Summary
प्राइमेट सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स का इलेक्ट्रोपोरेशन प्राइमेट (पैथो) फिजियोलॉजिकल नियोकॉर्टेक्स विकास के करीब एक मॉडल सिस्टम में विभिन्न पूर्वज प्रकारों और न्यूरॉन्स में क्षणिक आनुवंशिक संशोधन (ओं) को पेश करने के लिए एक सटीक और कुशल दृष्टिकोण प्रदान करता है। यह न्यूरोडेवलपमेंटल और विकासवादी प्रक्रियाओं के अध्ययन की अनुमति देता है और रोग मॉडलिंग के लिए भी लागू किया जा सकता है।
Abstract
सेरेब्रल कॉर्टेक्स सबसे बाहरी मस्तिष्क संरचना है और संवेदी इनपुट और मोटर आउटपुट के प्रसंस्करण के लिए जिम्मेदार है; इसे स्तनधारियों, विशेष रूप से, प्राइमेट्स में उच्च-क्रम संज्ञानात्मक क्षमताओं की सीट के रूप में देखा जाता है। प्राइमेट दिमाग में जीन कार्यों का अध्ययन तकनीकी और नैतिक कारणों से चुनौतीपूर्ण है, लेकिन मस्तिष्क ऑर्गेनॉइड तकनीक की स्थापना ने पारंपरिक प्राइमेट मॉडल (जैसे, रीसस मकाक और आम मार्मोसेट) में मस्तिष्क के विकास के अध्ययन को सक्षम किया है, साथ ही साथ पहले प्रयोगात्मक रूप से दुर्गम प्राइमेट प्रजातियों (जैसे, महान वानर) में, नैतिक रूप से उचित और कम तकनीकी रूप से मांग वाली प्रणाली में। इसके अलावा, मानव मस्तिष्क ऑर्गेनोइड ्स न्यूरोडेवलपमेंटल और न्यूरोलॉजिकल विकारों की उन्नत जांच की अनुमति देते हैं।
जैसा कि मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स मस्तिष्क के विकास की कई प्रक्रियाओं को पुन: उत्पन्न करते हैं, वे एक विकासवादी संदर्भ में विभिन्न प्रजातियों के मस्तिष्क के विकास में अंतर्निहित आनुवंशिक निर्धारकों में अंतर की पहचान करने और कार्यात्मक रूप से तुलना करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण का भी प्रतिनिधित्व करते हैं। ऑर्गेनोइड्स का उपयोग करने का एक बड़ा लाभ आनुवंशिक संशोधनों को पेश करने की संभावना है, जो जीन कार्यों के परीक्षण की अनुमति देता है। हालांकि, इस तरह के संशोधनों की शुरूआत श्रमसाध्य और महंगी है। यह पेपर प्राइमेट सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स की वेंट्रिकल जैसी संरचनाओं के भीतर आनुवंशिक रूप से सेल आबादी को संशोधित करने के लिए एक तेज और लागत कुशल दृष्टिकोण का वर्णन करता है, जो मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स का एक उपप्रकार है। यह विधि मानव-, चिंपांज़ी-, रीसस मकाक-और सामान्य मार्मोसेट-व्युत्पन्न प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं (आईपीएससी) से सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स की विश्वसनीय पीढ़ी के लिए एक संशोधित प्रोटोकॉल को एक माइक्रोइंजेक्शन और इलेक्ट्रोपोरेशन दृष्टिकोण के साथ जोड़ती है। यह न्यूरोडेवलपमेंटल और विकासवादी प्रक्रियाओं के अध्ययन के लिए एक प्रभावी उपकरण प्रदान करता है जिसे रोग मॉडलिंग के लिए भी लागू किया जा सकता है।
Introduction
सेरेब्रल कॉर्टेक्स के (पैथो) शारीरिक विकास और विकास की जांच करना एक दुर्जेय कार्य है जो उपयुक्त मॉडल सिस्टम की कमी से बाधित है। पहले, इस तरह के अध्ययन दो-आयामी सेल कल्चर मॉडल (जैसे प्राथमिक तंत्रिका पूर्वज या न्यूरोनल सेल संस्कृतियों) और विकासवादी रूप से दूर के पशु मॉडल (जैसे कृन्तक) 1,2 तक ही सीमित थे। हालांकि ये मॉडल कुछ प्रश्नों को संबोधित करने के लिए उपयोगी हैं, वे स्वस्थ और रोगग्रस्त राज्यों में विकासशील मानव नियोकॉर्टेक्स की जटिलता, सेल प्रकार संरचना, सेलुलर वास्तुकला और जीन अभिव्यक्ति पैटर्न को मॉडलिंग में सीमित हैं। ये सीमाएं, उदाहरण के लिए, मानव स्थितियों के लिए मानव रोगों के माउस मॉडल की खराब हस्तांतरणीयता की ओर ले जाती हैं, जैसा कि माइक्रोसेफली के कुछ मामलों के लिए वर्णित है (जैसे, झांग एट अल.3)। हाल ही में, ट्रांसजेनिक गैर-मानव प्राइमेट्स, जो मानव नियोकॉर्टेक्स विकास के विकासात्मक, कार्यात्मक और रूपात्मक रूप से करीबी मॉडल हैं, 4,5,6,7,8 पर ध्यान केंद्रित किए गए हैं क्योंकि वे सेल संस्कृति- और कृंतक-आधारित मॉडल की कई सीमाओं को पार करते हैं। हालांकि, अनुसंधान में गैर-मानव प्राइमेट्स का उपयोग न केवल अत्यधिक महंगा और समय लेने वाला है, बल्कि नैतिक चिंताओं को भी बढ़ाता है। हाल ही में, मस्तिष्क ऑर्गेनॉइड प्रौद्योगिकी 9,10 का विकास एक आशाजनक विकल्प के रूप में उभरा है जो पिछले मॉडल 11,12,13,14,15,16 की कई सीमाओं को हल करता है।
मस्तिष्क ऑर्गेनोइड ्स त्रि-आयामी (3 डी), बहुकोशिकीय संरचनाएं हैं जो परिभाषित विकास समय विंडो 11,12,13,14,17 के लिए एक या कई मस्तिष्क क्षेत्रों की साइटोआर्किटेक्चर और सेल-प्रकार संरचना की मुख्य विशेषताओं का अनुकरण करती हैं। ये 3 डी संरचनाएं या तो प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) से उत्पन्न होती हैं या, यदि रुचि की प्रजातियों के लिए उपलब्ध हैं, तो भ्रूण स्टेम सेल (ईएससी) से। सामान्य तौर पर, दो प्रकार के मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स को उपयोग की जाने वाली पद्धति के आधार पर अलग किया जा सकता है: अनिर्देशित और क्षेत्रीय (निर्देशित) मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स18। बाद के प्रकार के ऑर्गेनोइड्स उत्पन्न करने में, छोटे अणु या कारक प्रदान किए जाते हैं जो प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं के भेदभाव को एक विशेष मस्तिष्क क्षेत्र (जैसे, फोरब्रेन ऑर्गेनोइड्स) के ऑर्गेनोइड्स में मार्गदर्शन करते हैं। इसके विपरीत, अनिर्देशित ऑर्गेनोइड्स में, भेदभाव छोटे अणुओं के अतिरिक्त द्वारा निर्देशित नहीं होता है, बल्कि विशेष रूप से आईपीएससी / ईएससी के सहज भेदभाव पर निर्भर करता है। परिणामी मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स में विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों (जैसे, सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स) का प्रतिनिधित्व करने वाले सेल प्रकार होते हैं। ब्रेन ऑर्गेनोइड्स मस्तिष्क के विकास की कई प्रमुख विशेषताओं को किसी भी प्रजाति से अपेक्षाकृत लागत और समय-कुशल पीढ़ी के साथ जोड़ते हैं, जिसके लिए आईपीएससी या ईएससी उपलब्ध हैं11,12,13,14। यह मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स को कई प्रकार के न्यूरोबायोलॉजिकल अध्ययनों के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल बनाता है, जिसमें विकासवादी और विकासात्मक प्रश्नों से लेकर रोग मॉडलिंग और दवा परीक्षण15,16 शामिल हैं। हालांकि, मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स का उपयोग करके ऐसे सवालों को संबोधित करना आनुवंशिक संशोधन के लिए विभिन्न तरीकों की उपलब्धता पर निर्भर करता है।
नियोकॉर्टेक्स (पैथो) शारीरिक विकास और इसके विकास का अध्ययन करने का एक महत्वपूर्ण पहलू जीन और जीन वेरिएंट का कार्यात्मक विश्लेषण है। यह आमतौर पर (अटोपिक) अभिव्यक्ति और / या उन जीनों के नॉक-डाउन (केडी) या नॉक-आउट (केओ) द्वारा प्राप्त किया जाता है। इस तरह के आनुवंशिक संशोधनों को स्थिर और क्षणिक आनुवंशिक संशोधन में वर्गीकृत किया जा सकता है, साथ ही संशोधनों को अस्थायी और स्थानिक रूप से प्रतिबंधित किया जा सकता है या प्रतिबंधित नहीं किया जा सकता है। स्थिर आनुवंशिक संशोधन को मेजबान जीनोम में आनुवंशिक परिवर्तन की शुरूआत से परिभाषित किया जाता है जो बाद की सभी कोशिका पीढ़ियों को पारित किया जाता है। आनुवंशिक संशोधन के समय बिंदु के आधार पर, यह एक ऑर्गनॉइड की सभी कोशिकाओं को प्रभावित कर सकता है या कुछ सेल आबादी तक सीमित हो सकता है। सबसे अधिक बार, आईपीएससी / ईएससी स्तर पर मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स में स्थिर आनुवंशिक संशोधन लेंटिवायरस, ट्रांसपोसन जैसी प्रणालियों और सीआरआईएसपीआर / कैस 9 तकनीक (उदाहरण के लिए, फिशर एट अल.17, किरोसी एट अल.19, और टेरियापिरोम एट अल.20 द्वारा समीक्षा) को लागू करके प्राप्त किया जाता है। इसका लाभ यह है कि मस्तिष्क ऑर्गेनॉइड की सभी कोशिकाएं आनुवंशिक संशोधन करती हैं और यह अस्थायी या स्थानिक रूप से प्रतिबंधित नहीं है। हालांकि, इन स्थिर आईपीएससी / ईएससी लाइनों की पीढ़ी और लक्षण वर्णन बहुत समय लेने वाला है, अक्सर पहले संशोधित मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स का विश्लेषण करने तक कई महीने लगते हैं (उदाहरण के लिए, फिशर एट अल.17, किरोसी एट अल.19, या टेरियापिरोम एट अल.20 द्वारा समीक्षा की गई)।
