Summary
Представлен протокол для удобной и высокопроизводительной изоляции и обогащения железистых головчатых стеблевых и сидячих трихом из Cannabis sativa. Протокол основан на сухой, небуферной экстракции трихом с использованием только жидкого азота, сухого льда и нейлоновых сит и подходит для экстракции РНК и транскриптомного анализа.
Abstract
В этой статье представлен протокол для удобной и высокопроизводительной изоляции и обогащения железистых головчатых стеблевых и сидячих трихом из Cannabis sativa. Пути биосинтеза метаболизма каннабиноидов и летучих терпенов локализованы в основном в трихомах каннабиса , а изолированные трихомы полезны для анализа транскриптома. Существующие протоколы выделения железистых трихом для транскриптомной характеристики неудобны и обеспечивают скомпрометированные трихомные головки и относительно небольшое количество изолированных трихом. Кроме того, они полагаются на дорогостоящие аппараты и изолирующие среды, содержащие ингибиторы белка, чтобы избежать деградации РНК. Настоящий протокол предлагает объединить три отдельные модификации для получения большого количества изолированных железистых головчатых черешковых и сидячих трихом из зрелых женских соцветий и веерных листьев C. sativa соответственно. Первая модификация включает в себя замену жидкого азота на обычную изолирующую среду для облегчения прохождения трихом через микросита. Вторая модификация включает в себя использование сухого льда для отделения трихом от растительного источника. Третья модификация включает в себя последовательное прохождение растительного материала через пять микросит с уменьшающимися размерами пор. Микроскопическая визуализация продемонстрировала эффективность метода изоляции для обоих типов трихом. Кроме того, качество РНК, выделенной из изолированных трихом, соответствовало последующему транскриптомному анализу.
Introduction
Железистые трихомы представляют собой волосовидные структуры, присутствующие в растениях, которые содержат много вторичных метаболитов1 и представляют собой ценный банк новых биосинтетических генов и ферментов2. В каннабисе биосинтез важных вторичных метаболитов, каннабиноидов3 и терпенов4, локализуется в трихомах. Учитывая роль трихом в определении качества каннабиса как для медицинского, так и для рекреационного использования, представляет интерес изучение экспрессии генов трихом. Чтобы охарактеризовать экспрессию трихом-специфических генов, сначала необходимо выделить интересующие трихомы. Протоколы изоляции трихом были впервые описаны еще в 1992 году5, а их последние разработки были недавно пересмотрены2. В целом, протоколы экстракции железистых трихом для транскриптомной характеристики можно разделить на два отдельных последовательных этапа. Первый шаг включает в себя тщательное физическое отделение трихом от растительной ткани. Этот этап может быть выполнен с использованием сухого льда5, стеклянных шариков с помощью коммерческого устройства6,7, измельчения растительного материала против сетчатого сита8 или вихривания растительной ткани в изолирующем буфере9. Вторая стадия включает в себя более тонкое отделение интересующих трихом от микроскопических растительных остатков и/или других типов трихом. Этот этап может быть выполнен с помощью центрифугирования с градиентомплотности 8,10 или сит различных размеров 7,9. Из-за чрезвычайной чувствительности РНК в обработанных тканях к разлагающим агентам эти два последовательных этапа обычно проводят в ледяной изолирующей среде, часто в присутствии ингибиторов белка4.
Обычные протоколы изоляции трихом требуют, в дополнение к ледяным температурам, большого количества изолирующей среды для обеспечения эффективной процедуры экстракции. Сочетание этих компонентов приводит к трудному и длительному процессу изоляции, который препятствует высокой пропускной способности. Таким образом, представление простого, удобного для пользователя альтернативного протокола изоляции трихомы, вероятно, будет полезно для различных аспектов, связанных с характеристикой трихомы. Цель настоящей статьи состоит в том, чтобы предложить альтернативный протокол выделения черешковых и сидячих железистых головчатых трихом из Cannabis sativa путем объединения и интеграции нескольких элементов из обычных протоколов. Эти элементы включают сухой лед5, пропускание трихом через несколько микросит с уменьшением размера пор 7,9 и замену изолирующей среды8 жидким азотом (LN).
Новизна настоящего протокола изоляции трихом, по сравнению с традиционными протоколами, проявляется в ряде аспектов. Этот протокол удобен тем, что не требует опасных компонентов. Процедура может проводиться в лаборатории с минимальными мерами предосторожности и обеспечивает высокую пропускную способность. Замена LN на стандартную жидкую изолирующую среду обеспечивает целостность трихом на протяжении всего процесса изоляции, что позволяет проводить последующий транскриптомный анализ. После сублимации LN и сухого льда изолированные трихомы остаются свободными от вредных остатков. Кроме того, склонность LN к сублимации при комнатной температуре позволяет широко использовать его во всем протоколе. Напротив, использование больших объемов обычной изоляционной среды создает практические трудности при обращении с ней. Наконец, протокол уменьшает отделение клетки диска от оставшейся хрупкой структуры головки железистой трихомы, что позволяет сохранить содержимое свободного пространства.
