Summary
Een experimentele pijplijn om het bewegingspatroon van vrij lopende muizen kwantitatief te beschrijven met behulp van de MouseWalker (MW) toolbox wordt geleverd, variërend van initiële video-opnames en tracking tot post-kwantificeringsanalyse. Een dwarslaesiemodel bij muizen wordt gebruikt om het nut van het MW-systeem aan te tonen.
Abstract
De uitvoering van complexe en sterk gecoördineerde motorische programma's, zoals lopen en hardlopen, is afhankelijk van de ritmische activering van spinale en supra-spinale circuits. Na een thoracale dwarslaesie is de communicatie met stroomopwaartse circuits verstoord. Dit leidt op zijn beurt tot een verlies van coördinatie, met een beperkt herstelpotentieel. Om de mate van herstel na toediening van geneesmiddelen of therapieën beter te evalueren, is er dus behoefte aan nieuwe, meer gedetailleerde en nauwkeurige hulpmiddelen om gang, ledemaatcoördinatie en andere fijne aspecten van locomotorisch gedrag in diermodellen van ruggenmergletsel te kwantificeren. In de loop der jaren zijn verschillende testen ontwikkeld om het vrijloopgedrag bij knaagdieren kwantitatief te beoordelen; Ze missen echter meestal directe metingen met betrekking tot staploopstrategieën, voetafdrukpatronen en coördinatie. Om deze tekortkomingen aan te pakken, wordt een bijgewerkte versie van de MouseWalker geleverd, die een gefrustreerde totale interne reflectie (fTIR) loopbrug combineert met tracking- en kwantificeringssoftware. Dit open-source systeem is aangepast om verschillende grafische outputs en kinematische parameters te extraheren, en een set post-kwantificeringstools kan zijn om de verstrekte outputgegevens te analyseren. Dit manuscript laat ook zien hoe deze methode, in combinatie met reeds gevestigde gedragstests, motorische tekorten na een dwarslaesie kwantitatief beschrijft.
Introduction
De effectieve coördinatie van vier ledematen is niet uniek voor viervoetige dieren. De coördinatie van de voorpoot en de achterpoot bij de mens blijft belangrijk om verschillende taken uit te voeren, zoals zwemmen en veranderingen in snelheid tijdens het lopen1. Verschillende ledemaatkinematisch 2 en motorisch programma 1,3,4, evenals proprioceptieve feedbackcircuits5, worden bewaard tussen mensen en andere zoogdieren en moeten worden overwogen bij het analyseren van therapeutische opties voor motorische aandoeningen, zoals dwarslaesie (SCI)6,7,8.
Om te kunnen lopen, moeten verschillende spinale verbindingen van de voorpoten en achterpoten goed worden bedraad en ritmisch worden geactiveerd, wat input van de hersenen en feedback van het somatosensorische systeem vereist 2,9,10. Deze verbindingen culmineren in de centrale patroongeneratoren (CLB's), die zich op cervicaal en lumbaal niveau bevinden voor de voorpoten en achterpoten, respectievelijk 1,9,10. Vaak, na dwarslaesie, beperken de verstoring van neuronale connectiviteit en de vorming van een remmend gliaal litteken12 het herstel van de locomotorische functie, met uitkomsten variërend van totale verlamming tot beperkte functie van een groep ledematen, afhankelijk van de ernst van het letsel. Hulpmiddelen om de locomotorische functie na dwarslaesie nauwkeurig te kwantificeren zijn van cruciaal belang voor het monitoren van herstel en het evalueren van de effecten van behandelingen of andere klinische interventies6.
De standaard metrische test voor muiscontusiemodellen van SCI is de Basso-muisschaal (BMS)13,14, een niet-parametrische score die rekening houdt met rompstabiliteit, staartpositie, plantaire stepping en voorpoot-achterledemaatcoördinatie in een open veldarena. Hoewel het BMS in de meeste gevallen uiterst betrouwbaar is, vereist het ten minste twee ervaren beoordelaars om alle hoeken van dierbewegingen te observeren om rekening te houden met natuurlijke variabiliteit en vertekening te verminderen.
Andere testen zijn ook ontwikkeld om motorische prestaties na SCI kwantitatief te beoordelen. Deze omvatten de rotarod-test, die de tijd meet die wordt besteed aan een roterende cilinder15; de horizontale ladder, die het aantal gemiste leuningen en positieve laddergrijpers meet16,17; en de balklooptest, die de tijd meet die een dier nodig heeft en het aantal fouten dat het maakt bij het overschrijden van een smalle balk18. Ondanks een combinatie van motorische tekorten, produceert geen van deze tests directe locomotorische informatie over de coördinatie van de voorpoot-achterpoot.
Om loopgedrag specifiek en grondiger te analyseren, zijn andere testen ontwikkeld om stapcycli en loopstrategieën te reconstrueren. Een voorbeeld is de voetafdruktest, waarbij de geïnkte poten van een dier een patroon tekenen over een vel wit papier19. Hoewel eenvoudig in zijn uitvoering, is het extraheren van kinematische parameters zoals paslengte omslachtig en onnauwkeurig. Bovendien beperkt het ontbreken van dynamische parameters, zoals de duur van de stapcyclus of beengetimede coördinatie, de toepassingen ervan; Inderdaad, deze dynamische parameters kunnen alleen worden verkregen door frame-voor-frame video's van knaagdieren die door een transparant oppervlak lopen te analyseren. Voor SCI-studies hebben onderzoekers het loopgedrag geanalyseerd vanuit een zijaanzicht met behulp van een loopband, inclusief het reconstrueren van de stapcyclus en het meten van de hoekvariaties van elk beengewricht 4,20,21. Hoewel deze aanpak uiterst informatief kan zijn6, blijft het gericht op een specifieke set ledematen en mist het extra loopfuncties, zoals coördinatie.
Om deze hiaten op te vullen, ontwikkelden Hamers en collega's een kwantitatieve test op basis van een optische aanraaksensor met behulp van gefrustreerde totale interne reflectie (fTIR)22. Bij deze methode plant licht zich via interne reflectie door glas, wordt het verstrooid bij het drukken van de poten en wordt het uiteindelijk vastgelegd door een hogesnelheidscamera. Meer recent werd een open-source versie van deze methode, genaamd MouseWalker, beschikbaar gesteld, en deze aanpak combineert een fTIR-loopbrug met een tracking- en kwantificeringssoftwarepakket23. Met behulp van deze methode kan de gebruiker een grote reeks kwantitatieve parameters extraheren, waaronder stap-, ruimte- en looppatronen, voetafdrukpositionering en coördinatie van de voorpoot-achterpoot, evenals visuele outputs, zoals voetafdrukpatronen (die de geïnkte poottest6 nabootsen) of houdingsfasen ten opzichte van de lichaamsas. Belangrijk is dat vanwege het open-source karakter nieuwe parameters kunnen worden geëxtraheerd door het MATLAB-scriptpakket bij te werken.
Hier wordt de eerder gepubliceerde assemblage van het MouseWalker23-systeem bijgewerkt. Er wordt een beschrijving gegeven van hoe u het kunt instellen, met alle stappen die nodig zijn om de beste videokwaliteit, trackingcondities en parameteracquisitie te bereiken. Aanvullende post-kwantificeringstools worden ook gedeeld om de analyse van de MouseWalker (MW) outputdataset te verbeteren. Ten slotte wordt het nut van deze tool aangetoond door het verkrijgen van kwantificeerbare waarden voor algemene locomotorische prestaties, met name stapcycli en voorpoot-achterpootcoördinatie, in een context van dwarslaesie (SCI).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle behandelings-, chirurgische en postoperatieve zorgprocedures werden goedgekeurd door het Moleculair Intern Comité (ORBEA) van het Instituto de Medicina en het Portugese Comité voor Dierethiek (DGAV) in overeenstemming met de richtlijnen van de Europese Gemeenschap (Richtlijn 2010/63/EU) en de Portugese wet op de verzorging van dieren (DL 113/2013) onder de licentie 0421/000/000/2022. Vrouwelijke C57Bl/6J muizen van 9 weken oud werden gebruikt voor deze studie. Alles werd in het werk gesteld om het aantal dieren tot een minimum te beperken en het lijden van de in het onderzoek gebruikte dieren te verminderen. Het MATLAB-script en de zelfstandige versie van de MW-software zijn open-source en zijn beschikbaar op de GitHub
Repository (https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker). Terwijl de MW-software is ontwikkeld in MATLAB R2012b, is deze aangepast om te worden uitgevoerd in MATLAB R2022b. Figuur 1 illustreert de analyseworkflow van de MW.
1. Het MouseWalker (MW)-apparaat instellen
- Monteer het MW-apparaat zoals eerder beschreven23, of pas het aan de specifieke behoeften van het experimentele ontwerp aan (zie Materiaaltabel en Aanvullende Figuur 1 voor meer informatie over de opstelling).
OPMERKING: De looparena kan breder worden gemaakt om grotere dieren, zoals ratten, te huisvesten. -
Controleer of het plexiglas waar de dieren lopen schoon en krasvrij is. Gebruik een gladde reinigingsdoek en minimaliseer het gebruik van organische oplosmiddelen zoals ammoniak of ethanol in hoge concentraties, die het plexiglas kunnen beschadigen (3% waterstofperoxide, 7% ethanol of een compatibel en geschikt desinfectiemiddel voor plexiglas wordt aanbevolen). Vervang indien nodig het plexiglas.