इसके विपरीत, क्षणिक आनुवंशिक संशोधन को आनुवंशिक कार्गो (जैसे, एक जीन अभिव्यक्ति प्लास्मिड) के वितरण द्वारा परिभाषित किया जाता है जो मेजबान जीनोम में एकीकृत नहीं होता है। जबकि यह संशोधन, सिद्धांत रूप में, बाद की कोशिका पीढ़ियों को पारित किया जा सकता है, वितरित आनुवंशिक कार्गो प्रत्येक कोशिका विभाजन के साथ उत्तरोत्तर पतला हो जाएगा। इसलिए, इस प्रकार का आनुवंशिक संशोधन आमतौर पर अस्थायी और स्थानिक रूप से प्रतिबंधित होता है। क्षणिक आनुवंशिक संशोधन मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स में एडेनो से जुड़े वायरस द्वारा या इलेक्ट्रोपोरेशन द्वारा किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, फिशर एट अल.17, किरूसी एट अल.19, और टेरियापिरोम एट अल.20 द्वारा समीक्षा की गई), बाद में इस लेख में विस्तार से वर्णित किया गया है। स्थिर आनुवंशिक संशोधन के विपरीत, यह दृष्टिकोण बहुत तेज और लागत कुशल है। दरअसल, इलेक्ट्रोपोरेशन मिनटों के भीतर किया जा सकता है, और, लक्ष्य सेल आबादी (ओं) के आधार पर, इलेक्ट्रोपोरेटेड ऑर्गेनोइड ्स दिनों के भीतर विश्लेषण के लिए तैयार होते हैं (उदाहरण के लिए, फिशर एट अल.17 और किरोसी एट अल.19 द्वारा समीक्षा की गई)। हालांकि, मस्तिष्क ऑर्गेनॉइड के सकल रूपात्मक परिवर्तन, जैसे कि आकार में अंतर, इस विधि का उपयोग करके पता नहीं लगाया जा सकता है, क्योंकि इस प्रकार का आनुवंशिक संशोधन अस्थायी और स्थानिक रूप से प्रतिबंधित है। यह प्रतिबंध एक फायदा भी हो सकता है, उदाहरण के लिए, ऑर्गेनॉइड के भीतर व्यक्तिगत कोशिका आबादी का अध्ययन करने या विशिष्ट विकास समय बिंदुओं पर मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स पर प्रभाव (उदाहरण के लिए, फिशर एट अल.17 और किरोसी एट अल.19 द्वारा समीक्षा की गई)।
मस्तिष्क के विकास और विकास के दौरान जीन फ़ंक्शन का अध्ययन करने के लिए एक शास्त्रीय दृष्टिकोण गर्भाशय इलेक्ट्रोपोरेशन में है। गर्भाशय में इलेक्ट्रोपोरेशन कृंतक 21,22,23 और फेरेट24,25 दिमागों में जीन अभिव्यक्ति संरचनाओं के वितरण के लिए एक प्रसिद्ध और उपयोगी तकनीक है। सबसे पहले, रुचि की अभिव्यक्ति निर्माण (ओं) वाले एक समाधान को गर्भाशय की दीवार के माध्यम से भ्रूण के मस्तिष्क के एक निश्चित वेंट्रिकल में माइक्रोइंजेक्ट किया जाता है, जो लक्षित क्षेत्र पर निर्भर करता है। दूसरे चरण में, लक्षित वेंट्रिकल को सीधे अस्तर करने वाली कोशिकाओं को स्थानांतरित करने के लिए इलेक्ट्रिक पल्स लागू किए जाते हैं। यह दृष्टिकोण न केवल अस्थानिक अभिव्यक्ति या जीन के अतिवृद्धि तक सीमित है, क्योंकि इसे केडी या केओ अध्ययनों में क्रमशःशॉर्ट हेयरपिन (एसएचआरएनए) या सीआरआईएसपीआर / कैस 9 (अभिव्यक्ति प्लास्मिड या राइबोन्यूक्लिओप्रोटीन [आरएनपी] के रूप में) को माइक्रोइंजेक्ट करके भी लागू किया जा सकता है। हालांकि, माउस, चूहे, और फेरेट भ्रूण के गर्भाशय इलेक्ट्रोपोरेशन में वही सीमाएं हैं जो इन पशु मॉडलों के लिए ऊपर वर्णित हैं।
आदर्श रूप से, कोई प्राइमेट्स में सीधे गर्भाशय इलेक्ट्रोपोरेशन में प्रदर्शन करना चाहेगा। हालांकि यह सिद्धांत रूप में, तकनीकी रूप से संभव है, नैतिक चिंताओं, उच्च पशु रखरखाव लागत और छोटे कूड़े के आकार के कारण प्राइमेट्स में गर्भाशय इलेक्ट्रोपोरेशन आयोजित नहीं किया जाता है। कुछ प्राइमेट्स के लिए, जैसे महान वानर (मनुष्यों सहित), यह बिल्कुल संभव नहीं है। हालांकि, इन प्राइमेट्स में मानव (पैथो) फिजियोलॉजिकल नियोकॉर्टेक्स विकास और इसके विकास के अध्ययन के लिए सबसे बड़ी क्षमता है। इस दुविधा का एक समाधान प्राइमेट ब्रेन ऑर्गेनोइड्स28 के लिए इलेक्ट्रोपोरेशन तकनीक को लागू करना है।
यह पेपर प्राइमेट ब्रेन ऑर्गेनोइड्स, प्राइमेट सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स के एक उपप्रकार के इलेक्ट्रोपोरेशन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। यह दृष्टिकोण ऑर्गेनोइड्स के वेंट्रिकल जैसी संरचनाओं के भीतर सेल आबादी के तेज और लागत कुशल आनुवंशिक संशोधन की अनुमति देता है। विशेष रूप से, हम मानव (होमो सेपियन्स), चिंपांज़ी (पैन ट्रोग्लोडाइट्स), रीसस मकाक (मकाका मुलाटा), और आम मार्मोसेट (कैलिथ्रेक्स जैकस) आईपीएससी से प्राइमेट सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स की पीढ़ी के लिए एक एकीकृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। इसके अलावा, हम माइक्रोइंजेक्शन और इलेक्ट्रोपोरेशन तकनीक का विस्तार से वर्णन करते हैं और प्राइमेट सेरेब्रल ऑर्गनॉइड इलेक्ट्रोपोरेशन करने के लिए "गो" और "नो-गो" मानदंड प्रदान करते हैं। यह दृष्टिकोण (पैथो) शारीरिक नियोकॉर्टेक्स विकास और विशेष रूप से मानव स्थिति के करीब एक मॉडल में इसके विकास का अध्ययन करने के लिए एक प्रभावी उपकरण है।
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Protocol
1. प्राइमेट आईपीएससी की संस्कृति
नोट: इसकी मजबूती के कारण, यहां प्रस्तुत विधि को किसी भी प्राइमेट आईपीएससी लाइन पर लागू किया जा सकता है। इस लेख में, हम मानव (iLonza2.2)29, चिम्पांजी (सैंड्रा ए)30, रीसस मकाक (iRh33.1)29, और सामान्य मार्मोसेट (cj_160419_5)31 आईपीएससी लाइनों से सेरेब्रल ऑर्गेनॉइड उत्पादन का वर्णन करते हैं। संस्कृति की स्थितियों को तालिका 1 में संक्षेपित किया गया है। इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली सभी सामग्रियों, अभिकर्मकों और उपकरणों से संबंधित विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें।
- संबंधित आईपीएससी की खेती के लिए, मूल रूप से वर्णित संस्कृति स्थितियों का पालन करें। सामान्य तौर पर, सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स की सफल पीढ़ी और इलेक्ट्रोपोरेशन के लिए, आईपीएससी लाइनों का उपयोग करें जिन्हें 90 से अधिक मार्गों के लिए सुसंस्कृत नहीं किया गया है। इसके अतिरिक्त, सेरेब्रल ऑर्गनॉइड पीढ़ी की शुरुआत में, सुनिश्चित करें कि आईपीएससी भेदभाव के कोई संकेत के बिना प्लूरिपोटेंसी की विशेषताओं का प्रदर्शन करते हैं।
2. प्राइमेट आईपीएससी से सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स का उत्पादन।
नोट: सेरेब्रल ऑर्गनॉइड पीढ़ी के लिए प्रोटोकॉल कुछ प्रजातियों-विशिष्ट संशोधनों (नीचे विस्तृत) के साथ मूल सेरेब्रल ऑर्गनॉइड प्रोटोकॉल 10,34 के संशोधित संस्करण28,30,32,33 पर आधारित है।
- भ्रूण यी शरीर (ईबी) उत्पन्न करने के लिए आईपीएससी का सीडिंग।
- एक बार जब आईपीएससी 80% -90% कंफ्लुएंसी तक पहुंच जाते हैं, तो उन्हें डलबेकको के फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (डीपीबीएस) से धो लें, और 500 μL पुनः संयोजक ट्रिप्सिन विकल्प या 1 एमएल प्रोटियोलिटिक और कोलेजनोलिटिक मिश्रण जोड़ें।
नोट: आमतौर पर, आईपीएससी को लगभग 900,000 कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए 60 मिमी सेल कल्चर डिश में सुसंस्कृत किया जाता है, जो 96 सेरेब्रल ऑर्गेनोइड उत्पन्न करने के लिए पर्याप्त है। आवश्यक ऑर्गेनोइड की संख्या के आधार पर सेल संख्या को समायोजित किया जा सकता है। ध्यान रखें कि सभी उत्पन्न सेरेब्रल ऑर्गेनोइड इलेक्ट्रोपोरेशन के लिए उपयुक्त नहीं हो सकते हैं। - कोशिकाओं को अलग करने के लिए 2 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पकवान को इनक्यूबेट करें।
नोट: आईपीएससी लाइन या एंजाइम के आधार पर 37 डिग्री सेल्सियस पर अतिरिक्त 2 मिनट इनक्यूबेशन की आवश्यकता हो सकती है। यह सुनिश्चित करने के लिए माइक्रोस्कोप के तहत पकवान की जांच करने की सलाह दी जाती है कि कोशिकाओं ने अलग होना शुरू कर दिया है। - प्रतिक्रिया को रोकने के लिए 1.5 एमएल प्रीवार्म्ड (37 डिग्री सेल्सियस) आईपीएससी कल्चर माध्यम जोड़ें, और सेल कल्चर डिश से कोशिकाओं को अलग करने और एकल-सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए 7x-10x (10x से अधिक नहीं) को ऊपर और नीचे करें।
- सेल निलंबन को 15 एमएल शंक्वाकार सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें, और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 200 × ग्राम पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें।
- सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें, और आईपीएससी कल्चर माध्यम के 2 एमएल में गोली को फिर से निलंबित करें, जो या तो 50 μM Y27632 या 50 μM प्रो-सर्वाइवल यौगिक के साथ पूरक है।
- न्यूबॉयर कक्ष का उपयोग करके कोशिकाओं को गिनने के लिए सेल निलंबन के 10 μL का उपयोग करें।
- 50 μM Y27632 या 50 μM प्रो-सर्वाइवल यौगिक के साथ पूरक आईपीएससी कल्चर माध्यम का उपयोग करके सेल निलंबन को 9,000 कोशिकाओं प्रति 150 μL (60,000 कोशिकाओं / एमएल) की एकाग्रता में समायोजित करें।
- भ्रूण यी शरीर (ईबी) उत्पन्न करने के लिए, एक अल्ट्रा-लो अटैचमेंट 96-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में सेल निलंबन के 150 μL बीज डालें। पाइपिंग करते समय, कोशिकाओं को तलछट से रोकने के लिए सेल सस्पेंशन युक्त ट्यूब को धीरे से हिलाएं ।
- ईबी को 5% सीओ2 और 95% हवा के 37 डिग्री सेल्सियस (बीजारोपण के 0 दिन बाद [डीपीएस]) के आर्द्र वातावरण में कल्चर करें। बीज बोने के बाद पहले 24 घंटे के भीतर ईबी को परेशान न करें।
नोट: मार्मोसेट आईपीएससी से उत्पन्न ईबी को 37 डिग्री सेल्सियस पर हाइपोक्सिक परिस्थितियों (5% सीओ 2, 5% ओ2, और 90% एन2) के तहत एक आर्द्र वातावरण में सुसंस्कृत करने की आवश्यकता होती है। - ~ 48 घंटे (2 डीपीएस) के बाद, वाई 27632 / प्रो-सर्वाइवल यौगिक के बिना माध्यम को आईपीएससी संस्कृति माध्यम में बदलें। प्रति अच्छी तरह से 100 μL मध्यम निकालें, और Y27632 के बिना 150 μL प्रीवार्म्ड (37 °C) ताजा माध्यम जोड़ें। पंक्ति दर पंक्ति जाओ.
