Summary
Un protocole est présenté pour l’isolement et l’enrichissement pratiques et à haut débit des trichomes glandulaires et sessiles de Cannabis sativa. Le protocole est basé sur une extraction sèche et non tampon des trichomes en utilisant uniquement de l’azote liquide, de la glace sèche et des tamis en nylon et convient à l’extraction d’ARN et à l’analyse transcriptomique.
Abstract
Cet article présente un protocole pour l’isolement et l’enrichissement pratiques et à haut débit des trichomes glandulaires et sessiles de Cannabis sativa. Les voies de biosynthèse pour le métabolisme des cannabinoïdes et des terpènes volatils sont localisées principalement dans les trichomes de cannabis , et les trichomes isolés sont bénéfiques pour l’analyse du transcriptome. Les protocoles existants pour isoler les trichomes glandulaires pour la caractérisation transcriptomique sont peu pratiques et fournissent des têtes de trichomes compromises et une quantité relativement faible de trichomes isolés. De plus, ils s’appuient sur des appareils coûteux et des milieux d’isolement contenant des inhibiteurs de protéines pour éviter la dégradation de l’ARN. Le protocole actuel suggère de combiner trois modifications individuelles pour obtenir une grande quantité de trichomes glandulaires et de trichomes sessiles isolés à partir d’inflorescences femelles matures et de feuilles en éventail, respectivement. La première modification consiste à substituer l’azote liquide au milieu isolant conventionnel pour faciliter le passage des trichomes à travers les micro-tamis. La deuxième modification consiste à utiliser de la glace sèche pour détacher les trichomes de la source végétale. La troisième modification consiste à faire passer le matériel végétal consécutivement à travers cinq micro-tamis de taille décroissante des pores. L’imagerie microscopique a démontré l’efficacité de la technique d’isolement pour les deux types de trichomes. De plus, la qualité de l’ARN extrait des trichomes isolés était appropriée pour l’analyse transcriptomique en aval.
Introduction
Les trichomes glandulaires sont des structures ressemblant à des cheveux présentes dans les plantes qui contiennent de nombreux métabolites secondaires1 et représentent une banque précieuse de nouveaux gènes et enzymes biosynthétiques2. Dans le cannabis, la biosynthèse des métabolites secondaires importants, cannabinoïdes3 et terpènes4, est localisée dans les trichomes. Compte tenu du rôle des trichomes dans la détermination de la qualité du cannabis à des fins médicinales et récréatives, l’étude de l’expression des gènes des trichomes est intéressante. Pour caractériser l’expression des gènes spécifiques aux trichomes, les trichomes d’intérêt doivent d’abord être isolés. Les protocoles d’isolement des trichomes ont été décrits pour la première fois dès 19925, et leurs derniers développements ont été récemment examinés2. En général, les protocoles d’extraction des trichomes glandulaires pour la caractérisation transcriptomique peuvent être divisés en deux étapes séquentielles distinctes. La première étape implique une séparation physique complète des trichomes du tissu végétal. Cette étape peut être réalisée en utilisant de la glace sèche5, des billes de verre avec un appareil commercial6,7, en broyant le matériel végétal contre un tamis à mailles8, ou en tourbillonnant le tissu végétal dans un tampon d’isolement9. La deuxième étape consiste à séparer plus finement les trichomes d’intérêt des résidus de plantes microscopiques et/ou d’autres types de trichomes. Cette étape peut être exécutée en utilisant la centrifugation à gradient de densité 8,10 ou des tamis de différentes tailles 7,9. En raison de l’extrême sensibilité de l’ARN dans les tissus traités aux agents dégradants, ces deux étapes séquentielles sont généralement conduites dans le milieu d’isolement glacé, souvent en présence d’inhibiteurs de protéines4.
Les protocoles conventionnels d’isolement des trichomes nécessitent, en plus des températures glaciales, de grandes quantités de milieu d’isolement pour assurer une procédure d’extraction efficace. La combinaison de ces composants entraîne un processus d’isolation long et fastidieux qui entrave un débit élevé. La présentation d’un protocole alternatif simple et convivial d’isolement des trichomes est donc susceptible d’être bénéfique pour divers aspects associés à la caractérisation des trichomes. Le présent article vise à offrir un protocole alternatif pour isoler les trichomes de tête glandulaires pédonculés et sessiles de Cannabis sativa en combinant et en intégrant plusieurs éléments des protocoles conventionnels. Ces éléments comprennent la glace carbonique5, le passage des trichomes à travers plusieurs micro-tamis avec des pores de taille décroissante7,9, et la substitution de l’azote liquide (LN) au milieu isolant8.
