Summary
Elektroporering av primater cerebrale organoider gir en presis og effektiv tilnærming til å introdusere forbigående genetisk modifikasjon (er) i forskjellige stamtyper og nevroner i et modellsystem nær primat (pato) fysiologisk neocortex utvikling. Dette tillater studier av nevrodevelopmental og evolusjonære prosesser og kan også brukes til sykdomsmodellering.
Abstract
Hjernebarken er den ytterste hjernestrukturen og er ansvarlig for behandlingen av sensorisk inngang og motorisk utgang; Det blir sett på som sete for høyere ordens kognitive evner hos pattedyr, spesielt primater. Å studere genfunksjoner i primathjerner er utfordrende av tekniske og etiske årsaker, men etableringen av hjerneorganoidteknologien har gjort det mulig å studere hjernens utvikling i tradisjonelle primatmodeller (f.eks. Rhesus macaque og vanlig marmoset), så vel som i tidligere eksperimentelt utilgjengelige primatarter (f.eks. Store aper), i et etisk forsvarlig og mindre teknisk krevende system. Videre tillater menneskelige hjerneorganoider avansert undersøkelse av nevrodevelopmental og nevrologiske lidelser.
Som hjerneorganoider rekapitulerer mange prosesser for hjernens utvikling, representerer de også et kraftig verktøy for å identifisere forskjeller i, og funksjonelt sammenligne, de genetiske determinanter som ligger til grunn for hjernens utvikling av ulike arter i en evolusjonær sammenheng. En stor fordel ved å bruke organoider er muligheten til å innføre genetiske modifikasjoner, som tillater testing av genfunksjoner. Innføringen av slike modifikasjoner er imidlertid arbeidskrevende og dyr. Denne artikkelen beskriver en rask og kostnadseffektiv tilnærming til genetisk modifisering av cellepopulasjoner innenfor ventrikkellignende strukturer av primat-cerebrale organoider, en subtype av hjerneorganoider. Denne metoden kombinerer en modifisert protokoll for pålitelig generering av cerebrale organoider fra menneske-, sjimpanse-, rhesusmakak- og vanlige marmoset-avledede induserte pluripotente stamceller (iPSCs) med en mikroinjeksjons- og elektroporeringstilnærming. Dette gir et effektivt verktøy for studiet av nevrodevelopmental og evolusjonære prosesser som også kan brukes til sykdomsmodellering.
Introduction
Å undersøke (pato)fysiologisk utvikling og utvikling av hjernebarken er en formidabel oppgave som hemmes av mangelen på egnede modellsystemer. Tidligere var slike studier begrenset til todimensjonale cellekulturmodeller (som primære nevrale stamceller eller nevroncellekulturer) og evolusjonært fjerne dyremodeller (som gnagere)1,2. Selv om disse modellene er nyttige for å ta opp visse spørsmål, er de begrenset i modellering av kompleksiteten, celletypesammensetningen, cellulær arkitektur og genuttrykksmønstre i den utviklende humane neocortex i sunne og syke tilstander. Disse begrensningene fører for eksempel til dårlig oversettbarhet av musemodeller av menneskelige sykdommer til den menneskelige situasjonen, som beskrevet for visse tilfeller av mikrocefali (f.eks. Zhang et al.3). Nylig har transgene ikke-menneskelige primater, som er en evolusjonært, funksjonelt og morfologisk nærmere modell for utvikling av menneskelig neocortex, kommet i fokus 4,5,6,7,8 da de overvinner mange begrensninger i cellekultur- og gnagerbaserte modeller. Bruk av ikke-menneskelige primater i forskning er imidlertid ikke bare svært kostbart og tidkrevende, men reiser også etiske bekymringer. Mer nylig har utviklingen av hjerneorganoidteknologi 9,10 dukket opp som et lovende alternativ som løser mange av begrensningene til tidligere modeller 11,12,13,14,15,16.
Hjerneorganoider er tredimensjonale (3D), flercellede strukturer som etterligner hovedtrekkene i cytoarkitekturen og celletypesammensetningen til en eller flere hjernegrupper for et definert utviklingstidsvindu 11,12,13,14,17. Disse 3D-strukturene genereres enten fra induserte pluripotente stamceller (iPSCs) eller, hvis tilgjengelig for artene av interesse, fra embryonale stamceller (ESC). Generelt kan to typer hjerneorganoider skilles ut fra metoden som brukes: ikke-styrte og regionaliserte (guidede) hjerneorganoider18. Ved generering av sistnevnte type organoider er det gitt små molekyler eller faktorer som styrer differensieringen av de pluripotente stamcellene til organoider i en bestemt hjernegruppe (f.eks. Forhjerneorganoider)18. I motsetning til dette, i ikke-styrte organoider, styres differensieringen ikke av tilsetning av små molekyler, men er utelukkende avhengig av spontan differensiering av iPSCs / ESCs. De resulterende hjerneorganoidene består av celletyper som representerer forskjellige hjernegrupper (f.eks. cerebrale organoider)18. Hjerneorganoider kombinerer mange viktige funksjoner i hjernens utvikling med relativt kostnadseffektiv og tidseffektiv generering fra alle arter av interesse som iPSCs eller ESCs er tilgjengelige for11,12,13,14. Dette gjør hjerneorganoider til en utmerket modell for mange typer nevrobiologiske studier, alt fra evolusjonære og utviklingsspørsmål til sykdomsmodellering og narkotikatesting15,16. Å ta opp slike spørsmål ved hjelp av hjerneorganoider avhenger imidlertid sterkt av tilgjengeligheten av forskjellige metoder for genetisk modifikasjon.
Et viktig aspekt ved å studere neocortex (pato)fysiologisk utvikling og dens utvikling er funksjonell analyse av gener og genvarianter. Dette oppnås vanligvis ved (ektopisk) uttrykk og / eller ved knock-down (KD) eller knock-out (KO) av disse genene. Slike genetiske modifikasjoner kan klassifiseres i stabil og forbigående genetisk modifikasjon, samt at modifikasjonene er tidsmessig og romlig begrenset eller ikke begrenset. Stabil genetisk modifikasjon er definert ved innføring av en genetisk endring i vertsgenomet som overføres til alle påfølgende cellegenerasjoner. Avhengig av tidspunktet for genetisk modifisering, kan det påvirke alle cellene i en organoid eller kan begrenses til visse cellepopulasjoner. Oftest oppnås stabil genetisk modifikasjon i hjerneorganoider på iPSC / ESC-nivå ved å anvende lentivirus, transposonlignende systemer og CRISPR / Cas9-teknologien (gjennomgått av f.eks. Fischer et al.17, Kyrousi et al.19 og Teriyapirom et al.20). Dette har fordelen at alle celler i hjerneorganoiden bærer den genetiske modifikasjonen, og at den ikke er tidsmessig eller romlig begrenset. Imidlertid er generering og karakterisering av disse stabile iPSC / ESC-linjene svært tidkrevende, og tar ofte flere måneder før de første modifiserte hjerneorganoidene kan analyseres (gjennomgått av f.eks. Fischer et al.17, Kyrousi et al.19 eller Teriyapirom et al.20).
I motsetning til dette er forbigående genetisk modifikasjon definert ved levering av genetisk last (f.eks. Et genuttrykksplasmid) som ikke integreres i vertsgenomet. Selv om denne modifikasjonen i prinsippet kan overføres til etterfølgende cellegenerasjoner, vil den leverte genetiske lasten gradvis fortynnes med hver celledeling. Derfor er denne typen genetisk modifikasjon vanligvis tidsmessig og romlig begrenset. Forbigående genetisk modifikasjon kan utføres i hjerneorganoider ved adenoassosierte virus eller ved elektroporering (gjennomgått av f.eks. Fischer et al.17, Kyrousi et al.19 og Teriyapirom et al.20), med sistnevnte beskrevet i detalj i denne artikkelen. I motsetning til stabil genmodifisering er denne tilnærmingen svært rask og kostnadseffektiv. Faktisk kan elektroporering utføres i løpet av minutter, og avhengig av målcellepopulasjonen (e), er elektroporerte organoider klare for analyse innen dager (gjennomgått av f.eks. Fischer et al.17 og Kyrousi et al.19). Imidlertid kan brutto morfologiske endringer i hjerneorganoiden, som forskjeller i størrelse, ikke oppdages ved hjelp av denne metoden, da denne typen genetisk modifikasjon er tidsmessig og romlig begrenset. Denne begrensningen kan også være en fordel, for eksempel ved å studere individuelle cellepopulasjoner i organoiden eller effektene på hjerneorganoider ved bestemte utviklingstidspunkter (gjennomgått av f.eks. Fischer et al.17 og Kyrousi et al.19).
