Utilisation du MouseWalker pour quantifier le dysfonctionnement locomoteur dans un modèle murin de lésion de la moelle épinière
Summary
Un pipeline expérimental pour décrire quantitativement le modèle locomoteur de souris marchant librement à l’aide de la boîte à outils MouseWalker (MW) est fourni, allant des enregistrements vidéo initiaux et du suivi à l’analyse post-quantification. Un modèle de lésion de la moelle épinière chez la souris est utilisé pour démontrer l’utilité du système MW.
Abstract
L’exécution de programmes moteurs complexes et hautement coordonnés, tels que la marche et la course, dépend de l’activation rythmique des circuits rachidiens et supra-rachidiens. Après une lésion de la moelle épinière thoracique, la communication avec les circuits en amont est altérée. Ceci, à son tour, conduit à une perte de coordination, avec un potentiel de récupération limité. Par conséquent, pour mieux évaluer le degré de récupération après l’administration de médicaments ou de thérapies, il est nécessaire de disposer de nouveaux outils plus détaillés et plus précis pour quantifier la démarche, la coordination des membres et d’autres aspects fins du comportement locomoteur dans les modèles animaux de lésions de la moelle épinière. Plusieurs tests ont été développés au fil des ans pour évaluer quantitativement le comportement de marche libre chez les rongeurs; Cependant, ils manquent généralement de mesures directes liées aux stratégies de marche, aux modèles d’empreinte et à la coordination. Pour remédier à ces lacunes, une version mise à jour du MouseWalker, qui combine une passerelle de réflexion interne totale frustrée (fTIR) avec un logiciel de suivi et de quantification, est fournie. Ce système open-source a été adapté pour extraire plusieurs sorties graphiques et paramètres cinématiques, et un ensemble d’outils de post-quantification peut être pour analyser les données de sortie fournies. Ce manuscrit démontre également comment cette méthode, alliée à des tests comportementaux déjà établis, décrit quantitativement les déficits locomoteurs suite à une lésion de la moelle épinière.
Introduction
La coordination efficace de quatre membres n’est pas unique aux animaux quadrupèdes. La coordination des membres antérieurs et des membres postérieurs chez l’homme reste importante pour accomplir plusieurs tâches, telles que la natation et les modifications de la vitesse en marchant1. Divers circuits de rétroaction cinématiquedes membres 2 et moteurs 1,3,4, ainsi que les circuits de rétroaction proprioceptive5, sont conservés entre les humains et les autres mammifères et devraient être pris en compte lors de l’analyse des options thérapeutiques pour les troubles moteurs, tels que les lésions de la moelle épinière (LME)6,7,8.
Pour marcher, plusieurs connexions vertébrales des membres antérieurs et postérieurs doivent être correctement câblées et activées rythmiquement, ce qui nécessite des entrées du cerveau et une rétroaction du système somatosensoriel 2,9,10. Ces connexions culminent dans les générateurs centraux (CPG), qui sont situés au niveau cervical et lombaire pour les membres antérieurs et postérieurs, respectivement 1,9,10. Souvent, après une lésion médullaire, la perturbation de la connectivité neuronale et la formation d’une cicatrice gliale inhibitrice12 limitent la récupération de la fonction locomotrice, avec des résultats variant de la paralysie totale à la fonction restreinte d’un groupe de membres en fonction de la gravité de la blessure. Les outils permettant de quantifier précisément la fonction locomotrice après une lésion médullaire sont essentiels pour surveiller la récupération et évaluer les effets des traitements ou d’autres interventions cliniques6.
Le test métrique standard pour les modèles de contusion de souris de SCI est l’échelle de souris Basso (BMS)13,14, un score non paramétrique qui tient compte de la stabilité du tronc, de la position de la queue, du pas plantaire et de la coordination des membres antérieurs et postérieurs dans une arène en plein champ. Même si le BMS est extrêmement fiable dans la plupart des cas, il nécessite au moins deux évaluateurs expérimentés pour observer tous les angles de mouvement des animaux afin de tenir compte de la variabilité naturelle et de réduire le biais.
D’autres tests ont également été développés pour évaluer quantitativement les performances motrices après une lésion médullaire. Il s’agit notamment de l’essai rotarod, qui mesure le temps passé sur un cylindre rotatif15; l’échelle horizontale, qui mesure le nombre de garde-corps manqués et de poignées d’échelle positives16,17; et le test de marche à la poutre, qui mesure le temps qu’un animal prend et le nombre de défaillances qu’il fait lorsqu’il traverse une poutre étroite18. Bien qu’ils reflètent une combinaison de déficits moteurs, aucun de ces tests ne produit d’informations locomotrices directes sur la coordination des membres antérieurs et postérieurs.