La nouveauté du protocole actuel d’isolement des trichomes, par rapport aux protocoles conventionnels, se présente de plusieurs façons. Ce protocole est pratique, car il ne nécessite pas de composants dangereux. La procédure peut être effectuée en laboratoire avec un minimum de précautions et facilite un débit élevé. La substitution du LN au milieu d’isolation liquide standard garantit l’intégrité des trichomes tout au long du processus d’isolement, ce qui permet une analyse transcriptomique ultérieure. Lors de la sublimation du LN et de la glace sèche, les trichomes isolés sont laissés exempts de résidus nocifs. De plus, la propension du LN à se sublimer à température ambiante permet son utilisation généreuse tout au long du protocole. En revanche, l’utilisation de grands volumes de milieu isolant conventionnel génère des difficultés pratiques dans sa manipulation. Enfin, le protocole diminue la séparation de la cellule discale de la structure de tête fragile restante du trichome glandulaire, permettant la rétention du contenu de l’espace de tête.
Ce protocole est présenté étape par étape détaillée pour faciliter la pratique technique d’isolement des trichomes à tête glandulaire de C. sativa. Le protocole fournit un flux de travail gérable qui se traduit par des trichomes isolés avec une concentration et une pureté élevées qui sont appropriés pour l’analyse moléculaire en aval.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOTE: Le matériel végétal utilisé dans cette étude consistait en quatre souches de C. sativa ARO-Volcani (CS-11, CS-12, CS-13 et CS-14) qui ont été cultivées dans le Volcani Center, Israël, comme décrit ailleurs11. Les trichomes à tige de capitate glandulaire ont été isolés à partir d’inflorescences à fleurs matures, et les trichomes sessiles glandulaires capitates ont été isolés à partir de grandes feuilles en éventail de plantes mères matures non florifères. Tout le matériel végétal a été fraîchement cueilli et immédiatement stocké à −80 °C.
ATTENTION : La glace sèche et le LN sont utilisés tout au long du protocole. Ces substances sont extrêmement dangereuses. Les trichomes isolés peuvent contenir des particules de glace sèche qui peuvent créer une pression de gaz dangereuse lorsqu’elles sont insérées dans des tubes scellés; Par conséquent, tous les capuchons doivent être perforés à l’aiguille. L’utilisation de lunettes de protection, de vêtements de laboratoire appropriés et de gants pour la manipulation à des températures extrêmement basses est fortement conseillée.
1. Configuration pour la séparation initiale des trichomes du matériel végétal
- Écraser un bloc de glace carbonique en petits flocons fins à l’aide d’un marteau et d’un objet plat dur dans un récipient en plastique de 5 L.
- Tamiser les fines lamelles de glace carbonique (inférieures à 5 mm) de la glace sèche non broyée avec une grande passoire (via des pores inférieurs à 5 mm) dans un autre récipient en plastique de 5 L. Verser environ 200 cm3 (marque de 200 ml) des flocons de glace carbonique dans un bécher en verre vertical de 1 L.
- Ajouter jusqu’à 10 g d’inflorescences congelées de C. sativa (désormais appelées matières végétales) sur la première couche de glace sèche broyée et couvrir d’une couche supplémentaire de 200cm3 de glace sèche finement broyée.
- Couvrir l’ouverture du bécher en verre de 1 L avec deux à trois couches de moustiquaire de porte moustiquaire de 1 mm et la fixer sur les côtés extérieurs de la tasse en verre à l’aide d’élastiques (Figure 1).
- Versez le LN dans un grand récipient en acier inoxydable à fond rond (voir le tableau des matériaux), où les trichomes isolés seront recueillis.
- Insérez une maille de 350 μm dans une passoire à tamis à farine pour couvrir la maille du tamis de farine par le bas (figure 2). Si un tamis à farine muni d’un anneau en plastique amovible est disponible, insérer le treillis de 350 μm de manière à ce qu’il soit fixé sous le filet du tamis à farine. Sinon, fixez la maille de 350 μm à la circonférence du tamis à farine avec des élastiques.
- Placez le tamis à farine au-dessus du grand récipient en acier inoxydable à fond rond rempli de LN (figure 3). Assurez-vous que la largeur du contenant dépasse celle du tamis à farine afin de minimiser la perte de la masse tamisée à l’extérieur du récipient en acier inoxydable à fond rond.
2. Séparation des trichomes du matériel végétal
- Secouez le verre de 1 L avec son ouverture dirigée vers le bas vers le tamis à farine comme si vous utilisiez une grande salière (figure 4).
- Mettez de côté le bécher en verre de 1 L toutes les 2-3 minutes pour permettre le tamisage de la glace sèche broyée et de la matière végétale accumulée sur le tamis de farine.
- Tamiser le tamis à farine horizontalement pour faciliter le passage de la matière végétale dans le LN dans le récipient en acier inoxydable à fond rond situé en dessous.
- Ajouter du LN au récipient en acier inoxydable et de la glace sèche pilée au bécher en verre de 1 L lorsque leurs niveaux sont faibles. Reconstituer le matériel végétal usagé dans le bécher en verre avec 10 g supplémentaires de matériel végétal frais lorsque le matériel végétal sur le tamis à farine est épuisé. Le réapprovisionnement ne doit généralement pas être répété plus de deux fois.
- Répéter les étapes 2.1-2.4 jusqu’à ce qu’une quantité suffisante de trichomes enrichis ait été recueillie dans le récipient en acier inoxydable à fond rond. En général, 20 g de matériel végétal frais suffisent pour l’extraction de l’ARN et l’analyse du transcriptome.
