Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Riktad mikroinjektion och elektroporering av primatcerebrala organoider för genetisk modifiering

Published: March 24, 2023 doi: 10.3791/65176
Automatic Translation
1, 1, 2, 1,2
1German Primate Center, Leibniz Institute for Primate Research, 2Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics

Summary

Elektroporering av primatcerebrala organoider ger ett exakt och effektivt tillvägagångssätt för att introducera övergående genetisk modifiering (er) i olika stamtyper och neuroner i ett modellsystem nära primat (pato) fysiologisk neocortexutveckling. Detta möjliggör studier av neurodevelopmental och evolutionära processer och kan också tillämpas för sjukdomsmodellering.

Abstract

Hjärnbarken är den yttersta hjärnstrukturen och ansvarar för behandlingen av sensorisk inmatning och motorutgång; Det ses som säte för högre ordningens kognitiva förmågor hos däggdjur, i synnerhet primater. Att studera genfunktioner i primathjärnor är utmanande på grund av tekniska och etiska skäl, men etableringen av hjärnorganoidtekniken har möjliggjort studier av hjärnans utveckling i traditionella primatmodeller (t.ex. rhesusmakak och vanlig marmoset), liksom i tidigare experimentellt otillgängliga primatarter (t.ex. stora apor), i ett etiskt motiverat och mindre tekniskt krävande system. Dessutom tillåter mänskliga hjärnorganoider avancerad undersökning av neurodevelopmental och neurologiska störningar.

Eftersom hjärnorganoider rekapitulerar många processer av hjärnans utveckling, representerar de också ett kraftfullt verktyg för att identifiera skillnader i och att funktionellt jämföra de genetiska determinanterna som ligger till grund för hjärnans utveckling av olika arter i ett evolutionärt sammanhang. En stor fördel med att använda organoider är möjligheten att införa genetiska modifieringar, vilket möjliggör testning av genfunktioner. Införandet av sådana modifieringar är dock mödosamt och dyrt. Detta dokument beskriver ett snabbt och kostnadseffektivt tillvägagångssätt för att genetiskt modifiera cellpopulationer inom de ventrikelliknande strukturerna hos primatcerebrala organoider, en subtyp av hjärnorganoider. Denna metod kombinerar ett modifierat protokoll för tillförlitlig generering av cerebrala organoider från humana, schimpans-, rhesusmakak- och vanliga marmoset-härledda inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) med en mikroinjektions- och elektroporeringsmetod. Detta ger ett effektivt verktyg för studier av utvecklingsneurologiska och evolutionära processer som också kan tillämpas för sjukdomsmodellering.

Introduction

Att undersöka den (pato)fysiologiska utvecklingen och evolutionen av hjärnbarken är en formidabel uppgift som försvåras av bristen på lämpliga modellsystem. Tidigare var sådana studier begränsade till tvådimensionella cellodlingsmodeller (såsom primära neurala stamceller eller neuronala cellkulturer) och evolutionärt avlägsna djurmodeller (såsom gnagare)1,2. Även om dessa modeller är användbara för att ta itu med vissa frågor, är de begränsade när det gäller att modellera komplexiteten, celltypskompositionen, cellulär arkitektur och genuttrycksmönster hos den utvecklande mänskliga neocortexen i friska och sjuka tillstånd. Dessa begränsningar leder till exempel till dålig översättningsbarhet av musmodeller av mänskliga sjukdomar till den mänskliga situationen, som beskrivs för vissa fall av mikrocefali (t.ex. Zhang et al.3). Nyligen har transgena icke-mänskliga primater, som är en evolutionärt, funktionellt och morfologiskt närmare modell av mänsklig neocortexutveckling, kommit i fokus 4,5,6,7,8 eftersom de övervinner många begränsningar av cellodlings- och gnagarbaserade modeller. Användningen av icke-mänskliga primater i forskning är dock inte bara mycket dyr och tidskrävande utan ger också upphov till etiska betänkligheter. På senare tid har utvecklingen av hjärnorganoidteknik9,10 framstått som ett lovande alternativ som löser många av begränsningarna i tidigare modeller 11,12,13,14,15,16.

Hjärnorganoider är tredimensionella (3D), multicellulära strukturer som efterliknar huvuddragen i cytoarkitekturen och celltypsammansättningen i en eller flera hjärnregioner för ett definierat utvecklingstidsfönster 11,12,13,14,17. Dessa 3D-strukturer genereras antingen från inducerade pluripotenta stamceller (iPSC) eller, om sådana finns tillgängliga för arten av intresse, från embryonala stamceller (ESC). I allmänhet kan två typer av hjärnorganoider särskiljas baserat på den använda metoden: ostyrda och regionaliserade (guidade) hjärnorganoider18. Vid generering av den senare typen av organoider tillhandahålls små molekyler eller faktorer som styr differentieringen av de pluripotenta stamcellerna till organoider i en viss hjärnregion (t.ex. organoider i framhjärnan)18. I ostyrda organoider styrs differentieringen däremot inte av tillsatsen av små molekyler utan förlitar sig uteslutande på spontan differentiering av iPSC/ESC. De resulterande hjärnorganoiderna består av celltyper som representerar olika hjärnregioner (t.ex. cerebrala organoider)18. Hjärnorganoider kombinerar många viktiga funktioner i hjärnans utveckling med relativt kostnads- och tidseffektiv generering från alla arter av intresse för vilka iPSC eller ESC finns tillgängliga11,12,13,14. Detta gör hjärnorganoider till en utmärkt modell för många typer av neurobiologiska studier, allt från evolutionära och utvecklingsfrågor till sjukdomsmodellering och läkemedelstestning15,16. Att ta itu med sådana frågor med hjälp av hjärnorganoider beror dock starkt på tillgången på olika metoder för genetisk modifiering.

En viktig aspekt av att studera neocortex (pato) fysiologisk utveckling och dess utveckling är funktionell analys av gener och genvarianter. Detta uppnås vanligtvis genom (ektopisk) uttryck och / eller genom knock-down (KD) eller knock-out (KO) av dessa gener. Sådana genetiska modifieringar kan klassificeras i stabil och övergående genetisk modifiering, liksom i modifieringar som är tidsmässigt och rumsligt begränsade eller inte begränsade. Stabil genetisk modifiering definieras genom införandet av en genetisk förändring i värdgenomet som överförs till alla efterföljande cellgenerationer. Beroende på tidpunkten för genetisk modifiering kan den påverka alla celler i en organoid eller kan begränsas till vissa cellpopulationer. Oftast uppnås stabil genetisk modifiering i hjärnorganoider på iPSC / ESC-nivå genom att tillämpa lentivirus, transposonliknande system och CRISPR / Cas9-tekniken (granskad av t.ex. Fischer et al.17, Kyrousi et al.19 och Teriyapirom et al.20). Detta har fördelen att alla celler i hjärnorganoiden bär den genetiska modifieringen och att den inte är tidsmässigt eller rumsligt begränsad. Genereringen och karakteriseringen av dessa stabila iPSC / ESC-linjer är dock mycket tidskrävande och tar ofta flera månader tills de första modifierade hjärnorganoiderna kan analyseras (granskad av t.ex. Fischer et al.17, Kyrousi et al.19 eller Teriyapirom et al.20).

Däremot definieras övergående genetisk modifiering genom leverans av genetisk last (t.ex. en genuttrycksplasmid) som inte integreras i värdgenomet. Även om denna modifiering i princip kan överföras till efterföljande cellgenerationer, kommer den levererade genetiska lasten gradvis att spädas ut med varje celldelning. Därför är denna typ av genetisk modifiering vanligtvis tidsmässigt och rumsligt begränsad. Övergående genetisk modifiering kan utföras i hjärnorganoider av adenoassocierade virus eller genom elektroporering (granskad av t.ex. Fischer et al.17, Kyrousi et al.19 och Teriyapirom et al.20), där den senare beskrivs i detalj i denna artikel. Till skillnad från stabil genetisk modifiering är detta tillvägagångssätt mycket snabbt och kostnadseffektivt. Elektroporering kan utföras inom några minuter, och beroende på målcellpopulationen (erna) är elektroporerade organoider redo för analys inom några dagar (granskade av t.ex. Fischer et al.17 och Kyrousi et al.19). Grova morfologiska förändringar av hjärnorganoiden, såsom skillnader i storlek, kan emellertid inte detekteras med denna metod, eftersom denna typ av genetisk modifiering är tidsmässigt och rumsligt begränsad. Denna begränsning kan också vara en fördel, till exempel när det gäller att studera enskilda cellpopulationer inom organoiden eller effekterna på hjärnorganoider vid specifika utvecklingstidpunkter (granskad av t.ex. Fischer et al.17 och Kyrousi et al.19).

