Summary
Es wird eine experimentelle Pipeline zur quantitativen Beschreibung des Bewegungsmusters von frei gehenden Mäusen mit der MouseWalker (MW) Toolbox bereitgestellt, die von ersten Videoaufnahmen und Tracking bis hin zur Analyse nach der Quantifizierung reicht. Ein Modell für Rückenmarksprellungen bei Mäusen wird verwendet, um die Nützlichkeit des MW-Systems zu demonstrieren.
Abstract
Die Ausführung komplexer und hochkoordinierter motorischer Programme, wie Gehen und Laufen, ist abhängig von der rhythmischen Aktivierung von spinalen und supraspinalen Schaltkreisen. Nach einer thorakalen Rückenmarksverletzung ist die Kommunikation mit den vorgelagerten Kreisläufen gestört. Dies wiederum führt zu einem Koordinationsverlust mit begrenztem Erholungspotenzial. Um den Grad der Genesung nach der Verabreichung von Medikamenten oder Therapien besser beurteilen zu können, sind daher neue, detailliertere und genauere Instrumente erforderlich, um den Gang, die Koordination der Gliedmaßen und andere feine Aspekte des Bewegungsverhaltens in Tiermodellen für Rückenmarksverletzungen zu quantifizieren. Im Laufe der Jahre wurden mehrere Assays entwickelt, um das Freilaufverhalten von Nagetieren quantitativ zu bewerten. Ihnen fehlen jedoch in der Regel direkte Messungen in Bezug auf Schrittschrittstrategien, Fußabdruckmuster und Koordination. Um diese Unzulänglichkeiten zu beheben, wird eine aktualisierte Version des MouseWalkers bereitgestellt, die einen frustrierten Totalreflexions-Laufsteg (fTIR) mit Tracking- und Quantifizierungssoftware kombiniert. Dieses Open-Source-System wurde angepasst, um mehrere grafische Ausgaben und kinematische Parameter zu extrahieren, und eine Reihe von Nachquantifizierungswerkzeugen kann zur Analyse der bereitgestellten Ausgabedaten verwendet werden. Dieses Manuskript zeigt auch, wie diese Methode, verbunden mit bereits etablierten Verhaltenstests, Bewegungsdefizite nach Rückenmarksverletzungen quantitativ beschreibt.
Introduction
Die effektive Koordination von vier Gliedmaßen ist nicht nur bei vierbeinigen Tieren der Fall. Die Koordination zwischen Vorder- und Hintergliedmaßen beim Menschen ist nach wie vor wichtig, um verschiedene Aufgaben zu erfüllen, wie z. B. Schwimmen und Geschwindigkeitsänderungen beim Gehen1. Verschiedene gliedmaßenkinematische2 und motorische Programme 1,3,4 sowie propriozeptive Rückkopplungskreise5 sind zwischen Menschen und anderen Säugetieren konserviert und sollten bei der Analyse von therapeutischen Optionen für motorische Störungen, wie z. B. Rückenmarksverletzungen (SCI)6,7,8, berücksichtigt werden.
Um gehen zu können, müssen mehrere Wirbelsäulenverbindungen von den Vorder- und Hintergliedmaßen richtig verdrahtet und rhythmisch aktiviert werden, was Inputs des Gehirns und Feedback des somatosensorischen Systems erfordert 2,9,10. Diese Verbindungen gipfeln in den zentralen Mustergeneratoren (CPGs), die sich auf zervikaler und lumbaler Ebene für die Vorder- bzw. Hintergliedmaßen befinden 1,9,10. Häufig schränken nach einer Rückenmarksverletzung die Störung der neuronalen Konnektivität und die Bildung einer inhibitorischen Glianarbe12 die Wiederherstellung der Bewegungsfunktion ein, wobei die Ergebnisse je nach Verletzungsschwere von einer vollständigen Lähmung bis hin zu einer eingeschränkten Funktion einer Gruppe von Gliedmaßen variieren. Instrumente zur präzisen Quantifizierung der Bewegungsfunktion nach einer Rückenmarksverletzung sind entscheidend für die Überwachung der Genesung und die Bewertung der Auswirkungen von Behandlungen oder anderen klinischen Interventionen6.
Der standardmäßige metrische Assay für Maus-Prellungsmodelle der Rückenmarksverletzung ist die Basso-Maus-Skala (BMS)13,14, ein nicht-parametrischer Score, der die Rumpfstabilität, die Schwanzposition, das Plantartreten und die Koordination zwischen Vorder- und Hintergliedmaßen in einem offenen Feld berücksichtigt. Obwohl das BMS in den meisten Fällen äußerst zuverlässig ist, sind mindestens zwei erfahrene Bewerter erforderlich, um alle Winkel der Tierbewegung zu beobachten, um die natürliche Variabilität zu berücksichtigen und Verzerrungen zu reduzieren.
Es wurden auch andere Assays entwickelt, um die motorische Leistung nach einer Rückenmarksverletzung quantitativ zu bewerten. Dazu gehört der Rotarod-Test, bei dem die Zeit gemessen wird, die an einem rotierenden Zylinder15 verbracht wird; die horizontale Leiter, die die Anzahl der fehlenden Geländer und der positiven Leitergreifer misst16,17; und der Beam-Walking-Test, der die Zeit misst, die ein Tier benötigt, und die Anzahl der Fehler, die es beim Überqueren eines schmalen Balkens18 macht. Obwohl es sich um eine Kombination von motorischen Defiziten handelt, liefert keiner dieser Tests direkte lokomotorische Informationen über die Koordination zwischen Vorder- und Hintergliedmaßen.
Um das Gehverhalten spezifisch und gründlicher zu analysieren, wurden weitere Assays entwickelt, um Schrittzyklen und Gangstrategien zu rekonstruieren. Ein Beispiel ist der Fußabdrucktest, bei dem die eingefärbten Pfoten eines Tieres ein Muster über ein weißes Blatt Papier zeichnen19. Obwohl es einfach in der Ausführung ist, ist das Extrahieren von kinematischen Parametern wie der Schrittlänge umständlich und ungenau. Darüber hinaus schränkt das Fehlen dynamischer Parameter, wie z. B. die Dauer des Schrittzyklus oder die zeitgesteuerte Koordination der Beine, seine Anwendungen ein. In der Tat können diese dynamischen Parameter nur durch die Analyse von Bild-für-Bild-Videos von Nagetieren erfasst werden, die durch eine transparente Oberfläche laufen. Für SCI-Studien haben die Forscher das Gehverhalten aus seitlicher Sicht mit einem Laufband analysiert, einschließlich der Rekonstruktion des Schrittzyklus und der Messung der Winkelvariationen jedes Beingelenks 4,20,21. Auch wenn dieser Ansatz äußerst informativ sein kann6, konzentriert er sich auf eine bestimmte Gruppe von Gliedmaßen und es fehlen zusätzliche Gangmerkmale, wie z. B. Koordination.
Um diese Lücken zu schließen, entwickelten Hamers und Kollegen einen quantitativen Test, der auf einem optischen Berührungssensor basiert, der frustrierte interne Totalreflexion (fTIR) verwendet22. Bei dieser Methode breitet sich das Licht durch interne Reflexion durch Glas aus, wird beim Pfotendrücken gestreut und schließlich von einer Hochgeschwindigkeitskamera erfasst. In jüngerer Zeit wurde eine Open-Source-Version dieser Methode namens MouseWalker zur Verfügung gestellt, und dieser Ansatz kombiniert einen fTIR-Laufsteg mit einem Tracking- und Quantifizierungssoftwarepaket23. Mit dieser Methode kann der Benutzer eine große Anzahl quantitativer Parameter extrahieren, darunter Schritt-, Raum- und Gangmuster, Fußabdruckpositionierung und Koordination zwischen Vorder- und Hintergliedmaßen sowie visuelle Ausgaben, wie z. B. Fußabdruckmuster (in Anlehnung an den eingefärbten Pfoten-Assay6) oder Standphasen relativ zur Körperachse. Wichtig ist, dass aufgrund des Open-Source-Charakters neue Parameter durch Aktualisieren des MATLAB-Skriptpakets extrahiert werden können.