- Vérifiez qu’il y a une substance blanche semblable à de la poudre (composée de débris végétaux, de trichomes glandulaires et de glace sèche pilée) au fond du récipient en acier inoxydable immergé dans le LN. Une observation microscopique aidera à déterminer si une quantité suffisante de trichomes a été recueillie; Cependant, cette étape peut entraver le flux du protocole. Habituellement, 10 à 20 g de matériel végétal initial suffisent pour la plupart des isolements; Cependant, il peut y avoir des différences dans la densité des trichomes des plantes.
REMARQUE: À partir de ce point, l’expérience peut être interrompue et redémarrée ultérieurement. En cas de pause pendant une courte période, des quantités adéquates de LN doivent être ajoutées afin que les trichomes restent submergés. Alternativement, les trichomes peuvent être collectés et stockés à -80 ° C jusqu’à 3 mois pour une utilisation ultérieure, comme décrit à l’étape 5.
3. Séparation des trichomes glandulaires (tiges et sessiles) des autres types de trichomes, tels que les trichomes bulbeux et cystolithiques, et les débris
- Ajouter une petite quantité de LN dans un petit récipient en acier inoxydable propre à fond rond.
- Pliez deux fois un micro-tamis de 40 cm x 40 cm avec un maillage de 150 μm pour obtenir un pli de 20 cm x 20 cm et ouvrez-le. Assurez-vous qu’il ressemble à une forme de cône (Figure 5).
- Fixez le cône en maille au bord du récipient en acier inoxydable à fond rond avec une ou deux épingles à linge de sorte que la partie ouverte du cône soit verticale et que sa partie pointue soit partiellement immergée dans le LN.
- Verser doucement le LN et la substance blanche semblable à de la poudre de l’étape 2.6 dans le cône de micro-tamis.
- Appliquez délicatement une brosse large pour rassembler et transférer tout matériel végétal restant du premier récipient dans le cône de maille de 150 μm.
- Ajouter plus de LN au premier récipient et répéter le mouvement de brossage jusqu’à ce que tout le matériel végétal soit transféré dans le cône de micro-tamis.
- Détachez soigneusement la pince à linge du couvercle du récipient et ouvrez le cône de micro-tamis de sorte que les trichomes soient situés au milieu du micro-tamis ouvert. Maintenez les quatre coins du microtamis ensemble de manière à ce que la partie centrale contenant les trichomes reste immergée dans le LN (Figure 6).
- Tout en tenant les quatre coins du micro-tamis, trempez et secouez doucement le micro-tamis dans le LN dans le récipient en acier comme si vous infuseriez un sachet de thé. Continuez ce mouvement de trempage/agitation (verticale et horizontale) pendant 1 min. Il y a un compromis entre la qualité de l’isolation et la quantité. Des mouvements de trempage plus longs peuvent entraîner de plus grandes quantités de trichomes, mais leur degré d’isolement peut être plus faible. Dans l’ensemble, 1 min est recommandé comme suffisant pour la qualité et la quantité.
REMARQUE: Ce mouvement de tamisage est la partie la plus critique du protocole et doit être exécuté en conséquence. - Facultatif : Prélever les débris végétaux non tamisés et les trichomes plus gros (encore immergés dans le LN) qui sont enveloppés au centre du microtamis dans un tube à essai de 13 ml ou 50 ml, et conserver à −80 °C pour une utilisation ultérieure.
ATTENTION : Pour éviter l’accumulation de gaz sous pression (provenant de la glace sèche et des résidus de LN), percez un trou dans le bouchon du tube à essai à l’aide d’une aiguille stérilisée. Le bouchon peut être remplacé une fois que la pression a diminué, ce qui est généralement après 24 h.
4. Passage des trichomes à travers des micro-tamis de taille de pores décroissante
- Transférer séquentiellement les trichomes tamisés immergés dans le LN au fond du petit récipient en acier inoxydable à fond rond à travers des micro-tamis dont la taille des pores est décroissante (105 μm, 80 μm, 65 μm et 50 μm), de la même manière que celle présentée à l’étape 3.
5. Collecte des trichomes souhaités
- Retirez les trichomes désirés immergés dans le LN et enveloppez-les dans le micro-tamis de 50 μm à l’aide d’une cuillère pré-refroidie (dans LN). Placez-les sur une assiette propre.
REMARQUE: Dans cette dernière étape d’isolement, les trichomes souhaités sont collectés à partir du tamis. - Transférer rapidement les trichomes en poudre dans un tube pré-refroidi étiqueté de 1,5 ml à l’aide d’une spatule prérefroidie ou d’une cuillère insérée dans le tube (Figure 7). Conserver immédiatement les tubes à −80 °C pour d’autres études.
Remarque : Un diagramme de flux de travail schématique illustrant l’ensemble du protocole d’isolation est donné à la figure 8.