Ett klassiskt tillvägagångssätt för att studera genfunktion under hjärnans utveckling och evolution är i utero elektroporering. In utero elektroporering är en välkänd och användbar teknik för leverans av genuttryckskonstruktioner i gnagare 21,22,23 och iller 24,25 hjärnor. Först mikroinjiceras en lösning som innehåller uttryckskonstruktionen (erna) av intresse genom livmoderväggen in i en viss ventrikel i den embryonala hjärnan, beroende på vilken region som ska riktas. I det andra steget appliceras elektriska pulser för att transfektera cellerna direkt som fodrar den riktade ventrikeln. Detta tillvägagångssätt är inte bara begränsat till ektopiskt uttryck eller överuttryck av gener, eftersom det också kan tillämpas i KD- eller KO-studier genom mikroinjicering av kort hårnål (shRNA) eller CRISPR / Cas9 (i form av expressionsplasmider eller ribonukleoproteiner [RNP]), respektive26,27. Elektroporering in utero av mus-, rått- och illerembryon har dock samma begränsningar som beskrivits ovan för dessa djurmodeller.

Helst skulle man vilja utföra i utero elektroporering direkt i primater. Även om detta i princip är tekniskt möjligt, utförs elektroporering i livmodern inte på primater på grund av etiska problem, höga djurunderhållskostnader och små kullstorlekar. För vissa primater, såsom stora apor (inklusive människor), är detta inte möjligt alls. Dessa primater har emellertid den största potentialen för studier av mänsklig (pato) fysiologisk neocortexutveckling och dess utveckling. En lösning på detta dilemma är att tillämpa elektroporeringstekniken på primathjärnorganoider28.

Detta dokument presenterar ett protokoll för elektroporering av en subtyp av primathjärnorganoider, primatcerebrala organoider. Detta tillvägagångssätt möjliggör snabb och kostnadseffektiv genetisk modifiering av cellpopulationer inom organoidernas ventrikelliknande strukturer. Specifikt beskriver vi ett enhetligt protokoll för generering av primatcerebrala organoider från humana (Homo sapiens), schimpanser (Pan troglodytes), rhesusmakak (Macaca mulatta) och vanlig marmoset (Callithrix jacchus) iPSCs. Dessutom beskriver vi mikroinjektions- och elektroporeringstekniken i detalj och tillhandahåller "go" och "no-go" kriterier för att utföra primatcerebral organoid elektroporering. Detta tillvägagångssätt är ett effektivt verktyg för att studera (pato) fysiologisk neocortexutveckling och dess utveckling i en modell särskilt nära den mänskliga situationen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Odling av primat-iPSC

OBS: På grund av dess robusthet kan metoden som presenteras här tillämpas på alla primater iPSC-linjer. I den här artikeln beskriver vi cerebral organoidproduktion från humana (iLonza2.2)29, schimpanser (Sandra A)30, rhesusmakak (iRh33.1)29 och vanliga marmoset(cj_160419_5)31 iPSC-linjer. Odlingsförhållandena sammanfattas i tabell 1. Se materialtabellen för detaljer relaterade till alla material, reagenser och utrustning som används i detta protokoll.

  1. För odling av respektive iPSC, följ de ursprungligen beskrivna odlingsförhållandena. I allmänhet, för framgångsrik generering och elektroporering av cerebrala organoider, använd iPSC-linjer som inte har odlats i mer än 90 passager. Dessutom, i början av cerebral organoidgenerering, se till att iPSC uppvisar egenskaper av pluripotens utan tecken på differentiering.

2. Generering av cerebrala organoider från primater iPSC

OBS: Protokollet för cerebral organoidgenerering är baserat på en modifierad version 28,30,32,33 av det ursprungliga cerebrala organoidprotokollet 10,34 med några artspecifika modifieringar (beskrivs nedan).

  1. Sådd av iPSC för att generera embryoidkroppar (EB)
    1. När iPSC har nått 80% -90% sammanflöde, tvätta dem med Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS) och tillsätt 500 μL rekombinant trypsinsubstitut eller 1 ml proteolytisk och kollagenolytisk blandning.
      OBS: Vanligtvis odlas iPSC i en 60 mm cellodlingsskål för att erhålla cirka 900 000 celler, vilket är tillräckligt för att generera 96 cerebrala organoider. Cellnumren kan justeras beroende på antalet organoider som behövs. Var medveten om att inte alla genererade cerebrala organoider kan vara lämpliga för elektroporering.
    2. Inkubera skålen vid 37 °C i 2 minuter för att lossa cellerna.
      OBS: Upp till ytterligare 2 minuters inkubation vid 37 °C kan behövas beroende på vilken iPSC-ingång eller vilket enzym som används. Det rekommenderas att undersöka skålen under ett mikroskop för att säkerställa att cellerna har börjat lossna.
    3. Tillsätt 1,5 ml förvärmt (37 °C) iPSC-odlingsmedium för att stoppa reaktionen och pipettera upp och ner 7x-10x (högst 10x) för att dissociera cellerna från cellodlingsskålen och för att erhålla en encellssuspension.
    4. Överför cellsuspensionen till ett 15 ml koniskt centrifugrör och centrifugera cellerna vid 200 × g i 5 minuter vid rumstemperatur.
    5. Aspirera supernatanten och suspendera pelleten igen i 2 ml iPSC-odlingsmedium kompletterat med antingen 50 μM Y27632 eller 50 μM pro-survival compound.
    6. Använd 10 μL av cellsuspensionen för att räkna cellerna med hjälp av en Neubauer-kammare.
    7. Justera cellsuspensionen till en koncentration av 9 000 celler per 150 μl (60 000 celler/ml) med hjälp av iPSC-odlingsmedium kompletterat med 50 μM Y27632 eller 50 μM pro-survival förening.
    8. För att generera embryoidkroppar (EB), frö 150 μL av cellsuspensionen i varje brunn på en ultralåg fästplatta med 96 brunnar. Skaka försiktigt röret som innehåller cellsuspensionen under pipettering för att förhindra att cellerna sedimenterar.
    9. Odla EB i en humifierad atmosfär av 5% CO2 och 95% luft vid 37 ° C (0 dagar efter sådd [dps]). Stör inte EB inom de första 24 timmarna efter sådd.
      EB genererade från marmoset iPSC måste odlas i en humifierad atmosfär under hypoxiska förhållanden (5% CO 2, 5% O 2 och 90% N 2) vid 37 ° C.
    10. Efter ~48 timmar (2 dps), byt medium till iPSC-odlingsmedium utan Y27632/pro-survival compound. Avlägsna 100 μl medium per brunn och tillsätt 150 μl förvärmt (37 °C) färskt medium utan Y27632. Gå rad för rad.
    11. Utför ytterligare medieförändringar varannan dag; avlägsna 150 μl medium från varje brunn och tillsätt 150 μl förvärmt (37 °C) färskt medium utan Y27632/pro-survival förening per brunn.
      OBS: Efter 4-5 dps bör EB: s periferi bli genomskinlig.
  2. Induktion av neuroektoderm
    OBS: I allmänhet bör EB av god kvalitet ha släta konturer och genomskinliga gränser i detta skede. Tidpunkterna för neural induktion skiljer sig något mellan primatarter och iPSC-linjer. När det gäller de cellinjer som används här (se avsnitt 1 och materialförteckning) måste neural induktion för marmoset EB vanligtvis startas vid 4 dps, för rhesusmakak vid 5 dps och för humana och schimpans-EB vid 4-5 dps (figur 1A), beroende på EB: s tillstånd (se ovan).
    1. Ta bort 150 μl medium från varje brunn i den första raden på 96-brunnsplattan och tillsätt 150 μL förvärmt (37 °C) neuralt induktionsmedium (se tabell 2) per brunn i samma rad.
    2. Fortsätt att byta medium enligt beskrivningen ovan rad för rad för hela 96-brunnsplattan. Utför ytterligare förändringar i neuralt induktionsmedium (NIM) varannan dag genom att avlägsna 150 μL NIM från varje brunn och tillsätta 150 μL förvärmd (37 °C) färsk NIM.
      OBS: Från och med nu bör marmoset EB odlas under samma förhållanden som de andra primaterna EB (humifierad atmosfär på 5% CO2 och 95% luft vid 37 ° C).
  3. Inbäddning i basalmembranmatris
    OBS: När EB: erna har utvecklat ett uttalat, genomskinligt, radiellt organiserat neuroepitel på ytan, måste strukturellt stöd ges för utveckling av ventrikelliknande strukturer. Detta uppnås genom att bädda in EB: erna i en basalmembranmatris. På grund av skillnader i utvecklingshastigheter är marmoset- och rhesusmakak EB redo för inbäddning redan vid 7 dps, medan humana och schimpans-EB vanligtvis är inbäddade vid 8-9 dps. För enkelhetens skull hänvisar basalmembranmatris endast till Matrigel i detta protokoll. Geltrex kan dock användas som ersättning.
    1. Som förberedelse för inbäddning, UV-sterilisera sax, pincett, ett litet ställ för 0,2 ml rör och tre till sex rutor parafilm behandlad med 70% (vol / vol) etanol under laminär flödeshuv i 15 minuter. Låt basalmembranmatrisen tina på is i flera timmar (~ 1,5 ml basalmembranmatris räcker vanligtvis för 96 EB).
      OBS: Håll alltid basalmembranmatrisen på is.
    2. Skapa ett 4 x 4 dimple rutnät på parafilmen. Placera parafilmgallret på 0,2 ml rörstället så att den pappershölje sidan är vänd uppåt och tryck försiktigt ett handskfinger mot varje hål på stället.
    3. Ta bort papperet och klipp ut dimplegallret ur parafilmtorget med sax för att justera storleken så att den passar in i en 60 mm cellodlingsskål. Placera den gropiga parafilmen tillbaka på 0,2 ml rörställ för att ge en grund för genereringen av basalmembranmatrisdroppen.
    4. Använd en pipett med en skuren 200 μL pipettspets och överför försiktigt EB: erna efter varandra från odlingsskålens brunn till parafilmgroparna.
    5. Efter att ha flyttat 16 EB till gallret, ta en ny 200 μL pipettspets och ta bort det återstående mediet från groparna.
    6. Pipettera en droppe (~15 μL) basalmembranmatris på varje grop innehållande en EB.
    7. Ta en 10 μL pipettspets och flytta snabbt EB: erna till mitten av varje droppe utan att störa droppkanterna.
    8. Placera den gropiga parafilmen med basalmembranmatrisdropparna i en 60 mm cellodlingsskål och inkubera i 15-30 minuter vid 37 ° C så att matrisen kan polymerisera.
    9. För att lossa de matrisinbäddade EB: erna från parafilmen, tillsätt 5 ml differentieringsmedium (DM) utan vitamin A ( se tabell 2) till skålen och vänd parafilmkvadraten upp och ner med pincett så att sidan med EB: erna vetter mot botten av skålen.
    10. Skaka försiktigt skålen så att basalmembranmatrisdropparna som innehåller EB: erna lossnar från parafilmen. Om några av dem fortfarande är fästa, ta en kant av parafilmtorget med pincett och rulla snabbt upp den mot mitten av skålen flera gånger.
    11. Odla hjärnorganoiderna på en orbitalshaker vid 55 rpm i en humifierad atmosfär med 5% CO2 och 95% luft vid 37 ° C. Håll dem i DM utan vitamin A med medelstora förändringar varannan dag. För att inducera produktionen av neuroner, byt till DM med vitamin A (retinsyra, RA) efter 13 dps för marmoset och rhesusmakak cerebrala organoider eller 14-15 dps för humana och schimpanscerebrala organoider (figur 1A). Från och med denna tid, byt mediet var 3-4: e dag.
      OBS: För att stödja neuronal överlevnad kan DM med vitamin A kompletteras med 20 μg / ml human neurotrofin 3 (NT3), 20 μg / ml hjärnhärledd neurotrofisk faktor (BDNF) och 1 μL / ml basalmembranmatris från 40 dps på.