Hier wird die zuvor veröffentlichte Zusammenstellung des MouseWalker23 Systems aktualisiert. Es wird eine Beschreibung der Einrichtung mit allen Schritten bereitgestellt, die erforderlich sind, um die beste Videoqualität, die Tracking-Bedingungen und die Parametererfassung zu erreichen. Zusätzliche Werkzeuge nach der Quantifizierung werden ebenfalls zur Verfügung gestellt, um die Analyse des MouseWalker (MW)-Ausgabedatensatzes zu verbessern. Schließlich wird die Nützlichkeit dieses Instruments demonstriert, indem quantifizierbare Werte für die allgemeine Bewegungsleistung, insbesondere für Schrittzyklen und die Koordination von Vordergliedmaßen und Hintergliedmaßen, im Zusammenhang mit einer Rückenmarksverletzung (SCI) ermittelt werden.
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Protocol
Alle Handhabungs-, chirurgischen und postoperativen Pflegeverfahren wurden vom Instituto de Medicina Molecular Internal Committee (ORBEA) und der portugiesischen Tierethikkommission (DGAV) in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Europäischen Gemeinschaft (Richtlinie 2010/63/EU) und dem portugiesischen Tierhaltungsgesetz (DL 113/2013) unter der Lizenz 0421/000/000/2022 genehmigt. Für die vorliegende Studie wurden weibliche C57Bl/6J-Mäuse im Alter von 9 Wochen verwendet. Es wurden alle Anstrengungen unternommen, um die Anzahl der Tiere zu minimieren und das Leiden der in der Studie verwendeten Tiere zu verringern. Das MATLAB-Skript und die Standalone-Version der MW-Software sind Open Source und stehen auf GitHub zur Verfügung
Repositorium (https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker). Während die MW-Software in MATLAB R2012b entwickelt wurde, wurde sie für die Ausführung in MATLAB R2022b angepasst. Abbildung 1 veranschaulicht den Analyse-Workflow des MW.
1. Einrichten des MouseWalker (MW)-Geräts
- Die MW-Apparatur ist wie zuvor23 beschrieben zusammenzubauen oder an die spezifischen Anforderungen des Versuchsaufbaus anzupassen (weitere Einzelheiten zum Aufbau finden Sie in der Materialtabelle und in der ergänzenden Abbildung 1 ).
Anmerkungen: Die Laufarena kann breiter gemacht werden, um größere Tiere, wie z. B. Ratten, unterzubringen. -
Stellen Sie sicher, dass das Plexiglas, auf dem die Tiere laufen, sauber und kratzfrei ist. Verwenden Sie ein glattes Reinigungstuch und minimieren Sie die Verwendung organischer Lösungsmittel wie Ammoniak oder Ethanol in hohen Konzentrationen, die das Plexiglas beschädigen können (3 % Wasserstoffperoxid, 7 % Ethanol oder ein anderes kompatibles und geeignetes Desinfektionsmittel für Plexiglas wird empfohlen). Tauschen Sie ggf. das Plexiglas aus.
- Richten Sie die Hochgeschwindigkeitskamera mit einem lichtstarken Objektiv und einer großen Blende (d. h. kleineren Blendenwerten) ein, um eine große Lichtmenge einzufangen, da dies bei der Aufzeichnung der fTIR-Signale hilft (siehe Materialtabelle).
HINWEIS: Das Objektiv sollte keine optischen Verzerrungen erzeugen, insbesondere nicht an den Rändern des Bildes. Optische Verzerrungen können getestet werden, indem ein bekanntes Muster (z. B. Streifen oder Quadrate) aufgezeichnet und dann die Größe der Blöcke auf ImageJ/FIJI24 gemessen wird (verwenden Sie das Linienwerkzeug und klicken Sie dann auf Analysieren > messen). Zum Beispiel sollte ein Quadrat mit einer Größe von 1 cm sowohl in der Mitte des Bildes als auch an den Rändern die gleichen Pixelabmessungen haben. Variationen sollten kleiner als 5 % sein. - Beleuchten Sie den mehrfarbigen LED-Lichtstreifen aus dem Hintergrundbeleuchtungskasten.
- Beleuchten Sie den weißen LED-Lichtstreifen aus dem Gehweg-Leuchtkasten.
HINWEIS: Eine farbige LED kann auch25 verwendet werden, um die Unterscheidung von Grundfläche/Körper/Hintergrund zu erleichtern. - Überprüfen Sie bei ausgeschalteter Raumbeleuchtung die Lichtintensität des Hintergrundbeleuchtungskastens und des Gehwegs. Stellen Sie die Intensität bei Bedarf mit einem Potentiometer oder halbundurchsichtigem Kunststoff ein. Diese müssen so optimiert werden, dass die Pixelintensität in folgender Reihenfolge zunimmt: Körper < Hintergrund des Tieres < Fußabdrücke.
- Um die Pixelintensität des Körpers/Hintergrunds/der Fußabdrücke des Tieres zu überprüfen, öffnen Sie die Bildsequenz auf ImageJ/FIJI24 und klicken Sie auf Analyze > Measure. Das Footprint-Signal sollte nicht übersättigt sein, da dadurch verhindert wird, dass die Grenzen des Footprints (d. h. Zehen und Fußballen) definiert werden (ergänzende Abbildung 2).
- Passen Sie den Bildkontrast des Gehwegs in der Videoaufzeichnungssoftware an. Der Kontrast kann auf zwei Arten eingestellt werden: durch Dimmen oder Erhöhen der Beleuchtung des LED-Streifens oder durch Einstellen der Blende des Kameraobjektivs.
- Positionieren Sie das Objektiv richtig, um sich auf gleicher Höhe und in der Mitte des 45° reflektierenden Spiegels und senkrecht (90°) zum Gehweg zu befinden. Dadurch wird ein konstant proportionales Bild entlang des Links-Rechts-Gehwegs erzeugt.
HINWEIS: Vermeiden Sie es, die Kameraposition (Abstand, Höhe und Ausrichtung) während mehrerer Aufnahmesitzungen zu ändern. Markieren Sie ggf. den Boden, auf dem das Stativ platziert werden soll. Dadurch bleiben die Bildmerkmale erhalten. - Fokussieren Sie das Objektiv auf die Oberfläche des Plexiglases. Dies kann mit einem nicht beschädigenden Gegenstand getestet werden, der die Oberfläche des Plexiglases berührt.
Anmerkungen: Bei niedrigeren Blendenwerten wird die Schärfentiefe kleiner, wodurch das Fokussieren erschwert wird. - Stellen Sie sicher, dass alle Einstellungen während des Assays unverändert bleiben, da sie die Pixelintensität der aufgezeichneten Videos verändern können.
2. Video-Akquisition
- Stellen Sie sicher, dass die Mäuse vor dem Testen mit dem Raum und dem Gerät vertraut sind. Bewahren Sie mindestens 1 Tag für die Gewöhnung auf (Tag 0). Um übermäßiges Training zu vermeiden, führen Sie den MW-Test an einem anderen Tag als die anderen Verhaltenstests durch (vorzugsweise am Tag danach).
- Stellen Sie in der Videoaufzeichnungssoftware sicher, dass mindestens 50 cm des Gehwegs sichtbar sind.
- Passen Sie die Aufnahmeeinstellungen an, um den Gehwegbereich abzuschneiden. Dadurch wird die Videogröße reduziert und die Videoaufnahme optimiert.
- Machen Sie vor jeder Sitzung ein Foto oder ein kurzes Video von einem normalen Lineal. Die Anzahl der Pixel pro Zentimeter wird später im "Einstellungsfenster" verwendet, um die Videos zu kalibrieren.