6. Observation et analyse des trichomes purifiés
- Placez une petite quantité (10 mg) de trichomes isolés sur une lame de microscope à l’aide d’une spatule pré-refroidie (via LN). Ajoutez une goutte d’eau et observez directement au microscope optique sans tacher. Évaluer le degré global d’isolement et de contamination à l’aide d’un grossissement faible (10x) et élevé (40x). L’enrichissement est estimé visuellement par la quantité relative de trichomes par rapport aux tissus non trichomes, comme le montre la figure 9.
- Effectuer l’extraction de l’ARN et l’analyse de la qualité à partir de 50 mg de trichomes isolés à tige glandulaire et de trichomes sessiles de C. sativa.
REMARQUE : Une trousse d’extraction commerciale (voir le tableau des matériaux) utilisant une stratégie de purification de l’ARNm basée sur le poly-A a été utilisée pour l’extraction de l’ARN.- Resuspendre 50 mg des trichomes isolés dans la solution de lyse, vortex pendant 30 s, soniquer dans une unité de nettoyage à ultrasons glacé à 35 kHz pendant 5 minutes et extraire l’ARNm des échantillons selon le protocole du fabricant (voir le tableau des matériaux).
- Pour estimer l’intégrité de l’ARN extrait des trichomes, déterminez la concentration d’ARN, la quantité totale et les valeurs du nombre d’intégrité de l’ARN (RIN) à l’aide d’un système de laboratoire sur puce (voir le tableau des matériaux).
- Effectuer une analyse RNAseq des fractions de trichomes (facultatif). L’analyse RNAseq et les analyses bioinformatiques des lectures séquencées peuvent être effectuées par des services d’externalisation standard
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La principale modification incluse dans ce protocole par rapport aux protocoles conventionnels d’isolement de trichomes est de remplacer le milieu d’isolement standard par LN. L’utilisation du LN comme milieu d’isolement permet un flux de travail détendu, car tant que les échantillons sont immergés dans le LN, il est peu probable qu’une dégradation métabolique se produise. De plus, comme le protocole évite les composants dangereux (c.-à-d. l’acide aurintricarboxylique et le β-mercaptoéthanol) utilisés dans les milieux d’isolement traditionnels des trichomes, le travail ne se limite pas à une hotte chimique. Néanmoins, il est important de prendre les précautions nécessaires lors de la manipulation de la glace sèche et du LN.
Pour évaluer les avantages du présent protocole, les résultats de l’isolement des trichomes du présent protocole ont été comparés à ceux obtenus à l’aide d’une procédure conventionnelle d’isolement des trichomes (qui utilisait un tampon aqueux, des billes de verre et un tamis fin pour l’isolement des trichomes)12, initialement à l’aide d’un microscope optique. Une comparaison des composants de différentes phases d’isolement par inspection au microscope optique illustre l’augmentation du degré d’isolement des trichomes à mesure que le processus d’isolement progresse. Au stade initial du processus d’isolement (micro-tamis de 105 à 150 μm), des morceaux de tissu foliaire étaient prédominants dans la partie isolée (figure 9A), contrairement au produit d’isolement final, composé presque entièrement de trichomes isolés (figure 9C). Il faut prendre soin de vérifier que les échantillons isolés sont exempts de contamination (figure 9B).
Bien que la densité des trichomes n’ait pas été quantifiée dans cette étude, la qualité de la tige glandulaire isolée et des trichomes sessiles dans la dernière étape d’isolement peut être observée à la figure 10. La pureté peut être comparée à celle obtenue avec l’isolement du trichome à l’aide d’un protocole conventionnel12 (Figure 10C). Dans le présent protocole, la structure délicate de la tête du trichome à tige est conservée et les têtes entières du trichome à tige isolée sont visibles (figure 10D), alors qu’en utilisant le protocole conventionnel, la structure complète de la tête du trichome est manquante et seules les cellules discales sont présentes (figure 10E). Le rendement peut également être considérablement augmenté puisque l’utilisation de glace sèche et de LN évite la limite de matériel végétal pouvant être extrait. Un avantage supplémentaire de notre protocole non aqueux est qu’il n’utilise que de la glace sèche et du LN et, par conséquent, aucun composant résiduel du milieu isolant n’est laissé une fois qu’ils s’évaporent. L’utilisation de LN empêche la libération de métabolites secondaires collants qui peuvent conduire à l’agrégation des trichomes13. Dans le présent protocole, les trichomes isolés lors de la dernière étape d’isolement ont été récupérés sous forme de poudre fine sèche.
Les températures extrêmement basses maintenues tout au long du présent protocole sont susceptibles de suffire à atteindre les objectifs des milieux tampons conventionnels visant à prévenir la dégradation de l’ARN (tant que les échantillons sont maintenus immergés) et à faciliter les applications moléculaires en aval. Afin de valider cette hypothèse, nous avons extrait l’ARN des trichomes isolés et estimé l’intégrité de l’ARN à l’aide de kits disponibles dans le commerce. Les valeurs RIN élevées obtenues (9,4 à 10) et la chromatographie sur gel distincte (figure 11) indiquent clairement une intégrité élevée de l’ARN. Les échantillons d’ARN ont ensuite été analysés par RNAseq, et des lectures de haute qualité de >20 M ont été obtenues à partir de toutes les bibliothèques.