- हर दूसरे दिन आगे मध्यम परिवर्तन करें; प्रत्येक कुएं से 150 μL माध्यम निकालें, और प्रति कुएं Y27632 / प्रो-सर्वाइवल यौगिक के बिना 150 μL प्रीवार्म्ड (37 डिग्री सेल्सियस) ताजा माध्यम जोड़ें।
नोट: 4-5 डीपीएस के बाद, ईबी की परिधि पारभासी हो जानी चाहिए।
- एक बार जब आईपीएससी 80% -90% कंफ्लुएंसी तक पहुंच जाते हैं, तो उन्हें डलबेकको के फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (डीपीबीएस) से धो लें, और 500 μL पुनः संयोजक ट्रिप्सिन विकल्प या 1 एमएल प्रोटियोलिटिक और कोलेजनोलिटिक मिश्रण जोड़ें।
- न्यूरोएक्टोडर्म का प्रेरण
नोट: सामान्य तौर पर, अच्छी गुणवत्ता वाले ईबी में इस स्तर पर चिकनी आकृति और पारभासी सीमाएं होनी चाहिए। तंत्रिका प्रेरण के समय बिंदु प्राइमेट प्रजातियों और आईपीएससी लाइनों के बीच थोड़ा भिन्न होते हैं। यहां उपयोग की जाने वाली सेल लाइनों के मामले में (अनुभाग 1 और सामग्री की तालिका देखें), मार्मोसेट ईबी के लिए तंत्रिका प्रेरण आमतौर पर 4 डीपीएस पर शुरू करने की आवश्यकता होती है, रीसस मकाक के लिए 5 डीपीएस पर, और मानव और चिंपांज़ी ईबी के लिए 4-5 डीपीएस (चित्रा 1 ए) पर, ईबी की स्थिति के आधार पर (ऊपर देखें)।- 96-वेल प्लेट की पहली पंक्ति के प्रत्येक कुएं से 150 μL मध्यम निकालें, और उसी पंक्ति में प्रति कुएं में 150 μL प्रीवार्म्ड (37 °C) तंत्रिका प्रेरण माध्यम ( तालिका 2 देखें) जोड़ें।
- पूरे 96-वेल प्लेट के लिए पंक्ति द्वारा ऊपर वर्णित के रूप में माध्यम को बदलना जारी रखें। प्रत्येक कुएं से 150 μL NIM को हटाकर और 150 μL प्रीवार्म्ड (37 °C) ताजा एनआईएम जोड़कर हर दूसरे दिन आगे तंत्रिका प्रेरण माध्यम (एनआईएम) परिवर्तन करें।
नोट: इस बिंदु से, मार्मोसेट ईबी को अन्य प्राइमेट ईबी (37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 और 95% हवा का ह्यूमिफाइड वातावरण) के समान परिस्थितियों में सुसंस्कृत किया जाना चाहिए।
- तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में एम्बेड करना
नोट: एक बार जब ईबी ने सतह पर एक स्पष्ट, पारभासी, रेडियल रूप से संगठित न्यूरोएपिथेलियम विकसित कर लिया है, तो वेंट्रिकल जैसी संरचनाओं के विकास के लिए संरचनात्मक सहायता प्रदान करने की आवश्यकता है। यह ईबी को तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में एम्बेड करके प्राप्त किया जाता है। विकास दर में अंतर के कारण, मार्मोसेट और रीसस मकाक ईबी पहले से ही 7 डीपीएस पर एम्बेड करने के लिए तैयार हैं, जबकि मानव और चिंपांज़ी ईबी आमतौर पर 8-9 डीपीएस पर एम्बेडेड होते हैं। सादगी के लिए, तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स इस प्रोटोकॉल में केवल मैट्रिगेल को संदर्भित करता है। हालांकि, गेलट्रेक्स को प्रतिस्थापन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।- एम्बेडिंग की तैयारी में, यूवी-स्टरलाइज़ कैंची, फोर्स, 0.2 एमएल ट्यूबों के लिए एक छोटा रैक, और पैराफिल्म के तीन से छह वर्गों को 15 मिनट के लिए लैमिनर फ्लो हुड के तहत 70% (वॉल्यूम / वॉल्यूम) इथेनॉल के साथ इलाज किया जाता है। बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स को कई घंटों तक बर्फ पर पिघलने दें (~ 1.5 एमएल बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स आमतौर पर 96 ईबी के लिए पर्याप्त है)।
नोट: बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स को हमेशा बर्फ पर रखें। - पैराफिल्म पर 4 x 4 डिंपल ग्रिड बनाएं। पैराफिल्म ग्रिड को 0.2 एमएल ट्यूब रैक पर रखें ताकि पेपर-लिफाफा साइड ऊपर की ओर हो, और धीरे से रैक के प्रत्येक छेद के खिलाफ एक घिसी हुई उंगली दबाएं।
- कागज को हटा दें, और 60 मिमी सेल कल्चर डिश में फिट होने के लिए इसके आकार को समायोजित करने के लिए कैंची का उपयोग करके पैराफिल्म स्क्वायर से डिंपल ग्रिड को काट लें। बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स ड्रॉपलेट पीढ़ी के लिए आधार प्रदान करने के लिए डिंपल ्ड पैराफिल्म को 0.2 एमएल ट्यूब रैक पर वापस रखें।
- एक कटे हुए 200 μL पिपेट टिप के साथ एक पिपेट का उपयोग करके, ईबी को संस्कृति पकवान के कुएं से पैराफिल्म डिंपल में एक के बाद एक स्थानांतरित करें।
- 16 ईबी को ग्रिड में ले जाने के बाद, एक नया 200 μL पिपेट टिप लें, और शेष माध्यम को डिंपल से हटा दें।
- एक ईबी वाले प्रत्येक डिंपल पर बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स की एक बूंद (~ 15 μL) पिपेट करें।
- एक 10 μL पिपेट टिप लें और जल्दी से बूंद सीमाओं को परेशान किए बिना प्रत्येक बूंद के केंद्र में ईबी ले जाएं।
- 60 मिमी सेल कल्चर डिश में बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स बूंदों के साथ डिंपल ्ड पैराफिल्म रखें, और मैट्रिक्स को पॉलीमराइजेशन करने की अनुमति देने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 15-30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
- पैराफिल्म से मैट्रिक्स-एम्बेडेड ईबी को अलग करने के लिए, डिश में विटामिन ए (तालिका 2 देखें) के बिना 5 एमएल विभेदन माध्यम (डीएम) जोड़ें, और फोर्सप्स का उपयोग करके पैराफिल्म स्क्वायर को उल्टा कर दें ताकि ईबी के साथ साइड डिश के निचले हिस्से का सामना कर सके।
- ईबी युक्त तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स बूंदों को पैराफिल्म से अलग करने के लिए पकवान को ध्यान से हिलाएं। यदि उनमें से कुछ अभी भी जुड़े हुए हैं, तो फोर्सप्स का उपयोग करके पैराफिल्म स्क्वायर का एक किनारा लें, और इसे कई बार पकवान के केंद्र की ओर तेजी से रोल करें।
- सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स को 55 आरपीएम पर ऑर्बिटल शेकर पर 5% सीओ2 और 37 डिग्री सेल्सियस पर 95% हवा के ह्यूमीफाइड वातावरण में कल्चर करें। उन्हें हर दूसरे दिन मध्यम परिवर्तन के साथ विटामिन ए के बिना डीएम में रखें। न्यूरॉन्स के उत्पादन को प्रेरित करने के लिए, मार्मोसेट और रीसस मकाक सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स के लिए 13 डीपीएस या मानव और चिंपांज़ी सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स के लिए 14-15 डीपीएस के बाद विटामिन ए (रेटिनोइक एसिड, आरए) के साथ डीएम पर स्विच करें (चित्रा 1 ए)। इस बिंदु से, हर 3-4 दिनों में माध्यम बदलें।
नोट: न्यूरोनल अस्तित्व का समर्थन करने के लिए, विटामिन ए के साथ डीएम को 20 μg / mL मानव न्यूरोट्रोफिन 3 (NT3), 20 μg / mL मस्तिष्क-व्युत्पन्न न्यूरोट्रॉफिक कारक (BDNF), और 1 μL / mL तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के साथ 40 डीपीएस से पूरक किया जा सकता है।
- एम्बेडिंग की तैयारी में, यूवी-स्टरलाइज़ कैंची, फोर्स, 0.2 एमएल ट्यूबों के लिए एक छोटा रैक, और पैराफिल्म के तीन से छह वर्गों को 15 मिनट के लिए लैमिनर फ्लो हुड के तहत 70% (वॉल्यूम / वॉल्यूम) इथेनॉल के साथ इलाज किया जाता है। बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स को कई घंटों तक बर्फ पर पिघलने दें (~ 1.5 एमएल बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स आमतौर पर 96 ईबी के लिए पर्याप्त है)।
3. प्राइमेट सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स का इलेक्ट्रोपोरेशन
नोट: तकनीकी दृष्टिकोण से, सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स का इलेक्ट्रोपोरेशन जैसे ही वेंट्रिकल जैसी संरचनाओं को माइक्रोइंजेक्शन द्वारा लक्षित करने के लिए पर्याप्त रूप से स्पष्ट किया जाता है, संचालित किया जा सकता है। इष्टतम इलेक्ट्रोपोरेशन समय खिड़की जैविक प्रश्न और रुचि के सेल आबादी (ओं) पर निर्भर करती है। उदाहरण के लिए, यदि एपिकल पूर्वज (एपी) मुख्य लक्ष्य हैं, तो लगभग 30 डीपीएस पर सेरेब्रल ऑर्गेनोइड पहले से ही उपयुक्त हैं। यदि बेसल पूर्वज (बीपी) या न्यूरॉन्स मुख्य लक्ष्य हैं, तो 50 से अधिक डीपीएस के पुराने सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स का उपयोग किया जाना चाहिए (देखें, उदाहरण के लिए, फिशर एट अल .28)।
- इलेक्ट्रोपोरेशन सेटअप की तैयारी
नोट: इलेक्ट्रोपोरेशन दक्षता आकार और इलेक्ट्रोपोरेटेड प्लास्मिड (एस) की एकाग्रता से दृढ़ता से प्रभावित होती है (विवरण के लिए चर्चा अनुभाग देखें)।- नियंत्रण और रुचि के जीन (जीओआई) के लिए पर्याप्त मात्रा में इलेक्ट्रोपोरेशन मिश्रण तैयार करें, उदाहरण के लिए, प्रत्येक नियंत्रण के लिए 10 μL इलेक्ट्रोपोरेशन मिश्रण और भारत सरकार प्रति स्थिति लगभग 30 सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स को इलेक्ट्रोपोरेट करने के लिए।
नोट: इलेक्ट्रोपोरेशन मिक्स की संरचना के लिए, तालिका 3 देखें। - प्रीवार्म (गैर-बाँझ) डलबेकको का संशोधित ईगल मध्यम / पोषक तत्व मिश्रण एफ -12 (डीएमईएम / एफ 12) और डीएम विटामिन ए के साथ 37 डिग्री सेल्सियस तक। एक छोटा स्पैटुला और बारीक और सामान्य कैंची तैयार करें, और उपकरणों को 70% (वॉल्यूम / वॉल्यूम) इथेनॉल के साथ स्प्रे करें।