Этот протокол представлен в подробном пошаговом виде, предназначенном для оказания технической помощи в выделении железистых головчатых трихом C. sativa. Протокол обеспечивает управляемый рабочий процесс, в результате которого получаются изолированные трихомы с высокой концентрацией и чистотой, подходящие для последующего молекулярного анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Растительный материал, использованный в этом исследовании, состоял из четырех штаммов C. sativa ARO-Volcani (CS-11, CS-12, CS-13 и CS-14), которые были выращены в Центре Вулкани, Израиль, как описано в другом месте11. Железистые головчатые черешковые трихомы были выделены из зрелых цветущих соцветий, а железистые головчатые сидячие трихомы были выделены из крупных веерных листьев зрелых нецветущих материнских растений. Все растительное сырье было свежесобрано и сразу же хранилось при температуре -80 °C.
ВНИМАНИЕ: Сухой лед и LN используются во всем протоколе. Эти вещества чрезвычайно опасны. Изолированные трихомы могут содержать частицы сухого льда, которые могут создавать опасное давление газа при введении в герметичные трубки; Поэтому все колпачки должны быть проколоты иглой. Настоятельно рекомендуется использовать защитные очки, соответствующую лабораторную одежду и перчатки для работы при экстремально низких температурах.
1. Установка для первичного отделения трихом от растительного материала
- Измельчите блок сухого льда на мелкие мелкие хлопья с помощью молотка и твердого плоского предмета в пластиковом контейнере объемом 5 л.
- Просейте мелкие хлопья сухого льда (менее 5 мм) из неизмельченного сухого льда с помощью большого ситечка (через поры менее 5 мм) в другой пластиковый контейнер объемом 5 л. Насыпьте примерно 200 см3 (отметка 200 мл) хлопьев сухого льда в вертикальный стеклянный стакан объемом 1 л.
- На первый слой измельченного сухого льда добавьте до 10 г замороженных соцветий C. sativa (отныне именуемых растительным материалом) и накройте дополнительным слоем 200 см3 мелко измельченного сухого льда.
- Закройте отверстие стеклянного стакана объемом 1 л двумя-тремя слоями москитной сетки с экраном диаметром 1 мм и закрепите его на внешних сторонах стеклянной чашки резиновыми лентами (рис. 1).
- Налейте LN в большой контейнер из нержавеющей стали с круглым дном (см. Таблицу материалов), где будут собираться изолированные трихомы.
- Вставьте ячейку размером 350 мкм в просеиватель/ситечко для муки, чтобы покрыть сетку просеивателя муки снизу (рис. 2). Если имеется просеиватель муки со съемным пластиковым кольцом, вставьте ячейку размером 350 мкм так, чтобы она была закреплена под сеткой просеивателя муки. Если нет, закрепите сетку 350 мкм по окружности просеивателя муки с помощью резинок.
- Поместите просеиватель муки над большим контейнером из нержавеющей стали с круглым дном, наполненным LN (рис. 3). Убедитесь, что ширина контейнера превышает ширину просеивателя муки, чтобы свести к минимуму потери просеянной массы за пределами контейнера из нержавеющей стали с круглым дном.
2. Отделение трихом от растительного материала
- Встряхните стакан объемом 1 л так, чтобы его отверстие было направлено вниз к просеивателю муки, как если бы вы использовали большую солонку (рис. 4).
- Откладывайте стакан объемом 1 л каждые 2-3 минуты, чтобы можно было просеять измельченный сухой лед и растительный материал, скопившийся на мучном сите.
- Просейте сито для муки горизонтально, чтобы облегчить прохождение растительного материала в LN в контейнере из нержавеющей стали с круглым дном, расположенном ниже.
- Добавьте LN в контейнер из нержавеющей стали и измельченный сухой лед в стеклянный стакан объемом 1 л, когда их уровень иссякнет. Пополните использованный растительный материал в стеклянном стакане дополнительными 10 г свежего растительного материала, когда растительный материал на мучном сите истощится. Пополнение обычно не приходится повторять более двух раз.
- Повторяйте шаги 2.1-2.4 до тех пор, пока в контейнере из нержавеющей стали с круглым дном не будет собрано достаточное количество обогащенных трихом. Как правило, 20 г свежего растительного материала достаточно для выделения РНК и анализа транскриптома.