- Stel de hogesnelheidscamera in met een snelle lens en een groot diafragma (d.w.z. kleinere F-stopwaarden) om een grote hoeveelheid licht vast te leggen, omdat dit helpt om de fTIR-signalen op te nemen (zie materiaaltabel).
OPMERKING: De lens mag geen optische vervormingen genereren, met name aan de randen van het beeld. Optische vervormingen kunnen worden getest door een bekend patroon op te nemen (bijvoorbeeld strepen of vierkanten) en vervolgens de grootte van de blokken op ImageJ / FIJI24 te meten (gebruik het lijngereedschap en klik vervolgens op Analyseren > meten). Een vierkant van 1 cm moet bijvoorbeeld dezelfde pixelafmetingen hebben, zowel in het midden van de afbeelding als aan de randen. Variaties moeten kleiner zijn dan 5%. - Verlicht de veelkleurige LED-lichtstrip van de achtergrondlichtbak.
- Verlicht de witte LED-lichtstrip van de lichtbak van de loopbrug.
OPMERKING: Een gekleurde LED kan ook25 worden gebruikt om het onderscheid van de voetafdruk / lichaam / achtergrond te vergemakkelijken. - Controleer met de lichten van de kamer uit de lichtintensiteit van de achtergrondlichtbak en loopbrug. Pas de intensiteit aan, indien nodig, met behulp van een potentiometer of semi-ondoorzichtige kunststof. Deze moeten zo worden geoptimaliseerd dat de pixelintensiteit in de volgende volgorde toeneemt: het lichaam van het dier < achtergrond < voetafdrukken.
- Om de pixelintensiteit van het lichaam / de achtergrond / voetafdrukken van het dier te controleren, opent u de beeldreeks op ImageJ / FIJI24 en klikt u op Analyseren > meten. Het voetafdruksignaal mag niet oververzadigd zijn, omdat dit voorkomt dat de grenzen van de voetafdruk worden gedefinieerd (d.w.z. tenen en voetkussens) (aanvullende figuur 2).
- Pas het beeldcontrast van de loopbrug aan op de video-opnamesoftware. Het contrast kan op twee manieren worden aangepast: door de verlichting op de ledstrip te dimmen of te vergroten of door het diafragma van de cameralens aan te passen.
- Plaats de lens op de juiste plaats op dezelfde hoogte en in het midden van de 45° reflecterende spiegel en loodrecht (90°) op de loopbrug. Dit genereert een constant proportioneel beeld langs de links-rechts loopbrug.
OPMERKING: Wijzig de camerapositie (afstand, hoogte en oriëntatie) niet tijdens de meerdere opnamesessies. Markeer indien nodig de vloer waar het statief moet worden geplaatst. Hierdoor blijven de afbeeldingsfuncties behouden. - Richt de lens op het oppervlak van het plexiglas. Dit kan worden getest met behulp van een niet-beschadigend voorwerp dat het oppervlak van het plexiglas raakt.
OPMERKING: Met lagere F-stop lenswaarden wordt de scherptediepte kleiner, waardoor scherpstellen moeilijker wordt. - Zorg ervoor dat alle instellingen ongewijzigd blijven tijdens de test, omdat ze de pixelintensiteit van de opgenomen video's kunnen wijzigen.
2. Video-acquisitie
- Zorg ervoor dat de muizen bekend zijn met de kamer en het apparaat voordat ze worden getest. Bewaar minstens 1 dag voor gewenning (dag 0). Om overmatige training te voorkomen, voert u de MW-test uit op een andere dag dan de andere gedragstests (bij voorkeur de dag erna).
- Zorg er in de video-opnamesoftware voor dat ten minste 50 cm van de loopbrug zichtbaar is.
- Pas de opname-instellingen aan om het loopbruggebied af te kappen. Dit verkleint de videogrootte en optimaliseert de video-acquisitie.
- Maak voor elke sessie een foto of een korte video van een gewone liniaal. Het aantal pixels per centimeter wordt later gebruikt in het "instellingenvenster" om de video's te kalibreren.
- Start de video-acquisitie en plaats het dier op de rand van de loopbrug door de basis van de staart vast te pakken om verwondingen te voorkomen. Zorg ervoor dat de dieren naar voren bewegen naar de uiterste rand van het platform. Voer de video-opnamen uit met ten minste 100 frames /s om soepele loopovergangen te garanderen.
- Motiveer de dieren indien nodig om te bewegen door zachtjes op de muur van het looppad te tikken of door met de vingers te knakken / klappen. Vermijd echter fysieke nudging, omdat dit de resultaten kan beïnvloeden.
- Sla de video's rechtstreeks op als beeldreeksen in TIFF-indeling (met LZW-compressie), JPEG of PNG. Als de camera opneemt als een onbewerkt MOV-bestand, converteert u de video's naar beeldreeksen door het bestand te openen in ImageJ / FIJI24 en te klikken op Bestand > Opslaan als > afbeeldingsreeks (of door andere software te gebruiken, zoals LosslessCut25).
OPMERKING: De meeste dieren beginnen direct te lopen nadat ze in de loopbrug zijn gezet; Daarom wordt aanbevolen om de video-acquisitie te starten voordat u het dier plaatst.
3. De video's voorbereiden voor de MW-trackingsoftware
- Film genoeg volledige runs van elke individuele muis. Het aantal te filmen dieren per conditie en het aantal volledige runs moeten worden bepaald volgens elk experimenteel ontwerp. Een volledige run is wanneer de muis de volledige 50 cm van de loopbrug loopt zonder langdurige stops (in dit experiment werden drie volledige runs geselecteerd).
OPMERKING: Afhankelijk van de beeldacquisitiesoftware moeten video's mogelijk worden bijgesneden tot de kleinste ROI. Dit verhoogt de snelheid van tracking en het genereren van uitvoer. - Selecteer in ImageJ/FIJI24 de frames waarin de muis zich op het scherm bevindt door op Image > Stack > Tools > Make a substack te klikken. De tracking op de MW vereist dat de kop en de staart zichtbaar zijn in alle frames. Het is echter mogelijk om meerdere substacks te maken van een enkele video-opname, die later elke run zal vertegenwoordigen.
- Sla elke substack afzonderlijk op in verschillende mappen door op Bestand te klikken > Opslaan als > afbeeldingsreeks. De MW-software maakt later automatisch een submap in elke map telkens wanneer men begint met het analyseren van een run.
4. Traceren
- Open MATLAB, voeg de map met het MW-script toe aan de werkmap en voer "MouseWalker.m" uit op de hoofdopdrachtregel.
OPMERKING: Met behulp van de MW-software onder MATLAB kunnen trackingfoutmeldingen worden bekeken op de hoofdconsole van MATLAB en kunnen de gewenste uitvoergegevens worden geselecteerd (door het hoofdscriptbestand "MouseEvaluate.m" te openen en de uitgangen te wijzigen in 1 of 0: het Excel-bestand, voetstapplots, standsporen en looppatronen). - Laad de videomap als de "Input directory". Men kan ook de uitvoermap kiezen; dit is echter geen vereiste, omdat de MW-software automatisch een nieuwe map met de naam "Resultaten" maakt in de "Invoermap".
- Controleer met behulp van de pijlen "<<", "<", ">>" en ">" of de videoframes allemaal correct zijn geladen in de MW-software.
- Ga naar het venster "Instellingen" waar alle kalibratie- en drempelparameters zich bevinden. Deze instellingen kunnen veranderen afhankelijk van de pixelintensiteit van de achtergrond en voetafdrukken, evenals de minimale grootte van het lichaam en voetafdrukken, naast andere factoren (zie voorbeeld in aanvullende figuur 2). Test het effect van het wijzigen van sommige parameters door op de knop Voorbeeld te klikken.
- Gebruik de verschillende plotstijlen, waaronder "lichaam + voeten + staart", "alleen lichaam", "alleen voeten" en "alleen staart", om lichaamsdelen te onderscheiden na het aanpassen van de drempelparameters.
- Maak gebruik van de gereedschappen op het rechterpaneel om metingen van de helderheid of grootte uit te voeren (met behulp van respectievelijk de knoppen "helderheid" en "liniaal"). Alle instellingen kunnen als "standaard" worden opgeslagen zolang de cameraafstand hetzelfde blijft.
- Nadat u de drempelparameters hebt aangepast, controleert u of de video klaar is voor geautomatiseerde tracking. Ga naar het eerste frame en klik op Auto om te beginnen met volgen. Deze stap kan in realtime worden gevolgd en duurt enkele minuten, afhankelijk van de grootte van de video en de prestaties van de computer.
- Als de autotracking de lichaamsfuncties onjuist labelt, annuleert u de automatische tracking, voert u nieuwe instellingen in en start u het proces opnieuw.
- Nadat het volgen is voltooid, controleert u of een handmatige correctie nodig is. Om te corrigeren, gebruikt u het middelste paneel om te selecteren of te deselecteren en geeft u de locatie aan van de voetafdrukken van de rechtervoorpoot (RF), rechterachterhand (RV), linkervoor (LF) en linkerachterhand (LH), hoofd, neus, lichaam (verdeeld in twee segmenten) en staartposities (verdeeld in vier segmenten). Sla de wijzigingen op door op de knop Opslaan te drukken.