- Starten Sie die Videoaufnahme und legen Sie das Tier an den Rand des Gehwegs, indem Sie die Basis des Schwanzes greifen, um Verletzungen zu vermeiden. Stellen Sie sicher, dass sich die Tiere bis zum äußersten Rand der Plattform vorwärts bewegen. Führen Sie die Videoaufnahmen mit mindestens 100 Bildern/s durch, um reibungslose Gangübergänge zu gewährleisten.
- Motivieren Sie die Tiere bei Bedarf, sich zu bewegen, indem Sie sanft auf die Gehwegwand klopfen oder mit den Fingern schnippen/klatschen. Vermeiden Sie jedoch physisches Nudging, da dies die Ergebnisse beeinträchtigen kann.
- Speichern Sie die Videos direkt als Bildsequenzen im TIFF- (mit LZW-Komprimierung), JPEG- oder PNG-Format. Falls die Kamera als rohe MOV-Datei aufzeichnet, konvertieren Sie die Videos in Bildsequenzen, indem Sie die Datei in ImageJ/FIJI24 öffnen und auf Datei klicken > Als > Bildsequenz speichern (oder eine andere Software wie LosslessCut25 verwenden).
HINWEIS: Die meisten Tiere beginnen sofort nach dem Setzen auf den Gehweg zu laufen. Daher wird empfohlen, die Videoaufnahme zu starten, bevor Sie das Tier platzieren.
3. Vorbereiten der Videos für die MW-Tracking-Software
- Filmen Sie genügend komplette Durchläufe jeder einzelnen Maus. Die Anzahl der Tiere, die pro Bedingung gefilmt werden sollen, und die Anzahl der vollständigen Durchläufe müssen je nach Versuchsplanung festgelegt werden. Ein vollständiger Lauf liegt vor, wenn die Maus die gesamten 50 cm des Laufstegs ohne längere Unterbrechungen zurücklegt (in diesem Experiment wurden drei vollständige Läufe ausgewählt).
HINWEIS: Abhängig von der Bilderfassungssoftware müssen Videos möglicherweise auf den kleinsten ROI zugeschnitten werden. Dadurch wird die Geschwindigkeit der Nachverfolgung und Ausgabegenerierung erhöht. - Wählen Sie in ImageJ/FIJI24 die Frames aus, in denen sich die Maus auf dem Bildschirm befindet, indem Sie auf Image > Stack > Tools klicken > Substack erstellen. Das Tracking auf dem MW erfordert, dass der Kopf und das Heck in allen Rahmen sichtbar sind. Es ist jedoch möglich, aus einer einzigen Videoaufnahme mehrere Substacks zu erstellen, die später jeden Durchlauf darstellen.
- Speichern Sie jeden Teilstapel separat in verschiedenen Ordnern, indem Sie auf Datei > Speichern als > Bildsequenz klicken. Die MW-Software erstellt später automatisch einen Unterordner in jedem Verzeichnis, wenn man mit der Analyse eines Laufs beginnt.
4. Sendungsverfolgung
- Öffnen Sie MATLAB, fügen Sie den Ordner mit dem MW-Skript zum Arbeitsverzeichnis hinzu und führen Sie "MouseWalker.m" in der Hauptbefehlszeile aus.
HINWEIS: Die Verwendung der MW-Software unter MATLAB ermöglicht es, Tracking-Fehlermeldungen auf der Hauptkonsole von MATLAB anzuzeigen und die gewünschten Ausgabedaten auszuwählen (indem Sie die Hauptskriptdatei "MouseEvaluate.m" öffnen und die Ausgaben entweder auf 1 oder 0 ändern: die Excel-Datei, Schrittdiagramme, Standspuren und Gangmuster). - Laden Sie den Videoordner als "Eingabeverzeichnis". Man kann auch den Ausgabeordner auswählen; Dies ist jedoch keine Voraussetzung, da die MW-Software automatisch einen neuen Ordner namens "Results" im "Input-Verzeichnis" erstellt.
- Überprüfen Sie mit den Pfeilen "<<", "<", ">>" und ">", ob alle Videobilder korrekt in der MW-Software geladen sind.
- Gehen Sie zum Fenster "Einstellungen", in dem sich alle Kalibrierungs- und Schwellenwertparameter befinden. Diese Einstellungen können sich unter anderem in Abhängigkeit von der Pixelintensität des Hintergrunds und der Footprints sowie der minimalen Größe des Körpers und der Footprints ändern (siehe Beispiel in der ergänzenden Abbildung 2). Testen Sie die Auswirkungen der Änderung einiger Parameter, indem Sie auf die Schaltfläche Vorschau klicken.
- Verwenden Sie die verschiedenen Plotstile, einschließlich "Körper + Füße + Schwanz", "Nur Körper", "Nur Füße" und "Nur Schwanz", um Körperteile nach dem Anpassen der Schwellenwertparameter zu unterscheiden.
- Nutzen Sie die Werkzeuge auf der rechten Seite, um die Helligkeit oder Größe zu messen (mit den Tasten "Helligkeit" bzw. "Lineal"). Alle Einstellungen können als "Standard" gespeichert werden, solange der Kameraabstand gleich bleibt.
- Überprüfen Sie nach dem Anpassen der Schwellenwertparameter, ob das Video für das automatisierte Tracking bereit ist. Gehen Sie zum ersten Frame und klicken Sie auf Auto , um das Tracking zu starten. Dieser Schritt kann in Echtzeit verfolgt werden und dauert je nach Größe des Videos und der Leistung des Computers einige Minuten.
- Wenn das automatische Tracking die Körper-Features falsch beschriftet, brechen Sie das automatische Tracking ab, geben Sie neue Einstellungen ein, und starten Sie den Vorgang erneut.
- Überprüfen Sie nach Abschluss der Nachverfolgung, ob eine manuelle Korrektur erforderlich ist. Verwenden Sie zum Korrigieren das mittlere Feld, um die Auswahl aufzuheben, und geben Sie die Position der Pfotenabdrücke der rechten Vorderseite (RF), der rechten Hinterhand (rechts), der linken Vorderseite (LF) und der linken Hinterhand (LH), des Kopfes, der Nase, des Körpers (in zwei Segmente unterteilt) und des Schwanzes (unterteilt in vier Segmente) an. Speichern Sie die Änderungen, indem Sie auf die Schaltfläche Speichern klicken.
HINWEIS: Alle Tasten und die meisten Befehle haben eine Tastenkombination (siehe das zugehörige Handbuch für Details23). Um das Scrollen von Videos und das Ausführen von Tastaturkürzeln zu erleichtern, kann ein Hardware-Controller mit programmierbaren Tasten und einem Shuttle-Rad wie dem Contour ShuttlePro V2 verwendet werden. - Klicken Sie auf Auswerten , um die Ausgabedateien aus dem verfolgten Video zu generieren. Je nach gewählter gewünschter Ausgabe (siehe Schritt 4.1) kann dieser Schritt einige Minuten dauern.
- Vergewissern Sie sich, dass alle grafischen Ausgabedaten im Ordner "Ergebnisse" gespeichert sind. Überprüfen Sie die Genauigkeit des Trackings, indem Sie einige der grafischen Ausgaben untersuchen, wie z. B. die "Stance-Traces", wo Sie überprüfen können, ob alle Pfotenpositionen konsistent sind.
- Wenn ein Fehler festgestellt wird, korrigieren Sie das Tracking manuell (wenn möglich, andernfalls löschen Sie den Ordner "Ergebnisse" und führen Sie das automatische Tracking mit neuen Einstellungen erneut durch) und klicken Sie erneut auf den Befehl Auswerten .
- Vergewissern Sie sich, dass alle von der MW-Software generierten quantitativen Messungen in einer Excel-Tabelle gespeichert und unter "1. Info_Sheet". Stellen Sie sicher, dass die Excel-Optionen für die Formeltrennzeichen mit dem Skript übereinstimmen. Das Dezimaltrennzeichen muss "," sein, und die Tausendertrennzeichen müssen ";" sein.