- Убедитесь, что на дне контейнера из нержавеющей стали, погруженного в LN, есть белое порошкообразное вещество (состоящее из растительных остатков, железистых трихом и измельченного сухого льда). Микроскопическое наблюдение поможет определить, было ли собрано достаточное количество трихом; Однако этот шаг может затруднить поток протокола. Обычно для большинства выделений достаточно 10-20 г исходного растительного материала; Однако могут быть различия в плотности трихомы растений.
ПРИМЕЧАНИЕ: С этого момента эксперимент можно приостановить и возобновить позже. При кратковременной паузе следует добавить достаточное количество LN, чтобы трихомы оставались погруженными в воду. Альтернативно, трихомы можно собирать и хранить при -80 °С до 3 месяцев для последующего использования, как описано на шаге 5.
3. Отделение железистых головчатых трихом (черешковых и сидячих) от других типов трихом, таких как луковичные и цистолитические трихомы и мусор
- Добавьте небольшое количество LN в чистый небольшой контейнер из нержавеющей стали с круглым дном.
- Сложите микросито размером 40 см x 40 см с размером ячеек 150 мкм дважды, чтобы получить сгиб 20 см x 20 см, и откройте его. Убедитесь, что он напоминает конусообразную форму (рис. 5).
- Прикрепите сетчатый конус к краю контейнера из нержавеющей стали с круглым дном с помощью одной или двух прищепок так, чтобы открытая часть конуса находилась в вертикальном положении, а его заостренная часть была частично погружена в LN.
- Аккуратно вылейте LN и белое порошкообразное вещество из шага 2.6 в конус микросита.
- Аккуратно нанесите широкую кисть, чтобы собрать и перенести оставшийся растительный материал из первого контейнера в ячеистый конус размером 150 мкм.
- Добавьте больше LN в первый контейнер и повторяйте чистящие движения, пока весь растительный материал не будет перенесен в конус микросита.
- Аккуратно отсоедините прищепку от крышки контейнера, и откройте конус микросита так, чтобы трихомы располагались посередине открытого микросита. Держите все четыре угла микросита вместе так, чтобы средняя часть, содержащая трихомы, оставалась погруженной в LN (рис. 6).
- Держась за все четыре угла микросита, аккуратно окуните и встряхните микросито в LN в стальном контейнере, как если бы вы настаивали чайный пакетик. Продолжайте это погружение/встряхивание (вертикальное и горизонтальное) движение в течение 1 минуты. Существует компромисс между качеством изоляции и количеством. Более длительные движения погружения могут привести к большему количеству трихом, но степень их изоляции может быть хуже. В целом, 1 минута рекомендуется как достаточная как для качества, так и для количества.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это просеивающее движение является наиболее важной частью протокола и должно выполняться соответствующим образом. - Дополнительно: Зачерпните непросеянные растительные остатки и более крупные трихомы (все еще погруженные в LN), которые завернуты в центр микросита, в пробирку объемом 13 мл или 50 мл и храните при температуре -80 ° C для использования в будущем.
ВНИМАНИЕ: Во избежание накопления газа под давлением (из сухого льда и остатков LN) проколите отверстие в колпачке пробирки стерилизованной иглой. Колпачок можно заменить после снижения давления, что обычно происходит через 24 часа.
4. Прохождение трихом через микросита с уменьшением размера пор
- Просеянные трихомы, погруженные в LN на дне небольшого контейнера из нержавеющей стали с круглым дном, последовательно перемещают через микросита с уменьшающимися размерами пор (105 мкм, 80 мкм, 65 мкм и 50 мкм) таким же образом, как показано на шаге 3.
5. Сбор желаемых трихом
- Удалите нужные трихомы, погруженные в LN и завернутые в микросито 50 мкм, с помощью предварительно охлажденной (в LN) ложки. Выложите их на чистую тарелку.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом заключительном этапе изоляции желаемые трихомы собирают из сита. - Быстро перенесите порошкообразные трихомы в маркированную предварительно охлажденную пробирку объемом 1,5 мл с помощью предварительно охлажденного шпателя или совка, вставленного в пробирку (рис. 7). Немедленно храните пробирки при температуре -80 °C для дальнейших исследований.
ПРИМЕЧАНИЕ: Схематическая схема рабочего процесса, изображающая весь протокол изоляции, показана на рисунке 8.
6. Наблюдение и анализ очищенных трихом
- Поместите небольшое количество (10 мг) изолированных трихом на предметное стекло микроскопа с помощью предварительно охлажденного (через LN) шпателя. Добавьте каплю воды и наблюдайте прямо на световом микроскопе, не окрашивая. Оцените общую изоляцию и степень загрязнения, используя низкое (10-кратное) и большое (40-кратное) увеличение. Обогащение визуально оценивается по относительному количеству трихом по отношению к нетрихомной ткани, как показано на рисунке 9.