नोट: निम्नलिखित चरणों को बाँझ या गैर-बाँझ स्थितियों के तहत किया जा सकता है क्योंकि डीएम में एंटीबायोटिक्स होते हैं ( तालिका 2 देखें)। हमारे अनुभव में, बाँझपन की अनुपस्थिति ने कभी भी कोई संदूषण नहीं किया है। - 35 मिमी सेल कल्चर व्यंजन तैयार करें, और पेट्री डिश इलेक्ट्रोड चैंबर को इलेक्ट्रोपोरेटर से कनेक्ट करें।
नोट: पेट्री डिश इलेक्ट्रोड कक्ष व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं। हालांकि, उन्हें आसानी से लागत कुशल तरीके से उत्पादित किया जा सकता है ( पूरक फ़ाइल 1 देखें)। - माइक्रोलोडर युक्तियों का उपयोग करके, प्रत्येक इलेक्ट्रोपोरेशन मिश्रण के 8 μL के साथ माइक्रोइंजेक्शन सुइयों को भरें। एक स्थिर प्रवाह प्राप्त करने के लिए पहले उपयोग से पहले बारीक कैंची का उपयोग करके सुइयों की युक्तियों को काट लें। हालांकि, टिप का केवल एक छोटा सा हिस्सा हटा दें, क्योंकि एक कुंद और चौड़ी नोक ऑर्गेनोइड्स को गंभीर रूप से नुकसान पहुंचा सकती है।
नोट: माइक्रोइंजेक्शन सुइयां या तो व्यावसायिक रूप से प्री-खींची गई माइक्रोइंजेक्शन सुइयों के रूप में उपलब्ध हैं या सुई खींचने वाला उपलब्ध होने पर प्रयोगशाला में खींचा जा सकता है। एक लंबी टेपर और 10 μm टिप व्यास के साथ माइक्रोइंजेक्शन सुइयों को उत्पन्न करने के लिए सुई खींचने वाले निर्माता के निर्देशों का पालन करें।
- नियंत्रण और रुचि के जीन (जीओआई) के लिए पर्याप्त मात्रा में इलेक्ट्रोपोरेशन मिश्रण तैयार करें, उदाहरण के लिए, प्रत्येक नियंत्रण के लिए 10 μL इलेक्ट्रोपोरेशन मिश्रण और भारत सरकार प्रति स्थिति लगभग 30 सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स को इलेक्ट्रोपोरेट करने के लिए।
- माइक्रोइंजेक्शन और इलेक्ट्रोपोरेशन
- एक माइक्रोस्कोप के तहत, चिकनी सीमाओं और स्पष्ट रूप से दिखाई देने वाले वेंट्रिकल जैसी संरचनाओं के साथ पांच सेरेब्रल ऑर्गेनोइड चुनें। उन्हें एक 35 मिमी सेल कल्चर डिश में ले जाएं जिसमें 1,000 μL पिपेट टिप का उपयोग करके प्रीवार्म्ड (37 डिग्री सेल्सियस) डीएमईएम / एफ 12 हो।
नोट: स्पष्ट और सुलभ वेंट्रिकल जैसी संरचनाओं के साथ सेरेब्रल ऑर्गेनोइड चुनें ( चित्रा 1 बी देखें)। - वेंट्रिकल जैसी संरचना को इंजेक्ट करने के लिए, सावधानीपूर्वक सुई को इसकी दीवार के माध्यम से डालें, और इसे स्पष्ट रूप से भरने तक इलेक्ट्रोपोरेशन मिश्रण के साथ इंजेक्ट करें। वेंट्रिकल जैसी संरचनाओं को फटने से बचाने के लिए उन पर अत्यधिक दबाव न डालें। इस तरह से प्रत्येक सेरेब्रल ऑर्गनॉइड की छह से आठ वेंट्रिकल जैसी संरचनाओं के साथ आगे बढ़ें।
नोट: यदि माइक्रोइंजेक्शन प्रक्रिया के दौरान सुई बंद हो जाती है, तो टिप को थोड़ा ट्रिम करने की आवश्यकता होती है। - डीएमईएम / एफ 12 की थोड़ी मात्रा के साथ पेट्री डिश इलेक्ट्रोड चैंबर में एक माइक्रोइंजेक्टेड सेरेब्रल ऑर्गनॉइड को स्थानांतरित करें। ऑर्गेनॉइड को इस तरह से व्यवस्थित करें कि माइक्रोइंजेक्टेड वेंट्रिकल जैसी संरचनाओं की सतहें इलेक्ट्रोपोरेटर के सकारात्मक ध्रुव से जुड़े इलेक्ट्रोड की ओर हों।
नोट: इस तरह से संरचनाओं को उन्मुख करना यह सुनिश्चित करता है कि कोशिकाओं को वेंट्रिकल जैसी संरचना के किनारे स्थानांतरित किया जाता है जो आसन्न संरचना से प्रभावित नहीं होता है। - निम्नलिखित सेटिंग्स का उपयोग करके सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स को एक-एक करके इलेक्ट्रोपोरेट करें: 80 वी की 5 दालें, 50 एमएस की पल्स अवधि और 1 सेकंड का अंतराल। इलेक्ट्रोपोरेटेड ऑर्गेनोइड्स को एक नए 35 मिमी सेल कल्चर डिश में ले जाएं जो प्रीवार्म्ड (37 डिग्री सेल्सियस) डीएमईएम / एफ 12 से भरा हो।
नोट: इलेक्ट्रोपोरेशन सेटिंग्स उपलब्ध वर्ग तरंग इलेक्ट्रोपोरेटर पर निर्भर हो सकती हैं। ये सेटिंग्स संदर्भित इलेक्ट्रोपोरेशन सिस्टम के लिए अनुकूलित हैं। वोल्टेज बढ़ने से कोशिकाओं का विस्थापन हो सकता है। - दूसरे इलेक्ट्रोपोरेशन मिश्रण (उदाहरण के लिए, जीओआई) का उपयोग करके अगले पांच सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स के साथ उसी तरह से आगे बढ़ें।
नोट: चरण 3.2.1-3.2.5 को तब तक दोहराएं जब तक कि इलेक्ट्रोपोरेटेड सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स की वांछित संख्या तक न पहुंच जाए। - यदि माइक्रोइंजेक्शन और इलेक्ट्रोपोरेशन गैर-बाँझ परिस्थितियों में आयोजित किए गए थे, तो इलेक्ट्रोपोरेटेड ऑर्गेनोइड्स को एक लामिनर फ्लो हुड के तहत एक बाँझ 35 मिमी सेल कल्चर डिश में स्थानांतरित करें, जबकि नए सेल कल्चर डिश में जितना संभव हो उतना कम डीएमईएम / एफ 12 ले जाएं।
- एक माइक्रोस्कोप के तहत, चिकनी सीमाओं और स्पष्ट रूप से दिखाई देने वाले वेंट्रिकल जैसी संरचनाओं के साथ पांच सेरेब्रल ऑर्गेनोइड चुनें। उन्हें एक 35 मिमी सेल कल्चर डिश में ले जाएं जिसमें 1,000 μL पिपेट टिप का उपयोग करके प्रीवार्म्ड (37 डिग्री सेल्सियस) डीएमईएम / एफ 12 हो।
- सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स की आगे की संस्कृति और निर्धारण।
- डीएम में इलेक्ट्रोपोरेटेड ऑर्गेनोइड्स को 55 आरपीएम पर ऑर्बिटल शेकर पर 5% सीओ2 और 37 डिग्री सेल्सियस पर 95% हवा के ह्यूमिफाइड वातावरण में विटामिन ए के साथ कल्चर करें।
- इलेक्ट्रोपोरेशन के अगले दिन, पारंपरिक उल्टे प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत सफल इलेक्ट्रोपोरेशन के लिए सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स की जांच करें।
नोट: इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद आगे की संस्कृति की लंबाई के आधार पर, सेरेब्रल ऑर्गनॉइड के भीतर विभिन्न सेल आबादी प्रभावित होती है (प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग भी देखें)। - रुचि के जैविक प्रश्न के लिए उपयुक्त समय के लिए इलेक्ट्रोपोरेटेड सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स की खेती करने के बाद डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के साथ आगे बढ़ें।
नोट: इलेक्ट्रोपोरेटेड सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स को विभिन्न डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए संसाधित किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, आरएनए अलगाव और क्यूआरटी-पीसीआर के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग या स्नैप-फ्रोजन के लिए निर्धारण)। यहां, हम इलेक्ट्रोपोरेटेड सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स के निर्धारण का वर्णन करते हैं। - 1,000 μl पिपेट टिप का उपयोग करके इलेक्ट्रोपोरेटेड ऑर्गेनोइड्स को 15 एमएल शंक्वाकार सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें, और अतिरिक्त माध्यम को हटा दें।
- डीपीबीएस (पीएच 7.5) में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) की पर्याप्त मात्रा जोड़ें, और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
सावधानी: पीएफए को मानव कार्सिनोजेन के रूप में वर्गीकृत किया गया है और इससे अपूरणीय स्वास्थ्य क्षति हो सकती है। नाइट्राइल दस्ताने और चश्मे सहित अतिरिक्त एहतियात ी उपायों की दृढ़ता से सिफारिश की जाती है। - पीएफए को एस्पिरेट करें, डीपीबीएस के 5 एमएल जोड़ें, थोड़ा हिलाएं, और डीपीबीएस को एस्पिरेट करें। इस 2x को दोहराएं। आगे के उपयोग तक 4 डिग्री सेल्सियस पर डीपीबीएस में ऑर्गेनोइड्स स्टोर करें।
नोट: प्रोटोकॉल को यहां रोका जा सकता है, क्योंकि पीएफए-फिक्स्ड सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स को कई महीनों तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। पीएफए-फिक्स्ड इलेक्ट्रोपोरेटेड ऑर्गेनोइड्स का विश्लेषण क्रायोसेक्शनिंग और इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग10,28 या पूरे-माउंट स्टेनिंग और क्लियरिंग35,36 द्वारा किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग देखें (एंटीबॉडी विवरण के लिए तालिका 4 देखें)।
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Representative Results
यहां वर्णित प्रोटोकॉल मानव, चिंपांज़ी, रीसस मकाक और सामान्य मार्मोसेट आईपीएससी लाइनों से सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स की कुशल पीढ़ी की अनुमति देता है, जिसमें प्रजातियों के बीच आवश्यक न्यूनतम समय परिवर्तन होते हैं (चित्रा 1 ए)। इन ऑर्गेनोइड्स को वेंट्रिकल जैसी संरचनाओं की पहुंच और रुचि के सेल आबादी (ओं) की प्रचुरता के आधार पर 20 डीपीएस से 50 डीपीएस की सीमा में इलेक्ट्रोपोरेट किया जा सकता है। हालांकि, इलेक्ट्रोपोरेशन से पहले, यह निर्धारित करना महत्वपूर्ण है कि सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स इलेक्ट्रोपोरेटेड होने के लिए पर्याप्त गुणवत्ता के हैं या नहीं।