- Verwenden Sie das Skript "MouseMultiEvaluate.m", um die Messungen aus allen Durchläufen zur Analyse in einer neuen Datei zusammenzufassen.
- Generieren Sie zunächst eine .txt Datei, die die Ordnerpfade für alle Videos enthält (z. B. "Videofiles.txt"). Stellen Sie sicher, dass jede Zeile einem einzelnen Video entspricht.
- Schreiben Sie dann "MouseMultiEvaluate('Videofiles.txt')" in die Befehlszeile. Im Arbeitsverzeichnis wird eine Excel-Datei mit dem Namen "ResultSummary.xls" generiert (siehe Beispiel im GitHub-Repository).
HINWEIS: Abbildung 2 zeigt die grafischen Ausgaben, die die MW-Software aus den Videos eines aufgezeichneten Tieres erhält.
5. Arbeitsablauf für die kinematische Datenanalyse
- Bearbeiten Sie die in Schritt 4.10 generierte Excel-Tabelle, die die Daten für die Verarbeitung mit den bereitgestellten Python-Skripten enthält, gemäß den folgenden Voraussetzungen.
- Geben Sie in der ersten Spaltenüberschrift die experimentelle Bedingung an. Benennen Sie jede Zeile nach dem Gruppen-/Bedingungsnamen (Personen aus denselben Gruppen müssen denselben Namen haben). Die erste Gruppe muss das Steuerelement oder die Baseline sein (dies ist nur für das Heatmap-Plotten, Schritt 5.6 obligatorisch).
- Geben Sie in der zweiten Spalte die Tier-ID an. Dies ist obligatorisch, obwohl diese Informationen nicht für die Ploterstellung verwendet werden.
- Wählen Sie in der dritten Spalte die Motorparameter aus, die für die Analyse verwendet werden sollen. Stellen Sie sicher, dass die erste Zeile der Name des Parameters ist (diese Namen werden später in den Diagrammen angezeigt).
- Öffnen Sie Anaconda Navigator und führen Sie Spyder aus, um die bereitgestellten Python-Skripte zu öffnen.
HINWEIS: Alle Skripte wurden mit Python 3.9.13 entwickelt, wurden mit Spyder 5.2.2 in Anaconda Navigator 2.1.4 ausgeführt und sind im Materialverzeichnis und im GitHub-Repository verfügbar (wo zusätzliche Materialien enthalten sind, wie z. B. ein Videobeispiel, eine Excel-Beispieldatei und ein FAQ-Dokument). Es ist möglich, die Skripte außerhalb des Anaconda Navigators auszuführen; Diese grafische Benutzeroberfläche ist jedoch benutzerfreundlicher. - Verwenden Sie die "Rawdata_PlotGenerator.py", um die Rohdatendiagramme zu generieren. Dies ermöglicht die Visualisierung jedes Parameters als Funktion der Geschwindigkeit.
- Öffnen Sie "Rawdata_PlotGenerator.py" in Spyder und führen Sie den Code aus, indem Sie auf die Schaltfläche "Abspielen " klicken.
- Wählen Sie die zu analysierende Excel-Datei und den Blattnamen im automatischen Fenster aus. Wenn der Blattname nicht geändert wurde, schreiben Sie "Tabelle1".
- Die Rohdatenplots werden in der Plotkonsole (oben rechts) angezeigt. Um die Plots zu speichern, klicken Sie in der Plotkonsole auf die Schaltfläche Bild speichern oder Alle Bilder speichern .
- Verwenden Sie das Skript "Residuals_DataAnalysis", um die Residuen für die Datenanalyse zu berechnen. Dieses Skript generiert eine CSV-Datei mit den Berechnungen der Residuen für alle Motorparameter.
HINWEIS: Viele der gemessenen Gangparameter, die vom MW extrahiert werden, variieren mit der Geschwindigkeit (z. B. Schwunggeschwindigkeit, Schrittlänge, Standdauer, Standgeradheit und Gangindex). Daher wird empfohlen, für das Baseline-Experiment ein Best-Fit-Regressionsmodell für jeden einzelnen Parameter in Abhängigkeit von der Geschwindigkeit durchzuführen und dann die Residuenwerte für jede Versuchsgruppe in Bezug auf dieses Regressionsmodell zu bestimmen. Die Daten werden dann als Differenz aus der normalisierten Restzeile26 ausgedrückt.- Öffnen Sie "Residuals_DataAnalysis.py" in Spyder und führen Sie den Code aus, indem Sie auf die Schaltfläche "Abspielen " klicken.
- Wählen Sie die zu analysierende Excel-Datei und den Blattnamen im automatischen Fenster aus. Wenn der Blattname nicht geändert wurde, schreiben Sie "Tabelle1".
- Speichern Sie die CSV-Datei im selben Ordner wie die Daten. Es ist zwingend erforderlich, dass das Steuerelement (oder die Baseline) die erste Gruppe in der Excel-Datei ist.
- Verwenden Sie das Skript "PCA_PlotGenerator.py", um eine Hauptkomponentenanalyse (PCA) durchzuführen.
ANMERKUNG: Diese unüberwachte Methode zur Reduzierung der Dimensionalität wird verwendet, um eine prägnantere Darstellung27,28,29 der Daten zu erzeugen (Abbildung 3A, B). Das PCA-Skript umfasst die folgenden Schritte. Die Daten werden zunächst durch Zentrierung und Skalierung vorverarbeitet, danach berechnet der PCA-Algorithmus die Kovarianzmatrix, um die Korrelationen zwischen den Variablen zu bestimmen, und berechnet die Eigenvektoren und Eigenwerte der Kovarianzmatrix, um die Hauptkomponenten zu identifizieren. Die ersten zwei bzw. drei Hauptkomponenten werden für die Darstellung der Daten in 2D- bzw. 3D-Diagrammen ausgewählt. Jeder Punkt in den Diagrammen entspricht einem Tier und stellt eine andere abstrakte Variable dar. Farbcodierte Punkte werden verwendet, um die einzelnen Gruppen zu unterscheiden. Daher spiegeln Punktgruppen ähnliche Laufmuster wider, die von den entsprechenden Individuen geteilt werden.- Öffnen Sie "PCA_PlotGenerator.py" in Spyder und führen Sie den Code aus, indem Sie auf die Schaltfläche " Abspielen" klicken.
- Wählen Sie die zu analysierende Excel-Datei und den Blattnamen im automatischen Fenster aus. Wenn der Blattname nicht geändert wurde, schreiben Sie "Tabelle1".
- Stellen Sie sicher, dass die PCA-2D- und 3D-Plots in der Plotkonsole (oben rechts) angezeigt werden. Jede Farbe stellt eine andere Gruppe dar, und die Legende wird neben dem Diagramm angezeigt. Um den Plot zu speichern, klicken Sie in der Plotkonsole auf Bild speichern .
- Verwenden Sie "Heatmap_PlotGenerator.py", um eine Heatmap zu erstellen. Stellen Sie sicher, dass der Heatmap-Generator eine Tabelle erstellt, in der die statistischen Unterschiede zwischen der Basisgruppe (oder Kontrollgruppe) und den anderen Gruppen für jeden Motorparameter27 aufgeführt sind (Abbildung 4). Jede Spalte stellt eine Gruppe dar, und jede Zeile bezieht sich auf einen bestimmten Motorparameter.
ANMERKUNG: Die statistische Analyse wurde mit einer einfaktoriellen ANOVA durchgeführt, gefolgt von einem Tukey-Post-hoc-Test (für Normalverteilungen) oder einer Kruskal-Wallis-ANOVA gefolgt von einem Post-hoc-Test von Dunn (für Nicht-Normalverteilungen). Ausreißer wurden aus der Analyse ausgeschlossen. P-Werte werden durch einen Farbcode dargestellt, wobei rote und blaue Schattierungen eine Zunahme bzw. Abnahme relativ zur Kontrolle (bzw. zur Basislinie) anzeigen. Der Farbton stellt die statistische Signifikanz dar, wobei dunklere Farben eine höhere Signifikanz und hellere Farben eine geringere Signifikanz aufweisen. entspricht P < 0,001; ** entspricht P < 0,01; und * entspricht P < 0,05. Weiß zeigt keine Abweichung an.- Öffnen Sie "Heatmap_PlotGenerator.py" in Spyder und führen Sie den Code aus, indem Sie auf die Schaltfläche " Abspielen" klicken.