Pour analyser spécifiquement et plus en profondeur le comportement de marche, d’autres tests ont été développés pour reconstruire les cycles de pas et les stratégies de démarche. Un exemple est le test d’empreinte, où les pattes encrées d’un animal dessinent un motif sur une feuille de papier blanc19. Bien que simple dans son exécution, l’extraction de paramètres cinématiques tels que la longueur de foulée est lourde et imprécise. De plus, l’absence de paramètres dynamiques, tels que la durée du cycle de pas ou la coordination jambe-temps, limite ses applications; En effet, ces paramètres dynamiques ne peuvent être acquis qu’en analysant des vidéos image par image de rongeurs marchant sur une surface transparente. Pour les études sur les LM, les chercheurs ont analysé le comportement de marche à partir d’une vue latérale à l’aide d’un tapis roulant, y compris la reconstruction du cycle des pas et la mesure des variations angulaires de chaque articulation de la jambe 4,20,21. Même si cette approche peut être extrêmement informative6, elle reste axée sur un ensemble spécifique de membres et manque de caractéristiques de démarche supplémentaires, telles que la coordination.
Pour combler ces lacunes, Hamers et ses collègues ont mis au point un test quantitatif basé sur un capteur tactile optique utilisant la réflexion interne totale frustrée (fTIR)22. Dans cette méthode, la lumière se propage à travers le verre par réflexion interne, se disperse lors de la pression de la patte et, finalement, est capturée par une caméra à haute vitesse. Plus récemment, une version open source de cette méthode, appelée MouseWalker, a été mise à disposition, et cette approche combine une passerelle fTIR avec un progiciel de suivi et de quantification23. En utilisant cette méthode, l’utilisateur peut extraire un grand ensemble de paramètres quantitatifs, y compris les modèles de pas, d’espace et de démarche, le positionnement de l’empreinte et la coordination des membres antérieurs et postérieurs, ainsi que des sorties visuelles, telles que les motifs d’empreinte (imitant le test de la patte encrée6) ou les phases de position par rapport à l’axe du corps. Il est important de noter qu’en raison de sa nature open-source, de nouveaux paramètres peuvent être extraits en mettant à jour le package de script MATLAB.
Ici, l’assemblage précédemment publié du système MouseWalker23 est mis à jour. Une description de la façon de le configurer est fournie, avec toutes les étapes nécessaires pour obtenir la meilleure qualité vidéo, les meilleures conditions de suivi et l’acquisition des paramètres. Des outils de post-quantification supplémentaires sont également partagés pour améliorer l’analyse de l’ensemble de données de sortie MouseWalker (MW). Enfin, l’utilité de cet outil est démontrée par l’obtention de valeurs quantifiables pour la performance locomotrice générale, en particulier les cycles de pas et la coordination des membres antérieurs et postérieurs, dans un contexte de lésion médullaire (LME).
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, le potentiel de la méthode MouseWalker est démontré en analysant le comportement locomoteur après une lésion médullaire. Il fournit de nouvelles informations sur des modifications spécifiques des modèles de pas, d’empreinte et de démarche qui seraient autrement manquées par d’autres tests standard. En plus de fournir une version mise à jour du package MW, les outils d’analyse de données sont également décrits à l’aide des scripts Python fournis (voir étape 5).
Comm…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient Laura Tucker et Natasa Loncarevic pour leurs commentaires sur le manuscrit et le soutien apporté par le Rodent Facility de l’Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes. Les auteurs tiennent à souligner le soutien financier de Prémios Santa Casa Neurociências – Prix Melo e Castro pour la recherche sur les lésions de la moelle épinière (MC-36/2020) à L.S. et C.S.M. Ce travail a été soutenu par Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) (PTDC/BIA-COM/0151/2020), iNOVA4Health (UIDB/04462/2020 et UIDP/04462/2020), et LS4FUTURE (LA/P/0087/2020) au C.S.M. L.S. a été soutenu par un contrat de chercheur principal individuel CEEC (2021.02253.CEECIND). A.F.I. a été soutenu par une bourse doctorale de FCT (2020.08168.BD). A.M.M. a bénéficié d’une bourse doctorale de la FCT (/BD/128445/2017). I.M. a bénéficié d’une bourse postdoctorale de la FCT (SFRH/BPD/118051/2016). D.N.S. a été soutenu par une bourse doctorale de la FCT (SFRH/BD/138636/2018).