OPMERKING: Alle knoppen en de meeste opdrachten hebben een sneltoets (raadpleeg de bijbehorende handleiding voor details23). Om het scrollen van video's en het uitvoeren van sneltoetsen te vergemakkelijken, kan een hardwarecontroller met programmeerbare knoppen en een shuttlewiel zoals de Contour ShuttlePro V2 worden gebruikt. - Klik op Evalueren om de uitvoerbestanden van de gevolgde video te genereren. Afhankelijk van de gewenste uitvoer die is geselecteerd (zie stap 4.1), kan deze stap enkele minuten duren.
- Controleer of alle grafische uitvoergegevensplots zijn opgeslagen in de map "Resultaten". Controleer de nauwkeurigheid van de tracking door enkele van de grafische uitgangen te onderzoeken, zoals de "Stance-sporen", waar men kan controleren of alle pootposities consistent zijn.
- Als er een fout wordt vastgesteld, corrigeert u de tracking handmatig (indien mogelijk; anders verwijdert u de map "Resultaten" en voert u de automatische tracking opnieuw uit met nieuwe instellingen) en klikt u nogmaals op de opdracht Evalueren .
- Controleer of alle kwantitatieve metingen die door de MW-software worden gegenereerd, worden opgeslagen in een Excel-spreadsheet en worden samengevat op "1. Info_Sheet". Zorg ervoor dat de Excel-opties voor de formulescheidingstekens overeenkomen met het script. Het decimale scheidingsteken moet "," zijn en de duizend scheidingstekens moeten ";" zijn.
- Gebruik het script "MouseMultiEvaluate.m" om de metingen van alle runs samen te voegen in een nieuw bestand voor analyse.
- Genereer om te beginnen een .txt bestand met de mappaden voor alle video's (bijvoorbeeld "Videobestanden.txt"). Zorg ervoor dat elke regel overeenkomt met één video.
- Schrijf vervolgens "MouseMultiEvaluate('Videofiles.txt')" in de opdrachtregel. Een Excel-bestand met de naam "ResultSummary.xls" wordt gegenereerd in de werkmap (zie een voorbeeld in de GitHub-opslagplaats).
OPMERKING: Figuur 2 geeft de grafische uitgangen weer die door de MW-software zijn verkregen uit de video's van één opgenomen dier.
5. Kinematische data-analyse workflow
- Bewerk het Excel-blad dat is gegenereerd in stap 4.10, dat de gegevens bevat voor verwerking met behulp van de meegeleverde Python-scripts, volgens de volgende vereisten.
- Geef in de eerste kolomkop de experimentele voorwaarde op. Geef elke regel een naam na de naam van de groep/voorwaarde (personen uit dezelfde groepen moeten dezelfde naam hebben). De eerste groep moet het besturingselement of de basislijn zijn (dit is alleen verplicht voor heatmapplotten, stap 5.6).
- Geef in de tweede kolom de dier-ID op. Dit is verplicht, hoewel deze informatie niet zal worden gebruikt voor het genereren van percelen.
- Kies in de derde kolom de motorparameters die voor de analyse worden gebruikt. Zorg ervoor dat de eerste regel de naam van de parameter is (deze namen verschijnen later in de plots).
- Open Anaconda Navigator en voer Spyder uit om de meegeleverde Python-scripts te openen.
OPMERKING: Alle scripts zijn ontwikkeld met Python 3.9.13, zijn uitgevoerd met Spyder 5.2.2 in Anaconda Navigator 2.1.4 en zijn beschikbaar in de materiaaltabel en de GitHub-opslagplaats (waar extra materialen zijn opgenomen, zoals een videovoorbeeld, een Excel-voorbeeldbestand en een document met veelgestelde vragen). Het is mogelijk om de scripts buiten de Anaconda Navigator uit te voeren; Deze grafische gebruikersinterface is echter gebruiksvriendelijker. - Gebruik de "Rawdata_PlotGenerator.py" om de onbewerkte gegevensplots te genereren. Dit maakt de visualisatie van elke parameter mogelijk als een functie van de snelheid.
- Open "Rawdata_PlotGenerator.py" in Spyder en voer de code uit door op de knop Afspelen te klikken.
- Selecteer het Excel-bestand dat u wilt analyseren en de bladnaam in het automatische venster. Als de bladnaam niet is gewijzigd, schrijft u "Blad1".
- De onbewerkte gegevensplots worden weergegeven in de plotconsole (deelvenster rechtsboven). Om de plots op te slaan, klikt u op de knop Afbeelding opslaan of Alle afbeeldingen opslaan in de plotconsole.
- Gebruik het script "Residuals_DataAnalysis" om de resten voor data-analyse te berekenen. Dit script genereert een CSV-bestand met de berekeningen van de resten voor alle motorparameters.
OPMERKING: Veel van de gemeten loopparameters die door de MW worden geëxtraheerd, variëren met de snelheid (bijv. Zwenksnelheid, staplengte, standduur, rechtheid van de houding en loopindexen). Daarom wordt aanbevolen om een best passend regressiemodel uit te voeren van elke individuele parameter versus snelheid voor het basislijnexperiment en vervolgens de restwaarden voor elke experimentele groep te bepalen in relatie tot dit regressiemodel. De gegevens worden dan uitgedrukt als het verschil met de resterende genormaliseerde lijn26.- Open "Residuals_DataAnalysis.py" in Spyder en voer de code uit door op de knop Afspelen te klikken.
- Selecteer het Excel-bestand dat u wilt analyseren en de bladnaam in het automatische venster. Als de bladnaam niet is gewijzigd, schrijft u "Blad1".
- Sla het CSV-bestand op in dezelfde map als de gegevens. Het is verplicht dat het besturingselement (of de basislijn) de eerste groep in het Excel-bestand is.
- Gebruik het script "PCA_PlotGenerator.py" om een principal component analysis (PCA) uit te voeren.
OPMERKING: Deze methode voor het verminderen van de dimensionaliteit zonder toezicht wordt gebruikt om een beknoptere weergave van27,28,29 van de gegevens te genereren (figuur 3A, B). Het PCA-script bevat de volgende stappen. De gegevens worden eerst voorbewerkt door centreren en schalen, waarna het PCA-algoritme de covariantiematrix berekent om de correlaties tussen de variabelen te bepalen en de eigenvectoren en eigenwaarden van de covariantiematrix te berekenen om de belangrijkste componenten te identificeren. De eerste twee of drie hoofdcomponenten worden gekozen voor de weergave van de gegevens in respectievelijk 2D- of 3D-plots. Elke stip in de plots komt overeen met een dier en vertegenwoordigt een andere abstracte variabele. Kleurgecodeerde stippen worden gebruikt om de specifieke groepen te onderscheiden. Als zodanig weerspiegelen clusters van stippen vergelijkbare looppatronen die worden gedeeld door de overeenkomstige individuen.- Open "PCA_PlotGenerator.py" in Spyder en voer de code uit door op de knop Afspelen te klikken.
- Selecteer het Excel-bestand dat u wilt analyseren en de bladnaam in het automatische venster. Als de bladnaam niet is gewijzigd, schrijft u "Blad1".
- Zorg ervoor dat de PCA 2D- en 3D-plots worden weergegeven in de plotconsole (deelvenster rechtsboven). Elke kleur vertegenwoordigt een andere groep en de legenda wordt naast de plot weergegeven. Om de plot op te slaan, klikt u op Afbeelding opslaan in de plotconsole.
- Gebruik "Heatmap_PlotGenerator.py" om een heatmap te genereren. Zorg ervoor dat de heatmapgenerator een tabel maakt met de statistische verschillen tussen de basislijngroep (of controlegroep) en de andere groepen voor elke motorparameter27 (figuur 4). Elke kolom geeft één groep weer en elke regel heeft betrekking op een specifieke motorparameter.
OPMERKING: Statistische analyse werd uitgevoerd met een eenrichtings-ANOVA gevolgd door Tukey's post-hoctest (voor normale verdelingen) of een Kruskal-Wallis ANOVA gevolgd door Dunn's post-hoctest (voor niet-normale verdelingen). Uitschieters werden uitgesloten van de analyse. P-waarden worden weergegeven door een kleurcode, waarbij rode en blauwe tinten een toename of afname aangeven ten opzichte van respectievelijk het besturingselement (of de basislijn). De kleurschakering vertegenwoordigt de statistische significantie, waarbij donkere kleuren een hogere betekenis hebben en lichtere kleuren een lagere betekenis. komt overeen met P < 0,001; ** komt overeen met P < 0,01; en * komt overeen met P < 0,05. Wit geeft geen variatie aan.- Open "Heatmap_PlotGenerator.py" in Spyder en voer de code uit door op de knop Afspelen te klikken.
- Selecteer het Excel-bestand dat u wilt analyseren en de bladnaam in het automatische venster. Als de bladnaam niet is gewijzigd, schrijft u "Blad1".
- Selecteer het type gegevens in het tweede automatische venster: onbewerkte gegevens of restgegevens. Als een optie niet is geselecteerd, zijn restgegevens de standaardinstelling.
- De heatmap wordt weergegeven in de plotconsole (deelvenster rechtsboven). Om de plot op te slaan, klikt u op Afbeelding opslaan in de plotconsole.
OPMERKING: Het is verplicht dat het besturingselement (of de basislijn) de eerste groep in het Excel-bestand is.
- Gebruik "Boxplots_PlotGenerator.py" om de boxplots te genereren. Met deze tool kunnen boxplots worden gegenereerd die de verdeling van waarden voor alle motorparameters voor elke groep weergeven (figuur 5, figuur 6 en figuur 7).