- Проведите экстракцию РНК и анализ качества из 50 мг изолированных железистых головчатых стеблевых и сидячих трихом C. sativa.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для экстракции РНК использовался коммерческий набор для экстракции (см. Таблицу материалов), использующий стратегию очистки мРНК на основе поли-А.- Ресуспендируют 50 мг изолированных трихом в лизирующем растворе, вихревом в течение 30 с, обрабатывают ультразвуком в установке ультразвуковой очистки с ледяной частотой 35 кГц в течение 5 мин и извлекают мРНК из образцов в соответствии с протоколом производителя (см. Таблицу материалов).
- Чтобы оценить целостность РНК, выделенной из трихом, определите концентрацию РНК, общее количество и значения числа целостности РНК (RIN) с помощью системы «лаборатория-на-чипе» (см. Таблицу материалов).
- Проведите анализ RNAseq фракций трихомы (опционально). Анализ RNAseq и биоинформатический анализ секвенированных считываний могут выполняться стандартными аутсорсинговыми службами
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Основной модификацией, включенной в этот протокол по сравнению с обычными протоколами изоляции трихомы, является замена стандартной изолирующей среды на LN. Использование LN в качестве изолирующей среды обеспечивает расслабленный рабочий процесс, поскольку до тех пор, пока образцы погружены в LN, метаболическая деградация маловероятна. Кроме того, поскольку протокол избегает опасных компонентов (т.е. ауринтрикарбоновой кислоты и β-меркаптоэтанола), используемых в традиционной трихомоизоляционной среде, работа не ограничивается химическим колпаком. Тем не менее, важно соблюдать необходимые меры предосторожности при работе с сухим льдом и LN.
Для оценки преимуществ настоящего протокола результаты выделения трихом из настоящего протокола сравнивали с результатами, полученными с использованием обычной процедуры выделения трихомы (в которой использовали водный буфер, стеклянные шарики и мелкое сито для выделения трихомы)12, первоначально с использованием светового микроскопа. Сравнение компонентов из разных фаз изоляции с помощью светового микроскопа иллюстрирует возрастающую степень изоляции трихомы по мере продвижения процесса изоляции. На начальной стадии процесса выделения (микросито 105-150 мкм) в изолированной части преобладали кусочки ткани листа (рис. 9А), в отличие от конечного продукта выделения, который почти полностью состоял из изолированных трихом (рис. 9В). Следует позаботиться о том, чтобы убедиться, что выделенные образцы не загрязнены (рис. 9B).
Хотя плотность трихом не была количественно определена в этом исследовании, качество изолированных железистых головчатых стеблей и сидячих трихом на заключительном этапе изоляции можно наблюдать на рисунке 10. Чистоту можно сравнить с чистотой, полученной при выделении трихом с использованием обычного протокола12 (рис. 10С). В настоящем протоколе сохраняется тонкая структура головки черешкового трихома, и видны целые головки изолированного черешкового трихома (рис. 10D), тогда как при использовании обычного протокола отсутствует полная структура головки трихомы и присутствуют только клетки диска (рис. 10E). Урожайность также может быть значительно увеличена, поскольку использование сухого льда и LN устраняет предел растительного материала, который можно извлечь. Дополнительным преимуществом нашего неводного протокола является то, что в нем используется только сухой лед и LN, и, следовательно, после их испарения не остается остаточных компонентов изолирующей среды. Использование LN предотвращает высвобождение липких вторичных метаболитов, которые могут привести к агрегации трихом13. В настоящем протоколе выделенные трихомы на заключительной стадии выделения были извлечены в виде сухого мелкодисперсного порошка.
Чрезвычайно низких температур, сохраняемых на протяжении всего настоящего протокола, вероятно, будет достаточно для достижения целей обычных буферных сред, предотвращающих деградацию РНК (при условии, что образцы хранятся под водой) и облегчающих последующее молекулярное применение. Чтобы подтвердить это предположение, мы извлекли РНК из изолированных трихом и оценили целостность РНК, используя коммерчески доступные наборы. Полученные высокие значения RIN (от 9,4 до 10) и отчетливая гель-хроматография (рис. 11) явно указывают на высокую целостность РНК. Образцы РНК были дополнительно проанализированы с помощью RNAseq, и из всех библиотек было получено >20 M высококачественных считываний.