- Wählen Sie die zu analysierende Excel-Datei und den Blattnamen im automatischen Fenster aus. Wenn der Blattname nicht geändert wurde, schreiben Sie "Tabelle1".
- Wählen Sie im zweiten automatischen Fenster den Datentyp aus: Rohdaten oder Residuendaten. Wenn eine Option nicht ausgewählt ist, sind Residuendaten die Standardeinstellung.
- Die Heatmap wird in der Plotkonsole (oben rechts) angezeigt. Um den Plot zu speichern, klicken Sie in der Plotkonsole auf Bild speichern .
HINWEIS: Es ist zwingend erforderlich, dass das Steuerelement (oder die Baseline) die erste Gruppe in der Excel-Datei ist.
- Verwenden Sie "Boxplots_PlotGenerator.py", um die Boxplots zu generieren. Dieses Werkzeug ermöglicht die Generierung von Boxplots, die die Verteilung der Werte für alle Motorparameter für jede Gruppe darstellen (Abbildung 5, Abbildung 6 und Abbildung 7).
HINWEIS: Jedes Kästchen enthält den Median als Mittellinie, und der untere und obere Rand der Kästchen stellen das 25%- bzw. 75%-Quartil dar. Die Whisker stellen den Bereich des vollständigen Datensatzes dar, ohne Ausreißer. Ausreißer sind definiert als jeder Wert, der das 1,5-fache des Interquartilsbereichs unter oder über dem 25%- bzw. 75%-Quartil liegt.- Öffnen Sie "Boxplots_PlotGenerator.py" in Spyder und führen Sie den Code aus, indem Sie auf die Schaltfläche "Abspielen " klicken.
- Wählen Sie die zu analysierende Excel-Datei und den Blattnamen im automatischen Fenster aus. Wenn der Blattname nicht geändert wurde, schreiben Sie "Tabelle1".
- Wählen Sie im zweiten automatischen Fenster den Datentyp aus: Rohdaten oder Residuendaten. Wenn eine Option nicht ausgewählt ist, sind Residuendaten die Standardeinstellung.
- Die Boxplots werden in der Plotkonsole (oben rechts) angezeigt. Um die Plots zu speichern, klicken Sie in der Plotkonsole auf die Schaltfläche Bild speichern oder Alle Bilder speichern .
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Representative Results
Das Standard-BMS-System beschreibt die grobmotorischen Defizite nach SCI14. Aufgrund seiner subjektiven Natur werden in der Regel andere quantitative Assays zusammen mit dem BMS durchgeführt, um eine detailliertere und feinere Beurteilung der Fortbewegung zu ermöglichen. Diese Tests liefern jedoch keine spezifischen Informationen über Schrittzyklen, Schrittmuster und die Koordination zwischen Vorder- und Hintergliedmaßen, was äußerst wichtig ist, um zu verstehen, wie die spinalen Schaltkreise ihre Funktion aufrechterhalten und sich an eine unvollständige Rückenmarksverletzung anpassen. In diesem Abschnitt wird gezeigt, wie die MW-Toolbox dazu beitragen kann, die Wiederherstellung der Bewegungsfunktion nach einer Rückenmarksverletzung zu überwachen und relevante Informationen über das Gehverhalten hinzuzufügen.
Die Studienstichprobe wurde in zwei Gruppen von weiblichen C57Bl/6J-Mäusen im Alter von 9 Wochen unterteilt: eine SCI-Versuchsgruppe (n = 11), in der die Tiere einer Laminektomie mit anschließender mittelschwerer bis schwerer Prellung auf Höhe der T9/T10-Wirbelsäule mit einem Infinite Horizon Impaktor unterzogen wurden (siehe Materialtabelle); und eine scheinverletzte Kontrollgruppe (n = 10), in der nur die Laminektomie auf gleicher Säulenebene durchgeführt wurde (Abbildung 1, Schritt 1). Das Bewegungsverhalten der Rückenmarksverletzung und der scheinverletzten Tiere wurde 30 Tage lang beobachtet. Der MW-Test wurde am Gewöhnungstag vor der Operation (Baseline) und 15 Tage, 22 Tage und 30 Tage nach der Verletzung (dpi) durchgeführt (Abbildung 1, Schritt 2). Zum Vergleich wurden die Mäuse vor der Operation parallel und mit 1 dpi, 3 dpi, 7 dpi, 14 dpi, 21 dpi und 30 dpi dem BMS-Test unterzogen (ergänzende Abbildung 3). Nach der Verfolgung aller mit dem MW erhaltenen Videos wurden zwei Arten von Ausgabedateien generiert: grafische Ausgaben, die nach jedem Durchlauf visuelle Darstellungen mehrerer Parameter zeigen, und kinematische Ausgaben, die alle messbaren Motorparameter zusammenfassen (Abbildung 1, Schritt 3 und Schritt 4).
Folglich wurden unter Verwendung einer Reihe von Python-Skripten (siehe Materialverzeichnis und der GitHub-Repository-Link) die Rohdatendiagramme erhalten (Abbildung 1, Schritt 5). Da die meisten Parameter von der Geschwindigkeit des Tieres beeinflusst werden, wurde ein Regressionsmodell der Ausgangsgruppe vor der Verletzung zusammen mit den gemessenen Restwerten für jede Erkrankung durchgeführt (Abbildung 1, Schritt 6). Um kinematische Profile und signifikante Unterschiede zwischen der Kontrollgruppe (Scheingruppe) und der experimentellen Gruppe (SCI) zu überprüfen, wurden alle kinematischen Parameter (insgesamt 79) einer Hauptkomponentenanalyse (PCA) mit drei Ordnungen unterzogen und eine Heatmap mit einer Sammlung von Motorparametern erstellt, die den Datensatz am besten beschreiben (insgesamt 33) (Abbildung 1, Schritt 7a,b). Schließlich wurden spezifische motorische Parameter, die nach der Rückenmarksverletzung betroffen waren, mit dem Ausgangswert vor der Verletzung verglichen (Abbildung 1, Schritt 7c).