3. Elektroporering av primatcerebrala organoider

OBS: Ur teknisk synvinkel kan elektroporeringen av cerebrala organoider utföras så snart de ventrikelliknande strukturerna är tillräckligt uttalade för att riktas mot mikroinjektion. Det optimala elektroporeringstidsfönstret beror på den biologiska frågan och på cellpopulationen (erna) av intresse. Till exempel, om apikala föregångare (AP) är huvudmålet, är cerebrala organoider vid cirka 30 dps redan lämpliga. Om basala progenitorer (BP) eller neuroner är huvudmålen, bör äldre cerebrala organoider på mer än 50 dps användas (se t.ex. Fischer et al.28).

  1. Förberedelse av elektroporeringsinställningen
    OBS: Elektroporeringseffektiviteten påverkas starkt av storleken och koncentrationen av de elektroporerade plasmiderna (se diskussionsavsnittet för detaljer).
    1. Bered en tillräcklig mängd elektroporeringsblandning för kontrollen och genen av intresse (GOI), t.ex. 10 μL elektroporeringsblandning för varje kontroll och GOI för elektroporering av cirka 30 cerebrala organoider per tillstånd.
      Anmärkning: För elektroporeringsblandningarnas sammansättning, se tabell 3.
    2. Förvärm (icke-steril) Dulbeccos modifierade Eagle medium / näringsblandning F-12 (DMEM / F12) och DM med vitamin A till 37 ° C. Förbered en liten spatel och fin och normal sax och spraya instrumenten med 70% (vol / vol) etanol.
      OBS: Följande steg kan utföras antingen under sterila eller icke-sterila förhållanden eftersom DM innehåller antibiotika (se tabell 2). Enligt vår erfarenhet har frånvaron av sterilitet aldrig orsakat någon förorening.
    3. Förbered 35 mm cellodlingsskålar och anslut petriskålens elektrodkammare till elektroporatorn.
      OBS: Petriskålelektrodkammare är kommersiellt tillgängliga. De kan dock enkelt produceras på ett kostnadseffektivt sätt (se kompletterande fil 1).
    4. Fyll mikroinjektionsnålar med 8 μL av varje elektroporeringsblandning med hjälp av mikrolastarspetsar. Skär spetsarna på nålarna med fin sax före första användningen för att uppnå ett stabilt flöde. Ta dock bara bort en liten del av spetsen, eftersom en trubbig och bred spets kan skada organoiderna allvarligt.
      OBS: Mikroinjektionsnålar är antingen kommersiellt tillgängliga som fördragna mikroinjektionsnålar eller kan dras i labbet om en nåldragare är tillgänglig. Följ nålavdragartillverkarens instruktioner för att generera mikroinjektionsnålar med en lång kona och en spetsdiameter på 10 μm.
  2. Mikroinjektion och elektroporering
    1. Under ett mikroskop väljer du fem cerebrala organoider med släta gränser och tydligt synliga ventrikelliknande strukturer. Flytta dem till en 35 mm cellodlingsskål som innehåller förvärmd (37 °C) DMEM/F12 med en skuren 1 000 μl pipettspets.
      OBS: Välj cerebrala organoider med uttalade och tillgängliga ventrikelliknande strukturer (se figur 1B).
    2. För att injicera en ventrikelliknande struktur, sätt försiktigt in nålen genom väggen och infusera den med elektroporeringsblandningen tills den är synligt fylld. Applicera inte alltför stort tryck på ventrikelliknande strukturer för att undvika att de spricker. Fortsätt med sex till åtta ventrikelliknande strukturer av varje cerebral organoid på detta sätt.
      OBS: Om nålen blir igensatt under mikroinjektionsprocessen måste spetsen trimmas något.
    3. Överför en mikroinjicerad cerebral organoid till petriskålelektrodkammaren med en liten mängd DMEM / F12. Ordna organoiden på ett sådant sätt att ytorna på de mikroinjicerade ventrikelliknande strukturerna vetter mot elektroden ansluten till elektroporatorns positiva pol.
      OBS: Orientering av strukturerna på detta sätt säkerställer att cellerna transfekteras på den sida av den ventrikelliknande strukturen som inte påverkas av en intilliggande struktur.
    4. Elektroporera hjärnorganoiderna en efter en med följande inställningar: 5 pulser på 80 V, en pulslängd på 50 ms och ett intervall på 1 s. Flytta de elektroporerade organoiderna till en ny 35 mm cellodlingsskål fylld med förvärmd (37 °C) DMEM/F12.
      OBS: Elektroporeringsinställningarna kan bero på den tillgängliga fyrkantvågselektroporatorn. Dessa inställningar är optimerade för det refererade elektroporeringssystemet. Att öka spänningen kan leda till förskjutning av cellerna.
    5. Fortsätt på samma sätt med de följande fem cerebrala organoiderna med den andra elektroporeringsblandningen (till exempel GOI).
      OBS: Upprepa steg 3.2.1-3.2.5 tills önskat antal elektroporerade cerebrala organoider uppnås.
    6. Om mikroinjektionen och elektroporeringen utfördes under icke-sterila förhållanden, överför de elektroporerade organoiderna till en steril 35 mm cellodlingsskål under en laminär flödeshuv medan du flyttar så lite DMEM/F12 som möjligt till den nya cellodlingsskålen.
  3. Ytterligare odling och fixering av cerebrala organoider
    1. Odla elektroporerade organoider i DM med vitamin A på en orbitalskakare vid 55 rpm i en humifierad atmosfär med 5% CO2 och 95% luft vid 37 ° C.
    2. Nästa dag efter elektroporering, kontrollera cerebrala organoider för framgångsrik elektroporering under ett konventionellt inverterat fluorescensmikroskop.
      OBS: Beroende på längden på den ytterligare kulturen efter elektroporering påverkas olika cellpopulationer inom hjärnorganoiden (se även avsnittet representativa resultat).
    3. Fortsätt med nedströmsapplikationer efter odling av de elektroporerade cerebrala organoiderna under en tid som är lämplig för den biologiska frågan av intresse.
      OBS: Elektroporerade cerebrala organoider kan bearbetas för olika nedströmsapplikationer (t.ex. fixering för immunofluorescensfärgning eller snap-frozen för RNA-isolering och qRT-PCR). Här beskriver vi fixeringen av elektroporerade cerebrala organoider.