OPMERKING: Elk vak bevat de mediaan als de middelste lijn en de onder- en bovenranden van de vakken vertegenwoordigen respectievelijk het kwartiel van 25% en 75%. De snorharen vertegenwoordigen het bereik van de volledige dataset, exclusief uitschieters. Uitschieters worden gedefinieerd als elke waarde die 1,5 keer het interkwartielbereik onder of boven het kwartiel van respectievelijk 25% en 75% ligt.- Open "Boxplots_PlotGenerator.py" in Spyder en voer de code uit door op de knop Afspelen te klikken.
- Selecteer het Excel-bestand dat u wilt analyseren en de bladnaam in het automatische venster. Als de bladnaam niet is gewijzigd, schrijft u "Blad1".
- Selecteer het type gegevens in het tweede automatische venster: onbewerkte gegevens of restgegevens. Als een optie niet is geselecteerd, zijn restgegevens de standaardinstelling.
- De boxplots verschijnen in de plotconsole (deelvenster rechtsboven). Om de plots op te slaan, klikt u op de knop Afbeelding opslaan of Alle afbeeldingen opslaan in de plotconsole.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het standaard BMS-systeem beschrijft de bruto motorische tekorten na SCI14. Vanwege het subjectieve karakter worden over het algemeen naast het BMS andere kwantitatieve tests uitgevoerd om een meer gedetailleerde en fijne beoordeling van de voortbeweging te produceren. Deze tests tonen echter geen specifieke informatie over stapcycli, stappatronen en coördinatie van de voorpoten-achterpoten, wat uiterst belangrijk is om te begrijpen hoe het spinale circuit de functie behoudt en zich aanpast aan een onvolledige dwarslaesie. Deze sectie laat zien hoe de MW-toolbox kan helpen bij het monitoren van het herstel van de locomotorische functie na een dwarslaesie en relevante informatie over loopgedrag kan toevoegen.
Het onderzoeksmonster werd verdeeld in twee groepen vrouwelijke C57Bl/6J-muizen van 9 weken oud: een sci-experimentele groep (n = 11), waarbij de dieren laminectomie ondergingen, gevolgd door een matig tot ernstig kneuzingsletsel ter hoogte van de T9/T10-wervelkolom met behulp van een Infinite Horizon Impactor (zie materiaaltabel); en een schijngewonde controlegroep (n = 10), waarbij alleen de laminectomie op hetzelfde kolomniveau werd uitgevoerd (figuur 1, stap 1). Het locomotorische gedrag van de dwarslaesie en schijngewonde dieren werd gedurende 30 dagen gevolgd. De MW-test werd uitgevoerd op de gewenningsdag vóór de operatie (baseline) en 15 dagen, 22 dagen en 30 dagen na het letsel (dpi) (figuur 1, stap 2). Ter vergelijking: de muizen werden parallel voor de operatie onderworpen aan de BMS-test en bij 1 dpi, 3 dpi, 7 dpi, 14 dpi, 21 dpi en 30 dpi (aanvullende figuur 3). Na het volgen van alle video's verkregen met de MW, werden vervolgens twee soorten uitvoerbestanden gegenereerd: grafische uitgangen, met visuele weergaven van verschillende parameters na elke run, en kinematische uitgangen, die alle meetbare motorparameters samenvatten (figuur 1, stap 3 en stap 4).
Bijgevolg werden met behulp van een set Python-scripts (zie Materiaaltabel en de GitHub-repositorykoppeling) de ruwe gegevensplots verkregen (figuur 1, stap 5). Aangezien de meeste parameters worden beïnvloed door de snelheid van het dier, werd een regressiemodel van de basislijngroep vóór het letsel uitgevoerd samen met de gemeten restwaarden voor elke aandoening (figuur 1, stap 6). Om te controleren op kinematische profielen en significante verschillen tussen de controlegroepen (sham) en experimentele groepen (SCI), werden alle kinematische parameters (totaal 79) onderworpen aan een drie-orde principal component analysis (PCA) en werd een heatmap gegenereerd met een verzameling motorische parameters die de dataset het best beschreven (totaal van 33) (figuur 1, stap 7a, b). Ten slotte werden specifieke motorische parameters die na het dwarslaesie werden beïnvloed, vergeleken met de uitgangswaarde vóór het letsel (figuur 1, stap 7c).
Figuur 1: Schematische weergave van de analyseworkflow van de MW. (1) De dieren worden geselecteerd voor laminectomie (schijncontrolegroep) of laminectomie gevolgd door een dwarslaesie (experimentele groep). (2) De dieren worden vervolgens onderworpen aan een gedragstest op de dag vóór het letsel en op dag 15, 22 en 30 na het letsel. (3) De MW genereert twee soorten outputgegevens: (a) grafische visualisaties van verschillende parameters, zoals standsporen, gang- en stappatronen, en (b) een kinematische samenvatting van alle meetbare motorparameters. (4) Alle controle- en experimentele gegevens worden samengevoegd in één bestand met behulp van het script "MouseMultiEvaluate.m" op MATLAB. (5) Het "RawData_PlotGenerator" script voor Python genereert een visuele weergave van hoe alle meetbare motorparameters variëren afhankelijk van de snelheid. Als de parameters niet correleren met de snelheid, kan men overslaan naar (7); omdat de meeste parameters na SCI echter sterk afhankelijk zijn van de snelheid, moet een model worden gegenereerd (6) met behulp van het script "Residual_DataAnalysis" voor Python. Na het genereren van de restwaarden voor elke motorparameter wordt gegevensanalyse uitgevoerd (7): (a) een principal component analysis (PCA) wordt uitgevoerd met behulp van een selectie van parameters met een "PCA_PlotGenerator"-script; b) een heatmap wordt gemaakt met een "Heatmap_PlotGenerator"-script om de statistisch significante verschillen tussen de omstandigheden voor verschillende parameters weer te geven; en c) verschillende individuele parameters die na SCI worden gewijzigd, worden geëvalueerd met het script "BoxPlot_PlotGenerator". Alle scripts zijn beschikbaar in de materiaaltabel en de GitHub-repositorykoppeling. De scripts worden in het rood weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Uit de grafische outputgegevens verzameld van de MW, was het mogelijk om de bekende abrupte verandering in de visuele weergave van de voetafdrukken na SCI te bevestigen. In de "Digital-ink" assay gegenereerd door de MW, werd een gebrek aan ondersteuning van de achterpaws gedetecteerd (figuur 2A), samen met een afname van het voetafdrukgebied voor zowel de linker- als de rechterachterpoot (figuur 2B), die werd gehandhaafd vanaf 15 dpi (gegevens niet weergegeven). Bovendien berekent de MW binnen elke stapcyclus parameters met betrekking tot de houdingsfase (d.w.z. de tijd tussen de poottouchdown en vóór de lancering) en de zwaaifase (d.w.z. de tijd dat de ledemaat van de grond is). Als zodanig kan de MW visuele "houdingssporen" genereren, die rekening houden met de positie van het centrum en de as van het lichaam ten opzichte van elk been en hun voetafdrukcentrum tijdens de houdingsfasen23. De algemene houdingssporen die voor elk dier werden verkregen, vertoonden verschillende unieke kenmerken (figuur 2C). Deze gegevens toonden aan dat na SCI de achterpoten kortere houdingssporen en meer willekeurige pootpositionering hadden bij zowel touchdown als lift-off vanaf 15 dpi (figuur 2C).
Figuur 2: Representatieve grafische uitgangen verkregen door de MW-software uit de trackingvideo's. (A) "Digital-ink" afdrukken voor één SCI-dier met elke poot met een andere kleur: rood (rechts voor), geel (links voor), groen (rechtsachter) en blauw (linksachter) op verschillende tijdstippen. (B) Voetafdrukken voor de linker voorzijde (LF), linker hinde (LH), rechter voor (RF) en rechter hinde (RV) van een dwarsligger bij 15 dpi. (C) "Stance traces" voor één GCB-dier op verschillende tijdstippen. De AEP en PEP voor een van de poten worden geïllustreerd in het eerste paneel. De "footprint clustering" voor zowel de AEP als de PEP komt overeen met de standaarddeviatie van de gemiddelde AEP- of PEP-coördinaten in elke video. Afkortingen: dpi = dagen na het letsel; cm = centimeter; px = pixel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Vervolgens werden de kinematische uitgangen geanalyseerd na te zijn berekend door de MW (figuur 3 en figuur 4). Om een meer beknopte weergave van de dataset te verkrijgen en te testen of de kinematische motorparameters verkregen uit de MW voldoende waren om locomotorische tekorten weer te geven die in de loop van de tijd bij dwarslaesiedieren werden gevonden, werd een PCA27 uitgevoerd. Opmerkelijk is dat 40% van de variantie in de gegevens kon worden verklaard in de eerste component (PC1: 40,1%), die de groep dieren met een dwarslaesie scheidde van de rest, met een p-waarde lager dan 0,001 op basis van een eenrichtings-ANOVA-test (figuur 3A, B) op alle tijdstippen (15 dpi, 22 dpi en 30 dpi). Er was ook een slechte bijdrage van de andere componenten (PC2: 11% en PC3:8,6%). Het toegewezen gewicht van elke motorparameterbijdrage voor elk onderdeel wordt geïllustreerd in aanvullende figuur 4. Bovendien was de variantie in de dataset niet voldoende om verschillen in de tijd weer te geven (d.w.z. tussen 15 dpi, 22 dpi en 30 dpi), wat het eerder beschreven plateau van locomotorisch herstelrepliceert 14. Al met al geven deze resultaten aan dat de kinematische parameters verkregen uit de MW sterk de motorische tekorten beschrijven die na SCI op alle tijdspunten zijn waargenomen.