Abbildung 1: Schematische Darstellung des Analyse-Workflows des MW. (1) Die Tiere werden für eine Laminektomie (Scheinkontrollgruppe) oder Laminektomie mit anschließender Rückenmarksverletzung (Versuchsgruppe) ausgewählt. (2) Die Tiere werden dann am Tag vor der Verletzung und an den Tagen 15, 22 und 30 nach der Verletzung einem Verhaltenstest unterzogen. (3) Der MW erzeugt zwei Arten von Ausgangsdaten: (a) grafische Visualisierungen verschiedener Parameter, wie z. B. Standspuren, Gang- und Schrittmuster, und (b) eine kinematische Zusammenfassung aller messbaren Motorparameter. (4) Alle Kontroll- und Versuchsdaten werden mit dem Skript "MouseMultiEvaluate.m" in MATLAB in einer einzigen Datei zusammengefasst. (5) Das "RawData_PlotGenerator"-Skript für Python generiert eine visuelle Darstellung, wie alle messbaren Motorparameter in Abhängigkeit von der Geschwindigkeit variieren. Wenn die Parameter nicht mit der Geschwindigkeit korrelieren, könnte man zu (7) springen; Da jedoch die meisten Parameter nach SCI stark von der Geschwindigkeit abhängen, sollte ein Modell (6) mit dem Skript "Residual_DataAnalysis" für Python generiert werden. Nach der Generierung der Restwerte für jeden Motorparameter wird eine Datenanalyse durchgeführt (7): (a) eine Hauptkomponentenanalyse (PCA) wird unter Verwendung einer Auswahl von Parametern mit einem "PCA_PlotGenerator"-Skript durchgeführt; (b) eine Heatmap mit einem "Heatmap_PlotGenerator"-Skript erstellt wird, um die statistisch signifikanten Unterschiede zwischen den Bedingungen für verschiedene Parameter aufzuzeigen; und c) mehrere einzelne Parameter, die nach der SCI geändert werden, mit dem Skript "BoxPlot_PlotGenerator" ausgewertet werden. Alle Skripte sind im Materialverzeichnis und im GitHub-Repository-Link verfügbar. Die Skripte werden rot dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Anhand der vom MW gesammelten grafischen Ausgangsdaten konnte die bekannte abrupte Änderung der visuellen Darstellung der Fußabdrücke nach einer Rückenmarksverletzung bestätigt werden. In dem vom MW erzeugten "Digital-Ink"-Assay wurde eine mangelnde Unterstützung der Hinterpfoten festgestellt (Abbildung 2A) sowie eine Verringerung der Fußabdruckfläche sowohl für die linke als auch für die rechte Hinterpfote (Abbildung 2B), die ab 15 dpi beibehalten wurde (Daten nicht gezeigt). Darüber hinaus berechnet der MW innerhalb jedes Schrittzyklus Parameter in Bezug auf die Standphase (d. h. die Zeit zwischen dem Aufsetzen der Pfote und vor dem Abheben) und die Schwungphase (d. h. die Zeit, in der die Gliedmaße vom Boden abgehoben ist). Als solche kann der MW visuelle "Standspuren" erzeugen, die die Position des Körpermittelpunkts und der Achse in Bezug auf jedes Bein und deren Fußabdruckmitte während der Standphasen23 berücksichtigen. Die Gesamtspuren , die für jedes Tier erhalten wurden, zeigten mehrere einzigartige Merkmale (Abbildung 2C). Diese Daten zeigten, dass die Hinterpfoten nach einer Rückenmarksverletzung kürzere Standspuren und eine zufälligere Pfotenpositionierung sowohl beim Aufsetzen als auch beim Abheben ab 15 dpi aufwiesen (Abbildung 2C).
Abbildung 2: Repräsentative grafische Ausgaben, die die MW-Software aus den Tracking-Videos erhält. (A) "Digitaltinten"-Drucke für ein SCI-Tier, die jede Pfote mit einer anderen Farbe zeigen: Rot (rechts vorne), gelb (links vorne), grün (rechte Hinterhand) und blau (linke Hinterhand) zu verschiedenen Zeitpunkten. (B) Fußabdrücke für die linke Vorderhand (LF), die linke Hinterhand (LH), die rechte Vorderhand (RF) und die rechte Hinterhand (RH) eines Tieres mit Rückenmarksverletzung bei 15 dpi. (C) "Haltungsspuren" für ein SCI-Tier zu mehreren Zeitpunkten. Die AEP und PEP für einen der Beine sind in der ersten Tafel dargestellt. Das "Footprint-Clustering" sowohl für den AEP als auch für den PEP entspricht der Standardabweichung der durchschnittlichen AEP- oder PEP-Koordinaten in jedem Video. Abkürzungen: dpi = Tage nach der Verletzung; cm = Zentimeter; px = Pixel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Als nächstes wurden die kinematischen Ausgänge analysiert, nachdem sie mit dem MW berechnet wurden (Abbildung 3 und Abbildung 4). Um eine prägnantere Darstellung des Datensatzes zu erhalten und zu testen, ob die kinematischen Motorparameter, die aus dem MW gewonnen wurden, ausreichten, um die bei Querschnittgelähmten gefundenen Bewegungsdefizite im Zeitverlauf darzustellen, wurde eine PCA27 durchgeführt. Bemerkenswert ist, dass 40 % der Varianz in den Daten in der ersten Komponente (PC1: 40,1 %) erklärt werden konnten, die die Gruppe der Tiere, die eine Rückenmarksverletzung aufwiesen, von den übrigen abgrenzte, mit einem p-Wert von weniger als 0,001 basierend auf einem einfaktoriellen ANOVA-Test (Abbildung 3A,B) zu allen Zeitpunkten (15 dpi, 22 dpi und 30 dpi). Auch die anderen Komponenten leisteten einen schwachen Beitrag (PC2: 11 % und PC3: 8,6 %). Das zugewiesene Gewicht jedes Motorparameterbeitrags für jede Komponente ist in der ergänzenden Abbildung 4 dargestellt. Darüber hinaus reichte die Varianz im Datensatz nicht aus, um Unterschiede im Zeitverlauf widerzuspiegeln (d. h. zwischen 15 dpi, 22 dpi und 30 dpi), was das zuvor beschriebene Plateau der lokomotorischen Erholung repliziert14. Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die kinematischen Parameter, die aus dem MW gewonnen wurden, die motorischen Defizite, die nach einer Rückenmarksverletzung über alle Zeitpunkte beobachtet wurden, stark beschreiben.
Abbildung 3: Hauptkomponentenanalyse aller kinematischen Motorparameter (79), die von der MW-Software nach der Restdatenanalyse ermittelt wurden . (A) Eine 3D-Visualisierung der Dreikomponenten-PCA-Analyse. (B) Eine 2D-Visualisierung mit Kreisen, die 50 % der gesammelten Daten darstellen. In PC1, das über 40 % der Varianz erklärte, unterschied sich die SCI-Gruppe mit 15 dpi, 22 dpi und 30 dpi signifikant von der Scheingruppe und dem Ausgangswert (vor der Verletzung), mit einem p-Wert < 0,001, der durch eine einfaktorielle ANOVA bestimmt wurde. Jeder einzelne kleine Punkt oder jedes Dreieck stellt den Mittelwert von drei Videos für jedes Tier dar, während die größeren Punkte oder Dreiecke den Durchschnittspunkt darstellen (n = 10-11 pro Bedingung, n = 21 für die Basisgruppe). Der Beitrag jeder Komponente wird in jeder Achse angegeben. Abkürzungen: dpi = Tage nach der Verletzung; Rückenmarksverletzung = Rückenmarksverletzung; PC = Hauptkomponente. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Anschließend wurde eine Sammlung von Motorparametern ausgewählt, die darauf basierten, wie stark sie den Datensatz beschrieben (insgesamt 33), und eine Heatmap wurde erstellt (Abbildung 4). Tatsächlich zeigten die meisten Bewegungsparameter zu allen Zeitpunkten eine drastische Veränderung nach einer Rückenmarksverletzung (15 dpi, 22 dpi und 30 dpi), während die scheinverletzten Kontrollen nur bei 30 dpi signifikante Veränderungen zeigten. Diese Veränderungen in der Scheingruppe könnten durch eine allgemeine Abnahme der Schwunggeschwindigkeit erklärt werden, möglicherweise aufgrund einer Testgewöhnung, auf die später eingegangen wird.
Es fiel auf, dass die Querschnittslähmungstiere langsamer liefen als die scheinverletzten Kontrollen (Daten nicht gezeigt). Unabhängig von der Geschwindigkeit zeigten die SCI-Tiere jedoch sowohl bei 15 dpi als auch bei 30 dpi eine höhere Schwungdauer, eine geringere Standdauer und einen niedrigeren Tastverhältnisindex, der sich auf die Standdauer/Schrittperiode23 bezieht. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die oben beschriebenen Veränderungen in der Beinpositionierung charakteristisch für eine Rückenmarksverletzung sind, wie sie in anderen Tiermodellen30, 31, 32 beobachtet wurden, und nicht mit Veränderungen des Tempos zusammenhängen (Abbildung 4).
Es sollte auch erwähnt werden, dass die linke und rechte Synchronität nicht beeinträchtigt wurde, da keine signifikante Änderung der "Phasen"-Indizes für die Vorder- und Hintergliedmaßen beobachtet wurde10,23 (Abbildung 4), was auf eine intakte Kopplung zwischen der linken und rechten Extremität hinweist.