    4. Överför de elektroporerade organoiderna till ett 15 ml koniskt centrifugrör med en skuren 1 000 μl pipettspets och avlägsna överflödigt medium.
    5. Tillsätt en tillräcklig mängd 4% paraformaldehyd (PFA) i DPBS (pH 7,5) och inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur.
      VARNING: PFA klassificeras som cancerframkallande för människor och kan orsaka irreparabla hälsoskador. Ytterligare försiktighetsåtgärder inklusive nitrilhandskar och skyddsglasögon rekommenderas starkt.
    6. Aspirera PFA, tillsätt 5 ml DPBS, skaka lite och aspirera DPBS. Upprepa detta 2x. Förvara organoiderna i DPBS vid 4 °C tills de används vidare.
      OBS: Protokollet kan pausas här, eftersom PFA-fixerade cerebrala organoider kan lagras vid 4 °C i flera månader. PFA-fixerade elektroporerade organoider kan analyseras genom kryosektion och immunofluorescensfärgning10,28 eller genom helmonterad färgning och rensning 35,36. För exempelbilder, se avsnittet representativa resultat (se tabell 4 för antikroppsdetaljer).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokollet som beskrivs här möjliggör effektiv generering av cerebrala organoider från humana, schimpanser, rhesusmakak och vanliga marmoset-iPSC-linjer med minimala tidsförändringar som krävs mellan arter (figur 1A). Dessa organoider kan elektroporeras i intervallet 20 dps till 50 dps, beroende på tillgängligheten av de ventrikelliknande strukturerna och överflödet av cellpopulationerna av intresse. Före elektroporering är det dock viktigt att bestämma om hjärnorganoiderna är av tillräcklig kvalitet för att elektroporeras.

En cerebral organoid som är idealisk för elektroporering bör uppvisa uttalade ljusa ventrikelliknande strukturer i periferin, inga tecken på degeneration (t.ex. löstagande celler, förstorad apoptotisk kärna) och en generellt kompakt hälsosam morfologi (t.ex. ingen överdriven utväxt) (Figur 1B, "Go"). Det är att föredra att välja cerebrala organoider med stora, välorganiserade, ventrikelliknande strukturer för att rikta in sig på ett högre antal celler. Om den perifera zonen hos en organoid är mörk och inte visar några utskjutande strukturer, rekommenderas att den inte används för elektroporering, eftersom de exakta mikroinjektionerna kan äventyras av bristen på visuella signaler (figur 1B, "No-go"). För att uppnå en optimal cerebral organoidmorfologi är det viktigt att säkerställa att kritiska steg som neuroektoderminduktion och matrisinbäddning är vältajmade. Problem med cerebral organoidmorfologi härrör vanligtvis från misslyckad neuroektoderm och / eller neuroepitelial knoppbildning. Detta orsakas normalt av suboptimal timing av den neurala induktionen och/eller inbäddningen av basalmembranmatrisen och kan lösas genom att justera tidpunkten för dessa steg (ytterligare felsökningstips för cerebral organoidbildning finns i Lancaster och Knoblich34).

Efter elektroporering kan en första bedömning av dess framgång och dess effektivitet utföras efter 12 timmar, när GFP-uttrycket av de transfekterade cellerna blir detekterbart under ett konventionellt inverterat fluorescensmikroskop. Idealiskt, i detta skede, avger flera ventrikelliknande strukturer ljusgrön fluorescens lokaliserad till en av deras sidor (figur 2A). Detta indikerar procedurens höga precision och effektivitet. Framgångsrikt elektroporerade cerebrala organoider av de fyra olika primatarterna (dvs människa, schimpans, rhesusmakak och vanlig marmoset) visar liknande GFP-positiva mönster inom de riktade ventrikelliknande strukturerna (figur 2A). Dessutom, efter fixering och kryosektion av elektroporerade primatcerebrala organoider, uppvisar framgångsrikt elektroporerade ventrikelliknande strukturer av alla fyra arterna kolumner av GFP-positiva celler inom den radiellt organiserade och tätt packade ventrikulära zonen (VZ) (figur 2B). Kvantifieringen av de DAPI-positiva cellerna som också var GFP-positiva i sådana regioner av schimpans- och marmosethjärnorganoiderna 2 dagar efter elektroporering (17 ventriklar från 12 organoider kvantifierade) visade att i genomsnitt ungefär en tredjedel av cellerna (33%, SD ± 12%) framgångsrikt elektroporerades.

Suboptimala elektroporationer markeras antingen med ett litet antal GFP-positiva celler i den ventrikelliknande strukturen (figur 3A) eller med några GFP-positiva celler som ligger långt från någon ventrikelliknande struktur (figur 3B). Ett lågt antal GFP-positiva celler orsakas av ett dåligt plasmidupptag. Detta kan antingen bero på en låg plasmidkoncentration orsakad av en otillräcklig mängd mikroinjicerad elektroporeringsblandning eller på grund av elektriska pulser som inte är välriktade, vilket kan orsakas av suboptimal positionering av hjärnorganoiderna i petriskålelektrodkammaren. Ett lågt antal GFP-positiva celler som ligger långt från någon ventrikelliknande struktur orsakas av elektroporering av postmitotiska celler i hjärnorganoiden (t.ex. neuroner) på grund av en inexakt mikroinjektion. Dessa suboptimala elektroporeringar måste uteslutas från ytterligare analyser.

Den tillförlitliga identifieringen av de celltyper som finns i cerebrala organoider baseras bland annat på cellpositionen inom en ventrikelliknande struktur, vilket kräver en gränsdefinition mellan VZ och SVZ/neuron-anrikad zon. Denna gräns kan identifieras genom VZ: s radiella organisation och högcellkärnors densitetsegenskaper (se DAPI-färgning i kompletterande figur S1). Bekräftelsen av VZ/SVZ-gränsen kan utföras genom immunofluorescensfärgning för neurala stamfadermarkörer såsom PAX6 eller SOX2, som uttrycks av praktiskt taget alla VZ-celler (AP) och vissa SVZ-celler (BP). Närvaron av en neuronberikad zon kan valideras genom immunofluorescensfärgning för neuronala markörer såsom klass III β-tubulin (TUJ1) eller NeuN (kompletterande figur S1).