Figuur 3: Hoofdcomponentanalyse van alle kinematische motorparameters (79) verkregen door de MW-software na de analyse van de restgegevens. (A) Een 3D-visualisatie van de driecomponenten PCA-analyse. (B) Een 2D-visualisatie met cirkels die 50% van de verzamelde gegevens vertegenwoordigen. In PC1, dat meer dan 40% van de variantie verklaarde, verschilde de SCI-groep bij 15 dpi, 22 dpi en 30 dpi significant van de sham-groep en de baseline (vóór letsel), met een p-waarde < 0,001, zoals bepaald door een eenrichtings-ANOVA. Elke individuele kleine stip of driehoek vertegenwoordigt het gemiddelde van drie video's voor elk dier, terwijl de grotere stippen of driehoeken het gemiddelde punt vertegenwoordigen (n = 10-11 per aandoening, n = 21 voor de basislijngroep). De bijdrage van elke component wordt aangegeven in elke as. Afkortingen: dpi = dagen na het letsel; SCI = dwarslaesie; PC = hoofdcomponent. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Vervolgens werd een verzameling motorparameters geselecteerd op basis van hoe sterk deze de dataset beschreef (33 in totaal) en werd een heatmap gegenereerd (figuur 4). Inderdaad, de meeste locomotorische parameters vertoonden een drastische verandering na SCI op alle tijdstippen (15 dpi, 22 dpi en 30 dpi), terwijl de schijngewonde controles slechts significante veranderingen vertoonden bij 30 dpi. Deze veranderingen in de schijngroep kunnen worden verklaard door een algehele afname van de swingsnelheid, mogelijk als gevolg van testgewenning, die later zal worden besproken.
Het viel op dat de dwarslaesiedieren langzamer liepen dan de schijngewonden (gegevens niet getoond). Onafhankelijk van de snelheid, bij zowel 15 dpi als 30 dpi, vertoonden de SCI-dieren echter een hogere swingduur, lagere standduur en een lagere duty factor index, die betrekking heeft op de standduur/stapperiode23. Deze resultaten geven aan dat de hierboven beschreven veranderingen in beenpositionering kenmerkend zijn voor dwarslaesie, zoals te zien in andere diermodellen30,31,32, en niet gerelateerd zijn aan veranderingen in tempo (figuur 4).
Er moet ook worden vermeld dat de linker- en rechtersynchronisatie niet werd beïnvloed, aangezien een significante verandering in de "fase"-indexen voor de voor- en achterpoten niet werd waargenomen10,23 (figuur 4), wat wijst op een intacte koppeling tussen de linker- en rechterledematen.
Bovendien vertoonden de SCI-muizen een lagere "stance straightness" -index (verplaatsing / padlengte) in zowel de voorpoten als de achterpoten (figuur 4). Deze parameter meet hoe lineair de sporen zijn ten opzichte van de ideale toestand, die een rechte lijn zou zijn (variërend van 0 tot 1, wat een lineair spoor aangeeft)27. Daarom wijzen deze resultaten op een sterk onvermogen om recht te lopen in deze groep.
Voor elke houdingsfase tekent de MW een reconstructie van de oscillaties van het lichaam, beginnend bij de pootlanding - de voorste uiterste positie, of AEP- en eindigend voorafgaand aan de lancering - de achterste extreme positie of PEP (zie het voorbeeld in figuur 2C). De "footprint clustering" van zowel de AEP als de PEP meet de standaarddeviatie van de gemiddelde AEP- of PEP-coördinaten in elke video. De SCI-dieren vertoonden een toename van de clustering van de achterpootvoetafdruk voor de AEP op alle tijdstippen, en een significant effect werd alleen waargenomen voor de sham-gewonde groep bij 15 dpi (figuur 4). Dit illustreert dat de SCI-dieren hun achterpoten niet correct konden positioneren bij de touchdown na de swing. Daarnaast werd een afname van de "footprint clustering" van de voorpoot voor de PEP gezien, samen met een afname van de clustering van de achterpootvoetafdruk voor de PEP, bij 30 dpi (figuur 4). Deze resultaten zijn in overeenstemming met wat wordt waargenomen in de getekende "houdingssporen" en suggereren dat de positie van de voorpoten na een verwonding beperkter wordt.
Ten slotte, en in overeenstemming met de veranderingen in de plaatsing van de poot, waren er veranderingen in de loopstrategieën en "druk" die door de poten werden opgewekt, zoals gemeten door de gemiddelde helderheid over het gebied (figuur 4), die verder zal worden besproken.
Figuur 4: Heatmap-plot met een verzameling van de significant veranderde locomotorische parameters waarin dwarslaesiedieren en schijngewonde dieren worden vergeleken ten opzichte van de dag voorafgaand aan de operatie, zoals verkregen door de MW na analyse van resterende gegevens. n = 10-11 per aandoening; De baselinegroep omvat alle dieren de dag voor de operatie, n = 21. Gegevens worden uitgedrukt door de p-waarde na statistische analyse met een eenrichtings-ANOVA gevolgd door de post-hoctest van Tukey (voor normale verdelingen) of de post-hoctest van Dunn (voor niet-normale verdelingen). De P-waarden worden weergegeven door een kleurcode, waarbij rode en blauwe tinten respectievelijk een afname of toename ten opzichte van de basislijn aangeven. De kleurschakering vertegenwoordigt de statistische significantie, waarbij donkere kleuren een hogere betekenis aangeven en lichtere kleuren een lagere betekenis; P < 0,001; **P < 0,01; *P < 0,05. Wit geeft geen variatie aan. Afkortingen: dpi = dagen na het letsel; SCI = dwarslaesie; s = seconde; ms = milliseconde; gem = gemiddeld; F = voor; H = achteraf; AEP = voorste uiterste positie; PEP = achterste extreme positie; LF = linksvoor; LH = linkerachterste; RF = rechtsvoor; RH = rechtsachter. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Vervolgens probeerden we te begrijpen welke individuele parameters het beste zouden zijn om de locomotorische tekorten van dwarslaesiedieren in verschillende stadia van het letsel te beschrijven (d.w.z. 15 dpi, 22 dpi en 30 dpi). We begonnen met het onderzoeken van de parameters van de stapcyclus die verschillen tussen de voorpoten en de achterpoten lieten zien naarmate de achterpoten evolueerden van totale verlamming naar gedeeltelijke functie (figuur 5). Terwijl de gemiddelde zwaaisnelheid voor de voorpoten aanzienlijk toenam ten opzichte van de uitgangswaarde (vóór het letsel), veranderde de swingsnelheid van de achterpoten niet significant (hoewel er een tendens was dat deze lager was dan de basislijn) (figuur 5A, B). Tegelijkertijd nam de gemiddelde staplengte van de voorpoten af, zonder significante veranderingen voor de achterpoten (figuur 5C,D). Het is niet verrassend dat de gewonde muizen een verminderde voorpootzwaaiduur vertoonden en een omgekeerde toename van de duur van hun achterpootschommelingen bij 15 dpi verder (figuur 5E, F). Samen geven deze resultaten aan dat de voorpoten een sneller ritme aannamen, met twee voorpootcycli voor elke achterpootcyclus. Deze 2:1 cyclusverhouding is eerder beschreven na dwarslaesiehemisnede bij ratten 1,33 en illustreert een belangrijk aspect van gebrekkige coördinatie tussen voorpoten en achterpoten, die niet wordt hersteld na 30 dpi bij muizen.
Figuur 5: Stapcyclusparameters voor de voor- en achterpoten op verschillende tijdstippen 1 dag voor het letsel en bij 15 dpi, 22 dpi en 30 dpi bij dwarslaesiedieren (n = 11). (A,B) De gemiddelde swingsnelheid van de voor- en achterpoten ten opzichte van de basislijn. (C,D) De gemiddelde staplengte van de voor- en achterpoten ten opzichte van de basislijn. (E,F) De gemiddelde swingduur voor de voor- en achterpoten ten opzichte van de basislijn. In de boxplots wordt de mediaan weergegeven door de middelste lijn en de onder- en bovenranden van de vakken vertegenwoordigen respectievelijk het kwartiel van 25% en 75%; De snorharen vertegenwoordigen het bereik van de volledige dataset. Uitschieters worden weergegeven door enkele stippen. Statistische analyse werd uitgevoerd met een eenrichtings-ANOVA gevolgd door Tukey's post hoc test (voor normale verdelingen) of Dunn's post hoc test (voor niet-normale verdelingen). *P < 0,05; **P < 0,01; P < 0,001. Afkortingen: dpi = dagen na het letsel; SCI = dwarslaesie; cm = centimeter; s = seconde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De MW-software is ook in staat om de stappatronen van muizen te berekenen door de fractie van frames te meten die zijn toegewezen aan een specifieke beencombinatie, en dit werkt als een proxy voor de aanwezigheid van specifieke loopstrategieën. Bij lagere snelheden hebben niet-gewonde muizen de neiging om een "looppatroon" aan te nemen, waarbij de meeste frames een zwaai met één been hebben (ongeacht de pootpositie). Bij tussenliggende snelheden, die het meest voorkomen op de landingsbaan, veranderen muizen in een drafgang, waarbij de meest representatieve configuratie de diagonale beenzwaai is. Ten slotte gebruiken muizen bij hogere snelheden een "galopgang", waarbij drie poten tegelijkertijd23,34 zwaaien. Andere minder gebruikelijke configuraties zijn de pacing-gang, meestal vertegenwoordigd door de laterale beenzwaai (zowel linker- als rechterbenen), en de "gebonden / hoppende gang", waarbij beide achterpoten of voorpoten tegelijkertijd zwaaien10. Men moet echter in gedachten houden dat, in de context van een dwarslaesie, sommige van deze configuraties, zoals de driepootzwaai, een defecte positionering van de achterpoot kunnen weerspiegelen en dus niet precies overeenkomen met een specifieke loopstrategie - in dit geval de galop. Daarom werd de analyse vereenvoudigd door alleen de pootconfiguraties te vergelijken.