Afin de valider que, en effet, l’ARNm de la fraction de trichomes isolés est enrichi en gènes exprimés par les trichomes, nous avons comparé nos résultats d’expression génique pour l’inflorescence et les trichomes à tige isolée correspondants aux résultats précédents présentés par Livingston et al.14, qui caractérisaient l’expression génique des trichomes purifiés de cannabis (adapté de leur tableau supplémentaire 1 ). Leur protocole consistait à mélanger dans un tampon aqueux, à filtrer à travers des tamis et, enfin, à purifier les trichomes à l’aide d’un gradient de Percoll. Les gènes exprimés par trichomes ont été caractérisés comme étant les plus fortement corrélés (p > 0,95) avec l’expression génique de l’acide cannabidiolique synthase (CBDAS), un marqueur génétique spécifique du trichome14. La comparaison de l’expression génique entre les résultats obtenus avec le présent protocole et ceux présentés dans Livingston et al.14 montre que les 12 gènes les plus enrichis de notre fraction de trichomes ont également été enrichis dans l’étudede Livingston et al. 14, y compris le gène marqueur du trichome CBDAS (tableau 1). En particulier, un taux d’enrichissement nettement plus élevé a été obtenu grâce au protocole actuel. Ces résultats confirment la validité du présent protocole pour l’étude de l’expression génique enrichie en trichomes.
De plus, nous avons comparé les données d’expression de cinq gènes d’actine du cannabis, puisque l’actine est fréquemment utilisée comme gène de référence pour les études de transcriptome (tableau 2). Nos résultats pour les trichomes pédonculés isolés et les trichomes sessiles étaient comparables à ceux rapportés par l’étude de Livingston et al.14.
Enfin, nous avons calculé les données d’expression et d’enrichissement des trichomes pour les gènes de la famille des protéines de liaison à la chlorophylle a-b, qui ne sont probablement pas enrichis en trichomes (tableau 3). En effet, les 12 membres de cette famille de gènes ont montré un facteur d’enrichissement en trichomes de <1, servant de contrôle négatif pour l’enrichissement en trichomes. Ces résultats combinés indiquent les profils d’expression uniques de l’inflorescence et des fractions isolées de trichomes et soutiennent l’intégrité et la qualité du trichome fractionné isolé.
Figure 1 : Configuration du chargement du bécher en verre de 1 L. Le treillis de porte moustiquaire de 1 mm est fixé sur les côtés du bécher en verre par quelques élastiques (non représentés). Le bécher en verre de 1 L doit être chargé en position verticale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Installation du tamis à farine. Le tamis à farine est équipé d’un micro-tamis de 350 μm via des élastiques au fond (non représenté). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3: Configuration de la première étape de l’isolement des trichomes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Configuration du bécher en verre. Le bécher en verre muni de trois couches de treillis moustiquaire (moustique) de 1 mm fixé par des élastiques à l’ouverture. L’ouverture du bécher est dirigée vers le bas. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Configuration de la structure conique à micro-tamis utilisée pour l’isolation des trichomes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Configuration du mouvement de trempage et de secousse du micro-tamis contenant des trichomes isolés. Le mouvement horizontal/vertical doit ressembler à une infusion de sachet de thé. La configuration est identique pour chaque maillage utilisé. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : Configuration du transfert des derniers trichomes isolés. Les derniers trichomes isolés sont transférés dans un tube marqué de 1,5 mL. Tous les ustensiles doivent être pré-refroidis avec LN. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 8 : Organigramme décrivant le protocole. L’isolement des trichomes glandulaires à tête de C. sativa comporte trois étapes: (1) le détachement initial des trichomes de la source végétale et le passage par deux tamis (1 mm et 350 μm), (2) le passage du matériel végétal via cinq micro-tamis de taille de pores décroissantes (150 μm, 105 μm, 80 μm, 65 μm et 50 μm), et (3) la collecte des trichomes isolés dans un tube pré-refroidi de 1,5 mL. Les tissus retenus de l’une des étapes du micro-tamis peuvent également être collectés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 9 : Images microscopiques des trichomes isolés à l’aide du protocole actuel. (A, B, C) Trichomes sessiles glandulaires à tête provenant de feuilles d’éventail de C. sativa. (A) Isolement moyen, à partir de micro-tamis dont la taille des pores est comprise entre 105 μm et 150 μm. Notez la rétention de grandes quantités de matériaux verts autres que les trichomes. (B) Fin de l’isolement, à partir de micro-tamis dont la taille des pores varie de 50 μm à 65 μm, contaminés par des sources végétales (flèche rouge), et (C) exempts de contamination. Barres d’échelle = (A) 100 μm, (B,C) 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 10 : Images microscopiques des trichomes isolés. (A,B) Trichomes glandulaires de C. sativa : (A) type pédonculé, isolé selon le protocole actuel, et (B) type