Darüber hinaus zeigten die SCI-Mäuse sowohl in den Vorder- als auch in den Hintergliedmaßen einen niedrigeren "Standgeradheitsindex" (Verschiebung/Weglänge) (Abbildung 4). Dieser Parameter misst, wie linear die Leiterbahnen in Bezug auf die ideale Bedingung sind, bei der es sich um eine gerade Linie handelt (im Bereich von 0 bis 1, was auf eine lineare Leiterbahn hinweist)27. Daher deuten diese Ergebnisse auf eine starke Unfähigkeit hin, in dieser Gruppe geradeaus zu gehen.
Für jede Standphase zeichnet der MW eine Rekonstruktion der Schwingungen des Körpers, beginnend mit dem Aufsetzen der Pfote - der vorderen Extremposition (AEP) - und endend vor dem Abheben - der hinteren Extremposition (PEP) (siehe Beispiel in Abbildung 2C). Das "Footprint-Clustering" von AEP und PEP misst die Standardabweichung der durchschnittlichen AEP- oder PEP-Koordinaten in jedem Video. Die SCI-Tiere zeigten zu allen Zeitpunkten eine Zunahme des Hinterpfoten-Fußabdrucks für die AEP, und ein signifikanter Effekt wurde nur für die scheinverletzte Gruppe bei 15 dpi beobachtet (Abbildung 4). Dies verdeutlicht, dass die SCI-Tiere ihre Hinterbeine beim Aufsetzen nach dem Schwung nicht richtig positionieren konnten. Darüber hinaus wurde bei 30 dpi eine Abnahme des "Footprint Clustering" der Vorderpfoten für den PEP sowie eine Abnahme des Clusterings des Hinterpfoten-Fußabdrucks für das PEP beobachtet (Abbildung 4). Diese Ergebnisse stimmen mit den Beobachtungen in den gezeichneten "Standspuren" überein und deuten darauf hin, dass die Position der Vorderpfoten nach einer Verletzung eingeschränkter wird.
Schließlich gab es in Übereinstimmung mit den Veränderungen in der Pfotenpositionierung Veränderungen in den Gangstrategien und dem von den Pfoten erzeugten "Druck", gemessen an der durchschnittlichen Helligkeit über den Bereich (Abbildung 4), die weiter diskutiert werden.
Abbildung 4: Heatmap-Diagramm mit einer Sammlung der signifikant veränderten Bewegungsparameter im Vergleich zu Querschnittgelähmten und scheinverletzten Tieren im Vergleich zum Tag vor der Operation, wie sie vom MW nach der Analyse der Restdaten ermittelt wurden. n = 10-11 pro Bedingung; Die Ausgangsgruppe umfasst alle Tiere am Tag vor der Operation, n = 21. Die Daten werden durch den p-Wert nach der statistischen Analyse mit einer einfaktoriellen ANOVA ausgedrückt, gefolgt vom Tukey-Post-hoc-Test (für Normalverteilungen) oder dem Post-hoc-Test von Dunn (für Nicht-Normalverteilungen). Die p-Werte werden durch einen Farbcode dargestellt, wobei rote und blaue Schattierungen eine Abnahme bzw. Zunahme im Vergleich zum Ausgangswert anzeigen. Der Farbton stellt die statistische Signifikanz dar, wobei dunklere Farben eine höhere Signifikanz und hellere Farben eine geringere Signifikanz anzeigen. P < 0,001; **P < 0,01; *P < 0,05. Weiß zeigt keine Abweichung an. Abkürzungen: dpi = Tage nach der Verletzung; Rückenmarksverletzung = Rückenmarksverletzung; s = Sekunde; ms = Millisekunde; avg = Durchschnitt; F = vorne; H = hind; AEP = vordere Extremstellung; PEP = hintere Extremstellung; LF = links vorne; LH = linke Hinterstrecke; RF = rechts vorne; RH = rechte Hinterseite. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Anschließend versuchten wir zu verstehen, welche individuellen Parameter am besten geeignet sind, um die Bewegungsdefizite von Querschnittgelähmten Tieren in verschiedenen Stadien der Verletzung (d.h. 15 dpi, 22 dpi und 30 dpi) zu beschreiben. Wir begannen mit der Untersuchung der Schrittzyklusparameter, die Unterschiede zwischen den Vorder- und Hintergliedmaßen zeigten, als die Hintergliedmaßen von der totalen Lähmung zur Teilfunktion übergingen (Abbildung 5). Während die durchschnittliche Schwunggeschwindigkeit für die Vordergliedmaßen im Vergleich zur Ausgangslinie (vor der Verletzung) signifikant zunahm, änderte sich die Schwunggeschwindigkeit der Hintergliedmaßen nicht signifikant (obwohl die Tendenz bestand, dass sie niedriger als der Ausgangswert war) (Abbildung 5A,B). Parallel dazu nahm die durchschnittliche Schrittlänge der Vordergliedmaßen ab, ohne dass sich die Hintergliedmaßen signifikant veränderten (Abbildung 5C,D). Es überrascht nicht, dass die verletzten Mäuse bei 15 dpi eine verringerte Schwungdauer der Vordergliedmaßen und eine umgekehrte Zunahme der Dauer ihrer Schwünge an den Hintergliedmaßen zeigten (Abbildung 5E,F). Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die Vordergliedmaßen einen schnelleren Rhythmus annahmen, mit zwei Vordergliedmaßenzyklen für jeden Hintergliedmaßenzyklus. Dieses Zyklusverhältnis von 2:1 wurde bereits nach einer Querschnittslähmung bei Ratten beschrieben1,33 und veranschaulicht einen Schlüsselaspekt der fehlerhaften Koordination zwischen Vorder- und Hintergliedmaße, die bei Mäusen nach 30 dpi nicht wiederhergestellt ist.
Abbildung 5: Schrittzyklusparameter für die Vorder- und Hinterpfoten zu verschiedenen Zeitpunkten 1 Tag vor der Verletzung und bei 15 dpi, 22 dpi und 30 dpi bei Querschnittlähmungstieren (n = 11). (A,B) Die durchschnittliche Schwunggeschwindigkeit der Vorder- und Hinterpfoten relativ zur Grundlinie. (C,D) Die durchschnittliche Schrittlänge der Vorder- und Hinterpfoten relativ zur Grundlinie. (E,F) Die durchschnittliche Schwungdauer für die Vorder- und Hinterpfoten relativ zur Grundlinie. In den Boxplots wird der Median durch die Mittellinie dargestellt, und der untere und obere Rand der Boxen stellen das 25%- bzw. 75%-Quartil dar. Die Whisker stellen den Bereich des vollständigen Datensatzes dar. Ausreißer werden durch einzelne Punkte dargestellt. Die statistische Analyse wurde mit einer einfaktoriellen ANOVA durchgeführt, gefolgt von einem Tukey-Post-hoc-Test (für Normalverteilungen) oder einem Dunn-Post-hoc-Test (für Nicht-Normalverteilungen). *P < 0,05; **P < 0,01; P < 0,001. Abkürzungen: dpi = Tage nach der Verletzung; Rückenmarksverletzung = Rückenmarksverletzung; cm = Zentimeter; s = Sekunde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Die MW-Software ist auch in der Lage, die Schrittmuster von Mäusen zu berechnen, indem sie den Anteil der Frames misst, die einer bestimmten Beinkombination zugewiesen sind, und dies dient als Proxy für das Vorhandensein bestimmter Gangstrategien. Bei langsameren Geschwindigkeiten neigen unverletzte Mäuse dazu, einen "Gehgang" anzunehmen, bei dem die meisten Rahmen einen einbeinigen Schwung haben (unabhängig von der Pfotenposition). Bei mittleren Geschwindigkeiten, die auf der Landebahn am häufigsten vorkommen, wechseln Mäuse in einen Trabgang, bei dem die repräsentativste Konfiguration der diagonale Beinschwung ist. Schließlich verwenden Mäuse bei höheren Geschwindigkeiten einen "Galoppgang", bei dem drei Beine gleichzeitig schwingen23,34. Andere, weniger gebräuchliche Konfigurationen sind der Schrittgang, der meist durch den seitlichen Beinschwung (entweder beide linken oder rechten Beine) dargestellt wird, und der "gesprungene/hüpfende Gang", bei dem entweder beide Hinter- oder Vordergliedmaßen gleichzeitig schwingen10. Man sollte jedoch bedenken, dass im Rahmen einer Rückenmarksverletzung einige dieser Konfigurationen, wie z. B. der Dreibeinschwung, eine fehlerhafte Hinterfußpfotenstellung widerspiegeln können und daher nicht genau zu einer bestimmten Gangstrategie - in diesem Fall dem Galopp - passen. Daher wurde die Analyse vereinfacht, indem nur die Beinkonfigurationen verglichen wurden.