Na het uitvoeren van de restanalyse werd opgemerkt dat er een afname was in de prevalentie van diagonale schommelingen vergezeld van een afname van enkele schommelingen op alle tijdstippen (figuur 6A, B). Interessanter was dat er een toename was in de prevalentie van laterale schommelingen (figuur 6C). De pacing-achtige gang is niet typisch voor een normale C57BL/6J muis; er is echter al gemeld dat het optreedt na dwarslaesiehemisectie bij ratten1. Dit in-fase patroon was niet overheersend genoeg om de voorpoot- of achterpootfase-index te veranderen (zoals te zien in figuur 3), maar illustreert defecte spinale feedback van de achterpoten naar de voorpoten. Daarnaast was er een natuurlijke toename van de prevalentie van voorpoot/achterpootschommelingen (figuur 6D), mogelijk als gevolg van onjuiste plantaire stappen achteraan, en een toename van driebenige schommels (figuur 6E).
Figuur 6: De gemiddelde indexen voor verschillende stepping swing configuraties . (A) Diagonaal, (B) enkel, (C) lateraal, (D) voor/achter, en (E) driepotige swing op verschillende tijdstippen bij SCI-dieren (n = 11) worden getoond. In de boxplots wordt de mediaan weergegeven door de middelste lijn en de onder- en bovenranden van de vakken vertegenwoordigen respectievelijk het kwartiel van 25% en 75%; De snorharen vertegenwoordigen het bereik van de volledige dataset. Uitschieters worden weergegeven door enkele stippen. Statistische analyse werd uitgevoerd met een eenrichtings-ANOVA gevolgd door Tukey's post hoc test (voor normale verdelingen) of Dunn's post hoc test (voor niet-normale verdelingen). **P < 0,01; P < 0,001. Afkortingen: dpi = dagen na het letsel; SCI = dwarslaesie; NA = niet van toepassing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Ten slotte is een andere uitlezing die uit de MW kan worden geëxtraheerd "druk" als een maat voor helderheid / gebied. Bij hogere snelheden neemt het contactoppervlak met de grond af en neemt de druk toe, zodat een lineaire regressie van de basisgegevens werd uitgevoerd en de restwaarden voor elke toestand werden gemeten. Er werd opgemerkt dat de druk op de voorpoten aanzienlijk toenam over alle tijdstippen, maar de sterkte van dit effect nam in de loop van de tijd af, omdat de verandering voor de linker voorpoot al statistische significantie verloor bij 30 dpi (figuur 7A, C). Dit specifieke effect aan de linkerkant kan worden verklaard door een lateraal letsel, dat in deze studie bij voorkeur de rechterkant van het ruggenmerg zou kunnen hebben beïnvloed. Niettemin was de druk die door de achterpoten werd uitgeoefend bij gewonde muizen, zoals verwacht, over alle tijdspunten afgenomen, zonder neiging tot een toename (figuur 7B, D).
Figuur 7: Druk opgewekt door de achter- en voorpoten op verschillende tijdstippen bij dwarslaesiedieren (n = 11). Druk opgewekt door de (A) linker voorpoot, (B) linker achterpoot, (C) rechter voorpoot en (D) rechter achterpoot, weergegeven als relatieve verschillen met baseline (de dag voor het letsel). In de boxplots wordt de mediaan weergegeven als de middelste lijn en de onder- en bovenranden van de vakken vertegenwoordigen respectievelijk het kwartiel van 25% en 75%; De snorharen vertegenwoordigen het bereik van de volledige dataset. Uitschieters worden weergegeven door enkele stippen. Statistische analyse werd uitgevoerd met een eenrichtings-ANOVA gevolgd door Tukey's post hoc test (voor normale verdelingen) of Dunn's post hoc test (voor niet-normale verdelingen). **P < 0,01; P < 0,001. Afkortingen: dpi = dagen na het letsel; SCI = dwarslaesie; cm = centimeter; px = pixel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Al met al illustreert deze studie het vermogen van het MW-systeem voor het kwantitatief beschrijven van de motorische beperkingen veroorzaakt door SCI die soms kunnen worden genegeerd vanwege andere testbeperkingen. Bovendien onderstreept het het ongetwijfeld beperkte functionele herstel in de tijd in het kneuzingsmuismodel van SCI.
Aanvullende figuur 1: De MW-hardwarecomponenten. (A) Deze opstelling is als volgt verdeeld: I - fTIR-loopbrug; II - fTIR-steunbasis en posten; III - loopbrug muur; IV - 45° spiegel; en V - achtergrondverlichting. (B) Close-up beelden van het Base-U-kanaal en de zijlijnen van de loopbrug. (C) Ontwerp van de loopbrugwand. (D) Close-up van de 45° spiegelopstelling. Afkorting: cm = centimeter. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 2: Een enkel frame van een fTIR-video waarin de pixelintensiteit en regiogebieden worden aangegeven. De pixelintensiteiten voor het lichaam, de achtergrond en de voetafdrukken die in deze studie voor de video-analyse worden gebruikt, worden tussen haakjes weergegeven en in rood aangegeven, allemaal geoptimaliseerd voor beeldhelderheid. De lichtintensiteit moet worden aangepast om een goede discriminatie tussen de verschillende regio's te verkrijgen. Relatieve delen van het lichaam en voetafdrukken worden aangegeven door onderbroken gele lijnen. Zowel de gebieden als de pixelintensiteit werden verkregen in ImageJ/FIJI. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 3: (A) BMS-totaalscore en (B) subscore van de muizen geanalyseerd in deze studie (n = 10-11). Alle gegevens werden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM. Statistische analyse werd uitgevoerd met een tweeweg herhaalde metingen ANOVA gevolgd door Bonferroni's post hoc test; P < 0,001. Afkorting: BMS = Basso muisschaal. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 4: Het toegewezen gewicht van elke motorparameterbijdrage voor elk onderdeel. Het toegewezen gewicht van elke motorparameter (79 in totaal) na de restanalyse voor (A) PC1, (B) PC2 en (C) PC3 in de PCA. De afkaplijn werd getrokken op 0,04 ms en -0,04. Afkortingen: ms = milliseconde; gem = gemiddeld; SD = standaardafwijking; F = voor; H = achteraf; AEP = voorste uiterste positie; PEP = achterste extreme positie; LF = linksvoor; LH = linkerachterste; RF = rechtsvoor; RH = rechtsachter; Druk = druk. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier wordt het potentieel van de MouseWalker-methode aangetoond door het locomotorisch gedrag na dwarslaesie te analyseren. Het biedt nieuwe inzichten in specifieke veranderingen in stap-, voetafdruk- en looppatronen die anders zouden worden gemist door andere standaardtests. Naast het leveren van een bijgewerkte versie van het MW-pakket, worden ook data-analysetools beschreven met behulp van de meegeleverde Python-scripts (zie stap 5).
Omdat de MW een grote dataset en een verzameling kinematische parameters genereert die een hoogdimensionaal bewegingsproces weerspiegelen, werd een PCA gebruikt; PCA is inderdaad op grote schaal gebruikt in andere kinematische datasets die vergelijkbaar zijn met deze 27,35,36 (figuur 3). Deze dimensionaliteitsreductietechniek is een eenvoudige en robuuste methode met minimale aannames die het mogelijk maakt om kinematische profielen kwantitatief te identificeren en snel te onderscheiden van controle- of basisvoorwaarden. Daarnaast werden heatmaps gegenereerd om snel de parameters te identificeren die statistisch verschilden van de basislijn (figuur 4), die later individueel konden worden geanalyseerd (figuur 5, figuur 6 en figuur 7).
Vervolgens werd getoond hoe specifieke parameters die uit de MW kunnen worden geëxtraheerd de robuuste locomotorische tekorten illustreren die bij SCI-dieren worden gezien, zoals coördinatie. Coördinatie is het vermogen om elk ledemaat op een georganiseerde manier te gebruiken om een taak uit te voeren. Vaak wordt coördinatie indirect gemeten aan de hand van het aantal fouten/positieve gebeurtenissen op een ladder 16,17 of de tijd besteed aan de rotarod15. Duidelijk berekent de MW zowel de variabiliteit in pootpositionering tijdens de stapcyclus (voetafdrukpatroon) als de "stance straightness" -index27. Er werd aangetoond dat beide parameters significant werden beïnvloed door het letsel (figuur 4).
Bovendien stelt de MW de gebruiker in staat om parameters met betrekking tot temporele dynamica te extraheren. Er werd een significante verstoring van de swing/standduur bij dwarslaesiedieren gezien (figuur 4) en er werd vastgesteld dat de dwarslaesiemuizen het verlies van steun op hun achterpoten compenseerden door hun voorpootstapcyclus te versnellen, waardoor de staplengte van de voorpoot en de gemiddelde swingtijd werden verminderd (figuur 5). Dit effect zou te maken kunnen hebben met de verschuiving in het zwaartepunt, waardoor de voorpoten meer lichaamsgewicht moeten verdragen1. Evenzo kan het worden toegeschreven aan het verlies van de lange oplopende propriospinale paden, die verantwoordelijk zijn voor de synergetische interactie tussen de voorpoot en de achterste CLB's 1,9,32, wat uiteindelijk leidt tot dissociatie van het voorpoot-achterbeenritme.