Чтобы подтвердить, что мРНК из изолированной фракции трихом действительно обогащена генами, экспрессируемыми трихомами, мы сравнили наши результаты экспрессии генов для соцветия и соответствующих изолированных стеблевых трихом с предыдущими результатами, представленными Livingston et al.14, которые характеризовали экспрессию генов очищенных трихом каннабиса (адаптировано из их Дополнительной таблицы 1 ). Их протокол состоял из смешивания в водном буфере, фильтрации через сита и, наконец, очистки трихом с использованием градиента Перколла. Гены, экспрессируемые трихомой, были охарактеризованы как наиболее сильно коррелирующие (p > 0,95) с экспрессией гена синтазы каннабидиоловой кислоты (CBDAS), трихом-специфического генного маркера14. Сравнение экспрессии генов между результатами, полученными с помощью настоящего протокола, и результатами, представленными в Livingston et al.14, показывает, что 12 наиболее высокообогащенных генов в нашей трихомной фракции также были обогащены в исследованииLivingston et al. 14, включая ген трихом-маркера CBDAS (таблица 1). Следует отметить, что в настоящем протоколе был получен значительно более высокий коэффициент обогащения. Эти результаты подтверждают обоснованность настоящего протокола для изучения экспрессии генов, обогащенных трихомами.
Кроме того, мы сравнили данные экспрессии пяти генов актина каннабиса, поскольку актин часто используется в качестве эталонного гена для исследований транскриптома (таблица 2). Наши результаты как для изолированных черешковых, так и для сидячих трихом были сопоставимы с теми, о которых сообщалось в исследовании Livingston et al.14.
Наконец, мы рассчитали данные об экспрессии и обогащении трихомами для генов семейства связывающих белков хлорофилла a-b, которые, по-видимому, не обогащены трихомой (таблица 3). Действительно, 12 членов этого семейства генов показали фактор обогащения трихома <1, служащий отрицательным контролем для обогащения трихомы. Эти комбинированные результаты указывают на уникальные паттерны экспрессии фракций соцветия и изолированной трихомы и подтверждают целостность и качество трихомы изолированной фракции трихомы.
Рисунок 1: Настройка для загрузки стеклянного стакана объемом 1 л. Дверная сетка экрана диаметром 1 мм крепится к бокам стеклянного стакана с помощью нескольких резинок (не показаны). Стеклянный стакан объемом 1 л следует загружать в вертикальном положении. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Настройка просеивателя муки. Просеиватель муки оснащен микроситом размером 350 мкм с резиновыми лентами внизу (не показаны). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Настройка первого этапа изоляции трихомы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Установка стеклянного стакана. Стеклянный стакан оснащен тремя слоями сетки 1 мм с дверцей-экраном (москитной), закрепленной резинками в отверстии. Отверстие стакана направлено вниз. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Настройка конусной структуры микросита, используемой для изоляции трихом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Установка для погружения и встряхивания микросита, содержащего изолированные трихомы. Горизонтальное/вертикальное движение должно напоминать настой чайного пакетика. Настройка одинакова для каждого используемого размера сетки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Установка для переноса конечных изолированных трихом. Конечные изолированные трихомы переносят в меченую пробирку объемом 1,5 мл. Вся посуда должна быть предварительно охлаждена LN. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 8: Блок-схема, описывающая протокол. Выделение железистых головчатых трихом из С. Сатива включает в себя три этапа: (1) первоначальное отделение трихом от источника растения и прохождение через два сита (1 мм и 350 мкм), (2) пропускание растительного материала через пять микросит с уменьшающимися размерами пор (150 мкм, 105 мкм, 80 мкм, 65 мкм и 50 мкм) и (3) сбор изолированных трихом в предварительно охлажденную пробирку объемом 1,5 мл. Аналогичным образом может быть собрана оставшаяся ткань с любой из стадий микросита. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 9: Микроскопические изображения изолированных трихом с использованием текущего протокола. (А, В, В) Железистые головчатые сидячие трихомы из веерных листьев C. sativa. (A) Промежуточная изоляция из микросит с размерами пор от 105 мкм до 150 мкм. Обратите внимание на сохранение большого количества зеленого, нетрихомного материала. (B) Окончание изоляции из микросит с размерами пор от 50 мкм до 65 мкм, загрязненных растительным источником (красная стрелка), и (C) без загрязнения. Масштабные линейки = (A) 100 мкм, (B,C) 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 10: Микроскопические изображения изолированных трихом. (A, B) железистые головчатые трихомы C. sativa: (A) черешкового типа, выделенного с использованием текущего протокола, и (B) сидячего типа, выделенного с использованием текущего протокола. (C) Черешковые трихомы, выделенные с использованием обычного протокола. Очевидна низкая урожайность и отсутствие бескомпромиссных головок трихом. (Д,Е) Черешковые железистоголовчатые трихомы выделены с использованием (D) настоящего протокола и (E) обычного протокола. (F) Железистые стеблевые трихомы, выделенные из микросит размером от 65 мкм до 105 мкм (крупный план). Обратите внимание на высокую изоляцию черешковых трихом, с отделенными головками и стеблевыми частями. Красные стрелки указывают на цистолитические трихомы, синие стрелки указывают на несколько частей стебля железистых головчатых черешковых трихом, а желтые стрелки указывают на отдельные клетки диска. Масштабные линейки = (A, C, D, E, F) 100 мкм, (B) 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 11: Анализ целостности РНК, выделенной из трихом. Хроматографы и гели экстрагированных образцов РНК из железисто-головчатых стеблевых и сидячих трихом, выделенных по настоящему протоколу. Результаты для РНК из (A-D) стеблевых трихом четырех сортовых линий, используемых в этом исследовании, CS-11, CS-12, CS-13 и CS-14, соответственно, и (E-H) сидячих трихом, CS-11, CS-12, CS-13 и CS-14. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Таблица 1: Сравнение экспрессии генов, обогащенных трихомами, полученной с помощью RNAseq с использованием настоящего протокола, с результатами, полученными Livingston et al.14. Для сравнения были выбраны 12 генов, демонстрирующих наибольшую корреляцию с экспрессией синтазы каннабидиоловой кислоты (CBDAS) Livingston et al.14 (из их дополнительных табличных данных S4, адаптированных с разрешения издательств Wiley), считающихся трихом-специфическим генным маркером. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Таблица 2: Сравнение экспрессии генов (FPKM) пяти генов актина каннабиса изолированных стеблевых и сидячих трихом из настоящего протокола (наши данные об экспрессии генов из сорта каннабиса CS-1111 (Var CS-11)) с ранее опубликованными результатами, адаптированными из Livingston et al.14. Результаты Livingston et al.14 были представлены на основе референсного генома Finola FN, а их данные были переведены в референсный геном CS10.2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Таблица 3: Экспрессия генов (FPKM) генов, связывающих a-b хлорофилл каннабиса целых соцветий и изолированных черешковых трихом из настоящего протокола (наши данные об экспрессии генов из Var CS-11). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
По сравнению с имеющимися в настоящее время протоколами изоляции трихом, в настоящем протоколе описаны две основные модификации. К ним относятся отделение трихом от растительного материала с использованием сухого льда на начальном этапе и замена LN обычно используемой жидкой буферной среды. Первая модификация для очистки трихомы C. sativa основана на более раннем протоколе, который ввел использование измельченного сухого льда для отделения трифом от цветоножекгерани 5. В то время как в традиционных протоколах изоляции трихом обычно используется небольшая (50 мл) пробирка, в этом исследовании использовался стеклянный стакан объемом 1 л с большим количеством измельченного сухого льда, что позволяло обрабатывать больший объем исходного растительного материала (до 10 г). Кроме того, в настоящем протоколе на первом этапе изоляции были введены два дополнительных прохода трихом через микросита. На первом этапе используется вертикальное энергичное движение, похожее на солонку, а на втором - горизонтальное просеивающее движение через микросито в просеивателе муки. Предложены комбинированные горизонтальные и вертикальные просеивающие движения, способствующие усиленному разделению в зависимости от размера и формы трихомы.
Вторая, наиболее существенная модификация касается изолирующей среды, в которой осуществляется прохождение через микросита. В настоящем протоколе обычная водная изолирующая среда полностью заменена LN. Предыдущий протокол8 также использовал LN на первом этапе для изоляции трихом, отделяя трихомы от растительного материала (путем натирания цветочного материала сетчатым ситом), но продолжал экстракцию жидкого буфера и разделение плотности по Перколлу. Замена LN вместо обычной изолирующей среды устраняет необходимость в специальных процедурах, связанных с токсичными компонентами обычной изолирующей среды, обеспечивая облегченный рабочий процесс и высокую пропускную способность.
Ключевая особенность настоящего протокола заключается в склонности сухого льда и LN к быстрой сублимации при комнатной температуре. Эта функция позволяет широко применять их на протяжении всего процесса изоляции. Напротив, использование большого количества обычного изолирующего буфера привело бы к техническим сложностям, связанным с обработкой его больших объемов.
В то время как процесс изоляции в настоящем протоколе способствует сохранению хрупкой структуры головки железистой головчатой черешковой трихомы, обычные протоколы способствуют отделению клеток диска от оставшегося материала железы, который легко вымывается, оставляя только клетки диска. Это явление ясно видно в наших результатах, сравнивающих обычный протокол изоляции с нашим новым протоколом (рис. 10D, E). Помимо микроскопического наблюдения, анализ качества РНК, выделенной из трихом (выделенной с использованием этого протокола), ясно указывает на то, что целостность РНК сохраняется в процессе выделения и что она пригодна для транскриптомного анализа.