sessile, isolé selon le protocole actuel. (C) Trichomes pédonculés isolés à l’aide d’un protocole conventionnel. Le faible rendement et l’absence de têtes sans compromis des trichomes sont évidents. (D, E) Trichomes à tige glandulaire isolée à l’aide (D) du présent protocole et (E) du protocole conventionnel. (F) Trichomes à tige glandulaire isolés de microtamis de 65 μm à 105 μm (gros plan). Notez le grand isolement des trichomes pédonculés, avec des têtes détachées et des parties de tige. Les flèches rouges indiquent les trichomes cystolithiques, les flèches bleues indiquent quelques parties de tige des trichomes à tige glandulaire capitate et les flèches jaunes indiquent les cellules discales séparées. Barres d’échelle = (A,C,D,E,F) 100 μm, (B) 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 11 : Analyse de l’intégrité de l’ARN extrait des trichomes. Chromatographes et gels d’échantillons d’ARN extraits de tiges glandulaires capitates et de trichomes sessiles isolés selon le présent protocole. Résultats pour l’ARN des trichomes pédonculés (A-D) des quatre lignées de cultivars utilisés dans cette étude, CS-11, CS-12, CS-13 et CS-14, respectivement, et (E-H) les trichomes sessiles, CS-11, CS-12, CS-13 et CS-14. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Tableau 1 : Comparaison de l’expression génique enrichie en trichomes obtenue avec RNAseq en utilisant le présent protocole aux résultats obtenus par Livingston et al.14. Les 12 gènes présentant la plus forte corrélation avec l’expression de l’acide cannabidiolique synthase (CBDAS) par Livingston et al.14 (à partir de leur Supplemental Table Data S4, adapté avec la permission des éditeurs Wiley), considérés comme un marqueur génétique spécifique au trichome, ont été choisis pour la comparaison. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Tableau 2 : Comparaison de l’expression génique (FPKM) de cinq gènes d’actine de cannabis de trichomes sessiles et pédonculés isolés du présent protocole (nos données d’expression génique de la variété de cannabis CS-11 11 (Var CS-11)) avec les résultats publiés précédemment adaptés de Livingston et al.14. Les résultats de Livingston et coll.14 ont été présentés à partir du génome de référence de Finola FN, et leurs données ont été traduites dans le génome de référence CS10.2. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Tableau 3 : Expression génique (FPKM) des gènes de liaison à la chlorophylle a-b du cannabis d’inflorescences entières et de trichomes pédonculés isolés du présent protocole (nos données d’expression génique de Var CS-11). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Par rapport aux protocoles d’isolement des trichomes actuellement disponibles, deux modifications principales sont décrites dans le présent protocole. Il s’agit notamment du détachement des trichomes du matériel végétal à l’aide de glace sèche à l’étape initiale et de la substitution du LN au milieu tampon liquide couramment utilisé. La première modification pour la purification des trichomes de C. sativa est basée sur un protocole antérieur qui a introduit l’utilisation de glace sèche pilée pour détacher les trichomes des pédicelles de géranium5. Alors que les protocoles traditionnels d’isolement des trichomes utilisent généralement un petit tube à essai (50 mL), un bécher en verre de 1 L a été utilisé dans cette étude avec une quantité généreuse de glace sèche broyée, permettant de traiter un plus grand volume de matériel végétal initial (jusqu’à 10 g). En outre, dans le présent protocole, deux passages supplémentaires des trichomes à travers des micro-tamis ont été introduits dans la première étape d’isolement. La première étape utilise un mouvement vertical de haut en bas comme une salière, et la seconde utilise un mouvement de tamisage horizontal à travers le micro-tamis dans le tamis à farine. Les mouvements de tamisage horizontaux et verticaux combinés sont suggérés pour favoriser une séparation améliorée en fonction de la taille et de la forme du trichome.
La deuxième modification, la plus importante, concerne le milieu d’isolement dans lequel le passage à travers les micro-tamis est effectué. Dans le protocole actuel, le milieu d’isolation aqueux conventionnel est complètement remplacé par le LN. Unprotocole 8 précédent utilisait également le LN dans la première étape pour l’isolement des trichomes, séparant les trichomes du matériel végétal (en râpant le matériel floral contre un tamis à mailles), mais continuait avec une extraction tampon liquide et une séparation de densité Percoll. Le remplacement du LN par le milieu d’isolation conventionnel élimine le besoin de procédures spéciales associées aux composants toxiques du milieu d’isolation conventionnel, ce qui permet un flux de travail détendu et un débit élevé.
Une caractéristique clé du présent protocole repose sur la propension de la glace sèche et du LN à se sublimer rapidement à température ambiante. Cette fonctionnalité permet leur application généreuse tout au long du processus d’isolation. En revanche, l’utilisation d’une grande quantité du tampon d’isolement conventionnel entraînerait des complications techniques concernant la manipulation de ses grands volumes.