De kenmerken van stapgangen kunnen de modulaire organisatie van locomotorische netwerkenillustreren 1,34. Hoewel stappatronen geen directe proxy zijn voor de loopstrategieën die in dit gevalzijn aangenomen 23, kunnen er nog steeds enkele belangrijke observaties worden getrokken. Belangrijke veranderingen werden gezien in de stappatronen van dwarslaesiemuizen (figuur 6). De gewonde dieren begonnen zijwaartse schommelingen (pacing-achtige gangen) aan te nemen en er was ook een afname van diagonale schommels. Deze aanpassingen lijken geassocieerd te zijn met een poging om de voor- en achterpoten te coördineren, wat opnieuw de dissociatie tussen de spinale sporen onder en boven de verwonding aantoont, die niet herstelt 1,9,32.
Het beperkte herstel na een dwarslaesie werd ook geverifieerd door een afname van de spierkracht in de achterpoten, zoals gemeten aan de hand van de gemiddelde druk (figuur 7). Bijgevolg worden de voorpoten gedwongen om meer lichaamsgewicht te ondersteunen, waardoor de druk toeneemt. Hoewel veel parameters met betrekking tot spierdynamiek hier niet werden geanalyseerd (d.w.z. flexor- en extensorspiercoördinatie 7,21), kan deze kwantitatieve meting een directe uitlezing van de hoeveelheid ledemaatondersteuning bieden.
Deze MW-analyse kan ook worden gecombineerd met de standaard BMS-test, die ledemaatrotatie, pootplaatsing, staartpositie en stapfouten meet. Over het algemeen behalen SCI-muizen een maximale score van 4-5, met een maximale subscore van 3, wat betekent dat ze af en toe tot frequente stappen kunnen uitvoeren, maar meestal roteren bij de paw lift-off en / of touchdown14 (aanvullende figuur 2). Het wordt duidelijk waarom de AEP-waarden voor de achterpoten significant werden gewijzigd in de SCI-groep, omdat de niet-parallelle positionering van de ledematen tijdens de zwaaifase de pootcoördinaten kan beïnvloeden. Bovendien wordt in het BMS de romp meestal geclassificeerd als ernstig vanwege de aanwezigheid van gevallen of gebeurtenissen die het stappen voorkomen, zoals billen naar beneden en springen14. Hoewel het niet mogelijk was om het butt down-gedrag of gevallen die het stappen verhinderden te kwantificeren, werd een beperkte achterpootstap in de MW gedetecteerd, met een hogere swingduur (figuur 5F), verhoogde drie beenzwaaibewegingen (figuur 6E) en lagere druk (figuur 7B-D). Daarnaast werd een significante toename van voor/achter schommelingen waargenomen (figuur 6D). Er zouden twee complementaire verklaringen kunnen zijn voor deze gedragsmanifestatie. Eerst werd de hoppende gang gemeten, die al in de BMS-test kon worden waargenomen. Dit gedrag kan echter ook verband houden met een gebrek aan correcte plantaire stappen in beide achterpoten, wat resulteert in voetweerstand of dorsale plaatsing. Over het algemeen ondersteunen deze observaties de bewering dat de rompstabiliteit ernstig is beschadigd na dwarslaesie. Ten slotte is een van de vereisten om hoger te scoren dan 5 in de BMS-test coördinatie14, en hiervoor moeten de beoordelaars tijdens de test ten minste drie toegankelijke slagen in acht nemen. Daarvan moeten twee van de drie of meer toegankelijke passen als gecoördineerd worden geclassificeerd (d.w.z. voorpoten en achterpoten afwisselend). Uit de MW-gegevens kan men objectieve metingen, de stance straightness index en footprint clustering extraheren, die de coördinatie direct kwantificeren, onafhankelijk van de snelheid van het dier of de toegankelijke pas (figuur 4). Daarnaast kan de afwisseling tussen ledematen objectief worden gekwantificeerd door de stapstrategieën te meten (figuur 6). Deze parameters illustreren duidelijk dat dwarslaesiemuizen consequent niet in rechte lijnen kunnen lopen en hun achterpoten verkeerd kunnen plaatsen.
Hoewel de MW-toolbox een nuttige strategie is voor het bestuderen van locomotorische defecten na dwarslaesie, moet men enkele van de beperkingen ervan overwegen. Ten eerste is het van cruciaal belang om consistent te blijven met de acquisitieparameters (d.w.z. camerapositie, focus, lichtintensiteit), zodat de beeldkenmerken tussen tijdstippen behouden blijven. Ten tweede werd opgemerkt dat herhaling leidde tot gewenning, wat op zijn beurt leidde tot een verminderde snelheid. Dit droeg ook bij aan een verhoogd opfok- / verzorgingsgedrag en stopt halverwege de run. Voor gewonde dieren was er ook een neiging om op de loopbrugwanden te leunen en een verhoogd aantal stops halverwege de run. Aangezien deze gedragingen geen deel uitmaken van de locomotorische beoordeling, mogen ze niet worden overwogen. Bij voorkeur kiezen onderzoekers voor video's waarin de dieren continu lopen met hun hoofd recht gericht. Om de invloed van dit gedrag op de resultaten van deze studie tegen te gaan, werden muizen continu geregistreerd gedurende ten minste vier of vijf runs en mochten ze in beide richtingen langs de loopbrug rennen. Daarna werden de drie best opgenomen runs geselecteerd en aangepast in dezelfde richting op ImageJ / FIJI24 (180 ° rotatie). Elk dier werd dus vertegenwoordigd door een gemiddelde van drie runs samengevoegd per tijdpunt. Een groter aantal dieren per aandoening zou ook de verwachte variabiliteit kunnen verminderen. Bovendien moet worden opgemerkt dat deze locomotorische test alleen wordt aanbevolen nadat plantaire stappen zijn bereikt, omdat het volgsysteem is ontworpen voor nauwkeurig afgestelde locomotorische beoordeling. In deze studie werd opgemerkt dat vóór 15 dpi de MW-test niet gunstig was voor de locomotorische beoordeling vanwege de verhoogde voetweerstand en onjuiste plantaire plaatsing, wat de tracking zou kunnen beïnvloeden (gegevens niet getoond). Ten slotte zijn sommige parameters (zoals footprint clustering) erg gevoelig voor de extrapolaties die door het gegenereerde regressiemodel worden gemaakt. Daarom is de code dienovereenkomstig aangepast (zie de documentatie in het script in de GitHub-koppeling).
Over het algemeen werd aangetoond dat de MW SCI-dieren sterk kon onderscheiden van schijngewonde controles, en MW kon ook worden gekoppeld aan gevestigde tests als een waardevolle methode om locomotorische defecten na dwarslaesie te bestuderen. Bovendien werd aangetoond dat kwantitatieve outputs eenvoudig konden worden gegenereerd uit de MW-dataset met behulp van de meegeleverde Python-scripts. Deze tools bieden een efficiënte experimentele pijplijn om een rijke en diverse set kwantitatieve en grafische outputs te genereren die de originele MW-uitvoerbestanden aanvullen en kunnen worden gewijzigd om de doelen van de onderzoeker te vervullen in termen van het type analyse en grafische weergave.
Deze toolbox is een waardevolle methode voor het bestuderen van andere motorische gerelateerde ziekten of motorische disfuncties, niet alleen die gerelateerd aan ruggenmergletsel. Skarlatou et al.10 toonden al aan dat een specifieke mutatie in Afadin, een belangrijk steigereiwit tijdens de ontwikkeling, een afwijkend fenotype in het ruggenmerg veroorzaakte door twee centrale kanalen te genereren. Dit defect resulteerde in het verlies van de afwisseling van de rechter-linker ledematen en een hogere prevalentie van ledemaatsynchronisatie, typisch voor een hoppende gang. Stauch et al.10 illustreerden ook dat dit type systeem kan worden aangepast aan de behoeften van de gebruiker. In dit geval werd het toegepast om specifieke gedragsstoornissen in een parkinsonmodel bij ratten te bestuderen. Deze toolbox heeft dus een breed scala aan toepassingen in verschillende modellen waarin motorische storingen worden verwacht en kan worden gecombineerd met reeds gevestigde gedragsprotocollen in het veld.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
De auteurs bedanken Laura Tucker en Natasa Loncarevic voor hun commentaar op het manuscript en de steun van de knaagdierfaciliteit van het Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes. De auteurs willen de financiële steun van Prémios Santa Casa Neurociências - Prijs Melo e Castro voor onderzoek naar dwarslaesie (MC-36/2020) aan L.S. en C.S.M. erkennen. Dit werk werd ondersteund door Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) (PTDC/BIA-COM/0151/2020), iNOVA4Health (UIDB/04462/2020 en UIDP/04462/2020), en LS4FUTURE (LA/P/0087/2020) aan C.S.M. L.S. werd ondersteund door een CEEC Individual Principal Investigator contract (2021.02253.CEECIND). A.F.I. werd ondersteund door een doctoraatsbeurs van FCT (2020.08168.BD). A.M.M. werd ondersteund door een doctoraatsbeurs van FCT (PD/BD/128445/2017). I.M. werd ondersteund door een postdoctoraal fellowship van FCT (SFRH/BPD/118051/2016). D.N.S. werd ondersteund door een doctoraatsbeurs van FCT (SFRH/BD/138636/2018).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 45º Mirror | |||
| 2 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 16 cm height, 1 on each side | Misumi | ||
| 2 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 23 cm, @ 45° , 1 on each side | Misumi | ||
| 1 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 83 cm long | Misumi | ||
| 87 x 23 cm mirror | General glass supplier | ||
| black cardboard filler | General stationery supplier | We used 2, one with 69 x 6 cm and another with 69 x 3cm to limit the reflection on the mirror | |
| Background backlight | |||
| 109 x 23 cm plexiglass (0.9525 cm thick) | General hardware supplier | ||
| 2 lateral aluminum extrusion (4 x 4 cm), 20 cm long, 1 on each side | Misumi | ||
| multicolor LED strip | General hardware supplier | ||
| white opaque paper to cover the plexyglass | General stationery supplier | ||
| fTIR Support base and posts | |||
| 2 aluminum extrusion (4 x 4 cm), 100 cm height | Misumi | ||
| 60 x 30 cm metric breadboard | Edmund Optics | #54-641 | |
| M6 12 mm screws | Edmund Optics | ||
| M6 hex nuts and wahers | Edmund Optics | ||
| fTIR Walkway | |||
| 109 x 8.5 cm plexyglass (1.2 cm thick) | General hardware supplier | 109 x 8.5 cm plexyglass (1.2 cm thick) | |
| 109 cm long Base-U-channel aluminum with 1.6 cm height x 1.9 cm depth thick folds (to hold the plexyglass) | General hardware supplier | ||
| 2 lateral aluminum extrusion (4 x 4 cm) 20 cm length, 1 on each side | Misumi | ||
| black cardboard filler | General stationery supplier | we used 2 fillers on each side to cover the limits of the plexyglass, avoiding bright edges | |
| M6 12 mm screws | Edmund Optics | ||
| High speed camera (on a tripod) | |||
| Blackfly S USB3 | FLIR | #BFS-U3-32S4M-C | This is a reccomendation. The requirement is to record at least 100 frames per second |
| Infinite Horizon Impactor | |||
| Infinite Horizon Impactor | Precision Systems and Instrumentation, LLC. | #0400 | |
| Lens | |||
| Nikon AF Zoom-Nikkor 24-85mm | Nikon | #1929 | This lens is reccomended, however other lens can be used. Make sure it contains a large aperture (i.e., smaller F-stop values), to capture fTIR signals |
| Software | |||
| MATLAB R2022b | MathWorks | ||
| Python 3.9.13 | Python Software Foundation | ||
| Anaconda Navigator 2.1.4 | Anaconda, Inc. | ||
| Spyder 5.1.5 | Spyder Project Contributors | ||
| Walkway wall | |||
| 2 large rectagular acrilics with 100 x 15 cm | Any bricolage convenience store | ||
| 2 Trapezian acrilic laterals with 6-10 length x 15 cm height | Any bricolage convenience store | ||
| GitHub Materials | |||
| Folder name | URL | ||
| Boxplots | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Boxplots | Script to create Boxplots | |
| Docs | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Docs | Additional documents | |
| Heatmap | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Heatmaps | Script to create heatmap | |
| Matlat script | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Matlab%20Script | MouseWalker matlab script | |
| PCA | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/PCA%20plots | Script to perform Principal Component Analysis | |
| Raw data Plots | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Rawdata%20Plots | Script to create Raw data plots | |
| Residual Analysis | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Residual_Analysis | Code to compute residuals from Raw data |
References
- Frigon, A. The neural control of interlimb coordination during mammalian locomotion. Journal of Neurophysiology. 117 (6), 2224-2241 (2017).
- Grillner, S. Biological pattern generation: The cellular and computational logic of networks in motion. Neuron. 52 (5), 751-766 (2006).
- Dominici, N., et al. locomotor primitives in newborn babies and their development. Science. 334 (6058), 997-999 (2011).
- Courtine, G., et al. Kinematic and EMG determinants in quadrupedal locomotion of a non-human primate (Rhesus). Journal of Neurophysiology. 93 (6), 3127-3145 (2005).
- Clarac, F., Cattaert, D., le Ray, D. Central control components of a 'simple' stretch reflex. Trends Neuroscience. 23 (5), 199-208 (2000).
- Squair, J. W., Gautier, M., Sofroniew, M. V., Courtine, G., Anderson, M. A.
- Wenger, N., et al. Spatiotemporal neuromodulation therapies engaging muscle synergies improve motor control after spinal cord injury. Nature Medicine. 22 (2), 138-145 (2016).
- Grillner, S. The spinal locomotor CPG: A target after spinal cord injury. Progress in Brain Research. 137, 97-108 (2002).
- Boulain, M., et al. Synergistic interaction between sensory inputs and propriospinal signalling underlying quadrupedal locomotion. Journal of Physiology. 599 (19), 4477-4496 (2021).
- Skarlatou, S., et al. Afadin signaling at the spinal neuroepithelium regulates central canal formation and gait selection. Cell Reports. 31 (10), 107741 (2020).
- Viala, D., Vidal, C. Evidence for distinct spinal locomotion generators supplying respectively fore-and hindlimbs in the rabbit. Brain Research. 155 (1), 182-186 (1978).
- Silver, J., Miller, J. H.
- Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. Journal of Neurotrauma. 12 (1), 1-21 (1995).
- Basso, D. M., et al. Basso mouse scale for locomotion detects differences in recovery after spinal cord injury in five common mouse strains. Journal of Neurotrauma. 23 (5), 635-659 (2006).
- Jones, B. J., Roberts, D. J. The quantitative measurement of motor inco-ordination in naive mice using an accelerating rotarod. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 20 (4), 302-304 (1968).
- Metz, G. A., Whishaw, I. Q. The ladder rung walking task: A scoring system and its practical application. Journal of Visualized Experiments. (28), e1204 (2009).
- Metz, G. A., Whishaw, I. Q. Cortical and subcortical lesions impair skilled walking in the ladder rung walking test: A new task to evaluate fore-and hindlimb stepping, placing, and coordination. Journal of Neuroscience Methods. 115 (2), 169-179 (2002).
- Wallace, J. E., Krauter, E. E., Campbell, B. A. Motor and reflexive behavior in the aging rat. Journal of Gerontology. 35 (3), 364-370 (1980).
- Carter, R. J., et al. Characterization of progressive motor deficits in mice transgenic for the human Huntington's disease mutation. The Journal of Neuroscience. 19 (8), 3248-3257 (1999).
- Leblond, H., L'espérance, M., Orsal, D., Rossignol, S. Behavioral/systems/cognitive treadmill locomotion in the intact and spinal mouse. The Journal of Neuroscience. 23 (36), 11411-11419 (2003).
- Courtine, G., et al. Recovery of supraspinal control of stepping via indirect propriospinal relay connections after spinal cord injury. Nature Medicine. 14 (1), 69-74 (2008).
- Hamers, F. P. T., Koopmans, G. C., Joosten, E. A. J. CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 23 (3-4), 537-548 (2006).
- Mendes, C. S., et al. Quantification of gait parameters in freely walking rodents. BMC Biology. 13 (1), 50 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Stauch, K. L., et al. Applying the ratwalker system for gait analysis in a genetic rat model of Parkinson's disease. Journal of Visualized Experiments. (167), e62002 (2021).
- Mendes, C. S., Rajendren, S. V., Bartos, I., Márka, S., Mann, R. S. Kinematic responses to changes in walking orientation and gravitational load in Drosophila melanogaster. PLoS One. 9 (10), e109204 (2014).
- Cabrita, A., et al. Motor dysfunction in Drosophila melanogaster as a biomarker for developmental neurotoxicity. iScience. 25 (7), 104541 (2022).
- Bishop, C. M. Pattern Recognition and Machine Learning. , Springer. Delhi, India. (2006).
- vander Maaten, L., Postma, E., vanden Herik, J. Dimensionality reduction: A comparative review. , Tilburg University. The Netherlands.. http://www.uvt.nl/ticc (2009).
- Courtine, G., et al. Performance of locomotion and foot grasping following a unilateral thoracic corticospinal tract lesion in monkeys (Macaca mulatta). Brain. 128 (10), 2338-2358 (2005).
- Drew, T., Jiang, W., Kably, B., Lavoie, S. Role of the motor cortex in the control of visually triggered gait modifications. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 74 (4), 426-442 (1996).
- Cheng, H., et al. Gait analysis of adult paraplegic rats after spinal cord repair. Experimental Neurology. 148 (2), 544-557 (1997).
- Thibaudier, Y., et al. Interlimb coordination during tied-belt and transverse split-belt locomotion before and after an incomplete spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 34 (9), 1751-1765 (2017).
- Bellardita, C., Kiehn, O. Phenotypic characterization of speed-associated gait changes in mice reveals modular organization of locomotor networks. Current Biology. 25 (11), 1426-1436 (2015).
- Machado, A. S., Marques, H. G., Duarte, D. F., Darmohray, D. M., Carey, M. R. Shared and specific signatures of locomotor ataxia in mutant mice. eLife. 9, 55356 (2020).
- Takeoka, A., Vollenweider, I., Courtine, G., Arber, S. Muscle spindle feedback directs locomotor recovery and circuit reorganization after spinal cord injury. Cell. 159 (7), 1626-1639 (2014).