इलेक्ट्रोपोरेशन के लिए एक सेरेब्रल ऑर्गेनॉइड आदर्श को परिधि पर स्पष्ट उज्ज्वल वेंट्रिकल जैसी संरचनाओं को प्रदर्शित करना चाहिए, अध: पतन के कोई संकेत नहीं (जैसे, अलग कोशिकाएं, बढ़े हुए एपोप्टोटिक कोर), और एक आम तौर पर कॉम्पैक्ट स्वस्थ आकृति विज्ञान (जैसे, कोई अत्यधिक आउटग्रोथ नहीं) (चित्रा 1 बी, "गो")। कोशिकाओं की अधिक संख्या को लक्षित करने के लिए बड़े, सुव्यवस्थित, वेंट्रिकल जैसी संरचनाओं के साथ सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स चुनना बेहतर होता है। यदि एक ऑर्गनॉइड का परिधीय क्षेत्र अंधेरा है और कोई उभरी हुई संरचना नहीं दिखाता है, तो इसे इलेक्ट्रोपोरेशन के लिए उपयोग नहीं करने की सिफारिश की जाती है, क्योंकि दृश्य संकेतों की कमी से सटीक माइक्रोइंजेक्शन से समझौता किया जा सकता है (चित्रा 1 बी, "नो-गो")। एक इष्टतम सेरेब्रल ऑर्गेनॉइड आकृति विज्ञान प्राप्त करने के लिए, यह सुनिश्चित करना आवश्यक है कि न्यूरोएक्टोडर्म प्रेरण और मैट्रिक्स एम्बेडिंग जैसे महत्वपूर्ण कदम अच्छी तरह से समय पर हों। सेरेब्रल ऑर्गनॉइड आकृति विज्ञान से संबंधित समस्याएं आमतौर पर असफल न्यूरोएक्टोडर्म और / या न्यूरोएपिथेलियल कली गठन से उत्पन्न होती हैं। यह आम तौर पर तंत्रिका प्रेरण और / या तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स एम्बेडिंग के उप-समय के कारण होता है और इन चरणों के समय को समायोजित करके हल किया जा सकता है (सेरेब्रल ऑर्गनॉइड गठन के लिए आगे समस्या निवारण युक्तियां लैंकेस्टर और नॉब्लिच34 में पाई जा सकती हैं)।
इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद, इसकी सफलता और इसकी दक्षता का पहला मूल्यांकन 12 घंटे के बाद किया जा सकता है, जब ट्रांसक्रिप्टेड कोशिकाओं की जीएफपी अभिव्यक्ति एक पारंपरिक उल्टे प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत पता लगाने योग्य हो जाती है। आदर्श रूप से, इस स्तर पर, कई वेंट्रिकल जैसी संरचनाएं उनके एक पक्ष (चित्रा 2 ए) में स्थानीयकृत उज्ज्वल हरे रंग की प्रतिदीप्ति का उत्सर्जन करती हैं। यह प्रक्रिया की उच्च परिशुद्धता और दक्षता को इंगित करता है। चार अलग-अलग प्राइमेट प्रजातियों (यानी, मानव, चिंपांज़ी, रीसस मकाक, और आम मार्मोसेट) के सफलतापूर्वक इलेक्ट्रोपोरेटेड सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स लक्षित वेंट्रिकल जैसी संरचनाओं के भीतर समान जीएफपी-पॉजिटिव पैटर्न दिखाते हैं (चित्रा 2 ए)। इसके अलावा, इलेक्ट्रोपोरेटेड प्राइमेट सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स के निर्धारण और क्रायोसेक्शनिंग के बाद, सभी चार प्रजातियों की सफलतापूर्वक इलेक्ट्रोपोरेटेड वेंट्रिकल जैसी संरचनाएं रेडियल रूप से संगठित और घनी पैक वेंट्रिकुलर ज़ोन (वीजेड) के भीतर जीएफपी-पॉजिटिव कोशिकाओं के कॉलम प्रदर्शित करती हैं (चित्रा 2 बी)। चिम्पांजी और मार्मोसेट सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स के ऐसे क्षेत्रों में जीएफपी-पॉजिटिव कोशिकाओं की मात्रा का परिमाणीकरण 2 दिन बाद (12 ऑर्गेनोइड्स से 17 वेंट्रिकल्स परिमाणित) से पता चला है कि औसतन, लगभग एक-तिहाई कोशिकाओं (33%, एसडी ± 12%) को सफलतापूर्वक इलेक्ट्रोपोरेट किया गया था।
सबऑप्टिमल इलेक्ट्रोपोरेशन को या तो वेंट्रिकल जैसी संरचना (चित्रा 3 ए) के भीतर जीएफपी-पॉजिटिव कोशिकाओं की एक छोटी संख्या द्वारा चिह्नित किया जाता है या किसी भी वेंट्रिकल जैसी संरचना (चित्रा 3 बी) से दूर कुछ जीएफपी-पॉजिटिव कोशिकाओं द्वारा चिह्नित किया जाता है। जीएफपी-पॉजिटिव कोशिकाओं की कम संख्या एक खराब प्लास्मिड अपटेक के कारण होती है। यह या तो कम प्लास्मिड सांद्रता के कारण हो सकता है जो माइक्रोइंजेक्टेड इलेक्ट्रोपोरेशन मिक्स की अपर्याप्त मात्रा के कारण होता है या इलेक्ट्रिक पल्स के कारण होता है जो अच्छी तरह से निर्देशित नहीं होते हैं, जो पेट्री डिश इलेक्ट्रोड चैंबर में सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स की उप-स्थिति के कारण हो सकता है। किसी भी वेंट्रिकल जैसी संरचना से दूर जीएफपी-पॉजिटिव कोशिकाओं की कम संख्या एक अनिश्चित माइक्रोइंजेक्शन के कारण सेरेब्रल ऑर्गनॉइड (जैसे, न्यूरॉन्स) के भीतर पोस्टमाइटोटिक कोशिकाओं के इलेक्ट्रोपोरेशन के कारण होती है। इन उप-मानक यी इलेक्ट्रोपोरेशन को किसी भी और विश्लेषण से बाहर रखा जाना चाहिए।
सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स में मौजूद सेल प्रकारों की विश्वसनीय पहचान, अन्य बातों के अलावा, वेंट्रिकल जैसी संरचना के भीतर सेल की स्थिति पर आधारित है, जिसके लिए वीजेड और एसवीजेड / न्यूरॉन-समृद्ध क्षेत्र के बीच एक सीमा परिभाषा की आवश्यकता होती है। इस सीमा को रेडियल संगठन और वीजेड के उच्च सेल नाभिक घनत्व विशेषताओं द्वारा पहचाना जा सकता है (पूरक चित्रा एस 1 में डीएपीआई धुंधला देखें)। वीजेड / एसवीजेड सीमा की पुष्टि पैक्स 6 या एसओएक्स 2 जैसे तंत्रिका पूर्वज मार्करों के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग द्वारा की जा सकती है, जो लगभग सभी वीजेड कोशिकाओं (एपी) और कुछ एसवीजेड कोशिकाओं (बीपी) द्वारा व्यक्त की जाती हैं। न्यूरॉन-समृद्ध क्षेत्र की उपस्थिति को न्यूरोनल मार्करों जैसे कि वर्ग III β-ट्यूबुलिन (टीयूजे 1) या न्यून (पूरक चित्रा एस 1) के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग द्वारा मान्य किया जा सकता है।
इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद सेरेब्रल ऑर्गनॉइड कल्चर की अवधि जैविक प्रश्न और रुचि की कोशिका आबादी पर निर्भर करती है। हाल के एक अध्ययन में, यह प्रदर्शित किया गया था कि इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद आगे की संस्कृति की विभिन्न लंबाई चिंपांज़ी सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स में विभिन्न सेल आबादी को प्रभावित करती है, जो एपी से लेकर ऊपरी-परत न्यूरॉन्स24 तक होती है। यहां, हम इलेक्ट्रोपोरेटेड मार्मोसेट ऑर्गेनोइड्स के लिए समान परिणाम दिखाते हैं। विशेष रूप से, इलेक्ट्रोपोरेशन के 2 दिन बाद, जीएफपी-पॉजिटिव कोशिकाएं वीजेड में लगभग विशेष रूप से स्थानीयकृत होती हैं और पैक्स 6 के लिए भी सकारात्मक होती हैं - तंत्रिका पूर्वज कोशिकाओं के लिए एक मार्कर - यह दर्शाता है कि ये कोशिकाएं एपी या नवजात बीपी हैं (चित्रा 4 ए)। यदि इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद संस्कृति अवधि को 10 दिनों तक बढ़ाया जाता है, तो जीएफपी-पॉजिटिव कोशिकाओं को बेसल क्षेत्रों (यानी, एसवीजेड और न्यूरॉन-समृद्ध क्षेत्र) (चित्रा 4 बी, सी) में स्थानीयकृत किया जाता है। ये कोशिकाएं (जीएफपी सिग्नल के अलावा) पैक्स 6 (चित्रा 4 बी) के लिए भी सकारात्मक हो सकती हैं, जो बीपी, या न्यून (चित्रा 4 सी) का संकेत है, जो न्यूरॉन्स का संकेत है। इसी तरह के परिणाम मानव और रीसस मकाक इलेक्ट्रोपोरेटेड सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स के लिए प्राप्त किए जा सकते हैं। सारांश में, विभिन्न पूर्वज प्रकार, साथ ही न्यूरॉन्स, इस तकनीक द्वारा सफलतापूर्वक लक्षित किए जा सकते हैं।
लगभग सभी पहले दिखाए गए डेटा इलेक्ट्रोपोरेटेड सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स से उत्पन्न हिस्टोलॉजिकल वर्गों के इम्यूनोस्टेनिंग से प्राप्त किए गए थे। हालांकि, इन ऑर्गेनोइड्स का विश्लेषण करने का एक और सुरुचिपूर्ण तरीका ऑप्टिकल क्लियरिंग35,36 के बाद पूरे-माउंट इम्यूनोस्टेनिंग का प्रदर्शन करना है। यह जीएफपी-पॉजिटिव कोशिकाओं के 3 डी वितरण की छाप प्राप्त करने के लिए इलेक्ट्रोपोरेटेड सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स के 3 डी पुनर्निर्माण की अनुमति देगा। चित्रा 5 और वीडियो 1 ऑप्टिकल-क्लियर, इलेक्ट्रोपोरेटेड सेरेब्रल ऑर्गनॉइड में जीएफपी सिग्नल का एक प्रतिनिधि उदाहरण दिखाते हैं।
सारांश में, यहां वर्णित इलेक्ट्रोपोरेशन प्रोटोकॉल विभिन्न प्राइमेट आईपीएससी लाइनों से प्राप्त सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स के विभिन्न पूर्वज प्रकारों और न्यूरॉन्स में क्षणिक आनुवंशिक संशोधन (ओं) को पेश करने का एक सटीक और कुशल तरीका प्रदान करता है।
चित्रा 1: प्राइमेट सेरेब्रल ऑर्गनॉइड पीढ़ी का योजनाबद्ध अवलोकन और इलेक्ट्रोपोरेशन के लिए रूपात्मक "गो" और "नो-गो" मानदंड। (ए) प्राइमेट सेरेब्रल ऑर्गेनॉइड उत्पादन और इलेक्ट्रोपोरेशन की समयरेखा मानव और चिंपांज़ी (नीला), रीसस मकाक (बैंगनी), और मार्मोसेट (मैजेंटा) के लिए प्रोटोकॉल चरणों के विभिन्न समय पर प्रकाश डालती है। ध्यान दें कि समयरेखा का कालक्रम स्केल करने के लिए नहीं है। (बी) एक उपयुक्त (बाएं छवि, गो) और एक अनुपयुक्त (दाएं छवि, नो-गो) 32 डीपीएस मानव सेरेब्रल ऑर्गेनॉइड की ब्राइटफील्ड छवियां। तीर के निशान माइक्रोइंजेक्शन के लिए उपयुक्त वेंट्रिकल जैसी संरचनाओं के उदाहरणों को इंगित करते हैं। छवियों को 2.5x उद्देश्य के साथ Zeiss Axio Observer.Z1 उल्टे प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करके प्राप्त किया गया था। स्केल सलाखों = 500 μm. संक्षेप: बीडीएनएफ = मस्तिष्क-व्युत्पन्न न्यूरोट्रॉफिक कारक; डीपीएस = बीज बोने के बाद के दिन; एनटी 3 = न्यूरोट्रोफिन 3; आरए = रेटिनोइक एसिड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: सफलतापूर्वक इलेक्ट्रोपोरेटेड प्राइमेट सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स के उदाहरण। (ए) जीएफपी-व्यक्त प्लास्मिड के साथ इलेक्ट्रोपोरेशन के 15-48 घंटे बाद ब्राइटफील्ड (बाएं कॉलम), फ्लोरेसेंस (मध्य कॉलम), और 22 डीपीएस मानव, 32 डीपीएस