Alors que le processus d’isolement dans le présent protocole favorise la rétention de la structure fragile de la tête du trichome à tige de tête glandulaire, les protocoles conventionnels favorisent la séparation des cellules discales du matériel glandulaire restant, qui est facilement emporté, ne laissant que les cellules discales. Ce phénomène est clairement visible dans nos résultats comparant un protocole d’isolement conventionnel à notre nouveau protocole (Figure 10D,E). Outre l’observation microscopique, l’analyse de la qualité de l’ARN extrait des trichomes (isolés à l’aide de ce protocole) indique clairement que l’intégrité de l’ARN est conservée pendant le processus d’isolement et qu’il convient à l’analyse transcriptomique.
De plus, les résultats de l’expression génique de notre fraction isolée de trichomes indiquent que la fraction est fortement enrichie en gènes établis exprimés par trichomes (tableau 1) et, réciproquement, que les gènes non exprimés par trichomes ne sont pas représentés (tableau 3).
La principale limitation du présent protocole est son aptitude exclusive à isoler les trichomes en fonction de leur propension à passer à travers des micro-tamis. Bien que le protocole ne puisse pas être appliqué directement à l’isolement des trichomes à l’aide d’un gradient de densité, il convient d’isoler les trichomes avant l’étape du gradient de densité, si nécessaire. Dans cette étude, les trichomes isolés à l’aide de ce protocole n’ont pas subi de caractérisation protéomique et leur pertinence pour une telle application doit être vérifiée. Cependant, comme les échantillons d’ARN extraits à la fois des trichomes pédonculés et sessiles ne présentaient aucune dégradation, comme l’indiquent les chomatographes et les valeurs élevées de RIN, on peut supposer que les trichomes isolés avec le protocole actuel sont susceptibles de répondre aux exigences requises pour l’analyse protéomique.
Le degré d’isolement (de la source végétale initiale et d’autres types de trichomes) des trichomes sessiles glandulaires capitate des feuilles en éventail est très élevé, car les feuilles en éventail n’ont pas le trichome glandulaire à tige capitate de type15,16, et les trichomes cystolithiques et bulbeux sont facilement isolés des trichomes sessiles en raison de leurs différences structurelles et de taille. Cependant, en ce qui concerne l’isolement des trichomes glandulaires de type pédonculé, il est préférable d’aborder leur degré d’isolement comme un enrichissement, car la source végétale, l’inflorescence femelle mature, contient les quatre types de trichomes, en plus du typepré-tige 14. Il va de soi que la plupart des trichomes glandulaires isolés sont du type pédonculé, car leur position élevée (par rapport aux trichomes sessiles liés à l’épiderme) augmente la probabilité qu’ils entrent en collision avec une particule de glace carbonique et se détachent de la plante. De plus, la jonction reliant les parties de la tête et de la tige du trichome pédonculé est considérée comme un point de faiblesse associé à l’abscission de la tête de la glande17. Ainsi, il serait exact de parler de la partie de trichome pédonculé comme d’une fraction hautement enrichie avec une contamination potentiellement faible du type sessile. Cependant, aucune analyse plus poussée n’a été effectuée pour valider cette hypothèse.
La pertinence du protocole actuel pour extraire les trichomes glandulaires d’autres espèces végétales reste à déterminer. La forte densité de trichomes chez C. sativa contribue vraisemblablement au succès du protocole actuel. Cependant, il semble peu probable que ce soit la seule raison, car une source de matériel végétal relativement importante (jusqu’à 10 g par cycle d’isolement) peut être traitée efficacement. D’autres études ont présenté des protocoles détaillés pour isoler différents types de trichomes d’autres plantes, par exemple, les trichomes à feuilles de rosette d’Arabidopsis thaliana18,19. Bien que l’applicabilité du protocole actuel pour isoler d’autres types de trichomes n’ait pas été étudiée dans ce travail, les éléments présentés dans ce travail, en particulier la substitution du LN au tampon d’isolement, sont susceptibles d’améliorer le processus d’isolement des trichomes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Les auteurs reconnaissent le soutien financier de CannabiVar Ltd. Tout le matériel végétal a été généreusement fourni par le professeur Hinanit Koltai du Volcani Center, en Israël.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bioanalyzer RNA Pico 6000 chip | Agilent, Germany | Reorder number 5067-1513 | Lab-on-a-chip system |
| Transsonic-310 | Elma, Germany | D-78224 | Ultrasonic cleaning unit |
| TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 | Illumina, USA | RS-122-2001 | Sample preperation for RNA sequencing library |
| Spectrum Plant Total RNA Kit | SIGMA-ALDRICH, USA | STRN50-1KT | Plant Total RNA Kit |
| Nylon micro-sieve with a mesh size of 350 µm (40 x 40 cm or larger than the circumference of the flour sifter) | Sinun Tech, Israel | r0350n350210 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size of 150 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0150n360465 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 105 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0105n320718 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 80 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0080n370465 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 65 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0065n340715 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 50 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0080n370465 | Nylon screen aperture |
| Up to 10 g of frozen plant material (stored in -80 oC or liquid nitrogen) | |||
| Suitable gloves for handling low temperatures | |||
| Safety goggles | |||
| 1 mm screen door (mosquito) mesh (strip of 30 x 100 cm) | |||
| Large strainer (colander) with holes approximately 5 mm | |||
| 1 L glass beaker | |||
| 1 block of dry ice (0.5-1 kg) | |||
| Hammer and hard flat object | |||
| Two 5 L plastic containers | |||
| Rubber bands | |||
| Large flour sifter or sieve strainer- preferably one with a detachable plastic ring on the circumference | |||
| Several large and small round bottom stainless steel containers. One of them should be larger than the flour sifter's circumference (approximately 40 cm in diameter), to minimize the loss of the sifted mass outside the round bottome stainless steel container | |||
| Pre-chilled (via liquid nitrogen) stainless steel spoon, spatula, and scoopula | |||
| Clean plate | |||
| Several clothespins | |||
| Pre-chilled (via liquid nitrogen) labeled 1.5 mL tubes with holes poked on the lid with a sterile needle | |||
| Two containers of liquid nitrogen | |||
| 1 cm wide painting brush |
References
- Schilmiller, A. L., Last, R. L., Pichersky, E. Harnessing plant trichome biochemistry for the production of useful compounds. Plant Journal for Cell & Molecular Biology. 54 (4), 702-709 (2008).