Varaktigheten av cerebral organoidkultur efter elektroporering beror på den biologiska frågan och cellpopulationerna av intresse. I en nyligen genomförd studie visades att olika längder av ytterligare odling efter elektroporering påverkar olika cellpopulationer i schimpanscerebrala organoider, allt från AP till övre lager neuroner24. Här visar vi liknande resultat för elektroporerade marmosetorganoider. Specifikt, 2 dagar efter elektroporering, är GFP-positiva celler nästan uteslutande lokaliserade i VZ och är också positiva för PAX6 - en markör för neurala stamceller - vilket indikerar att dessa celler är AP eller nyfödda BP (figur 4A). Om odlingsperioden efter elektroporering förlängs till 10 dagar, lokaliseras GFP-positiva celler i de basala regionerna (dvs SVZ och neuronberikad zon) (figur 4B, C). Dessa celler kan (förutom GFP-signalen) också vara positiva för PAX6 (figur 4B), som indikerar BP, eller NeuN (figur 4C), som indikerar neuroner. Liknande resultat kan erhållas för humana och rhesusmakaka elektroporerade cerebrala organoider. Sammanfattningsvis kan olika stamtyper, såväl som neuroner, framgångsrikt riktas mot denna teknik.

Nästan alla tidigare visade data härleddes från immunfärgning av histologiska sektioner genererade från elektroporerade cerebrala organoider. Ett annat elegant sätt att analysera dessa organoider är dock att utföra helmonterad immunfärgning följt av optisk rensning35,36. Detta skulle möjliggöra 3D-rekonstruktion av de elektroporerade cerebrala organoiderna för att få ett intryck av 3D-fördelningen av de GFP-positiva cellerna. Figur 5 och video 1 visar ett representativt exempel på GFP-signalen i en optiskt rensad, elektroporerad cerebral organoid.

Sammanfattningsvis ger elektroporeringsprotokollet som beskrivs här ett exakt och effektivt sätt att införa övergående genetisk modifiering (er) i olika stamfadertyper och neuroner av cerebrala organoider härledda från olika primat-iPSC-linjer.

Figure 1
Figur 1: Schematisk översikt över primaternas cerebrala organoidgenerering och morfologiska "go"- och "no-go"-kriterier för elektroporering. (A) Tidslinje för primater cerebral organoidgenerering och elektroporering som belyser de olika tidpunkterna för protokollstegen för människa och schimpans (blå), rhesusmakak (violett) och marmoset (magenta). Observera att tidslinjens kronologi inte skalenlig. (B) Brightfield-bilder av en lämplig (vänster bild, Go) och en olämplig (höger bild, No-go) 32 dps human cerebral organoid. Pilspetsarna indikerar exempel på lämpliga ventrikelliknande strukturer för mikroinjektion. Bilderna togs med hjälp av ett Zeiss Axio Observer.Z1 inverterat fluorescensmikroskop med ett 2,5x objektiv. Skalstänger = 500 μm. Förkortningar: BDNF = hjärnhärledd neurotrofisk faktor; DPS = dagar efter sådd; NT3 = neurotrofin 3; RA = retinsyra. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Exempel på framgångsrikt elektroporerade primatcerebrala organoider . (A) Brightfield (vänster kolumn), fluorescens (mittkolumn) och sammanslagning (höger kolumn) bilder av 22 dps mänskliga, 32 dps schimpanser, 32 dps rhesusmakak och 31 dps marmoset cerebrala organoider (från topp till botten) 15-48 timmar efter elektroporering med GFP-uttryckande plasmid. De svarta pilspetsarna indikerar exempel på enskilda elektroporerade ventrikelliknande strukturer. Bilderna togs med hjälp av ett Zeiss Axio Observer.Z1 inverterat fluorescensmikroskop med ett 2,5x objektiv. Skalstänger = 500 μm. (B) Immunofluorescens för GFP (grön) kombinerad med DAPI-färgning (cyan) av 32 dps human, 34 dps schimpans, 32 dps rhesusmakak och 32 dps marmosetcerebrala organoider (från topp till botten) 2-4 dagar efter elektroporering med GFP-uttryckande plasmid. De ljusgrå pilspetsarna indikerar gränserna för de elektroporerade regionerna inom de ventrikelliknande strukturerna. Bilderna förvärvades med hjälp av ett Zeiss LSM 800 konfokalmikroskop med ett 10x mål. Skalstänger = 150 μm. Förkortningar: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol; DPS = dagar efter sådd; GFP = grönt fluorescerande protein. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Exempel på utan framgång elektroporerade primatcerebrala organoider. (A,B) Immunofluorescens för GFP (grön) kombinerad med DAPI-färgning (cyan) av en (A) 34 dps rhesusmakak cerebral organoid 4 dagar efter elektroporering med GFP-uttryckande plasmid och av (B) en 32 dps rhesusmakak cerebral organoid 2 dagar efter elektroporering med GFP-uttryckande plasmid. De ljusgrå pilspetsarna indikerar elektroporerade celler. Den ljusgrå streckade konturen indikerar gränsen mellan VZ och SVZ / neuron-berikad zon av en ventrikelliknande struktur intill de elektroporerade cellerna. Bilderna förvärvades med hjälp av ett Zeiss LSM 800 konfokalmikroskop med ett 10x mål. Skalstänger = 150 μm. Förkortningar: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol; DPS = dagar efter sådd; GFP = grönt fluorescerande protein; SVZ = subventrikulär zon; VZ = ventrikulär zon. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Visualisering av de olika cellpopulationer som finns i primatcerebrala organoider efter elektroporering. (A–C) Dubbel immunofluorescens för GFP (grön) och antingen PAX6 (A,B; magenta) eller NeuN (C; magenta), i samtliga fall kombinerad med DAPI-färgning (cyan), av en (A) 32 dps marmoset cerebral organoid 2 dagar efter elektroporering med GFP-uttryckande plasmid, och (B,C) av en 40 dps marmoset cerebral organoid 10 dagar efter elektroporering med GFP-uttryckande plasmid. De ljusgrå pilspetsarna indikerar (A,B) GFP+ och PAX6+ eller (C) NeuN+ dubbelpositiva celler. De ljusgrå streckade linjerna anger gränsen mellan VZ och SVZ/neuron-berikad zon. Bilderna togs med hjälp av ett Zeiss LSM 800 konfokalmikroskop med ett 20x mål. Skalstänger = 100 μm. Förkortningar: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol; DPS = dagar efter sådd; GFP = grönt fluorescerande protein; NeuN = neuronala kärnor protein; PAX6 = parat låda 6-protein; SVZ = subventrikulär zon; VZ = ventrikulär zon. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Tredimensionell rekonstruktion av elektroporerade bilder genom 3D-konfokal avbildning av elektroporerade primatcerebrala organoider efter optisk clearing. Frontal (vänster bild), 45° roterad (mellersta bilden) och 90° roterad (höger bild) vyer av en 3D-rekonstruerad elektroporerad 32 dps human cerebral organoid 2 dagar efter elektroporering med GFP-uttryckande plasmid. Före avbildning rensades organoiden optiskt baserat på 2Eci-metoden35. En 3D-rekonstruktion av hela elektroporerade organoider genererades från 269 optiska sektioner (1 μM tjocklek vardera) som är 3,73 μm från varandra med hjälp av ett Zeiss LSM 800 konfokalmikroskop med ett 10x mål. Bilderna bearbetades för 3D-rekonstruktion med Fiji. Observera att bilderna togs från samma 3D-rekonstruerade organoid som visas i Video 1. Skalstång = 500 μm. Förkortning: GFP = grönt fluorescerande protein. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Video 1: En 3D-rekonstruerad elektroporerad human cerebral organoid efter optisk clearing. Video av en 3D-rekonstruerad elektroporerad 32 dps human cerebral organoid 2 dagar efter elektroporering med GFP-uttryckande plasmid. Före avbildning rensades organoiden optiskt baserat på 2Eci-metoden35. En 3D-rekonstruktion av hela elektroporerade organoider genererades från 269 optiska sektioner (1 μM tjocklek vardera) som är 3,73 μm från varandra med hjälp av ett Zeiss LSM 800 konfokalmikroskop med ett 10x mål. Bilderna bearbetades för 3D-rekonstruktion med Fiji. Observera att videon togs från samma 3D-rekonstruerade organoid som visas i figur 5. Klicka här för att ladda ner den här videon.