Materials
| 45º Mirror | |||
| 2 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 16 cm height, 1 on each side | Misumi | ||
| 2 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 23 cm, @ 45° , 1 on each side | Misumi | ||
| 1 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 83 cm long | Misumi | ||
| 87 x 23 cm mirror | General glass supplier | ||
| black cardboard filler | General stationery supplier | We used 2, one with 69 x 6 cm and another with 69 x 3cm to limit the reflection on the mirror | |
| Background backlight | |||
| 109 x 23 cm plexiglass (0.9525 cm thick) | General hardware supplier | ||
| 2 lateral aluminum extrusion (4 x 4 cm), 20 cm long, 1 on each side | Misumi | ||
| multicolor LED strip | General hardware supplier | ||
| white opaque paper to cover the plexyglass | General stationery supplier | ||
| fTIR Support base and posts | |||
| 2 aluminum extrusion (4 x 4 cm), 100 cm height | Misumi | ||
| 60 x 30 cm metric breadboard | Edmund Optics | #54-641 | |
| M6 12 mm screws | Edmund Optics | ||
| M6 hex nuts and wahers | Edmund Optics | ||
| fTIR Walkway | |||
| 109 x 8.5 cm plexyglass (1.2 cm thick) | General hardware supplier | 109 x 8.5 cm plexyglass (1.2 cm thick) | |
| 109 cm long Base-U-channel aluminum with 1.6 cm height x 1.9 cm depth thick folds (to hold the plexyglass) | General hardware supplier | ||
| 2 lateral aluminum extrusion (4 x 4 cm) 20 cm length, 1 on each side | Misumi | ||
| black cardboard filler | General stationery supplier | we used 2 fillers on each side to cover the limits of the plexyglass, avoiding bright edges | |
| 12 mm screws | Edmund Optics | M6 | |
| High speed camera (on a tripod) | |||
| Blackfly S USB3 | Blackfly | USB3 | This is a reccomendation. The requirement is to record at least 100 frames per second |
| Infinite Horizon Impactor | |||
| Infinite Horizon Impactor | Precision Systems and Instrumentation, LLC. | ||
| Lens | |||
| Nikkon AF Zoom-Nikkor 24-85mm | Nikkon | 2.8-4D IF | This lens is reccomended, however other lens can be used. Make sure it contains a large aperture (i.e., smaller F-stop values), to capture fTIR signals |
| Software | |||
| MATLAB R2022b | MathWorks | ||
| Python 3.9.13 | Python Software Foundation | ||
| Anaconda Navigator 2.1.4 | Anaconda, Inc. | ||
| Spyder 5.1.5 | Spyder Project Contributors | ||
| Walkway wall | |||
| 2 large rectagular acrilics with 100 x 15 cm | Any bricolage convenience store | ||
| 2 Trapezian acrilic laterals with 6-10 length x 15 cm height | Any bricolage convenience store | ||
| GitHub Materials | |||
| Folder name | URL | ||
| Boxplots | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Boxplots | Script to create Boxplots | |
| Docs | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Docs | Additional documents | |
| Heatmap | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Heatmaps | Script to create heatmap | |
| Matlat script | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Matlab%20Script | MouseWalker matlab script | |
| PCA | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/PCA%20plots | Script to perform Principal Component Analysis | |
| Raw data Plots | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Rawdata%20Plots | Script to create Raw data plots | |
| Residual Analysis | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Residual_Analysis | Code to compute residuals from Raw data |
References
- Frigon, A. The neural control of interlimb coordination during mammalian locomotion. Journal of Neurophysiology. 117 (6), 2224-2241 (2017).
- Grillner, S. Biological pattern generation: The cellular and computational logic of networks in motion. Neuron. 52 (5), 751-766 (2006).
- Dominici, N., et al. locomotor primitives in newborn babies and their development. Science. 334 (6058), 997-999 (2011).
- Courtine, G., et al. Kinematic and EMG determinants in quadrupedal locomotion of a non-human primate (Rhesus). Journal of Neurophysiology. 93 (6), 3127-3145 (2005).
- Clarac, F., Cattaert, D., le Ray, D. Central control components of a ‘simple’ stretch reflex. Trends Neuroscience. 23 (5), 199-208 (2000).
- Squair, J. W., Gautier, M., Sofroniew, M. V., Courtine, G., Anderson, M. A. Engineering spinal cord repair. Current Opinion in Biotechnology. 72, 48-53 (2021).
- Wenger, N., et al. Spatiotemporal neuromodulation therapies engaging muscle synergies improve motor control after spinal cord injury. Nature Medicine. 22 (2), 138-145 (2016).
- Grillner, S. The spinal locomotor CPG: A target after spinal cord injury. Progress in Brain Research. 137, 97-108 (2002).
- Boulain, M., et al. Synergistic interaction between sensory inputs and propriospinal signalling underlying quadrupedal locomotion. Journal of Physiology. 599 (19), 4477-4496 (2021).