चिंपांज़ी, 32 डीपीएस रीसस मकाक, और 31 डीपीएस मार्मोसेट सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स (ऊपर से नीचे तक) की मर्ज (दाएं कॉलम) छवियां। काले तीर के निशान व्यक्तिगत इलेक्ट्रोपोरेटेड वेंट्रिकल जैसी संरचनाओं के उदाहरणों को इंगित करते हैं। छवियों को 2.5x उद्देश्य के साथ Zeiss Axio Observer.Z1 उल्टे प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करके प्राप्त किया गया था। स्केल बार = 500 μm. (B) जीएफपी (ग्रीन) के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस 32 डीपीएस मानव, 34 डीपीएस चिंपांज़ी, 32 डीपीएस रीसस मकाक, और 32 डीपीएस मार्मोसेट सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स (ऊपर से नीचे तक) के डीएपीआई स्टेनिंग (सियान) के साथ संयुक्त जीएफपी-व्यक्त प्लास्मिड के साथ इलेक्ट्रोपोरेशन के 2-4 दिन बाद। हल्के भूरे रंग के तीर के निशान वेंट्रिकल जैसी संरचनाओं के भीतर इलेक्ट्रोपोरेटेड क्षेत्रों की सीमाओं को इंगित करते हैं। छवियों को 10x उद्देश्य के साथ Zeiss LSM 800 कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके प्राप्त किया गया था। स्केल सलाखों = 150 μm. संक्षेप: DAPI = 4',6-डायमिडिनो-2-फेनिलिडोल; डीपीएस = बीज बोने के बाद के दिन; जीएफपी = हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: असफल इलेक्ट्रोपोरेटेड प्राइमेट सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स के उदाहरण। जीएफपी (बी) के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस को जीएफपी-व्यक्त करने वाले प्लास्मिड के साथ इलेक्ट्रोपोरेशन के 4 दिन बाद (ए) 34 डीपीएस रीसस मकाक सेरेब्रल ऑर्गेनॉइड के डीएपीआई स्टेनिंग (सियान) के साथ जोड़ा जाता है और (बी) जीएफपी-व्यक्त करने वाले प्लास्मिड के साथ इलेक्ट्रोपोरेशन के 2 दिन बाद 32 डीपीएस रीसस मकाक सेरेब्रल ऑर्गनॉइड होता है। हल्के भूरे रंग के तीर के निशान इलेक्ट्रोपोरेटेड कोशिकाओं को इंगित करते हैं। लाइट ग्रे डैश्ड आउटलाइन इलेक्ट्रोपोरेटेड कोशिकाओं से सटे वेंट्रिकल जैसी संरचना के वीजेड और एसवीजेड / न्यूरॉन-समृद्ध क्षेत्र के बीच की सीमा को इंगित करती है। छवियों को 10x उद्देश्य के साथ Zeiss LSM 800 कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके प्राप्त किया गया था। स्केल सलाखों = 150 μm. संक्षेप: DAPI = 4',6-डायमिडिनो-2-फेनिलिडोल; डीपीएस = बीज बोने के बाद के दिन; जीएफपी = हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन; एसवीजेड = सबवेंट्रिकुलर जोन; वीजेड = वेंट्रिकुलर जोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 4: इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद प्राइमेट सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स में मौजूद विभिन्न सेल आबादी का विज़ुअलाइज़ेशन। (A-C) जीएफपी (ग्रीन) और या तो पैक्स 6 (ए, बी; मैजेंटा) या न्यून (सी; मैजेंटा) के लिए डबल इम्यूनोफ्लोरेसेंस, सभी मामलों में डीएपीआई स्टेनिंग (सियान) के साथ संयुक्त, जीएफपी-व्यक्त करने वाले प्लास्मिड के साथ इलेक्ट्रोपोरेशन के 2 दिन बाद (ए) 32 डीपीएस मार्मोसेट सेरेब्रल ऑर्गनॉइड और जीएफपी-व्यक्त प्लास्मिड के साथ इलेक्ट्रोपोरेशन के 10 दिन बाद (बी, सी) 40 डीपीएस मार्मोसेट सेरेब्रल ऑर्गनॉइड का उपयोग किया जाता है। लाइट-ग्रे एरोहेड (ए, बी) जीएफपी + और पैक्स 6 + या (सी) न्यून + डबल-पॉजिटिव कोशिकाओं को इंगित करते हैं। हल्के-भूरे रंग की धराशायी रेखाएं वीजेड और एसवीजेड / न्यूरॉन-समृद्ध क्षेत्र के बीच की सीमा को इंगित करती हैं। छवियों को 20x उद्देश्य के साथ Zeiss LSM 800 कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके प्राप्त किया गया था। स्केल सलाखों = 100 μm. संक्षेप: DAPI = 4',6-डायमिडिनो-2-फेनिलिडोल; डीपीएस = बीज बोने के बाद के दिन; जीएफपी = हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन; न्यून = न्यूरोनल नाभिक प्रोटीन; पैक्स 6 = युग्मित बॉक्स 6 प्रोटीन; एसवीजेड = सबवेंट्रिकुलर जोन; वीजेड = वेंट्रिकुलर जोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 5: ऑप्टिकल समाशोधन के बाद इलेक्ट्रोपोरेटेड प्राइमेट सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स के 3 डी कॉन्फोकल इमेजिंग द्वारा इलेक्ट्रोपोरेटेड छवियों का त्रि-आयामी पुनर्निर्माण। जीएफपी-व्यक्त प्लास्मिड के साथ इलेक्ट्रोपोरेशन के 2 दिन बाद 3 डी पुनर्निर्मित इलेक्ट्रोपोरेटेड 32 डीपीएस मानव सेरेब्रल ऑर्गनॉइड के फ्रंटल (बाएं छवि), 45 डिग्री घुमाया (मध्य छवि), और 90 डिग्री घुमाया (दाएं छवि) दृश्य। इमेजिंग से पहले, ऑर्गेनॉइड को 2ईसीआई विधि35 के आधार पर ऑप्टिकल रूप से साफ किया गया था। पूरे इलेक्ट्रोपोरेटेड ऑर्गेनॉइड का एक 3 डी पुनर्निर्माण 269 ऑप्टिकल वर्गों (1-μM मोटाई प्रत्येक) से उत्पन्न किया गया था जो 10x उद्देश्य के साथ Zeiss LSM 800 कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके एक दूसरे से 3.73 μm अलग हैं। छवियों को फिजी का उपयोग करके 3 डी पुनर्निर्माण के लिए संसाधित किया गया था। ध्यान दें कि चित्र वीडियो 1 में दिखाए गए उसी 3 डी-पुनर्निर्मित ऑर्गेनॉइड से लिए गए थे। स्केल बार = 500 μm। संक्षिप्त नाम: जीएफपी = हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
वीडियो 1: ऑप्टिकल समाशोधन के बाद एक 3 डी-पुनर्निर्मित इलेक्ट्रोपोरेटेड मानव सेरेब्रल ऑर्गनॉइड। जीएफपी-व्यक्त प्लास्मिड के साथ इलेक्ट्रोपोरेशन के 2 दिन बाद 3 डी-पुनर्निर्मित इलेक्ट्रोपोरेटेड 32 डीपीएस मानव सेरेब्रल ऑर्गनॉइड का वीडियो। इमेजिंग से पहले, ऑर्गेनॉइड को 2ईसीआई विधि35 के आधार पर ऑप्टिकल रूप से साफ किया गया था। पूरे इलेक्ट्रोपोरेटेड ऑर्गेनॉइड का एक 3 डी पुनर्निर्माण 269 ऑप्टिकल वर्गों (1-μM मोटाई प्रत्येक) से उत्पन्न किया गया था जो 10x उद्देश्य के साथ Zeiss LSM 800 कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके एक दूसरे से 3.73 μm अलग हैं। छवियों को फिजी का उपयोग करके 3 डी पुनर्निर्माण के लिए संसाधित किया गया था। ध्यान दें कि वीडियो चित्र 5 में दिखाए गए उसी 3 डी-पुनर्निर्मित ऑर्गेनॉइड से लिया गया था। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।
| आईपीएससी लाइन | प्रजातियां | प्रकाशन | संस्कृति माध्यम रचना | संस्कृति की स्थिति | ||||
| iLonza2.2 | मानवता | स्टास्के एट अल, 2020 | 1 μM IWR1 और 0.5 μM CHIR में StemMACS iPS-Brew XF | 5%CO2 और 95% हवा, 37 °C का आर्द्र वातावरण | ||||
| सैंड्रा | Pan troglodytes | मोरा-बर्मुडेज़ एट अल। | mTeSR1 | 5%CO2 और 95% हवा, 37 °C का आर्द्र वातावरण | ||||
| iRh33.1 | Macaca mulatta | स्टास्के एट अल, 2020 | 1 μM IWR1 और 0.5 μM CHIR में StemMACS iPS-Brew XF | 5%CO2 और 95% हवा, 37 °C का आर्द्र वातावरण | ||||
| cj_160419_5 | कैलिथ्रेक्स जैककस | पेटकोव एट अल, 2020। | 3 μM IWR1, 0.3 μM CGP77675, 0.3 μM AZD77675, 0.5 μM CHIR99021, 10 μM Forskolin, 1 ng/mL Activin A, 1 μM OAC1 in StemMACS iPS-Brew XF | 5%CO2, 5% O2, और 90% N2, 37 °C का ह्यूमीफाइड वातावरण | ||||
तालिका 1: इस प्रकाशन में उपयोग किए जाने वाले प्राइमेट आईपीएससी के लिए संस्कृति की स्थिति। संक्षिप्त नाम: आईपीएससी = प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल।
| मध्यम | संयोजन | ||
| तंत्रिका प्रेरण माध्यम | 1x N-2 पूरक, 1x ग्लूटामाइन विकल्प पूरक, 1x MEM गैर-आवश्यक अमीनो एसिड समाधान, 1 μg / mL हेपरिन में डलबेकको के संशोधित ईगल मीडियम F12 (DMEM / F12) | ||
| विटामिन ए के बिना भेदभाव माध्यम (डीएम) | 0.5x B-27 पूरक (माइनस विटामिन ए), 0.5x N-2 पूरक, 0.5x MEM गैर-आवश्यक अमीनो एसिड समाधान, 1x ग्लूटामाइन विकल्प पूरक, 100 U/mL पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन, 0.00035% 2-मर्कैप्टोइथेनॉल, 1:1 DMEM/F12 और न्यूरोबेसल माध्यम में 2.875 ng/mL इंसुलिन | ||
| विटामिन ए के साथ भेदभाव माध्यम (डीएम) | 0.5x B-27 पूरक, 0.5x N-2 पूरक, 0.5x MEM गैर-आवश्यक अमीनो एसिड समाधान, 1x ग्लूटामाइन विकल्प पूरक, 100 U/mL पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन, 0.00035% 2-मर्कैप्टोइथेनॉल, 1:1 DMEM/F12 और न्यूरोबेसल माध्यम में 2.875 ng/mL इंसुलिन | ||
तालिका 2: प्राइमेट सेरेब्रल ऑर्गनॉइड पीढ़ी और संस्कृति के लिए उपयोग किए जाने वाले मीडिया की संरचना।
| घटक | इलेक्ट्रोपोरेशन मिश्रण को नियंत्रित करें | जीओआई इलेक्ट्रोपोरेशन मिश्रण। |
| जीएफपी अभिव्यक्ति प्लास्मिड | 500 ng/μL | 500 ng/μL |
| खाली वेक्टर | 500 ng/μL | - |
| जीओआई अभिव्यक्ति प्लास्मिड। | - | 500 ng/μL |
| तेजी से हरा | 0.10% | 0.10% |
| डीपीबीएस में। |
तालिका 3: नियंत्रण और रुचि के जीन के लिए इलेक्ट्रोपोरेशन मिक्स (अलग प्लास्मिड दृष्टिकोण) की संरचना। संक्षिप्त नाम: जीओआई = रुचि का जीन।
| रोग-प्रतिकारक | कंपनी | कैटलॉग संख्या | आरआरआईडी | तनूकरण |
| चिकन विरोधी जीएफपी | Aves Labs | जीएफपी -1020 | आरआरआईडी: AB_10000240 | 1:300 |