iPSC-linjen Art Publikation Kultur medium komposition Kulturella förhållanden
iLonza2,2 Mänsklighet Stauske et al., 2020 1 μM IWR1 och 0,5 μM CHIR i StemMACS iPS-Brew XF humifierad atmosfär av 5% CO2 och 95% luft, 37 °C
SandraA Pan troglodytes Mora-Bermúdez et al., 2016 mTeSR1 humifierad atmosfär av 5% CO2 och 95% luft, 37 °C
iRh33.1 Macaca mulatt Stauske et al., 2020 1 μM IWR1 och 0,5 μM CHIR i StemMACS iPS-Brew XF humifierad atmosfär av 5% CO2 och 95% luft, 37 °C
cj_160419_5 Callithrix jacchus Petkov et al., 2020 3 μM IWR1, 0,3 μM CGP77675, 0,3 μM AZD77675, 0,5 μM CHIR99021, 10 μM Forskolin, 1 ng/ml Activin A, 1 μM OAC1 i StemMACS iPS-Brew XF humifierad atmosfär av 5% CO2, 5% O2 och 90% N2, 37 °C

Tabell 1: Odlingsförhållanden för de iPSC för primater som används i denna publikation. Förkortning: iPSCs = inducerade pluripotenta stamceller.

Medium Sammansättning
Neuralt induktionsmedium 1x N-2-tillskott, 1x glutaminersättningstillskott, 1x MEM icke-essentiella aminosyror, 1 μg / ml heparin i Dulbeccos modifierade örnmedium F12 (DMEM / F12)
Differentieringsmedium (DM) utan vitamin A 0,5x B-27-tillskott (minus vitamin A), 0,5x N-2-tillskott, 0,5x MEM icke-essentiella aminosyror, 1x glutaminersättningstillskott, 100 U / ml penicillin-streptomycin, 0,00035% 2-merkaptoetanol, 2,875 ng / ml insulin i 1: 1 DMEM / F12 och neurobasalt medium
Differentieringsmedium (DM) med vitamin A 0,5x B-27-tillägg, 0,5x N-2-tillskott, 0,5x MEM icke-essentiell aminosyralösning, 1x glutaminersättningstillskott, 100 U / ml penicillin-streptomycin, 0,00035% 2-merkaptoetanol, 2,875 ng / ml insulin i 1: 1 DMEM / F12 och neurobasalt medium

Tabell 2: Sammansättning av media som används för generering och odling av cerebrala organoider hos primater.

Komponent Kontrollera elektroporeringsblandningen Blandning av elektroporering från GOI
GFP-uttryck plasmid 500 ng/μl 500 ng/μl
Tom vektor 500 ng/μl -
Plasmid för GOI-uttryck - 500 ng/μl
Snabb grön 0.10% 0.10%
i DPBS

Tabell 3: Elektroporeringsblandningens sammansättning (metod med separata plasmider) för den aktuella kontroll- och genen. Förkortning: GOI = gen av intresse.

Antikropp Företag Katalognummer RRID Utspädning
Kyckling anti GFP Aves labb GFP-1020 RRID:AB_10000240 1:300
Kanin anti PAX6 Novus Biologiska NBP1-89100 RRID:AB_11013575 1:300
Kanin anti NeuN Abcam AB104225 RRID:AB_10711153 1:300
Get anti kyckling Alexa Fluor 488 Thermo Fisher A-11039 RRID:AB_142924 1:500
Åsna anti kanin Alexa Fluor 555 Thermo Fisher A-31572 RRID:AB_162543 1:500

Tabell 4: Antikroppar som används för immunofluorescensfärgning.

Kompletterande figur S1: VZ/SVZ gränsbestämning i elektroporerade primatcerebrala organoider. Dubbel immunofluorescens för PAX6 (magenta) och TUJ1 (gul) kombinerad med DAPI-färgning (cyan) av en 32 dps marmoset cerebral organoid 2 dagar efter elektroporering med GFP-uttryckande plasmid. Immunofluorescensen för GFP visas inte. De ljusgrå streckade linjerna anger gränsen mellan VZ och SVZ/neuron-berikad zon. Bilderna togs med hjälp av ett Zeiss LSM 800 konfokalmikroskop med ett 20x mål. Skalstång = 100 μm. Förkortningar: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol; DPS = dagar efter sådd; PAX6 = parat låda 6-protein; SVZ = subventrikulär zon; TUJ1 = klass III β-tubulin; VZ = ventrikulär zon. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande fil 1: Monteringsanvisningar för elektroporeringskammare för petriskål. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De procedurer som beskrivs här representerar ett enhetligt protokoll för generering av cerebrala organoider från olika primatarter med en riktad elektroporeringsmetod. Detta möjliggör ektopiskt uttryck av en GOI i ett modellsystem som emulerar primat (inklusive mänsklig) (pato) fysiologisk neocortexutveckling. Detta enhetliga protokoll för generering av primatcerebrala organoider använder samma material (t.ex. media) och protokollsteg för alla fyra primatarter som presenteras. Utvecklingsskillnader mellan dessa arter åtgärdas genom att ändra tidpunkten för kritiska protokollsteg (dvs. neural induktion och inbäddning i basalmembranmatrisen; se ovan). Detta kan grovt återspegla skillnaderna i neurodevelopmental timing in vivo mellan dessa arter och utgör ett intressant ämne för vidare studier.

Detta tillvägagångssätt är baserat på elektroporeringsexperimenten som beskrivs i en tidigare artikel om cerebrala organoider10. Dessa experiment, som noterats av Lancaster och kollegor, begränsades emellertid av omfattande grader av apoptos, vilket inträffade på grund av en hög GFP-koncentration och ledde till uteslutning av de elektroporerade cellerna som uppvisade en stark GFP-signal10. I våra experiment fann vi att en slutlig total plasmidkoncentration (t.ex. EGFP-kodande plasmidkoncentration plus GOI-kodande plasmidkoncentration) på 1,000 ng / μL var optimal. Koncentrationer lägre än 1 000 ng / μL leder till minskad elektroporeringseffektivitet, medan höga koncentrationer över 1 000 ng / μL kan vara giftiga för de elektroporerade cellerna och leda till celldöd10. Studier som kombinerar mer än två olika expressionsplasmider är möjliga28. Den slutliga totala plasmidkoncentrationen bör dock hållas vid 1 000 ng/μl.

I en typisk elektroporeringsmetod behövs en plasmid som kodar för en fluorescensmarkör för att identifiera de framgångsrikt elektroporerade cellerna. Det finns två möjligheter att inkludera fluorescensmarkören i experimentuppställningen: i) genom att saminjicera två separata plasmider (dvs. en plasmid som kodar för markören plus en kontrollplasmid [t.ex. tom vektor] eller en plasmid som kodar för genen av intresse [GOI]) ( metoden med separata plasmider); ii) genom att injicera en plasmid som kodar för både markören och Indiens myndigheter genom att använda ett internt ribosomställe (IRES) eller en 2A självklyvande peptid (t.ex. P2A) ( metoden med en plasmid). I detta fall används en plasmid som kodar enbart fluorescensmarkören som en kontroll. Medan metoden med en plasmid resulterar i fullständigt samuttryck av fluorescensmarkören och GOI, är sådana plasmider stora i storlek, vilket resulterar i en låg elektroporeringseffektivitet. Om en hög elektroporeringseffektivitet krävs rekommenderas att metoden med separata plasmider används, eftersom det separerade uttrycket inte signifikant påverkar graden av samuttryck mellan fluorescensmarkören och de indonesiska myndigheterna samtidigt som en hög elektroporeringseffektivitet bibehålls28. I protokollet som presenteras här beskriver vi elektroporeringen med hjälp av den separata plasmidmetoden. Om metoden med en plasmid tillämpas måste stegen i protokollet justeras i enlighet därmed.