Кроме того, результаты экспрессии генов из нашей изолированной фракции трихомы указывают на то, что фракция сильно обогащена установленными генами, экспрессируемыми трихомами (таблица 1), и, в свою очередь, что гены, не экспрессируемые трихомой, не представлены (таблица 3).
Основным ограничением настоящего протокола является его исключительная пригодность для изоляции трихом в соответствии с их склонностью проходить через микросита. Хотя протокол не может быть непосредственно применен к изоляции трихом с использованием градиента плотности, он подходит для изоляции трихом до этапа градиента плотности, если это необходимо. В этом исследовании трихомы, выделенные с использованием этого протокола, не подвергались протеомной характеристике, и их пригодность для такого применения нуждается в проверке. Однако, поскольку образцы РНК, извлеченные как из черешковых, так и из сидячих трихом, не проявляли деградации, на что указывают хоматографы и высокие значения RIN, можно предположить, что трихомы, выделенные с помощью настоящего протокола, вероятно, удовлетворяют требованиям, необходимым для протеомного анализа.
Степень изоляции (от исходного источника растения и других типов трихом) железисто-головчатых сидячих трихом от веерных листьев очень высока, так как в веерных листьях отсутствует железисто-головчатый черешковый трихом типа15,16, а цистолитные и луковичные трихомы легко выделяются из сидячих трихом из-за их структурных и размерных различий. Однако, что касается выделения железистых головчатых черешковых трихом, лучше всего рассматривать степень их изоляции как обогащение, поскольку источник растения, зрелое женское соцветие, содержит все четыре типа трихом, в дополнение к предстеблевому типу14. Само собой разумеется, что большинство изолированных железистых головчатых трихом относятся к черешковому типу, поскольку их возвышенное положение (по отношению к эпидермально-связанным сидячим трихомам) увеличивает вероятность их столкновения с частицей сухого льда и отрыва от растения. Кроме того, соединение, соединяющее головную и стебельную части стеблевой трихомы, считается слабой точкой, связанной с абсциссией головки железы17. Таким образом, было бы правильно называть черешковую трихомную часть высокообогащенной фракцией с потенциально низким уровнем загрязнения сидячего типа. Однако дальнейший анализ для подтверждения этого предположения не проводился.
Пригодность настоящего протокола для извлечения железистых трихом из других видов растений еще предстоит определить. Высокая плотность трихомы у C. sativa, по-видимому, способствует успеху настоящего протокола. Однако представляется маловероятным, что это единственная причина, поскольку относительно большой источник растительного материала (до 10 г за цикл изоляции) может быть эффективно переработан. В других исследованиях были представлены подробные протоколы выделения различных типов трихом из других растений, например, трихом с розетками листьев из Arabidopsis thaliana18,19. Хотя применимость настоящего протокола для выделения других типов трихом в данной работе не изучалась, элементы, представленные в данной работе, особенно замена LN на изолирующий буфер, вероятно, улучшат процесс изоляции трихом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Конфликт интересов у авторов отсутствует.
Acknowledgments
Авторы выражают благодарность компании «КаннабиВар Лтд.» за финансовую поддержку. Весь растительный материал был щедро предоставлен профессором Хинанит Колтай из Центра Вулкани, Израиль.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bioanalyzer RNA Pico 6000 chip | Agilent, Germany | Reorder number 5067-1513 | Lab-on-a-chip system |
| Transsonic-310 | Elma, Germany | D-78224 | Ultrasonic cleaning unit |
| TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 | Illumina, USA | RS-122-2001 | Sample preperation for RNA sequencing library |
| Spectrum Plant Total RNA Kit | SIGMA-ALDRICH, USA | STRN50-1KT | Plant Total RNA Kit |
| Nylon micro-sieve with a mesh size of 350 µm (40 x 40 cm or larger than the circumference of the flour sifter) | Sinun Tech, Israel | r0350n350210 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size of 150 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0150n360465 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 105 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0105n320718 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 80 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0080n370465 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 65 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0065n340715 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 50 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0080n370465 | Nylon screen aperture |
| Up to 10 g of frozen plant material (stored in -80 oC or liquid nitrogen) | |||
| Suitable gloves for handling low temperatures | |||
| Safety goggles | |||
| 1 mm screen door (mosquito) mesh (strip of 30 x 100 cm) | |||
| Large strainer (colander) with holes approximately 5 mm | |||
| 1 L glass beaker | |||
| 1 block of dry ice (0.5-1 kg) | |||
| Hammer and hard flat object | |||
| Two 5 L plastic containers | |||
| Rubber bands | |||
| Large flour sifter or sieve strainer- preferably one with a detachable plastic ring on the circumference | |||
| Several large and small round bottom stainless steel containers. One of them should be larger than the flour sifter's circumference (approximately 40 cm in diameter), to minimize the loss of the sifted mass outside the round bottome stainless steel container | |||
| Pre-chilled (via liquid nitrogen) stainless steel spoon, spatula, and scoopula | |||
| Clean plate | |||
| Several clothespins | |||
| Pre-chilled (via liquid nitrogen) labeled 1.5 mL tubes with holes poked on the lid with a sterile needle | |||
| Two containers of liquid nitrogen | |||
| 1 cm wide painting brush |
References
- Schilmiller, A. L., Last, R. L., Pichersky, E. Harnessing plant trichome biochemistry for the production of useful compounds. Plant Journal for Cell & Molecular Biology. 54 (4), 702-709 (2008).