- Skarlatou, S., et al. Afadin signaling at the spinal neuroepithelium regulates central canal formation and gait selection. Cell Reports. 31 (10), 107741 (2020).
- Viala, D., Vidal, C. Evidence for distinct spinal locomotion generators supplying respectively fore-and hindlimbs in the rabbit. Brain Research. 155 (1), 182-186 (1978).
- Silver, J., Miller, J. H. Regeneration beyond the glial scar. Nature Reviews Neuroscience. 5 (2), 146-156 (2004).
- Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. Journal of Neurotrauma. 12 (1), 1-21 (1995).
- Basso, D. M., et al. Basso mouse scale for locomotion detects differences in recovery after spinal cord injury in five common mouse strains. Journal of Neurotrauma. 23 (5), 635-659 (2006).
- Jones, B. J., Roberts, D. J. The quantitative measurement of motor inco-ordination in naive mice using an accelerating rotarod. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 20 (4), 302-304 (1968).
- Metz, G. A., Whishaw, I. Q. The ladder rung walking task: A scoring system and its practical application. Journal of Visualized Experiments. (28), e1204 (2009).
- Metz, G. A., Whishaw, I. Q. Cortical and subcortical lesions impair skilled walking in the ladder rung walking test: A new task to evaluate fore-and hindlimb stepping, placing, and coordination. Journal of Neuroscience Methods. 115 (2), 169-179 (2002).
- Wallace, J. E., Krauter, E. E., Campbell, B. A. Motor and reflexive behavior in the aging rat. Journal of Gerontology. 35 (3), 364-370 (1980).
- Carter, R. J., et al. Characterization of progressive motor deficits in mice transgenic for the human Huntington’s disease mutation. The Journal of Neuroscience. 19 (8), 3248-3257 (1999).
- Leblond, H., L’espérance, M., Orsal, D., Rossignol, S. Behavioral/systems/cognitive treadmill locomotion in the intact and spinal mouse. The Journal of Neuroscience. 23 (36), 11411-11419 (2003).
- Courtine, G., et al. Recovery of supraspinal control of stepping via indirect propriospinal relay connections after spinal cord injury. Nature Medicine. 14 (1), 69-74 (2008).
- Hamers, F. P. T., Koopmans, G. C., Joosten, E. A. J. CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 23 (3-4), 537-548 (2006).
- Mendes, C. S., et al. Quantification of gait parameters in freely walking rodents. BMC Biology. 13 (1), 50 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Stauch, K. L., et al. Applying the ratwalker system for gait analysis in a genetic rat model of Parkinson’s disease. Journal of Visualized Experiments. (167), e62002 (2021).
- Mendes, C. S., Rajendren, S. V., Bartos, I., Márka, S., Mann, R. S. Kinematic responses to changes in walking orientation and gravitational load in Drosophila melanogaster. PLoS One. 9 (10), e109204 (2014).
- Cabrita, A., et al. Motor dysfunction in Drosophila melanogaster as a biomarker for developmental neurotoxicity. iScience. 25 (7), 104541 (2022).
- Bishop, C. M. . Pattern Recognition and Machine Learning. , (2006).
- vander Maaten, L., Postma, E., vanden Herik, J. . Dimensionality reduction: A comparative review. , (2009).
- Courtine, G., et al. Performance of locomotion and foot grasping following a unilateral thoracic corticospinal tract lesion in monkeys (Macaca mulatta). Brain. 128 (10), 2338-2358 (2005).
- Drew, T., Jiang, W., Kably, B., Lavoie, S. Role of the motor cortex in the control of visually triggered gait modifications. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 74 (4), 426-442 (1996).
- Cheng, H., et al. Gait analysis of adult paraplegic rats after spinal cord repair. Experimental Neurology. 148 (2), 544-557 (1997).
- Thibaudier, Y., et al. Interlimb coordination during tied-belt and transverse split-belt locomotion before and after an incomplete spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 34 (9), 1751-1765 (2017).
- Bellardita, C., Kiehn, O. Phenotypic characterization of speed-associated gait changes in mice reveals modular organization of locomotor networks. Current Biology. 25 (11), 1426-1436 (2015).
- Machado, A. S., Marques, H. G., Duarte, D. F., Darmohray, D. M., Carey, M. R. Shared and specific signatures of locomotor ataxia in mutant mice. eLife. 9, 55356 (2020).
- Takeoka, A., Vollenweider, I., Courtine, G., Arber, S. Muscle spindle feedback directs locomotor recovery and circuit reorganization after spinal cord injury. Cell. 159 (7), 1626-1639 (2014).