Jämfört med ett nyligen publicerat protokoll37 har vårt tillvägagångssätt tre huvudsakliga fördelar. Först riktar vi oss specifikt mot de ventrikelliknande strukturerna i hjärnorganoiden. Vi uppnår detta (i) genom att mikroinjicera de individuella ventrikelliknande strukturerna i hjärnorganoiden istället för att injicera i mitten av organoiden 37 och (ii) genom att arrangera orienteringen av hjärnorganoiden i petriskålelektrodkammaren för att optimera riktningen för det elektriska fältet (se ovan) istället för att använda en elektroporeringskyvett37. För det andra involverar detta protokoll inte användningen av en dyr nukleofektorlösning, eftersom detta tillvägagångssätt använder en fyrkantvågselektroporator i kombination med en petriskålelektrodkammare. För det tredje tillåter detta enhetliga protokoll för generering av primatcerebrala organoider studier av inte bara mänskliga utan även icke-mänskliga primatorganoider, vilket möjliggör evolutionära, jämförande och sjukdomsstudier.

Två egenskaper hos hjärnorganoiderna är avgörande för en framgångsrik elektroporering - kvaliteten på hjärnorganoiderna och storleken och kvaliteten på de ventrikelliknande strukturerna (se de representativa resultaten och figur 1B). När det gäller den första funktionen presenterar vi go och no-go-kriterier (se ovan och figur 1B) för att fortsätta med elektroporeringen. Huvudkriteriet är närvaron av tydligt synliga, genomskinliga och radiellt organiserade ventrikelliknande strukturer. Storleken på de ventrikelliknande strukturerna är den andra avgörande egenskapen för framgångsrik mikroinjektion och elektroporering. Ventrikelliknande strukturer som är för små är svåra att injicera och ger normalt inte ett tillräckligt stort antal elektroporerade celler för efterföljande analyser. Detta är den främsta anledningen till att vi använde ett modifierat cerebralt organoidprotokoll, eftersom detta protokoll, i våra händer och för dessa iPSC-linjer-producerar, i jämförelse med andra protokoll, välorganiserade ventrikelliknande strukturer som är tillräckligt stora för att elektroporeras. I princip kan elektroporeringsmetoden som presenteras här tillämpas på alla andra neurala organoidprotokoll så länge det senare ger tillräckligt stora och organiserade ventrikelliknande strukturer (se de representativa resultaten och figur 1B). Dessutom kan detta protokoll också tillämpas på andra primater i framtiden, såsom krabbätande makak (Macaca fascicularis), den klassiska primatmodellen som används i industriell forskning. Detta skulle kräva antingen identifiering av de korrekta kritiska tidpunkterna (se ovan) i det modifierade cerebrala organoidprotokollet som beskrivs här eller upprättandet av ett neuralt organoidprotokoll som ger upphov till lämpliga stora ventrikelliknande strukturer (se ovan).

Efter framgångsrik elektroporering kan hjärnorganoiderna odlas ytterligare under olika tidsperioder för att tillåta den genetiska modifieringen som undersöks att påverka de olika cellpopulationerna inom den utvecklande cerebrala organoiden. Dessa sträcker sig från de olika neurala stampopulationerna till de olika typerna av neuroner som finns i hjärnorganoiden (se de representativa resultaten och Fischer et al.28). Dessa cellpopulationer kan sedan analyseras antingen genom kryosektion och immunofluorescensfärgning (se figur 4) eller genom helmonterad immunofluorescensfärgning och optisk rensning (se figur 5 och video 1) av de PFA-fixerade elektroporerade cerebrala organoiderna.

Hittills har elektroporering av hjärnorganoider huvudsakligen använts för ektopiskt uttryck av gener för att utföra genfunktionsstudier 10,28,38,39, levande avbildning 10,39,40, visualisering av cellmorfologi 40 och celldelningsspårning 10. Men i det första cerebrala organoidpapperet introducerades shRNA i organoider genom elektroporering för att tysta genuttryck genom RNA-interferens. Detta visade potentialen för elektroporering att användas inte bara för ektopiskt uttryck av gener utan också för KD eller till och med KO av gener. Nyligen visades att CRISPR/Cas9-medierade KO kan uppnås genom elektroporering in utero av musembryon27 och elektroporering av mänsklig fostervävnad ex vivo41. Sådana CRISPR / Cas9-baserade KO kan lätt tillämpas på elektroporering av cerebrala organoider, eftersom den huvudsakliga mekanismen för elektroporering är densamma, och detta skulle ytterligare utöka användbarheten av detta tillvägagångssätt.

En potentiell ytterligare tillämpning av elektroporering i cerebrala organoider är räddning av specifika KO-fenotyper i fall där det inte är möjligt att erhålla en specifik KO för de indonesiska myndigheterna på grund av mycket likartade sekvenser mellan de indonesiska myndigheterna och dess förfäders versioner. Detta gäller särskilt för nyligen utvecklade människospecifika gener. I sådana fall är det inte möjligt (även med användning av CRISPR/Cas9-tekniken) att erhålla en specifik KO (vilket var fallet för ARHGAP11A och ARHGAP11B28). En lösning på detta dilemma är att generera en dubbel KO av de indonesiska myndigheterna och dess förfäders gen och att rädda de indonesiska myndigheterna ensamma, den ursprungliga genen ensam eller båda generna tillsammans genom elektroporering. Dessa elektroporerade organoider kan sedan betraktas som en selektiv förfädergen KO, en selektiv GOI KO respektive en kontroll. Detta skulle göra det möjligt att behandla dessa geners individuella bidrag till fenotypen (se t.ex. Fischer et al.28). En annan potentiell tillämpning är relaterad till analys av cerebrala organoider genererade från patient-härledda iPSCs. I sådana fall är det inte klart om den observerade fenotypen beror på en mutation i kandidatgenen eller på någon annan mutation som finns i patienten. Här skulle elektroporeringen av kandidatgenen och (potentiell) räddning av fenotypen göra det möjligt att validera denna gens roll i sjukdomen (se t.ex. Lancaster et al.10).

Sammantaget erbjuder protokollet som presenteras här ett snabbt och kostnadseffektivt tillvägagångssätt för att genetiskt modifiera cellpopulationer inom de ventrikelliknande strukturerna hos primatcerebrala organoider. Detta ger ett effektivt verktyg för studier av utvecklingsneurologiska och evolutionära processer som också kan tillämpas för sjukdomsmodellering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några intressekonflikter.

Acknowledgments

Vi ber om ursäkt till alla forskare vars arbete inte kunde citeras på grund av utrymmesbegränsningar. Vi tackar Ulrich Bleyer från de tekniska tjänsterna vid DPZ och Hartmut Wolf från verkstaden vid MPI-CBG för konstruktionen av petriskålelektrodkamrarna; Stoyan Petkov och Rüdiger Behr för tillhandahållande av humana (iLonza2.2), rhesusmakak (iRh33.1) och marmoset (cj_160419_5) iPSCs; Sabrina Heide för kryosektion och immunofluorescensfärgning; och Neringa Liutikaite och César Mateo Bastidas Betancourt för kritisk läsning av manuskriptet. Arbetet i W.B.H.:s laboratorium stöddes av ett ERA-NET NEURON (MicroKin) bidrag. Arbetet i M.H:s laboratorium stöddes av ett ERC Starting Grant (101039421).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20 µL Microloader Eppendorf 5242956003
2-Mercaptoethanol Merck 8.05740.0005
35 mm cell culture dishes Sarstedt 83.3900
60 mm cell culture dishes CytoOne CC7682-3359
Activin A Sigma-Aldrich SRP3003
AOC1 Selleckchem S7217
Axio Observer.Z1 Inverted Fluorescence Microscope Zeiss replacable by comparable fluorescent microscopes
AZD0530 Selleckchem  S1006
B-27 Supplement with Vitamin A (retinoic acid, RA) (50x) Gibco 17504-044
B-27 Supplement without Vitamin A (50x) Gibco 12587-010
BTX ECM 830 Square Wave Electroporation System BTX 45-2052
CGP77675 Sigma-Aldrich SML0314
Chimpanzee induced pluripotent stem cell line Sandra A doi: 10.7554/elife.18683 
Common marmoset induced pluripotent stem cell line cj_160419_5 doi: 10.3390/cells9112422
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) Gibco 11320-033
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) Gibco 14190-094 pH 7.0−7.3; warm to room temperature before use
Fast Green Sigma-Aldrich F7252-5G
Forskolin Selleckchem 2449
GlutaMAX Supplement (100x) Gibco 35050-061 glutamine substitute supplement
Heparin (1 mg/mL stock) Sigma-Aldrich H3149
Human induced pluripotent stem cell line iLonza2.2 doi: 10.3390/cells9061349
Human Neurotrophin-3 (NT-3) PeproTech 450-03
Insulin Sigma-Aldrich 19278
IWR1 Sigma-Aldrich I0161
Leica MS5 stereomicroscope (MDG 17 transmitted-light base) Leica 10473849 replacable by comparable stereomicroscopes
Matrigel Corning 354277/354234 basement membrane matrix; alternatively, Geltrex (ThermoFisher Scientific, A1413302) can be used
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) Sigma-Aldrich M7145
N-2 Supplement (100x) Gibco 17502-048
Neurobasal medium Gibco 21103-049
Parafilm Sigma-Aldrich P7793
Paraformaldehyde  Merck 818715 handle with causion due to cancerogenecity
Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL) PanBiotech P06-07100
Petri dish electrode chamber self-produced (see Supplemental File 1) also commertially available
Pre-Pulled Glass Pipettes WPI TIP10LT borosilicate glass pipettes with long taper, 10 µm tip diameter
Pro-Survival Compound MerckMillipore 529659
Recombinant Human/Murine/RatBrain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) PeproTech AF-450-02
Rhesus macaque induced pluripotent stem cell line iRh33.1 doi: 10.3390/cells9061349
StemMACS iPS-Brew XF Miltenyi Biotech 130-104-368
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent Gibco A1110501 proteolytic and collagenolytic enzyme mixture
TrypLE Gibco 12604-013 recombinant trypsin substitute; warm to room temperature before use
Ultra-Low Attachment 96-well plates Costar 7007
Y27632 Stemcell Technologies 72305