- Liu, Y., Jing, S. X., Luo, S. H., Li, S. H. Non-volatile natural products in plant glandular trichomes: chemistry, biological activities and biosynthesis. Natural Product Reports. 36 (4), 626-665 (2019).
- Fairbairn, J. W. The trichomes and glands of Cannabis sativa L. UN Bulletin on Narcotics. 23, 29-33 (1972).
- Booth, J. K., Page, J. E., Bohlmann, J. Terpene synthases from Cannabis sativa. PLoS One. 12 (3), 0173911 (2017).
- Yerger, E. H., et al. A rapid method for isolating glandular trichomes. Plant Physiology. 99 (1), 1-7 (1992).
- Gershenzon, J., Maffei, M. M., Croteau, R. Biochemical and histochemical localization of monoterpene biosynthesis in the glandular trichomes of spearmint (Mentha spicata). Plant Physiology. 89 (4), 1351-1357 (1989).
- Gershenzon, J., et al. Isolation of secretory cells from plant glandular trichomes and their use in biosynthetic studies of monoterpenes and other gland products. Analytical Biochemistry. 200 (1), 130-138 (1992).
- Conneely, L. J., Mauleon, R., Mieog, J., Barkla, B. J., Kretzschmar, T. Characterization of the Cannabis sativa glandular trichome proteome. PLoS One. 16 (4), 0242633 (2021).
- Liu, Y., Zhu, P., Cai, S., Haughn, G., Page, J. E. Three novel transcription factors involved in cannabinoid biosynthesis in Cannabis sativa L. Plant Molecular Biology. 106 (1-2), 49-65 (2021).
- Slone, J. H., Kelsey, R. G. Isolation and purification of glandular secretory cells from Artemisia tridentata (ssp. vaseyana) by Percoll density gradient centrifugation. American Journal of Botany. 72 (9), 1445-1451 (1985).
- Namdar, D., et al. Terpenoids and Phytocannabinoids Co-Produced in Cannabis Sativa Strains Show Specific Interaction for Cell Cytotoxic Activity. Molecules. 24 (17), 3031 (2019).
- McDowell, E. T., et al. Comparative functional genomic analysis of Solanum glandular trichome types. Plant Physiology. 155 (1), 524-539 (2011).
- Bergau, N., Santos, A. N., Henning, A., Balcke, G. U., Tissier, A. Autofluorescence as a signal to sort developing glandular trichomes by flow cytometry. Frontiers in Plant Science. 7, 949 (2016).
- Livingston, S. J., et al. Cannabis glandular trichomes alter morphology and metabolite content during flower maturation. The Plant Journal. 101 (1), 37-56 (2019).
- Turner, J. C., Hemphill, J. K., Mahlberg, P. G. Gland distribution and cannabinoid content in clones of Cannabis sativa L. American Journal of Botany. 64 (6), 687-693 (1977).
- Turner, J. C., Hemphill, J. K., Mahlberg, P. G. Quantitative determination of cannabinoids in individual glandular trichomes of Cannabis sativa L. (Cannabaceae). American Journal of Botany. 65 (10), 1103-1106 (1978).
- Hammond, C. T., Mahlberg, P. G. Morphology of glandular hairs of Cannabis sativa from scanning electron microscopy. American Journal of Botany. 60 (6), 524-528 (1973).
- Marks, M. D., et al. A new method for isolating large quantities of Arabidopsis trichomes for transcriptome, cell wall, and other types of analyses. The Plant Journal. 56 (3), 483-492 (2008).
- Huebbers, J. W., et al. An advanced method for the release, enrichment and purification of high-quality Arabidopsis thaliana rosette leaf trichomes enables profound insights into the trichome proteome. Plant Methods. 18 (1), 12 (2022).