En klassisk tilnærming til å studere genfunksjon under hjernens utvikling og evolusjon er i utero elektroporering. I utero er elektroporering en velkjent og nyttig teknikk for levering av genuttrykkskonstruksjoner i gnagere 21,22,23 og 24,25 hjerner. Først mikroinjiseres en løsning som inneholder uttrykkskonstruksjonen(e) av interesse gjennom livmorveggen inn i en bestemt ventrikkel i den embryonale hjernen, avhengig av regionen som skal målrettes. I det andre trinnet brukes elektriske pulser for å transfektere cellene som direkte fôrer den målrettede ventrikkelen. Denne tilnærmingen er ikke bare begrenset til ektopisk uttrykk eller overekspresjon av gener, da den også kan brukes i KD- eller KO-studier ved å mikroinjisere kort hårnål (shRNA) eller CRISPR/Cas9 (i form av ekspresjonsplasmider eller ribonukleoproteiner [RNP]), henholdsvis26,27. Imidlertid har in utero elektroporering av mus, rotte og ilderembryoer de samme begrensningene som beskrevet ovenfor for disse dyremodellene.
Ideelt sett ønsker man å utføre i utero elektroporering direkte i primater. Selv om dette i prinsippet er teknisk mulig, utføres ikke elektroporering in utero hos primater på grunn av etiske bekymringer, høye vedlikeholdskostnader for dyr og små kullstørrelser. For visse primater, som store aper (inkludert mennesker), er dette ikke mulig i det hele tatt. Imidlertid har disse primatene det største potensialet for studiet av menneskelig (pato)fysiologisk neocortex-utvikling og dens utvikling. En løsning på dette dilemmaet er å anvende elektroporasjonsteknikken på primathjerneorganoider28.
Dette papiret presenterer en protokoll for elektroporering av en subtype av primathjerneorganoider, primater, cerebrale organoider. Denne tilnærmingen tillater rask og kostnadseffektiv genetisk modifisering av cellepopulasjoner innenfor de ventrikkellignende strukturer av organoider. Spesielt beskriver vi en enhetlig protokoll for generering av primater cerebrale organoider fra mennesker (Homo sapiens), sjimpanse (Pan troglodytes), rhesus macaque (Macaca mulatta) og vanlig marmoset (Callithrix jacchus) iPSCs. Videre beskriver vi mikroinjeksjons- og elektroporasjonsteknikken i detalj og gir "go" og "no-go" kriterier for å utføre primat cerebral organoid elektroporering. Denne tilnærmingen er et effektivt verktøy for å studere (pato)fysiologisk neocortex-utvikling og dens utvikling i en modell spesielt nær den menneskelige situasjonen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kultur av primat-iPSCs
MERK: På grunn av sin robusthet kan metoden som presenteres her brukes på hvilken som helst primat iPSC-linje. I denne artikkelen beskriver vi cerebral organoidproduksjon fra humane (iLonza2.2)29, sjimpanse (Sandra A)30, rhesusmakaker (iRh33.1)29 og vanlig marmoset (cj_160419_5)31 iPSC-linjer. Kulturforholdene er oppsummert i tabell 1. Se materialfortegnelsen for detaljer relatert til alle materialer, reagenser og utstyr som brukes i denne protokollen.
- For dyrking av de respektive iPSCene, følg de opprinnelig beskrevne kulturforholdene. Generelt, for vellykket generering og elektroporering av cerebrale organoider, bruk iPSC-linjer som ikke har blitt dyrket i mer enn 90 passasjer. I tillegg, i begynnelsen av cerebral organoid generering, sørg for at iPSCs viser trekk av pluripotens uten tegn på differensiering.
2. Generering av cerebrale organoider fra primat iPSCs
MERK: Protokollen for cerebral organoidgenerering er basert på en modifisert versjon 28,30,32,33 av den opprinnelige cerebrale organoidprotokollen 10,34 med noen artsspesifikke modifikasjoner (detaljert nedenfor).
- Såing av iPSCs for å generere embryoidlegemer (EB)
- Når iPSCene har nådd 80% -90% samløp, vask dem med Dulbeccos fosfatbufrede saltvann (DPBS), og tilsett 500 μL rekombinant trypsinerstatning eller 1 ml proteolytisk og kollagenolytisk blanding.
MERK: Vanligvis dyrkes iPSC i en 60 mm cellekulturskål for å oppnå omtrent 900 000 celler, noe som er nok til å generere 96 cerebrale organoider. Celletallene kan justeres avhengig av antall organoider som trengs. Vær oppmerksom på at ikke alle genererte cerebrale organoider kan være egnet for elektroporering. - Inkuber fatet ved 37 °C i 2 minutter for å løsne cellene.
MERK: Opptil ytterligere 2 minutter inkubasjon ved 37 °C kan være nødvendig, avhengig av iPSC-linjen eller enzymet som brukes. Det anbefales å undersøke parabolen under et mikroskop for å sikre at cellene har begynt å løsne. - Tilsett 1,5 ml forvarmet (37 °C) iPSC dyrkningsmedium for å stoppe reaksjonen, og pipett opp og ned 7x-10x (ikke mer enn 10x) for å dissosiere cellene fra cellekulturskålen og for å oppnå en encellesuspensjon.
- Overfør cellesuspensjonen til et 15 ml konisk sentrifugerør, og sentrifuge cellene ved 200 × g i 5 minutter ved romtemperatur.
- Aspirer supernatanten og resuspender pelleten i 2 ml iPSC kulturmedium supplert med enten 50 μM Y27632 eller 50 μM pro-overlevelsesforbindelse.
- Bruk 10 μL av cellesuspensjonen til å telle cellene ved hjelp av et Neubauer-kammer.
- Juster cellesuspensjonen til en konsentrasjon på 9000 celler per 150 μL (60 000 celler/ml) ved bruk av iPSC kulturmedium supplert med 50 μM Y27632 eller 50 μM pro-overlevelsesforbindelse.
- For å generere embryoidlegemer (EB), frø 150 μL av cellesuspensjonen i hver brønn med en 96-brønnsplate med ultralavt vedlegg. Mens du pipetterer, rist forsiktig røret som inneholder cellesuspensjonen for å forhindre at cellene sedimenterer.
- Dyrk EB-ene i en fuktet atmosfære med 5 % CO2 og 95 % luft ved 37 °C (0 dager etter såing [dps]). Ikke forstyrr EB-ene de første 24 timene etter såing.
MERK: EB generert fra marmoset iPSCs må dyrkes i en ydmyket atmosfære under hypoksiske forhold (5% CO 2, 5% O 2 og 90% N 2) ved 37 ° C. - Etter ~48 h (2 dps), bytt medium til iPSC kulturmedium uten Y27632/pro-overlevelsesforbindelse. Fjern 100 μL medium per brønn, og tilsett 150 μL forvarmet (37 °C) ferskt medium uten Y27632. Gå rad for rad.
- Utfør ytterligere middels endringer annenhver dag; fjern 150 μL medium fra hver brønn, og tilsett 150 μL forvarmet (37 °C) ferskt medium uten Y27632/pro-overlevelsesforbindelse per brønn.
MERK: Etter 4-5 dps skal periferien av EB-ene bli gjennomskinnelig.
- Når iPSCene har nådd 80% -90% samløp, vask dem med Dulbeccos fosfatbufrede saltvann (DPBS), og tilsett 500 μL rekombinant trypsinerstatning eller 1 ml proteolytisk og kollagenolytisk blanding.
- Induksjon av nevroektoderm
MERK: Generelt bør EB-er av god kvalitet ha glatte konturer og gjennomskinnelige grenser på dette stadiet. Tidspunktene for nevral induksjon varierer litt mellom primatarter og iPSC-linjer. Når det gjelder cellelinjene som brukes her (se avsnitt 1 og materialfortegnelse), må nevral induksjon for marmoset EB vanligvis startes ved 4 dps, for rhesusmakaker ved 5 dps, og for humane og sjimpanse-EBer ved 4-5 dps (figur 1A), avhengig av tilstanden til EBs (se ovenfor).- Fjern 150 μL medium fra hver brønn i den første raden av 96-brønnplaten, og tilsett 150 μL forvarmet (37 °C) nevral induksjonsmedium (se tabell 2) per brønn i samme rad.
- Fortsett å endre mediet som beskrevet ovenfor rad for rad for hele 96-brønnsplaten. Utfør ytterligere endringer i nevrale induksjonsmedium (NIM) annenhver dag ved å fjerne 150 μL NIM fra hver brønn og tilsette 150 μL forvarmet (37 °C) fersk NIM.
MERK: Fra nå av bør marmoset-EB dyrkes under de samme forholdene som de andre primat-EB-ene (fuktet atmosfære på 5 % CO2 og 95 % luft ved 37 °C).
- Innebygging i kjellermembranmatrise
MERK: Når EBene har utviklet et uttalt, gjennomskinnelig, radialt organisert nevroepitel på overflaten, må strukturell støtte gis for utvikling av ventrikkellignende strukturer. Dette oppnås ved å legge inn EB-ene i en kjellermembranmatrise. På grunn av forskjeller i utviklingshastigheter er marmoset og rhesus macaque EBs klare for innebygging allerede ved 7 dps, mens menneske- og sjimpanse-EBs vanligvis er innebygd på 8-9 dps. For enkelhets skyld refererer kjellermembranmatrise bare til Matrigel i denne protokollen. Geltrex kan imidlertid brukes som erstatning.- Som forberedelse til innebygging, UV-steriliserer saks, tang, et lite stativ for 0,2 ml rør og tre til seks kvadrater parafilm behandlet med 70% (vol / vol) etanol under den laminære strømningshetten i 15 minutter. La kjellermembranmatrisen tine på is i flere timer (~ 1,5 ml kjellermembranmatrise er vanligvis nok for 96 EB).
MERK: Oppbevar alltid membranmatrisen i kjelleren på is. - Lag et 4 x 4 smilehullsrutenett på parafilmen. Plasser parafilmgitteret på rørstativet på 0,2 ml slik at den papirhylte siden vender opp, og trykk forsiktig en hansket finger mot hvert hull i stativet.
- Fjern papiret, og klipp smilehullsgitteret ut av parafilmfirkanten ved hjelp av saks for å justere størrelsen slik at den passer inn i en 60 mm cellekulturfat. Plasser den fordypede parafilmen tilbake på 0,2 ml rørstativet for å gi grunnlag for generering av kjellermembranmatrisedråper.
- Bruk en pipette med en kuttet 200 μL pipettespiss og overfør EB-ene forsiktig etter hverandre fra brønnen i kulturskålen til parafilmgropene.
- Etter å ha flyttet 16 EB-er til rutenettet, ta en ny 200 μL pipettespiss og fjern det gjenværende mediet fra gropene.
- Pipett en dråpe (~15 μL) kjellermembranmatrise på hver dimple inneholdende en EB.
- Ta en 10 μL pipettespiss og flytt EB-ene raskt inn i midten av hver dråpe uten å forstyrre dråpekantene.
- Plasser den fordypede parafilmen med kjellermembranmatrisedråpene i en 60 mm cellekulturskål, og inkuber i 15-30 minutter ved 37 °C for å la matrisen polymerisere.
- For å løsne de matriseinnebygde EB-ene fra parafilmen, tilsett 5 ml differensieringsmedium (DM) uten vitamin A ( se tabell 2) i fatet, og snu parafilmfirkanten opp ned med tang slik at siden med EB-ene vender mot bunnen av fatet.
- Rist forsiktig fatet for å få matriksdråpene i kjellermembranen som inneholder EB-ene til å løsne fra parafilmen. Hvis noen av dem fortsatt er festet, ta en kant av parafilmfirkanten med tang, og rull den raskt opp mot midten av fatet flere ganger.
- Dyrk: cerebrale organoider på en orbital shaker ved 55 rpm i en ydmyket atmosfære av 5% CO2 og 95% luft ved 37 ° C. Hold dem i DM uten vitamin A med middels endringer annenhver dag. For å indusere produksjonen av nevroner, bytt til DM med vitamin A (retinsyre, RA) etter 13 dps for marmoset og rhesus macaque cerebrale organoider eller 14-15 dps for humane og sjimpanse cerebrale organoider (figur 1A). Fra dette tidspunktet bytter du medium hver 3-4 dag.
MERK: For å støtte nevronoverlevelse kan DM med vitamin A suppleres med 20 μg / ml humant nevrotrofin 3 (NT3), 20 μg / ml hjerneavledet nevrotrofisk faktor (BDNF) og 1 μL / ml kjellermembranmatrise fra 40 dps på.
- Som forberedelse til innebygging, UV-steriliserer saks, tang, et lite stativ for 0,2 ml rør og tre til seks kvadrater parafilm behandlet med 70% (vol / vol) etanol under den laminære strømningshetten i 15 minutter. La kjellermembranmatrisen tine på is i flere timer (~ 1,5 ml kjellermembranmatrise er vanligvis nok for 96 EB).
3. Elektroporering av primater cerebrale organoider
MERK: Fra et teknisk synspunkt kan elektroporering av cerebrale organoider utføres så snart de ventrikkellignende strukturer er uttalt nok til å bli målrettet ved mikroinjeksjon. Det optimale tidsvinduet for elektroporering avhenger av det biologiske spørsmålet og cellepopulasjonen(e) av interesse. For eksempel, hvis apikale progenitorer (AP) er hovedmålet, er cerebrale organoider på rundt 30 dps allerede egnet. Hvis basale progenitorer (BP) eller nevroner er hovedmålene, bør eldre cerebrale organoider på mer enn 50 dps brukes (se for eksempel Fischer et al.28).
- Klargjøring av elektroporeringsoppsettet
MERK: Elektroporeringseffektiviteten påvirkes sterkt av størrelsen og konsentrasjonen av det elektroporerte plasmidet (e) (se diskusjonsdelen for detaljer).- Forbered en tilstrekkelig mengde elektroporasjonsblanding for kontroll og gen av interesse (GOI), for eksempel 10 μL elektroporasjonsblanding for hver kontroll og GOI for å elektroporere ca. 30 cerebrale organoider per tilstand.
MERK: For sammensetningen av elektroporasjonsblandingene, se tabell 3. - Forvarm (ikke-steril) Dulbeccos modifiserte Eagle medium/næringsstoffblanding F-12 (DMEM/F12) og DM med vitamin A til 37 °C. Forbered en liten slikkepott og fin og vanlig saks, og spray instrumentene med 70% (vol/vol) etanol.
MERK: Følgende trinn kan utføres enten under sterile eller ikke-sterile tilstander, da DM inneholder antibiotika (se tabell 2). Vår erfaring er at fravær av sterilitet aldri har ført til forurensning. - Forbered 35 mm cellekulturretter, og koble petriskålelektrodekammeret til elektroporatoren.
MERK: Petri parabolelektrodekamre er kommersielt tilgjengelige. De kan imidlertid enkelt produseres på en kostnadseffektiv måte (se tilleggsfil 1). - Bruk mikrolasterspisser til å fylle mikroinjeksjonsnåler med 8 μL av hver elektroporeringsblanding. Klipp spissene på nålene med fin saks før første gangs bruk for å oppnå en stabil strømning. Fjern imidlertid bare en liten del av spissen, da en stump og bred spiss kan skade organoidene alvorlig.
MERK: Mikroinjeksjonsnåler er enten kommersielt tilgjengelige som forhåndstrukne mikroinjeksjonsnåler eller kan trekkes i laboratoriet hvis en nåletrekker er tilgjengelig. Følg produsentens anvisninger for å generere mikroinjeksjonsnåler med en lang konisk og en diameter på 10 μm.
- Forbered en tilstrekkelig mengde elektroporasjonsblanding for kontroll og gen av interesse (GOI), for eksempel 10 μL elektroporasjonsblanding for hver kontroll og GOI for å elektroporere ca. 30 cerebrale organoider per tilstand.
- Mikroinjeksjon og elektroporering
- Under et mikroskop, velg fem cerebrale organoider med glatte grenser og tydelig synlige ventrikkellignende strukturer. Flytt dem til en 35 mm cellekulturskål som inneholder forvarmet (37 °C) DMEM/F12 ved hjelp av en kuttet 1000 μL pipettespiss.
MERK: Velg cerebrale organoider med uttalte og tilgjengelige ventrikkellignende strukturer (se figur 1B). - For å injisere en ventrikkellignende struktur, sett forsiktig nålen gjennom veggen og fyll den med elektroporasjonsblandingen til den er synlig fylt. Ikke bruk overdreven press på ventrikkellignende strukturer for å unngå at de sprekker. Fortsett med seks til åtte ventrikkellignende strukturer av hver cerebral organoid på denne måten.
MERK: Hvis nålen blir tilstoppet under mikroinjeksjonsprosessen, må spissen trimmes litt. - Overfør en mikroinjisert cerebral organoid til petriskakelektrodekammeret med en liten mengde DMEM/F12. Ordne organoid på en måte som overflatene av mikroinjiserte ventrikkellignende strukturer vender mot elektroden som er koblet til den positive polen til elektroporatoren.
MERK: Orientering av strukturene på denne måten sikrer at cellene transfekteres på siden av den ventrikkellignende strukturen som ikke påvirkes av en tilstøtende struktur. - Elektroporere cerebrale organoider en etter en ved hjelp av følgende innstillinger: 5 pulser på 80 V, en pulsvarighet på 50 ms og et intervall på 1 s. Flytt de elektroporerte organoidene til en ny 35 mm cellekulturskål fylt med forvarmet (37 °C) DMEM/F12.
MERK: Elektroporeringsinnstillingene kan avhenge av den tilgjengelige firkantbølgeelektroporatoren. Disse innstillingene er optimalisert for det refererte elektroporeringssystemet. Økning av spenningen kan føre til forskyvning av cellene. - Fortsett på samme måte med de neste fem cerebrale organoider ved hjelp av den andre elektroporasjonsblandingen (for eksempel GOI).
MERK: Gjenta trinn 3.2.1-3.2.5 til ønsket antall elektroporerte cerebrale organoider er nådd. - Hvis mikroinjeksjonen og elektroporeringen ble utført under ikke-sterile forhold, overfør de elektroporerte organoidene til en steril 35 mm cellekulturskål under en laminær strømningshette mens du beveger så lite DMEM/F12 som mulig til den nye cellekulturskålen.
- Under et mikroskop, velg fem cerebrale organoider med glatte grenser og tydelig synlige ventrikkellignende strukturer. Flytt dem til en 35 mm cellekulturskål som inneholder forvarmet (37 °C) DMEM/F12 ved hjelp av en kuttet 1000 μL pipettespiss.
- Videre kultur og fiksering av cerebrale organoider
- Dyrk de elektroporerte organoidene i DM med vitamin A på en orbital shaker ved 55 o / min i en ydmyket atmosfære på 5% CO2 og 95% luft ved 37 ° C.
- Neste dag etter elektroporering, kontroller cerebrale organoider for vellykket elektroporering under et konvensjonelt invertert fluorescensmikroskop.
MERK: Avhengig av lengden på den videre kulturen etter elektroporering, påvirkes forskjellige cellepopulasjoner i hjerneorganoiden (se også avsnittet om representative resultater). - Fortsett med nedstrøms applikasjoner etter dyrking av de elektroporerte cerebrale organoider i en tid som passer for det biologiske spørsmålet av interesse.
MERK: Elektroporerte cerebrale organoider kan behandles for forskjellige nedstrøms applikasjoner (f.eks. fiksering for immunfluorescensfarging eller snap-frosset for RNA-isolasjon og qRT-PCR). Her beskriver vi fiksering av elektroporerte cerebrale organoider. - Overfør de elektroporerte organoidene til et 15 ml konisk sentrifugerør ved hjelp av en kuttet 1000 μl pipettespiss, og fjern overflødig medium.
- Tilsett en tilstrekkelig mengde 4% paraformaldehyd (PFA) i DPBS (pH 7,5), og inkuber i 30 minutter ved romtemperatur.
FORSIKTIG: PFA er klassifisert som kreftfremkallende for mennesker og kan forårsake uopprettelig helseskade. Ytterligere forholdsregler, inkludert nitrilhansker og vernebriller, anbefales på det sterkeste. - Aspirer PFA, tilsett 5 ml DPBS, rist litt og aspirer DPBS. Gjenta dette 2x. Oppbevar organoidene i DPBS ved 4 °C inntil videre bruk.
MERK: Her kan protokollen settes på pause, da PFA-fikserte cerebrale organoider kan lagres ved 4 °C i flere måneder. PFA-faste elektroporerte organoider kan analyseres ved kryoseksjonering og immunfluorescensfarging10,28 eller ved helmontering farging og rydding35,36. For eksempel bilder, se avsnittet representative resultater (se tabell 4 for antistoffdetaljer).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen beskrevet her tillater effektiv generering av cerebrale organoider fra mennesker, sjimpanser, rhesusmakaker og vanlige marmoset iPSC-linjer med minimale tidsendringer som kreves mellom arter (figur 1A). Disse organoider kan elektroporeres i området 20 dps til 50 dps, avhengig av tilgjengeligheten av ventrikkellignende strukturer og overflod av cellepopulasjonen (e) av interesse. Før elektroporering er det imidlertid viktig å avgjøre om cerebrale organoider er av tilstrekkelig kvalitet til å bli elektroporert.
En cerebral organoid ideell for elektroporering bør ha uttalte lyse ventrikkellignende strukturer i periferien, ingen tegn til degenerasjon (f.eks. løsrivelse av celler, forstørret apoptotisk kjerne) og en generelt kompakt sunn morfologi (f.eks. ingen overdreven utvekst) (figur 1B, "Go"). Det er å foretrekke å velge cerebrale organoider med store, velorganiserte, ventrikkellignende strukturer for å målrette mot et høyere antall celler. Hvis den perifere sonen til en organoid er mørk og ikke viser noen utstikkende strukturer, anbefales det å ikke bruke den til elektroporering, da de nøyaktige mikroinjeksjonene kan bli kompromittert av mangel på visuelle signaler (figur 1B, "No-go"). For å oppnå en optimal cerebral organoid morfologi er det viktig å sikre at kritiske trinn som nevroektoderminduksjon og matriksinnebygging er godt timet. Problemer med cerebral organoid morfologi stammer typisk fra mislykket nevroektoderm og/eller nevroepitelial knoppdannelse. Dette er vanligvis forårsaket av suboptimal timing av nevral induksjon og / eller kjellermembranmatrisen innebygging og kan løses ved å justere tidspunktet for disse trinnene (ytterligere feilsøkingstips for cerebral organoiddannelse finnes i Lancaster og Knoblich34).
Etter elektroporering kan en første vurdering av suksessen og dens effektivitet utføres etter 12 timer, når GFP-ekspresjonen av de transfekterte cellene blir detekterbar under et konvensjonelt invertert fluorescensmikroskop. Ideelt sett, på dette stadiet, avgir flere ventrikkellignende strukturer lysegrønn fluorescens lokalisert til en av deres sider (figur 2A). Dette indikerer høy presisjon og effektivitet av prosedyren. Vellykket elektroporerte cerebrale organoider av de fire forskjellige primatartene (dvs. menneske, sjimpanse, rhesusmakak og vanlig marmoset) viser lignende GFP-positive mønstre innenfor de målrettede ventrikkellignende strukturer (figur 2A). Videre, etter fiksering og kryoseksjonering av elektroporerte primat-cerebrale organoider, viser vellykket elektroporerte ventrikkellignende strukturer av alle fire arter kolonner av GFP-positive celler i den radialt organiserte og tettpakkede ventrikkelsonen (VZ) (figur 2B). Kvantifiseringen av de DAPI-positive cellene som også var GFP-positive i slike regioner av sjimpansen og marmosetens cerebrale organoider 2 dager etter elektroporering (17 ventrikler fra 12 organoider kvantifisert) viste at i gjennomsnitt var omtrent en tredjedel av cellene (33%, SD ± 12%) vellykket elektroporert.
Suboptimale elektroporasjoner markeres enten av et lite antall GFP-positive celler i den ventrikkellignende strukturen (figur 3A) eller av noen få GFP-positive celler fjernt fra en ventrikkellignende struktur (figur 3B). Et lavt antall GFP-positive celler skyldes et dårlig plasmidopptak. Dette kan enten skyldes en lav plasmidkonsentrasjon forårsaket av utilstrekkelig mengde mikroinjisert elektroporasjonsblanding eller på grunn av elektriske pulser som ikke er godt rettet, noe som kan skyldes suboptimal posisjonering av cerebrale organoider i petriskakelektrodekammeret. Et lavt antall GFP-positive celler fjernt fra en hvilken som helst ventrikkellignende struktur er forårsaket av elektroporering av postmitotiske celler i hjerneorganoiden (f.eks. nevroner) på grunn av en upresis mikroinjeksjon. Disse suboptimale elektroporasjonene må utelukkes fra videre analyser.
Den pålitelige identifiseringen av celletyper tilstede i cerebrale organoider er blant annet basert på celleposisjonen i en ventrikkellignende struktur, som krever en grensedefinisjon mellom VZ og SVZ / nevronberiket sone. Denne grensen kan identifiseres ved den radiale organisasjonen og egenskapene til VZs høye cellekjernetetthet (se DAPI-farging i tilleggsfigur S1). Bekreftelsen av VZ/SVZ-grensen kan utføres ved immunfluorescensfarging for nevrale stammarkører som PAX6 eller SOX2, som uttrykkes av praktisk talt alle VZ-celler (AP) og noen SVZ-celler (BP). Tilstedeværelsen av en nevronberiket sone kan valideres ved immunfluorescensfarging for nevronmarkører som klasse III β-tubulin (TUJ1) eller NeuN (tilleggsfigur S1).
Varigheten av cerebral organoid kultur etter elektroporering avhenger av det biologiske spørsmålet og cellepopulasjonene av interesse. I en nylig studie ble det demonstrert at forskjellige lengder av videre kultur etter elektroporering påvirker forskjellige cellepopulasjoner i sjimpansens cerebrale organoider, alt fra APs til øvre lag nevroner24. Her viser vi lignende resultater for elektroporerte marmosetorganoider. Nærmere bestemt, 2 dager etter elektroporering, er GFP-positive celler nesten utelukkende lokalisert i VZ og er også positive for PAX6-en markør for nevrale stamceller - som indikerer at disse cellene er APs eller nyfødte BPs (figur 4A). Hvis kulturperioden etter elektroporering forlenges til 10 dager, lokaliseres GFP-positive celler i basalområdene (dvs. SVZ og nevronberiket sone) (figur 4B,C). Disse cellene kan (i tillegg til GFP-signalet) også være positive for PAX6 (figur 4B), som indikerer BP, eller NeuN (figur 4C), som indikerer nevroner. Lignende resultater kan oppnås for humane og rhesus makakelektroporerte cerebrale organoider. Oppsummert kan forskjellige stamtyper, så vel som nevroner, med hell målrettes av denne teknikken.
Nesten alle tidligere viste data ble avledet fra immunfarging av histologiske seksjoner generert fra elektroporerte cerebrale organoider. Imidlertid er en annen elegant måte å analysere disse organoider på å utføre helmontert immunfarging etterfulgt av optisk clearing35,36. Dette vil tillate 3D-rekonstruksjon av de elektroporerte cerebrale organoidene for å få et inntrykk av 3D-fordelingen av de GFP-positive cellene. Figur 5 og Video 1 viser et representativt eksempel på GFP-signalet i en optisk klarert, elektroporert cerebral organoid.
Oppsummert gir elektroporasjonsprotokollen beskrevet her en presis og effektiv måte å introdusere forbigående genetisk modifisering (er) i forskjellige stamtyper og nevroner av cerebrale organoider avledet fra forskjellige primat iPSC-linjer.
Figur 1 Skjematisk oversikt over primaters cerebrale organoidgenerering og morfologiske "go"- og "no-go"-kriterier for elektroporering. (A) Tidslinje for primat cerebral organoid generering og elektroporering som fremhever de forskjellige tidspunktene for protokolltrinnene for menneske og sjimpanse (blå), rhesusmakake (fiolett) og marmoset (magenta). Merk at kronologien til tidslinjen ikke skal skaleres. (B) Brightfield-bilder av et passende (venstre bilde, Go) og et uegnet (høyre bilde, No-go) 32 dps human cerebral organoid. Pilspissene indikerer eksempler på egnede ventrikkellignende strukturer for mikroinjeksjon. Bildene ble tatt ved hjelp av et Zeiss Axio Observer.Z1 invertert fluorescensmikroskop med et 2,5x objektiv. Skalastenger = 500 μm. Forkortelser: BDNF = hjerneavledet nevrotrofisk faktor; dps = dager etter såing; NT3 = nevrotrofin 3; RA = retinsyre. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Eksempler på vellykkede elektroporerte primater cerebrale organoider. (A) Brightfield (venstre kolonne), fluorescens (midterste kolonne) og slå sammen (høyre kolonne) bilder av 22 dps menneske, 32 dps sjimpanse, 32 dps rhesus macaque og 31 dps marmoset cerebrale organoider (fra topp til bunn) 15-48 timer etter elektroporering med GFP-uttrykkende plasmid. De svarte pilspissene indikerer eksempler på individuelle elektroporerte ventrikkellignende strukturer. Bildene ble tatt ved hjelp av et Zeiss Axio Observer.Z1 invertert fluorescensmikroskop med et 2,5x objektiv. Skalastenger = 500 μm. (B) Immunfluorescens for GFP (grønn) kombinert med DAPI-farging (cyan) på 32 dps human, 34 dps sjimpanse, 32 dps rhesusmakak, og 32 dps marmoset cerebrale organoider (fra topp til bunn) 2-4 dager etter elektroporering med GFP-uttrykkende plasmid. De lysegrå pilspissene indikerer grensene til de elektroporerte områdene innenfor de ventrikkellignende strukturene. Bildene ble tatt ved hjelp av et Zeiss LSM 800 konfokalmikroskop med et 10x objektiv. Skalastenger = 150 μm. Forkortelser: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol; dps = dager etter såing; GFP = grønt fluorescerende protein. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Eksempler på mislykkede elektroporerte primater cerebrale organoider. (A,B) Immunfluorescens for GFP (grønn) kombinert med DAPI-farging (cyan) av a (A) 34 dps rhesus macaque cerebral organoid 4 dager etter elektroporering med GFP-uttrykkende plasmid og av (B) en 32 dps rhesus macaque cerebral organoid 2 dager etter elektroporering med GFP-uttrykkende plasmid. De lysegrå pilspissene indikerer elektroporerte celler. Den lysegrå stiplede konturen indikerer grensen mellom VZ og SVZ / nevronberiket sone i en ventrikkellignende struktur ved siden av de elektroporerte cellene. Bildene ble tatt ved hjelp av et Zeiss LSM 800 konfokalmikroskop med et 10x objektiv. Skalastenger = 150 μm. Forkortelser: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol; dps = dager etter såing; GFP = grønt fluorescerende protein; SVZ = subventrikulær sone; VZ = ventrikkelsone. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Visualisering av de ulike cellepopulasjonene som finnes i primater cerebrale organoider etter elektroporering. (AC) Dobbel immunfluorescens for GFP (grønn) og enten PAX6 (A,B; magenta) eller NeuN (C; magenta), i alle tilfeller kombinert med DAPI-farging (cyan), av en (A) 32 dps marmoset cerebral organoid 2 dager etter elektroporering med GFP-uttrykkende plasmid, og (B,C) av en 40 dps marmoset cerebral organoid 10 dager etter elektroporering med GFP-uttrykkende plasmid. De lysegrå pilspissene indikerer (A,B) GFP+ og PAX6+ eller (C) NeuN+ dobbeltpositive celler. De lysegrå stiplede linjene indikerer grensen mellom VZ og SVZ / nevronberiket sone. Bildene ble tatt ved hjelp av et Zeiss LSM 800 konfokalmikroskop med et 20x objektiv. Skalastenger = 100 μm. Forkortelser: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol; dps = dager etter såing; GFP = grønt fluorescerende protein; NeuN = nevronkjerner protein; PAX6 = parret boks 6 protein; SVZ = subventrikulær sone; VZ = ventrikkelsone. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Tredimensjonal rekonstruksjon av elektroporerte bilder ved 3D-konfokal avbildning av elektroporerte primater cerebrale organoider etter optisk clearing. Frontale (venstre bilde), 45° roterte (midterste bilde) og 90° roterte (høyre bilde) bilder av en 3D-rekonstruert elektroporert 32 dps human cerebral organoid 2 dager etter elektroporering med GFP-uttrykkende plasmid. Før avbildning ble organoidet optisk eliminert basert på 2Eci-metoden35. En 3D-rekonstruksjon av hele elektroporert organoid ble generert fra 269 optiske seksjoner (1 μM tykkelse hver) som er 3,73 μm fra hverandre ved hjelp av et Zeiss LSM 800 konfokalmikroskop med et 10x objektiv. Bildene ble behandlet for 3D-rekonstruksjon ved hjelp av Fiji. Merk at bildene er tatt fra den samme 3D-rekonstruerte organoiden som vises i Video 1. Skala bar = 500 μm. Forkortelse: GFP = grønt fluorescerende protein. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Video 1: En 3D-rekonstruert elektroporert human cerebral organoid etter optisk clearing. Video av en 3D-rekonstruert elektroporert 32 dps human cerebral organoid 2 dager etter elektroporering med GFP-uttrykkende plasmid. Før avbildning ble organoidet optisk eliminert basert på 2Eci-metoden35. En 3D-rekonstruksjon av hele elektroporert organoid ble generert fra 269 optiske seksjoner (1 μM tykkelse hver) som er 3,73 μm fra hverandre ved hjelp av et Zeiss LSM 800 konfokalmikroskop med et 10x objektiv. Bildene ble behandlet for 3D-rekonstruksjon ved hjelp av Fiji. Merk at videoen er hentet fra den samme 3D-rekonstruerte organoiden vist i figur 5. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.
| iPSC-linjen | Art | Publikasjon | Kultur medium sammensetning | Kulturforhold | ||||
| iLonza2.2 | Menneske | Stauske et al., 2020 | 1 μM IWR1 og 0,5 μM CHIR i StemMACS iPS-Brew XF | fuktet atmosfære av 5% CO2 og 95% luft, 37 ° C | ||||
| SandraA | Pan troglodytter | Mora-Bermúdez et al., 2016 | mTeSR1 | fuktet atmosfære av 5% CO2 og 95% luft, 37 ° C | ||||
| iRh33.1 | Macaca mulatta | Stauske et al., 2020 | 1 μM IWR1 og 0,5 μM CHIR i StemMACS iPS-Brew XF | fuktet atmosfære av 5% CO2 og 95% luft, 37 ° C | ||||
| cj_160419_5 | Callithrix jacchus | Petkov et al., 2020 | 3 μM IWR1, 0,3 μM CGP77675, 0,3 μM AZD77675, 0,5 μM CHIR99021, 10 μM Forskolin, 1 ng/ml Activin A, 1 μM OAC1 i StemMACS iPS-Brew XF | fuktet atmosfære av 5% CO 2, 5% O 2 og 90% N 2, 37 ° C | ||||
Tabell 1: Dyrkningsbetingelser for primatene som brukes i denne publikasjonen. Forkortelse: iPSCs = induserte pluripotente stamceller.
| Middels | Komposisjon | ||
| Nevral induksjonsmedium | 1x N-2 supplement, 1x glutamin erstatning supplement, 1x MEM ikke-essensielle aminosyrer løsning, 1 μg / ml heparin i Dulbecco's Modified Eagle Medium F12 (DMEM / F12) | ||
| Differensieringsmedium (DM) uten vitamin A | 0,5x B-27 tilskudd (minus vitamin A), 0,5x N-2 tilskudd, 0,5x MEM ikke-essensielle aminosyrer løsning, 1x glutamin erstatning supplement, 100 U / ml penicillin-streptomycin, 0,00035% 2-merkaptoetanol, 2,875 ng / ml insulin i 1: 1 DMEM / F12 og neurobasal medium | ||
| Differensieringsmedium (DM) med vitamin A | 0,5x B-27 supplement, 0,5x N-2 supplement, 0,5x MEM ikke-essensielle aminosyrer løsning, 1x glutamin erstatning supplement, 100 U / ml penicillin-streptomycin, 0,00035% 2-merkaptoetanol, 2,875 ng / ml insulin i 1: 1 DMEM / F12 og neurobasal medium | ||
Tabell 2: Sammensetning av medier brukt til primat, cerebral organoidgenerering og kultur.
| Komponent | Kontroller elektroporeringsblanding | GOI elektroporasjonsblanding |
| GFP-uttrykk plasmid | 500 ng/μL | 500 ng/μL |
| Tom vektor | 500 ng/μL | - |
| GOI uttrykk plasmid | - | 500 ng/μL |
| Rask grønn | 0.10% | 0.10% |
| i DPBS |
Tabell 3: Sammensetning av elektroporasjonsblandingen (separat plasmidtilnærming) for kontroll og gen av interesse. Forkortelse: GOI = gen av interesse.
| Antistoff | Firma | Katalognummer | RRID | Fortynning |
| Kylling anti GFP | Aves laboratorier | GFP-1020 | RRID:AB_10000240 | 1:300 |
| Kanin anti PAX6 | Novus Biologiske | NBP1-89100 | RRID:AB_11013575 | 1:300 |
| Kanin anti NeuN | Abcam | AB104225 | RRID:AB_10711153 | 1:300 |
| Geit anti kylling Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A-11039 | RRID:AB_142924 | 1:500 |
| Esel anti kanin Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher | A-31572 | RRID:AB_162543 | 1:500 |
Tabell 4: Antistoffer brukt til immunfluorescensfarging.
Tilleggsfigur S1: VZ/SVZ grensebestemmelse i elektroporerte primater cerebrale organoider. Dobbel immunfluorescens for PAX6 (magenta) og TUJ1 (gul) kombinert med DAPI-farging (cyan) av en 32 dps marmoset cerebral organoid 2 dager etter elektroporering med GFP-uttrykkende plasmid. Immunfluorescens for GFP er ikke vist. De lysegrå stiplede linjene indikerer grensen mellom VZ og SVZ / nevronberiket sone. Bildene ble tatt ved hjelp av et Zeiss LSM 800 konfokalmikroskop med et 20x objektiv. Skala bar = 100 μm. Forkortelser: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol; dps = dager etter såing; PAX6 = parret boks 6 protein; SVZ = subventrikulær sone; TUJ1 = klasse III β-tubulin; VZ = ventrikkelsone. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 1: Monteringsanvisning for petriskålelektroporasjonskammer. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Prosedyrene beskrevet her representerer en enhetlig protokoll for generering av cerebrale organoider fra forskjellige primatarter med en målrettet elektroporasjonstilnærming. Dette tillater ektopisk uttrykk for en GOI i et modellsystem som emulerer primat (inkludert menneske) (pato) fysiologisk neocortex utvikling. Denne enhetlige protokollen for generering av primat-cerebrale organoider bruker de samme materialene (f.eks. Media) og protokolltrinnene for alle fire primatarter som presenteres. Utviklingsforskjeller mellom disse artene løses ved å endre tidspunktet for kritiske protokolltrinn (dvs. nevral induksjon og innebygging i kjellermembranmatrisen; se ovenfor). Dette kan grovt reflektere in vivo nevrodevelopmental timing forskjeller mellom disse artene og utgjør et interessant tema for videre studier.
Denne tilnærmingen er basert på elektroporasjonseksperimentene beskrevet i en tidligere artikkel om cerebrale organoider10. Imidlertid var disse forsøkene, som nevnt av Lancaster og kolleger, begrenset av omfattende grader av apoptose, som oppstod på grunn av en høy GFP-konsentrasjon og førte til utelukkelse av de elektroporerte cellene som utviste et sterkt GFP-signal10. I våre eksperimenter fant vi at en endelig total plasmidkonsentrasjon (f.eks. EGFP-kodende plasmidkonsentrasjon pluss GOI-kodende plasmidkonsentrasjon) på 1000 ng / μL var optimal. Konsentrasjoner lavere enn 1000 ng / μL fører til redusert elektroporasjonseffektivitet, mens høye konsentrasjoner over 1000 ng / μL kan være giftige for de elektroporerte cellene og føre til celledød10. Studier som kombinerer mer enn to forskjellige uttrykksplasmider er mulig28. Den endelige totale plasmidkonsentrasjonen bør imidlertid holdes på 1000 ng/μL.
I en typisk elektroporasjonstilnærming er det nødvendig med et plasmid som koder for en fluorescensmarkør for å identifisere de vellykkede elektroporerte cellene. Det er to muligheter for å inkludere fluorescensmarkøren i det eksperimentelle oppsettet: (i) ved å injisere to separate plasmider (dvs. en plasmidkoding for markøren pluss et kontrollplasmid [f.eks. tom vektor] eller et plasmid som koder for genet av interesse [GOI]) (den separate plasmidtilnærmingen); (ii) ved å injisere ett plasmid som koder for både markøren og GOI ved å bruke et internt ribosominngangssted (IRES) eller et 2A selvspaltende peptid (f.eks. P2A) ( enkeltplasmidtilnærmingen). I dette tilfellet brukes en plasmidkoding utelukkende fluorescensmarkøren som en kontroll. Mens enkeltplasmidtilnærmingen resulterer i fullt samuttrykk av fluorescensmarkøren og GOI, er slike plasmider store i størrelse, noe som resulterer i lav elektroporasjonseffektivitet. Hvis det er behov for høy elektroporasjonseffektivitet, anbefales det å bruke den separate plasmidtilnærmingen, da det separerte uttrykket ikke signifikant påvirker nivået av samuttrykk av fluorescensmarkøren og GOI, samtidig som en høy elektroporasjonseffektivitet opprettholdes28. I protokollen som presenteres her, beskriver vi elektroporeringen ved hjelp av den separate plasmidtilnærmingen. Hvis enkeltplasmidtilnærmingen brukes, må trinnene i protokollen justeres tilsvarende.
Sammenlignet med en nylig publisert protokoll37, har vår tilnærming tre hovedfordeler. For det første retter vi oss spesifikt mot de ventrikkellignende strukturene i hjerneorganoiden. Vi oppnår dette (i) ved å mikroinjisere de individuelle ventrikkellignende strukturer av hjerneorganoiden i stedet for å injisere i midten av organoid 37 og (ii) ved å arrangere orienteringen av hjerneorganoiden i petriskålelektrodekammeret for å optimalisere retningen til det elektriske feltet (se ovenfor) i stedet for å bruke en elektroporasjonskuvette37. For det andre innebærer denne protokollen ikke bruk av en kostbar nukleofektorløsning, da denne tilnærmingen bruker en firkantbølgeelektroporator i kombinasjon med et petriskålelektrodekammer. For det tredje tillater denne enhetlige protokollen for generering av primat-cerebrale organoider studiet av ikke bare menneskelige, men også ikke-menneskelige primatorganoider, noe som tillater evolusjonære, komparative og sykdomsstudier.
To trekk ved de cerebrale organoidene er avgjørende for en vellykket elektroporering – kvaliteten på de cerebrale organoidene og størrelsen og kvaliteten på de ventrikkellignende strukturene (se representative resultater og figur 1B). Når det gjelder den første funksjonen, presenterer vi go- og no-go-kriterier (se ovenfor og figur 1B) for å fortsette med elektroporeringen. Hovedkriteriet er tilstedeværelsen av tydelig synlige, gjennomsiktige og radialt organiserte ventrikkellignende strukturer. Størrelsen på de ventrikkellignende strukturene er den andre avgjørende funksjonen for vellykket mikroinjeksjon og elektroporering. Ventrikkellignende strukturer som er for små er vanskelige å injisere og gir normalt ikke et tilstrekkelig høyt antall elektroporerte celler for senere analyser. Dette er hovedgrunnen til at vi brukte en modifisert cerebral organoid protokoll, da denne protokollen, i våre hender og for disse iPSC-linjene produserer, sammenlignet med andre protokoller, velorganiserte ventrikkellignende strukturer som er tilstrekkelig store til å bli elektroporert. I prinsippet kan elektroporasjonstilnærmingen som presenteres her, brukes på enhver annen nevral organoidprotokoll så lenge sistnevnte gir tilstrekkelig store og organiserte ventrikkellignende strukturer (se representative resultater og figur 1B). Videre kan denne protokollen også brukes på andre primater i fremtiden, for eksempel den krabbespisende makaken (Macaca fascicularis), den klassiske primatmodellen som brukes i industriell forskning. Dette vil kreve enten identifisering av de riktige kritiske tidspunktene (se ovenfor) av den modifiserte cerebrale organoidprotokollen beskrevet her eller etablering av en nevral organoidprotokoll som gir opphav til egnede store ventrikkellignende strukturer (se ovenfor).
Etter vellykket elektroporering kan cerebrale organoider dyrkes videre i forskjellige tidsperioder for å tillate den genetiske modifikasjonen under undersøkelse for å påvirke de forskjellige cellepopulasjonene i den utviklende cerebrale organoiden. Disse spenner fra de forskjellige nevrale stampopulasjonene til de forskjellige typene nevroner som er tilstede i hjerneorganoiden (se representative resultater og Fischer et al.28). Disse cellepopulasjonene kan deretter analyseres enten ved kryoseksjonering og immunfluorescensfarging (se figur 4) eller ved helmontert immunfluorescensfarging og optisk clearing (se figur 5 og video 1) av de PFA-fikserte elektroporerte cerebrale organoidene.
Så langt har elektroporering av hjerneorganoider hovedsakelig blitt brukt til ektopisk ekspresjon av gener for å utføre genfunksjonsstudier 10,28,38,39, live imaging 10,39,40, visualisering av cellemorfologi 40 og celledelingssporing 10. Men i det første cerebrale organoidpapiret ble shRNA introdusert i organoider ved elektroporering for å dempe genuttrykk ved RNA-interferens. Dette viste potensialet for elektroporering som skal brukes ikke bare for ektopisk ekspresjon av gener, men også for KD eller til og med KO av gener. Nylig ble det vist at CRISPR / Cas9-medierte KOs kan oppnås ved in utero elektroporering av museembryoer27 og elektroporering av føtalt humant vev ex vivo41. Slike CRISPR / Cas9-baserte KOer kan lett brukes på elektroporering av cerebrale organoider, da hovedmekanismen for elektroporering er den samme, og dette vil ytterligere utvide nytten av denne tilnærmingen.
En potensiell videre anvendelse av elektroporering i cerebrale organoider er redning av spesifikke KO-fenotyper i tilfeller der det ikke er mulig å oppnå en spesifikk KO av GOI på grunn av svært like sekvenser mellom GOI og dens forfedre versjoner. Dette gjelder spesielt for nylig utviklede menneskespesifikke gener. I slike tilfeller er det ikke mulig (selv ved bruk av CRISPR/Cas9-teknologien) å oppnå en spesifikk KO (slik tilfellet var for ARHGAP11A og ARHGAP11B28). En løsning på dette dilemmaet er å generere en dobbel KO av GOI og dens forfedre gen og å redde GOI alene, forfedregenet alene, eller begge genene sammen ved elektroporering. Disse elektroporerte organoider kan da betraktes som et selektivt forfedre gen KO, en selektiv GOI KO eller en kontroll, henholdsvis. Dette vil gjøre det mulig å adressere de individuelle bidragene fra disse genene til fenotypen (se f.eks. Fischer et al.28). En annen potensiell anvendelse er relatert til analysen av cerebrale organoider generert fra pasientavledede iPSCer. I slike tilfeller er det ikke klart om den observerte fenotypen skyldes en mutasjon i kandidatgenet eller skyldes noen annen mutasjon som er tilstede i pasienten. Her vil elektroporeringen av kandidatgenet og (potensiell) redning av fenotypen tillate at dette genets rolle i sykdommen blir validert (se f.eks. Lancaster et al.10).
Samlet sett gir protokollen som presenteres her en rask og kostnadseffektiv tilnærming til genetisk modifisering av cellepopulasjoner innenfor ventrikkellignende strukturer av primat-cerebrale organoider. Dette gir et effektivt verktøy for studiet av nevrodevelopmental og evolusjonære prosesser som også kan brukes til sykdomsmodellering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi beklager til alle forskerne hvis arbeid ikke kunne siteres på grunn av plassbegrensninger. Vi takker Ulrich Bleyer fra de tekniske tjenestene ved DPZ og Hartmut Wolf fra verkstedet på MPI-CBG for byggingen av petriskakelektrodekamrene; Stoyan Petkov og Rüdiger Behr for å gi menneskelige (iLonza2.2), rhesus macaque (iRh33.1) og marmoset (cj_160419_5) iPSCs; Sabrina Heide for kryoseksjonering og immunfluorescensfarging; og Neringa Liutikaite og César Mateo Bastidas Betancourt for kritisk lesing av manuskriptet. Arbeid i laboratoriet til WBH ble støttet av et ERA-NET NEURON (MicroKin) stipend. Arbeidet i laboratoriet til M.H. ble støttet av et ERC-startstipend (101039421).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20 µL Microloader | Eppendorf | 5242956003 | |
| 2-Mercaptoethanol | Merck | 8.05740.0005 | |
| 35 mm cell culture dishes | Sarstedt | 83.3900 | |
| 60 mm cell culture dishes | CytoOne | CC7682-3359 | |
| Activin A | Sigma-Aldrich | SRP3003 | |
| AOC1 | Selleckchem | S7217 | |
| Axio Observer.Z1 Inverted Fluorescence Microscope | Zeiss | replacable by comparable fluorescent microscopes | |
| AZD0530 | Selleckchem | S1006 | |
| B-27 Supplement with Vitamin A (retinoic acid, RA) (50x) | Gibco | 17504-044 | |
| B-27 Supplement without Vitamin A (50x) | Gibco | 12587-010 | |
| BTX ECM 830 Square Wave Electroporation System | BTX | 45-2052 | |
| CGP77675 | Sigma-Aldrich | SML0314 | |
| Chimpanzee induced pluripotent stem cell line Sandra A | doi: 10.7554/elife.18683 | ||
| Common marmoset induced pluripotent stem cell line cj_160419_5 | doi: 10.3390/cells9112422 | ||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Gibco | 11320-033 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190-094 | pH 7.0−7.3; warm to room temperature before use |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| Forskolin | Selleckchem | 2449 | |
| GlutaMAX Supplement (100x) | Gibco | 35050-061 | glutamine substitute supplement |
| Heparin (1 mg/mL stock) | Sigma-Aldrich | H3149 | |
| Human induced pluripotent stem cell line iLonza2.2 | doi: 10.3390/cells9061349 | ||
| Human Neurotrophin-3 (NT-3) | PeproTech | 450-03 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | 19278 | |
| IWR1 | Sigma-Aldrich | I0161 | |
| Leica MS5 stereomicroscope (MDG 17 transmitted-light base) | Leica | 10473849 | replacable by comparable stereomicroscopes |
| Matrigel | Corning | 354277/354234 | basement membrane matrix; alternatively, Geltrex (ThermoFisher Scientific, A1413302) can be used |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Sigma-Aldrich | M7145 | |
| N-2 Supplement (100x) | Gibco | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 818715 | handle with causion due to cancerogenecity |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL) | PanBiotech | P06-07100 | |
| Petri dish electrode chamber | self-produced (see Supplemental File 1) | also commertially available | |
| Pre-Pulled Glass Pipettes | WPI | TIP10LT | borosilicate glass pipettes with long taper, 10 µm tip diameter |
| Pro-Survival Compound | MerckMillipore | 529659 | |
| Recombinant Human/Murine/RatBrain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) | PeproTech | AF-450-02 | |
| Rhesus macaque induced pluripotent stem cell line iRh33.1 | doi: 10.3390/cells9061349 | ||
| StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyi Biotech | 130-104-368 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | proteolytic and collagenolytic enzyme mixture |
| TrypLE | Gibco | 12604-013 | recombinant trypsin substitute; warm to room temperature before use |
| Ultra-Low Attachment 96-well plates | Costar | 7007 | |
| Y27632 | Stemcell Technologies | 72305 |
References
- Marchetto, M. C. N., Winner, B., Gage, F. H. Pluripotent stem cells in neurodegenerative and neurodevelopmental diseases. Human Molecular Genetics. 19 (R1), R71-R76 (2010).
- Zhao, X., Bhattacharyya, A. Human models are needed for studying human neurodevelopmental disorders. The American Journal of Human Genetics. 103 (6), 829-857 (2018).
- Zhang, W., et al. Modeling microcephaly with cerebral organoids reveals a WDR62–CEP170–KIF2A pathway promoting cilium disassembly in neural progenitors. Nature Communications. 10 (1), 2612 (2019).
- Sasaki, E., et al. Generation of transgenic non-human primates with germline transmission. Nature. 459 (7246), 523-527 (2009).
- Niu, Y., et al. Transgenic rhesus monkeys produced by gene transfer into early-cleavage–stage embryos using a simian immunodeficiency virus-based vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (41), 17663-17667 (2010).
- Niu, Y., et al. Generation of gene-modified cynomolgus monkey via Cas9/RNA-mediated gene targeting in one-cell embryos. Cell. 156 (4), 836-843 (2014).
- Shi, L., et al. Transgenic rhesus monkeys carrying the human MCPH1 gene copies show human-like neoteny of brain development. National Science Review. 6 (3), 480-493 (2019).
- Heide, M., et al. Human-specific ARHGAP11B increases size and folding of primate neocortex in the fetal marmoset. Science. 369 (6503), 546-550 (2020).
- Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell–derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20284-20289 (2013).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Kelava, I., Lancaster, M. A. Stem cell models of human brain development. Cell Stem Cell. 18 (6), 736-748 (2016).
- Lullo, E. D., Kriegstein, A. R. The use of brain organoids to investigate neural development and disease. Nature Reviews Neuroscience. 18 (10), 573-584 (2017).
- Arlotta, P. Organoids required! A new path to understanding human brain development and disease. Nature Methods. 15 (1), 27-29 (2018).
- Heide, M., Huttner, W. B., Mora-Bermúdez, F. Brain organoids as models to study human neocortex development and evolution. Current Opinion in Cell Biology. 55, 8-16 (2018).
- Qian, X., Song, H., Ming, G. Brain organoids: Advances, applications and challenges. Development. 146 (8), dev166074 (2019).
- Sun, N., Meng, X., Liu, Y., Song, D., Jiang, C., Cai, J. Applications of brain organoids in neurodevelopment and neurological diseases. Journal of Biomedical Science. 28 (1), 30 (2021).
- Fischer, J., Heide, M., Huttner, W. B.
- Pașca, S. P., et al. A nomenclature consensus for nervous system organoids and assembloids. Nature. 609 (7929), 907-910 (2022).
- Kyrousi, C., Cappello, S. Using brain organoids to study human neurodevelopment, evolution and disease. Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. 9 (1), e347 (2020).
- Teriyapirom, I., Batista-Rocha, A. S., Koo, B. -K.
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).
- Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294 (5544), 1071-1074 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
- Kawasaki, H., Toda, T., Tanno, K. In vivo genetic manipulation of cortical progenitors in gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Biology Open. 2 (1), 95-100 (2012).
- Kawasaki, H., Iwai, L., Tanno, K. Rapid and efficient genetic manipulation of gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Molecular Brain. 5 (1), 24 (2012).
- Bai, J., et al. RNAi reveals doublecortin is required for radial migration in rat neocortex. Nature Neuroscience. 6 (12), 1277-1283 (2003).
- Kalebic, N., et al. CRISPR/Cas9-induced disruption of gene expression in mouse embryonic brain and single neural stem cells in vivo. EMBO reports. 17 (3), 338-348 (2016).
- Fischer, J., et al. Human-specific ARHGAP11B ensures human-like basal progenitor levels in hominid cerebral organoids. EMBO Reports. 23 (11), e54728 (2022).
- Stauske, M., et al. Non-human primate iPSC generation, cultivation, and cardiac differentiation under chemically defined conditions. Cells. 9 (6), 1349 (2020).
- Mora-Bermúdez, F., et al. Differences and similarities between human and chimpanzee neural progenitors during cerebral cortex development. eLife. 5, e18683 (2016).
- Petkov, S., Dressel, R., Rodriguez-Polo, I., Behr, R. Controlling the switch from neurogenesis to pluripotency during marmoset monkey somatic cell reprogramming with self-replicating mRNAs and small molecules. Cells. 9 (11), 2422 (2020).
- Camp, J. G., et al. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (51), 15672-15677 (2015).
- Kanton, S., et al. Organoid single-cell genomic atlas uncovers human-specific features of brain development. Nature. 574 (7778), 418-422 (2019).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
- Cakir, B., et al. Engineering of human brain organoids with a functional vascular-like system. Nature Methods. 16 (11), 1169-1175 (2019).
- Masselink, W., et al. Broad applicability of a streamlined ethyl cinnamate-based clearing procedure. Development. 146 (3), dev166884 (2019).
- Denoth-Lippuner, A., Royall, L. N., Gonzalez-Bohorquez, D., Machado, D., Jessberger, S. Injection and electroporation of plasmid DNA into human cortical organoids. STAR Protocols. 3 (1), 101129 (2022).
- Denoth-Lippuner, A., et al. Visualization of individual cell division history in complex tissues using iCOUNT. Cell Stem Cell. 28 (11), 2020.e12-2034.e12 (2021).
- Kelava, I., Chiaradia, I., Pellegrini, L., Kalinka, A. T., Lancaster, M. A. Androgens increase excitatory neurogenic potential in human brain organoids. Nature. 602 (7895), 112-116 (2022).
- Lancaster, M. A., et al. Guided self-organization and cortical plate formation in human brain organoids. Nature Biotechnology. 35 (7), 659-666 (2017).
- Kalebic, N., et al. Neocortical expansion due to increased proliferation of basal progenitors is linked to changes in their morphology. Cell Stem Cell. 24 (4), 535.e9-550.e9 (2019).