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Marchetto, M. C. N., Winner, B., Gage, F. H. Pluripotent stem cells in neurodegenerative and neurodevelopmental diseases. Human Molecular Genetics. 19 (R1), R71-R76 (2010).
  2. Zhao, X., Bhattacharyya, A. Human models are needed for studying human neurodevelopmental disorders. The American Journal of Human Genetics. 103 (6), 829-857 (2018).
  3. Zhang, W., et al. Modeling microcephaly with cerebral organoids reveals a WDR62–CEP170–KIF2A pathway promoting cilium disassembly in neural progenitors. Nature Communications. 10 (1), 2612 (2019).
  4. Sasaki, E., et al. Generation of transgenic non-human primates with germline transmission. Nature. 459 (7246), 523-527 (2009).
  5. Niu, Y., et al. Transgenic rhesus monkeys produced by gene transfer into early-cleavage–stage embryos using a simian immunodeficiency virus-based vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (41), 17663-17667 (2010).
  6. Niu, Y., et al. Generation of gene-modified cynomolgus monkey via Cas9/RNA-mediated gene targeting in one-cell embryos. Cell. 156 (4), 836-843 (2014).
  7. Shi, L., et al. Transgenic rhesus monkeys carrying the human MCPH1 gene copies show human-like neoteny of brain development. National Science Review. 6 (3), 480-493 (2019).
  8. Heide, M., et al. Human-specific ARHGAP11B increases size and folding of primate neocortex in the fetal marmoset. Science. 369 (6503), 546-550 (2020).
  9. Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell–derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20284-20289 (2013).
  10. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  11. Kelava, I., Lancaster, M. A. Stem cell models of human brain development. Cell Stem Cell. 18 (6), 736-748 (2016).
  12. Lullo, E. D., Kriegstein, A. R. The use of brain organoids to investigate neural development and disease. Nature Reviews Neuroscience. 18 (10), 573-584 (2017).
  13. Arlotta, P. Organoids required! A new path to understanding human brain development and disease. Nature Methods. 15 (1), 27-29 (2018).
  14. Heide, M., Huttner, W. B., Mora-Bermúdez, F. Brain organoids as models to study human neocortex development and evolution. Current Opinion in Cell Biology. 55, 8-16 (2018).
  15. Qian, X., Song, H., Ming, G. Brain organoids: Advances, applications and challenges. Development. 146 (8), dev166074 (2019).
  16. Sun, N., Meng, X., Liu, Y., Song, D., Jiang, C., Cai, J. Applications of brain organoids in neurodevelopment and neurological diseases. Journal of Biomedical Science. 28 (1), 30 (2021).
  17. Fischer, J., Heide, M., Huttner, W. B. Genetic modification of brain organoids. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 558 (2019).
  18. Pașca, S. P., et al. A nomenclature consensus for nervous system organoids and assembloids. Nature. 609 (7929), 907-910 (2022).
  19. Kyrousi, C., Cappello, S. Using brain organoids to study human neurodevelopment, evolution and disease. Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. 9 (1), e347 (2020).
  20. Teriyapirom, I., Batista-Rocha, A. S., Koo, B. -K. Genetic engineering in organoids. Journal of Molecular Medicine. 99 (4), 555-568 (2021).
  21. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).
  22. Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294 (5544), 1071-1074 (2001).
  23. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
  24. Kawasaki, H., Toda, T., Tanno, K. In vivo genetic manipulation of cortical progenitors in gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Biology Open. 2 (1), 95-100 (2012).
  25. Kawasaki, H., Iwai, L., Tanno, K. Rapid and efficient genetic manipulation of gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Molecular Brain. 5 (1), 24 (2012).
  26. Bai, J., et al. RNAi reveals doublecortin is required for radial migration in rat neocortex. Nature Neuroscience. 6 (12), 1277-1283 (2003).
  27. Kalebic, N., et al. CRISPR/Cas9-induced disruption of gene expression in mouse embryonic brain and single neural stem cells in vivo. EMBO reports. 17 (3), 338-348 (2016).
  28. Fischer, J., et al. Human-specific ARHGAP11B ensures human-like basal progenitor levels in hominid cerebral organoids. EMBO Reports. 23 (11), e54728 (2022).
  29. Stauske, M., et al. Non-human primate iPSC generation, cultivation, and cardiac differentiation under chemically defined conditions. Cells. 9 (6), 1349 (2020).
  30. Mora-Bermúdez, F., et al. Differences and similarities between human and chimpanzee neural progenitors during cerebral cortex development. eLife. 5, e18683 (2016).
  31. Petkov, S., Dressel, R., Rodriguez-Polo, I., Behr, R. Controlling the switch from neurogenesis to pluripotency during marmoset monkey somatic cell reprogramming with self-replicating mRNAs and small molecules. Cells. 9 (11), 2422 (2020).
  32. Camp, J. G., et al. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (51), 15672-15677 (2015).
  33. Kanton, S., et al. Organoid single-cell genomic atlas uncovers human-specific features of brain development. Nature. 574 (7778), 418-422 (2019).
  34. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
  35. Cakir, B., et al. Engineering of human brain organoids with a functional vascular-like system. Nature Methods. 16 (11), 1169-1175 (2019).
  36. Masselink, W., et al. Broad applicability of a streamlined ethyl cinnamate-based clearing procedure. Development. 146 (3), dev166884 (2019).
  37. Denoth-Lippuner, A., Royall, L. N., Gonzalez-Bohorquez, D., Machado, D., Jessberger, S. Injection and electroporation of plasmid DNA into human cortical organoids. STAR Protocols. 3 (1), 101129 (2022).
  38. Denoth-Lippuner, A., et al. Visualization of individual cell division history in complex tissues using iCOUNT. Cell Stem Cell. 28 (11), 2020.e12-2034.e12 (2021).
  39. Kelava, I., Chiaradia, I., Pellegrini, L., Kalinka, A. T., Lancaster, M. A. Androgens increase excitatory neurogenic potential in human brain organoids. Nature. 602 (7895), 112-116 (2022).
  40. Lancaster, M. A., et al. Guided self-organization and cortical plate formation in human brain organoids. Nature Biotechnology. 35 (7), 659-666 (2017).
  41. Kalebic, N., et al. Neocortical expansion due to increased proliferation of basal progenitors is linked to changes in their morphology. Cell Stem Cell. 24 (4), 535.e9-550.e9 (2019).

Tags

Denna månad i JoVE nummer 193
Riktad mikroinjektion och elektroporering av primatcerebrala organoider för genetisk modifiering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tynianskaia, L., Eşiyok, N.,… More

Tynianskaia, L., Eşiyok, N., Huttner, W. B., Heide, M. Targeted Microinjection and Electroporation of Primate Cerebral Organoids for Genetic Modification. J. Vis. Exp. (193), e65176, doi:10.3791/65176 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter