהתבסס על גודל וצורת הטריכומה.
השינוי השני, המשמעותי ביותר, מתייחס למדיום הבידוד שבו מתבצע המעבר דרך המיקרו-מסננות. בפרוטוקול הנוכחי, אמצעי הבידוד המימי הקונבנציונלי מוחלף לחלוטין על ידי LN. פרוטוקול8 הקודם השתמש גם הוא ב-LN בשלב הראשון לבידוד טריכומות, הפרדת טריכומות מהחומר הצמחי (על ידי גרידת חומר הפרח כנגד מסננת רשת), אך המשיך עם מיצוי חיץ נוזלי והפרדת צפיפות פרקול. החלפת LN במקום אמצעי הבידוד הקונבנציונלי מבטלת את הצורך בהליכים מיוחדים הקשורים לרכיבים הרעילים של אמצעי הבידוד הקונבנציונלי, ומאפשרת זרימת עבודה רגועה ותפוקה גבוהה.
מאפיין מרכזי של הפרוטוקול הנוכחי מסתמך על הנטייה של קרח יבש ו- LN לסובלימציה מהירה בטמפרטורת החדר. תכונה זו מאפשרת את היישום הנדיב שלהם לאורך כל תהליך הבידוד. לעומת זאת, שימוש בכמות גדולה של מאגר הבידוד הקונבנציונלי יוביל לסיבוכים טכניים הנוגעים לטיפול בנפחים הגדולים שלו.
בעוד תהליך הבידוד בפרוטוקול הנוכחי מקדם את שימור מבנה הראש השברירי של טריכומה גבעול הקפיטט הבלוטתי, הפרוטוקולים המקובלים מקדמים את הפרדת תאי הדיסק מחומר הבלוטה הנותר, שנשטף בקלות ומשאיר רק את תאי הדיסק. ניתן לראות בבירור את התופעה הזו בתוצאות שלנו בהשוואה בין פרוטוקול בידוד קונבנציונלי לפרוטוקול החדש שלנו (איור 10D,E). מלבד התצפית המיקרוסקופית, ניתוח האיכות של הרנ"א המופק מהטריכומות (שבודד באמצעות פרוטוקול זה) מצביע בבירור על כך שתקינות הרנ"א נשמרת בתהליך הבידוד וכי הוא מתאים לאנליזה תעתוקתית.
יתר על כן, תוצאות ביטוי הגנים ממקטע הטריכומות המבודד שלנו מצביעות על כך שהשבר מועשר מאוד בגנים מבוססים המבוטאים בטריכומות (טבלה 1), ובאופן הדדי, שגנים שאינם מבוטאים בטריכומות אינם מיוצגים (טבלה 3).
המגבלה העיקרית של הפרוטוקול הנוכחי היא התאמתו הבלעדית לבידוד טריכומות על פי נטייתן לעבור דרך מיקרו-מסננות. אמנם לא ניתן להחיל את הפרוטוקול ישירות על בידוד טריכומות באמצעות שיפוע צפיפות, אך הוא מתאים לבידוד הטריכומות לפני שלב שיפוע הצפיפות, במידת הצורך. במחקר זה, הטריכומות שבודדו באמצעות פרוטוקול זה לא עברו אפיון פרוטאומי, ויש לוודא את התאמתן ליישום כזה. עם זאת, מכיוון שדגימות הרנ"א שחולצו הן מטריכומות גבעול והן מטריכומות ססיליות לא הראו התפרקות, כפי שעולה מהכומטוגרפים ומערכי RIN גבוהים, ניתן להניח כי הטריכומות שבודדו בפרוטוקול הנוכחי עשויות לעמוד בדרישות הדרושות לאנליזה פרוטאומית.
דרגת הבידוד (ממקור הצמח הראשוני ומסוגים אחרים של טריכומות) של הטריכומות הססיל הקפיטטיות הבלוטות מעלי המניפה גבוהה מאוד, מכיוון שעלי המניפה חסרים את הטריכומות הגבעולות מסוג15,16 של הקפיטט הבלוטתי והבולבוסי, והטריכומות הציסטוליות והבולבוסיות מבודדות בקלות מהטריכומות הססיליות בשל הבדלי המבנה והגודל שלהן. עם זאת, באשר לבידודם של טריכומות מסוג גבעול קפיטט בלוטות, מוטב להתייחס למידת הבידוד שלהן כהעשרה, שכן מקור הצמח, התפרחת הנקבית הבוגרת, מכיל את כל ארבעת סוגי הטריכומות, בנוסף לסוג14 שלפני הגבעול. סביר להניח שרוב הטריכומות המבודדות הן מסוג גבעול, שכן מיקומן הגבוה (ביחס לטריכומות הססיליות הקשורות לאפידרמיס) מגביר את הסבירות שהן יתנגשו בחלקיק קרח יבש ויתנתקו מהצמח. יתר על כן, הצומת המחבר בין חלקי הראש והגבעול של הטריכומה הגבעול נחשב לנקודת חולשה הקשורה לביטול ראש הבלוטה17. לכן, יהיה זה מדויק להתייחס לחלק הטריכומה הגבעול כשבר מועשר מאוד עם זיהום נמוך פוטנציאלי של סוג הססיל. עם זאת, לא נערך ניתוח נוסף כדי לאמת הנחה זו.
התאמתו של הפרוטוקול הנוכחי להפקת טריכומות בלוטות ממיני צמחים אחרים טרם נקבעה. צפיפות הטריכומות הגבוהה ב- C. sativa תורמת ככל הנראה להצלחת הפרוטוקול הנוכחי. עם זאת, לא נראה סביר שזו הסיבה היחידה, שכן מקור חומר צמחי גדול יחסית (עד 10 גרם למחזור בידוד) ניתן לעיבוד יעיל. מחקרים אחרים הציגו פרוטוקולים מפורטים לבידוד סוגי טריכומות שונים מצמחים אחרים, לדוגמה, טריכומות עלי רוזטה מ- Arabidopsis thaliana18,19. בעוד שתחולת הפרוטוקול הנוכחי לבידוד סוגי טריכומות אחרים לא נחקרה בעבודה זו, אלמנטים שהוצגו בעבודה זו, במיוחד החלפת LN במאגר הבידוד, עשויים לשפר את תהליך בידוד הטריכומות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים.
Acknowledgments
המחברים מודים על תמיכה כספית מחברת CannabiVar Ltd. כל החומר הצמחי סופק בנדיבות על ידי פרופ' חיננית קולטאי ממרכז וולקני.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bioanalyzer RNA Pico 6000 chip | Agilent, Germany | Reorder number 5067-1513 | Lab-on-a-chip system |
| Transsonic-310 | Elma, Germany | D-78224 | Ultrasonic cleaning unit |
| TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 | Illumina, USA | RS-122-2001 | Sample preperation for RNA sequencing library |
| Spectrum Plant Total RNA Kit | SIGMA-ALDRICH, USA | STRN50-1KT | Plant Total RNA Kit |
| Nylon micro-sieve with a mesh size of 350 µm (40 x 40 cm or larger than the circumference of the flour sifter) | Sinun Tech, Israel | r0350n350210 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size of 150 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0150n360465 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 105 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0105n320718 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 80 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0080n370465 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 65 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0065n340715 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 50 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0080n370465 | Nylon screen aperture |
| Up to 10 g of frozen plant material (stored in -80 oC or liquid nitrogen) | |||
| Suitable gloves for handling low temperatures | |||
| Safety goggles | |||
| 1 mm screen door (mosquito) mesh (strip of 30 x 100 cm) | |||
| Large strainer (colander) with holes approximately 5 mm | |||
| 1 L glass beaker | |||
| 1 block of dry ice (0.5-1 kg) | |||
| Hammer and hard flat object | |||
| Two 5 L plastic containers | |||
| Rubber bands | |||
| Large flour sifter or sieve strainer- preferably one with a detachable plastic ring on the circumference | |||
| Several large and small round bottom stainless steel containers. One of them should be larger than the flour sifter's circumference (approximately 40 cm in diameter), to minimize the loss of the sifted mass outside the round bottome stainless steel container | |||
| Pre-chilled (via liquid nitrogen) stainless steel spoon, spatula, and scoopula | |||
| Clean plate | |||
| Several clothespins | |||
| Pre-chilled (via liquid nitrogen) labeled 1.5 mL tubes with holes poked on the lid with a sterile needle | |||
| Two containers of liquid nitrogen | |||
| 1 cm wide painting brush |
References
- Schilmiller, A. L., Last, R. L., Pichersky, E. Harnessing plant trichome biochemistry for the production of useful compounds. Plant Journal for Cell & Molecular Biology. 54 (4), 702-709 (2008).
- Liu, Y., Jing, S. X., Luo, S. H., Li, S. H. Non-volatile natural products in plant glandular trichomes: chemistry, biological activities and biosynthesis. Natural Product Reports. 36 (4), 626-665 (2019).
- Fairbairn, J. W. The trichomes and glands of Cannabis sativa L. UN Bulletin on Narcotics. 23, 29-33 (1972).
- Booth, J. K., Page, J. E., Bohlmann, J. Terpene synthases from Cannabis sativa. PLoS One. 12 (3), 0173911 (2017).
- Yerger, E. H., et al. A rapid method for isolating glandular trichomes. Plant Physiology. 99 (1), 1-7 (1992).
- Gershenzon, J., Maffei, M. M., Croteau, R. Biochemical and histochemical localization of monoterpene biosynthesis in the glandular trichomes of spearmint (Mentha spicata). Plant Physiology. 89 (4), 1351-1357 (1989).
- Gershenzon, J., et al. Isolation of secretory cells from plant glandular trichomes and their use in biosynthetic studies of monoterpenes and other gland products. Analytical Biochemistry. 200 (1), 130-138 (1992).
- Conneely, L. J., Mauleon, R., Mieog, J., Barkla, B. J., Kretzschmar, T. Characterization of the Cannabis sativa glandular trichome proteome. PLoS One. 16 (4), 0242633 (2021).
- Liu, Y., Zhu, P., Cai, S., Haughn, G., Page, J. E. Three novel transcription factors involved in cannabinoid biosynthesis in Cannabis sativa L. Plant Molecular Biology. 106 (1-2), 49-65 (2021).
- Slone, J. H., Kelsey, R. G. Isolation and purification of glandular secretory cells from Artemisia tridentata (ssp. vaseyana) by Percoll density gradient centrifugation. American Journal of Botany. 72 (9), 1445-1451 (1985).
- Namdar, D., et al. Terpenoids and Phytocannabinoids Co-Produced in Cannabis Sativa Strains Show Specific Interaction for Cell Cytotoxic Activity. Molecules. 24 (17), 3031 (2019).
- McDowell, E. T., et al. Comparative functional genomic analysis of Solanum glandular trichome types. Plant Physiology. 155 (1), 524-539 (2011).
- Bergau, N., Santos, A. N., Henning, A., Balcke, G. U., Tissier, A. Autofluorescence as a signal to sort developing glandular trichomes by flow cytometry. Frontiers in Plant Science. 7, 949 (2016).
- Livingston, S. J., et al. Cannabis glandular trichomes alter morphology and metabolite content during flower maturation. The Plant Journal. 101 (1), 37-56 (2019).
- Turner, J. C., Hemphill, J. K., Mahlberg, P. G. Gland distribution and cannabinoid content in clones of Cannabis sativa L. American Journal of Botany. 64 (6), 687-693 (1977).
- Turner, J. C., Hemphill, J. K., Mahlberg, P. G. Quantitative determination of cannabinoids in individual glandular trichomes of Cannabis sativa L. (Cannabaceae). American Journal of Botany. 65 (10), 1103-1106 (1978).
- Hammond, C. T., Mahlberg, P. G. Morphology of glandular hairs of Cannabis sativa from scanning electron microscopy. American Journal of Botany. 60 (6), 524-528 (1973).
- Marks, M. D., et al. A new method for isolating large quantities of Arabidopsis trichomes for transcriptome, cell wall, and other types of analyses. The Plant Journal. 56 (3), 483-492 (2008).
- Huebbers, J. W., et al. An advanced method for the release, enrichment and purification of high-quality Arabidopsis thaliana rosette leaf trichomes enables profound insights into the trichome proteome. Plant Methods. 18 (1), 12 (2022).