| खरगोश विरोधी PAX6 | नोवस बायोलॉजिकल्स | NBP1-89100 | आरआरआईडी: AB_11013575 | 1:300 |
| खरगोश विरोधी NeuN | ABCAM | ab104225 | आरआरआईडी: AB_10711153 | 1:300 |
| बकरी एंटी चिकन एलेक्सा फ्लोर 488 | थर्मो फिशर | A-11039 | आरआरआईडी: AB_142924 | 1:500 |
| गधा विरोधी खरगोश एलेक्सा फ्लुर 555 | थर्मो फिशर | A-31572 | आरआरआईडी: AB_162543 | 1:500 |
तालिका 4: इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला करने के लिए उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी।
पूरक चित्रा एस 1: इलेक्ट्रोपोरेटेड प्राइमेट सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स में वीजेड / एसवीजेड सीमा निर्धारण। जीएफपी-व्यक्त प्लास्मिड के साथ इलेक्ट्रोपोरेशन के 2 दिन बाद पैक्स 6 (मैजेंटा) और टीयूजे 1 (पीला) के लिए डबल इम्यूनोफ्लोरेसेंस 32 डीपीएस मार्मोसेट सेरेब्रल ऑर्गनॉइड के डीएपीआई स्टेनिंग (सियान) के साथ संयुक्त होता है। जीएफपी के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस नहीं दिखाया गया है। हल्के-भूरे रंग की धराशायी रेखाएं वीजेड और एसवीजेड / न्यूरॉन-समृद्ध क्षेत्र के बीच की सीमा को इंगित करती हैं। छवियों को 20x उद्देश्य के साथ Zeiss LSM 800 कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके प्राप्त किया गया था। स्केल बार = 100 μm। संक्षेप: DAPI = 4',6-डायमिडिनो-2-फेनिलिडोल; डीपीएस = बीज बोने के बाद के दिन; पैक्स 6 = युग्मित बॉक्स 6 प्रोटीन; एसवीजेड = सबवेंट्रिकुलर जोन; टीयूजे 1 = वर्ग III β-ट्यूबुलिन; वीजेड = वेंट्रिकुलर जोन। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
पूरक फ़ाइल 1: पेट्री डिश इलेक्ट्रोपोरेशन चैंबर असेंबली निर्देश। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
यहां वर्णित प्रक्रियाएं एक लक्षित इलेक्ट्रोपोरेशन दृष्टिकोण के साथ विभिन्न प्राइमेट प्रजातियों से सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स की पीढ़ी के लिए एक एकीकृत प्रोटोकॉल का प्रतिनिधित्व करती हैं। यह एक मॉडल प्रणाली में जीओआई की अस्थानिक अभिव्यक्ति की अनुमति देता है जो प्राइमेट (मानव सहित) (पैथो) शारीरिक नियोकॉर्टेक्स विकास का अनुकरण करता है। प्राइमेट सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स की पीढ़ी के लिए यह एकीकृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत सभी चार प्राइमेट प्रजातियों के लिए समान सामग्री (जैसे, मीडिया) और प्रोटोकॉल चरणों का उपयोग करता है। इन प्रजातियों के बीच विकासात्मक अंतर को महत्वपूर्ण प्रोटोकॉल चरणों के समय को बदलकर संबोधित किया जाता है (यानी, तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में तंत्रिका प्रेरण और एम्बेडिंग; ऊपर देखें)। यह मोटे तौर पर इन प्रजातियों के बीच विवो न्यूरोडेवलपमेंटल समय अंतर को प्रतिबिंबित कर सकता है और आगे के अध्ययन के लिए एक दिलचस्प विषय का गठन करता है।
यह दृष्टिकोण सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स10 पर पिछले पेपर में वर्णित इलेक्ट्रोपोरेशन प्रयोगों पर आधारित है। हालांकि, ये प्रयोग, जैसा कि लैंकेस्टर और सहयोगियों द्वारा उल्लेख किया गया है, एपोप्टोसिस की व्यापक डिग्री तक सीमित थे, जो एक उच्च जीएफपी एकाग्रता के कारण हुआ और एक मजबूत जीएफपी सिग्नल10 का प्रदर्शन करने वाली इलेक्ट्रोपोरेटेड कोशिकाओं के बहिष्करण का कारण बना। हमारे प्रयोगों में, हमने पाया कि 1,000 एनजी / μL की अंतिम कुल प्लास्मिड एकाग्रता (जैसे, ईजीएफपी-एन्कोडिंग प्लास्मिड एकाग्रता प्लस जीओआई-एन्कोडिंग प्लास्मिड एकाग्रता) इष्टतम थी। 1,000 ng / μL से कम सांद्रता से इलेक्ट्रोपोरेशन दक्षता कम हो जाती है, जबकि 1,000 ng / μL से ऊपर उच्च सांद्रता इलेक्ट्रोपोरेटेड कोशिकाओं के लिए विषाक्त हो सकती है और कोशिका मृत्युका कारण बन सकती है। दो से अधिक अलग-अलग अभिव्यक्ति प्लास्मिड के संयोजन केअध्ययन संभव हैं। हालांकि, अंतिम कुल प्लास्मिड एकाग्रता 1,000 एनजी / μL पर रखी जानी चाहिए।
एक विशिष्ट इलेक्ट्रोपोरेशन दृष्टिकोण में, सफलतापूर्वक इलेक्ट्रोपोरेटेड कोशिकाओं की पहचान करने के लिए एक फ्लोरेसेंस मार्कर को एन्कोडिंग करने वाले प्लास्मिड की आवश्यकता होती है। प्रयोगात्मक सेटअप में प्रतिदीप्ति मार्कर को शामिल करने के लिए दो संभावनाएं हैं: (i) दो अलग-अलग प्लास्मिड (यानी, मार्कर के लिए एक प्लास्मिड एन्कोडिंग और एक नियंत्रण प्लास्मिड [जैसे, खाली वेक्टर] या एक प्लास्मिड एन्कोडिंग जीन ऑफ इंटरेस्ट [जीओआई]) ( अलग प्लास्मिड दृष्टिकोण); (ii) एक प्लास्मिड इंजेक्ट करके जो आंतरिक राइबोसोम एंट्री साइट (आईआरईएस) या 2 ए सेल्फ-क्लीविंग पेप्टाइड (जैसे, पी 2 ए) ( एकल प्लास्मिड दृष्टिकोण) का उपयोग करके मार्कर और जीओआई दोनों के लिए एन्कोड करता है। इस मामले में, एक प्लास्मिड एन्कोडिंग केवल प्रतिदीप्ति मार्कर का उपयोग नियंत्रण के रूप में किया जाता है। जबकि एकल प्लास्मिड दृष्टिकोण के परिणामस्वरूप प्रतिदीप्ति मार्कर और जीओआई की पूर्ण सह-अभिव्यक्ति होती है, ऐसे प्लास्मिड आकार में बड़े होते हैं, जिसके परिणामस्वरूप कम इलेक्ट्रोपोरेशन दक्षता होती है। यदि एक उच्च इलेक्ट्रोपोरेशन दक्षता की आवश्यकता होती है, तो अलग-अलग प्लास्मिड दृष्टिकोण का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है, क्योंकि अलग अभिव्यक्ति उच्च इलेक्ट्रोपोरेशनदक्षता बनाए रखते हुए फ्लोरेसेंस मार्कर और जीओआई की सह-अभिव्यक्ति के स्तर को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित नहीं करती है। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल में, हम अलग प्लास्मिड दृष्टिकोण का उपयोग करके इलेक्ट्रोपोरेशन का वर्णन करते हैं। यदि एकल प्लास्मिड दृष्टिकोण लागू किया जाता है, तो प्रोटोकॉल में चरणों को तदनुसार समायोजित किया जाना चाहिए।
हाल ही में प्रकाशित प्रोटोकॉल37 की तुलना में, हमारे दृष्टिकोण के तीन मुख्य फायदे हैं। सबसे पहले, हम विशेष रूप से सेरेब्रल ऑर्गेनॉइड की वेंट्रिकल जैसी संरचनाओं को लक्षित करते हैं। हम इसे प्राप्त करते हैं: (i) ऑर्गेनॉइड 37 के केंद्र में इंजेक्ट करने के बजाय सेरेब्रल ऑर्गनॉइड की अलग-अलग वेंट्रिकल जैसी संरचनाओं को माइक्रोइंजेक्ट करके और (ii) इलेक्ट्रोपोरेशन क्यूवेट37 का उपयोग करने के बजाय विद्युत क्षेत्र की दिशा को अनुकूलित करने के लिए पेट्री डिश इलेक्ट्रोड चैंबर में सेरेब्रल ऑर्गनॉइड के अभिविन्यास की व्यवस्था करके (ऊपर देखें)।. दूसरा, इस प्रोटोकॉल में एक महंगे न्यूक्लियोफेक्टर समाधान का उपयोग शामिल नहीं है, क्योंकि यह दृष्टिकोण पेट्री डिश इलेक्ट्रोड चैंबर के साथ संयोजन में एक वर्ग तरंग इलेक्ट्रोपोरेटर का उपयोग करता है। तीसरा, प्राइमेट सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स की पीढ़ी के लिए यह एकीकृत प्रोटोकॉल न केवल मानव बल्कि गैर-मानव प्राइमेट ऑर्गेनोइड्स के अध्ययन की अनुमति देता है, जो विकासवादी, तुलनात्मक और रोग अध्ययन की अनुमति देता है।
सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स से संबंधित दो विशेषताएं एक सफल इलेक्ट्रोपोरेशन के लिए महत्वपूर्ण हैं- सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स की गुणवत्ता और वेंट्रिकल जैसी संरचनाओं का आकार और गुणवत्ता (प्रतिनिधि परिणाम और चित्रा 1 बी देखें)। पहली विशेषता के बारे में, हम इलेक्ट्रोपोरेशन के साथ आगे बढ़ने के लिए गो और नो-गो मानदंड (ऊपर और चित्रा 1 बी देखें) प्रस्तुत करते हैं। मुख्य मानदंड स्पष्ट रूप से दिखाई देने वाले, पारभासी और रेडियल रूप से संगठित वेंट्रिकल जैसी संरचनाओं की उपस्थिति है। वेंट्रिकल जैसी संरचनाओं का आकार सफल माइक्रोइंजेक्शन और इलेक्ट्रोपोरेशन के लिए दूसरी महत्वपूर्ण विशेषता है। वेंट्रिकल जैसी संरचनाएं जो बहुत छोटी होती हैं, उन्हें इंजेक्ट करना मुश्किल होता है और आम तौर पर बाद के विश्लेषणों के लिए पर्याप्त रूप से उच्च संख्या में इलेक्ट्रोपोरेटेड कोशिकाएं नहीं होती हैं। यह मुख्य कारण है कि हमने एक संशोधित सेरेब्रल ऑर्गनॉइड प्रोटोकॉल का उपयोग किया, क्योंकि यह प्रोटोकॉल, हमारे हाथों में और इन आईपीएससी लाइनों के लिए, अन्य प्रोटोकॉल की तुलना में, अच्छी तरह से संगठित वेंट्रिकल जैसी संरचनाएं जो इलेक्ट्रोपोरेट होने के लिए पर्याप्त रूप से बड़ी हैं। सिद्धांत रूप में, यहां प्रस्तुत इलेक्ट्रोपोरेशन दृष्टिकोण को किसी भी अन्य तंत्रिका ऑर्गनॉइड प्रोटोकॉल पर लागू किया जा सकता है जब तक कि उत्तरार्द्ध पर्याप्त रूप से बड़े और संगठित वेंट्रिकल जैसी संरचनाओं का उत्पादन करता है (प्रतिनिधि परिणाम और चित्रा 1 बी देखें)। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल को भविष्य में अन्य प्राइमेट्स पर भी लागू किया जा सकता है जैसे कि केकड़ा खाने वाले मकाक (मकाका फासिकुलरिस), औद्योगिक अनुसंधान में उपयोग किए जाने वाले शास्त्रीय प्राइमेट मॉडल। इसके लिए या तो यहां वर्णित संशोधित सेरेब्रल ऑर्गनॉइड प्रोटोकॉल के सही महत्वपूर्ण समय बिंदुओं (ऊपर देखें) की पहचान या एक तंत्रिका ऑर्गेनॉइड प्रोटोकॉल की स्थापना की आवश्यकता होगी जो उपयुक्त बड़े वेंट्रिकल जैसी संरचनाओं को जन्म देता है (ऊपर देखें)।