- Liu, Y., Jing, S. X., Luo, S. H., Li, S. H. Non-volatile natural products in plant glandular trichomes: chemistry, biological activities and biosynthesis. Natural Product Reports. 36 (4), 626-665 (2019).
- Fairbairn, J. W. The trichomes and glands of Cannabis sativa L. UN Bulletin on Narcotics. 23, 29-33 (1972).
- Booth, J. K., Page, J. E., Bohlmann, J. Terpene synthases from Cannabis sativa. PLoS One. 12 (3), 0173911 (2017).
- Yerger, E. H., et al. A rapid method for isolating glandular trichomes. Plant Physiology. 99 (1), 1-7 (1992).
- Gershenzon, J., Maffei, M. M., Croteau, R. Biochemical and histochemical localization of monoterpene biosynthesis in the glandular trichomes of spearmint (Mentha spicata). Plant Physiology. 89 (4), 1351-1357 (1989).
- Gershenzon, J., et al. Isolation of secretory cells from plant glandular trichomes and their use in biosynthetic studies of monoterpenes and other gland products. Analytical Biochemistry. 200 (1), 130-138 (1992).
- Conneely, L. J., Mauleon, R., Mieog, J., Barkla, B. J., Kretzschmar, T. Characterization of the Cannabis sativa glandular trichome proteome. PLoS One. 16 (4), 0242633 (2021).
- Liu, Y., Zhu, P., Cai, S., Haughn, G., Page, J. E. Three novel transcription factors involved in cannabinoid biosynthesis in Cannabis sativa L. Plant Molecular Biology. 106 (1-2), 49-65 (2021).
- Slone, J. H., Kelsey, R. G. Isolation and purification of glandular secretory cells from Artemisia tridentata (ssp. vaseyana) by Percoll density gradient centrifugation. American Journal of Botany. 72 (9), 1445-1451 (1985).
- Namdar, D., et al. Terpenoids and Phytocannabinoids Co-Produced in Cannabis Sativa Strains Show Specific Interaction for Cell Cytotoxic Activity. Molecules. 24 (17), 3031 (2019).
- McDowell, E. T., et al. Comparative functional genomic analysis of Solanum glandular trichome types. Plant Physiology. 155 (1), 524-539 (2011).
- Bergau, N., Santos, A. N., Henning, A., Balcke, G. U., Tissier, A. Autofluorescence as a signal to sort developing glandular trichomes by flow cytometry. Frontiers in Plant Science. 7, 949 (2016).
- Livingston, S. J., et al. Cannabis glandular trichomes alter morphology and metabolite content during flower maturation. The Plant Journal. 101 (1), 37-56 (2019).
- Turner, J. C., Hemphill, J. K., Mahlberg, P. G. Gland distribution and cannabinoid content in clones of Cannabis sativa L. American Journal of Botany. 64 (6), 687-693 (1977).
- Turner, J. C., Hemphill, J. K., Mahlberg, P. G. Quantitative determination of cannabinoids in individual glandular trichomes of Cannabis sativa L. (Cannabaceae). American Journal of Botany. 65 (10), 1103-1106 (1978).
- Hammond, C. T., Mahlberg, P. G. Morphology of glandular hairs of Cannabis sativa from scanning electron microscopy. American Journal of Botany. 60 (6), 524-528 (1973).
- Marks, M. D., et al. A new method for isolating large quantities of Arabidopsis trichomes for transcriptome, cell wall, and other types of analyses. The Plant Journal. 56 (3), 483-492 (2008).
- Huebbers, J. W., et al. An advanced method for the release, enrichment and purification of high-quality Arabidopsis thaliana rosette leaf trichomes enables profound insights into the trichome proteome. Plant Methods. 18 (1), 12 (2022).