सफल इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद, सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स को अलग-अलग समय के लिए सुसंस्कृत किया जा सकता है ताकि विकासशील सेरेब्रल ऑर्गेनॉइड के भीतर विभिन्न सेल आबादी को प्रभावित करने के लिए परीक्षा के तहत आनुवंशिक संशोधन की अनुमति मिल सके। ये विभिन्न तंत्रिका पूर्वज आबादी से लेकर सेरेब्रल ऑर्गनॉइड में मौजूद विभिन्न प्रकार के न्यूरॉन्स तक हैं (प्रतिनिधि परिणाम और फिशर एट अल 28 देखें)। इन सेल आबादी का विश्लेषण या तो क्रायोसेक्शनिंग और इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग (चित्रा 4 देखें) या पीएफए-फिक्स्ड इलेक्ट्रोपोरेटेड सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स के पूरे-माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग और ऑप्टिकल क्लियरिंग ( चित्रा 5 और वीडियो 1 देखें) द्वारा किया जा सकता है।
अब तक, मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स के इलेक्ट्रोपोरेशन का उपयोग मुख्य रूप से जीन फ़ंक्शन अध्ययन 10,28,38,39, लाइव इमेजिंग 10,39,40, सेल आकृति विज्ञान 40 के विज़ुअलाइज़ेशन और सेल डिवीजन ट्रेसिंग 10 करने के लिए जीन की अस्थानिक अभिव्यक्ति के लिए किया गया है।. हालांकि, पहले सेरेब्रल ऑर्गनॉइड पेपर में, आरएनए हस्तक्षेप द्वारा जीन अभिव्यक्ति को शांत करने के लिए इलेक्ट्रोपोरेशन द्वारा ऑर्गनोइड्स में एसएचआरएनए को पेश किया गया था। इसने इलेक्ट्रोपोरेशन की क्षमता को न केवल जीन की अस्थानिक अभिव्यक्ति के लिए बल्कि केडी या यहां तक कि जीन के केओ के लिए भी इस्तेमाल किया जा सकता है। हाल ही में, यह दिखाया गया था कि CRISPR / Cas9-मध्यस्थता KOs माउस भ्रूण27 के गर्भाशय इलेक्ट्रोपोरेशन और भ्रूण के मानव ऊतक के इलेक्ट्रोपोरेशन द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। इस तरह के CRISPR / Cas9-आधारित KOs को आसानी से सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स के इलेक्ट्रोपोरेशन पर लागू किया जा सकता है, क्योंकि इलेक्ट्रोपोरेशन का प्रमुख तंत्र समान है, और यह इस दृष्टिकोण की उपयोगिता का विस्तार करेगा।
सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स में इलेक्ट्रोपोरेशन का एक संभावित आगे का अनुप्रयोग उन मामलों में विशिष्ट केओ फेनोटाइप ्स का बचाव है जिनमें जीओआई और उसके पैतृक संस्करणों के बीच अत्यधिक समान अनुक्रमों के कारण जीओआई का एक विशिष्ट केओ प्राप्त करना संभव नहीं है। यह विशेष रूप से हाल ही में विकसित मानव-विशिष्ट जीन के लिए मामला है। ऐसे मामलों में, एक विशिष्ट केओ प्राप्त करना संभव नहीं है (यहां तक कि CRISPR / Cas9-तकनीक के उपयोग के साथ) (जैसा कि ARHGAP11A और ARHGAP11B 28 के लिए मामला था)। इस दुविधा का समाधान यह है कि भारत सरकार और उसके पैतृक जीन का एक डबल केओ उत्पन्न किया जाए और अकेले जीओआई को बचाया जाए, अकेले पैतृक जीन, या दोनों जीन ों को इलेक्ट्रोपोरेशन द्वारा एक साथ। इन इलेक्ट्रोपोरेटेड ऑर्गेनोइड्स को क्रमशः एक चयनात्मक पैतृक जीन केओ, एक चयनात्मक जीओआई केओ, या एक नियंत्रण के रूप में माना जा सकता है। यह फेनोटाइप के लिए इन जीनों के व्यक्तिगत योगदान को संबोधित करने की अनुमति देगा (देखें, उदाहरण के लिए, फिशर एट अल।28)। एक अन्य संभावित अनुप्रयोग रोगी-व्युत्पन्न आईपीएससी से उत्पन्न सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स के विश्लेषण से संबंधित है। ऐसे मामलों में, यह स्पष्ट नहीं है कि देखा गया फेनोटाइप उम्मीदवार जीन में उत्परिवर्तन के कारण है या रोगी में मौजूद किसी अन्य उत्परिवर्तन के कारण है। यहां, उम्मीदवार जीन का इलेक्ट्रोपोरेशन और फेनोटाइप का (संभावित) बचाव रोग में इस जीन की भूमिका को मान्य करने की अनुमति देगा (देखें, उदाहरण के लिए, लैंकेस्टर एट अल।10)।
एक साथ लिया गया, यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल प्राइमेट सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स के वेंट्रिकल जैसी संरचनाओं के भीतर आनुवंशिक रूप से सेल आबादी को संशोधित करने के लिए एक तेज और लागत कुशल दृष्टिकोण प्रदान करता है। यह न्यूरोडेवलपमेंटल और विकासवादी प्रक्रियाओं के अध्ययन के लिए एक प्रभावी उपकरण प्रदान करता है जिसे रोग मॉडलिंग के लिए भी लागू किया जा सकता है।
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Disclosures
लेखक ों ने घोषणा की है कि उनके पास हितों का कोई टकराव नहीं है।
Acknowledgments
हम उन सभी शोधकर्ताओं से माफी मांगते हैं जिनके काम को अंतरिक्ष सीमाओं के कारण उद्धृत नहीं किया जा सका। हम पेट्री डिश इलेक्ट्रोड कक्षों के निर्माण के लिए डीपीजेड में तकनीकी सेवाओं के उलरिच ब्लेयर और एमपीआई-सीबीजी में कार्यशाला के हार्टमुट वुल्फ को धन्यवाद देते हैं; स्टोयन पेटकोव और रुडिगर बेहर मानव (iLonza2.2), रीसस मकाक (iRh33.1) और मार्मोसेट (cj_160419_5) आईपीएससी प्रदान करने के लिए; क्रायोसेक्शनिंग और इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग के लिए सबरीना हेइड; और पांडुलिपि को आलोचनात्मक रूप से पढ़ने के लिए नेरिंगा लियुटिकेटे और सेसर माटेओ बस्तीदास बेटनकोर्ट। W.B.H. की प्रयोगशाला में काम एक ERA-NET न्यूरॉन (माइक्रोकिन) अनुदान द्वारा समर्थित था। एमएच की प्रयोगशाला में काम एक ईआरसी प्रारंभिक अनुदान (101039421) द्वारा समर्थित था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20 µL Microloader | Eppendorf | 5242956003 | |
| 2-Mercaptoethanol | Merck | 8.05740.0005 | |
| 35 mm cell culture dishes | Sarstedt | 83.3900 | |
| 60 mm cell culture dishes | CytoOne | CC7682-3359 | |
| Activin A | Sigma-Aldrich | SRP3003 | |
| AOC1 | Selleckchem | S7217 | |
| Axio Observer.Z1 Inverted Fluorescence Microscope | Zeiss | replacable by comparable fluorescent microscopes | |
| AZD0530 | Selleckchem | S1006 | |
| B-27 Supplement with Vitamin A (retinoic acid, RA) (50x) | Gibco | 17504-044 | |
| B-27 Supplement without Vitamin A (50x) | Gibco | 12587-010 | |
| BTX ECM 830 Square Wave Electroporation System | BTX | 45-2052 | |
| CGP77675 | Sigma-Aldrich | SML0314 | |
| Chimpanzee induced pluripotent stem cell line Sandra A | doi: 10.7554/elife.18683 | ||
| Common marmoset induced pluripotent stem cell line cj_160419_5 | doi: 10.3390/cells9112422 | ||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Gibco | 11320-033 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190-094 | pH 7.0−7.3; warm to room temperature before use |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| Forskolin | Selleckchem | 2449 | |
| GlutaMAX Supplement (100x) | Gibco | 35050-061 | glutamine substitute supplement |
| Heparin (1 mg/mL stock) | Sigma-Aldrich | H3149 | |
| Human induced pluripotent stem cell line iLonza2.2 | doi: 10.3390/cells9061349 | ||
| Human Neurotrophin-3 (NT-3) | PeproTech | 450-03 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | 19278 | |
| IWR1 | Sigma-Aldrich | I0161 | |
| Leica MS5 stereomicroscope (MDG 17 transmitted-light base) | Leica | 10473849 | replacable by comparable stereomicroscopes |
| Matrigel | Corning | 354277/354234 | basement membrane matrix; alternatively, Geltrex (ThermoFisher Scientific, A1413302) can be used |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Sigma-Aldrich | M7145 | |
| N-2 Supplement (100x) | Gibco | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 818715 | handle with causion due to cancerogenecity |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL) | PanBiotech | P06-07100 | |
| Petri dish electrode chamber | self-produced (see Supplemental File 1) | also commertially available | |
| Pre-Pulled Glass Pipettes | WPI | TIP10LT | borosilicate glass pipettes with long taper, 10 µm tip diameter |
| Pro-Survival Compound | MerckMillipore | 529659 | |
| Recombinant Human/Murine/RatBrain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) | PeproTech | AF-450-02 | |
| Rhesus macaque induced pluripotent stem cell line iRh33.1 | doi: 10.3390/cells9061349 | ||
| StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyi Biotech | 130-104-368 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | proteolytic and collagenolytic enzyme mixture |
| TrypLE | Gibco | 12604-013 | recombinant trypsin substitute; warm to room temperature before use |
| Ultra-Low Attachment 96-well plates | Costar | 7007 | |
| Y27632 | Stemcell Technologies | 72305 |
References
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