Nach der Durchführung der Residualanalyse wurde festgestellt, dass es zu allen Zeitpunkten eine Abnahme der Prävalenz von Diagonalschwingungen gab, die mit einer Abnahme der Einzelschwingungen einherging (Abbildung 6A,B). Noch interessanter ist, dass die Prävalenz von lateralen Schwüngen zunahm (Abbildung 6C). Der tempoartige Gang ist nicht typisch für eine normale C57BL/6J-Maus; Es wurde jedoch bereits berichtet, dass es nach einer Querschnittslähmung bei Ratten1 auftritt. Dieses In-Phase-Muster war nicht weit genug verbreitet, um den Phasenindex der Vorder- oder Hintergliedmaßen zu verändern (wie in Abbildung 3 zu sehen), veranschaulicht aber eine fehlerhafte Rückkopplung der Wirbelsäule von den Hintergliedmaßen zu den Vordergliedmaßen. Darüber hinaus gab es einen natürlichen Anstieg der Prävalenz von Schwüngen zwischen Vorder- und Hintergliedmaßen (Abbildung 6D), möglicherweise aufgrund eines falschen Plantartritts der Hintergliedmaßen, und eine Zunahme von Dreibeinschwüngen (Abbildung 6E).
Abbildung 6: Die durchschnittlichen Indizes für verschiedene Schrittschwungkonfigurationen . (A) diagonaler, (B) einfacher, (C) lateraler, (D) vorwärts/hind- und (E) dreibeiniger Schwung zu verschiedenen Zeitpunkten bei Rückenmarksverletzungstieren (n = 11) sind dargestellt. In den Boxplots wird der Median durch die Mittellinie dargestellt, und der untere und obere Rand der Boxen stellen das 25%- bzw. 75%-Quartil dar. Die Whisker stellen den Bereich des vollständigen Datensatzes dar. Ausreißer werden durch einzelne Punkte dargestellt. Die statistische Analyse wurde mit einer einfaktoriellen ANOVA durchgeführt, gefolgt von einem Tukey-Post-hoc-Test (für Normalverteilungen) oder einem Dunn-Post-hoc-Test (für Nicht-Normalverteilungen). **P < 0,01; P < 0,001. Abkürzungen: dpi = Tage nach der Verletzung; Rückenmarksverletzung = Rückenmarksverletzung; NA = entfällt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Eine weitere Anzeige, die aus dem MW extrahiert werden kann, ist "Druck" als Maß für Helligkeit/Fläche. Bei höheren Geschwindigkeiten verringert sich die Kontaktfläche mit dem Boden und der Druck nimmt zu, so dass eine lineare Regression der Basisdaten durchgeführt und die Restwerte für jede Bedingung gemessen wurden. Es wurde festgestellt, dass der Druck auf die Vorderpfoten über alle Zeitpunkte hinweg signifikant zunahm, die Stärke dieses Effekts jedoch mit der Zeit tendenziell abnahm, da die Veränderung für die linke Vorderpfote bereits bei 30 dpi an statistischer Signifikanz verlor (Abbildung 7A,C). Dieser spezifische Effekt auf der linken Seite könnte durch eine lateralisierte Verletzung erklärt werden, die in dieser Studie bevorzugt die rechte Seite des Rückenmarks betroffen haben könnte. Nichtsdestotrotz war der von den Hinterpfoten ausgeübte Druck bei den verletzten Mäusen erwartungsgemäß über alle Zeitpunkte hinweg abgenommen, ohne dass eine Tendenz zu einer Zunahme bestand (Abbildung 7B,D).
Abbildung 7: Druck, der von den Hinter- und Vorderpfoten zu verschiedenen Zeitpunkten bei Querschnittgelähmten Tieren ausgeübt wird (n = 11). Der Druck, der von der linken Vorderpfote, (B) der linken Hinterpfote, (C) der rechten Vorderpfote und (D) der rechten Hinterpfote ausgeübt wird, wird als relative Differenz zum Ausgangswert (am Tag vor der Verletzung) dargestellt. In den Boxplots wird der Median als Mittellinie dargestellt, und der untere und obere Rand der Boxen stellen das 25%- bzw. 75%-Quartil dar. Die Whisker stellen den Bereich des vollständigen Datensatzes dar. Ausreißer werden durch einzelne Punkte dargestellt. Die statistische Analyse wurde mit einer einfaktoriellen ANOVA durchgeführt, gefolgt von einem Tukey-Post-hoc-Test (für Normalverteilungen) oder einem Dunn-Post-hoc-Test (für Nicht-Normalverteilungen). **P < 0,01; P < 0,001. Abkürzungen: dpi = Tage nach der Verletzung; Rückenmarksverletzung = Rückenmarksverletzung; cm = Zentimeter; px = Pixel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Zusammenfassend veranschaulicht diese Studie die Leistungsfähigkeit des MW-Systems zur quantitativen Beschreibung der durch Rückenmarksverletzungen verursachten motorischen Beeinträchtigungen, die aufgrund anderer Testeinschränkungen manchmal außer Acht gelassen werden können. Darüber hinaus unterstreicht es die zweifellos begrenzte funktionelle Erholung über die Zeit im Contusion-Mausmodell der Rückenmarksverletzung.
Ergänzende Abbildung 1: Die MW-Hardwarekomponenten. (A) Dieser Aufbau ist wie folgt unterteilt: I - fTIR-Gehweg; II - fTIR-Stützbasis und Pfosten; III - Mauer des Gehwegs; IV - 45° Spiegel; und V - Hintergrundbeleuchtung. (B) Nahaufnahmen des Base-U-Kanals und des Gehwegs. (C) Gestaltung der Gehwegwand. (D) Nahaufnahme des 45°-Spiegelaufbaus. Abkürzung: cm = Zentimeter. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzend Abbildung 2: Ein einzelnes Bild eines fTIR-Videos, in dem die Pixelintensität und die Bereichsbereiche angegeben sind. Die Pixelintensitäten für den Körper, den Hintergrund und die Fußabdrücke, die für die Videoanalyse in dieser Studie verwendet wurden, werden in Klammern dargestellt und in Rot angezeigt, um die Bildschärfe zu verbessern. Die Lichtintensität sollte angepasst werden, um eine gute Unterscheidung zwischen den verschiedenen Regionen zu erreichen. Relative Bereiche des Körpers und Fußabdrücke sind durch gestrichelte gelbe Linien gekennzeichnet. Sowohl die Flächen als auch die Pixelintensität wurden in ImageJ/FIJI erfasst. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 3: (A) BMS-Gesamtscore und (B) Subscore der in dieser Studie analysierten Mäuse (n = 10-11). Alle Daten wurden als Mittelwert ± REM ausgedrückt. Die statistische Analyse wurde mit einer bidirektionalen ANOVA mit wiederholten Messungen durchgeführt, gefolgt von einem Post-hoc-Test von Bonferroni. P < 0,001. Abkürzung: BMS = Basso Mausskala. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzend Abbildung 4: Das zugewiesene Gewicht jedes Motorparameterbeitrags für jede Komponente. Das zugewiesene Gewicht jedes Motorparameters (insgesamt 79) nach der Residualanalyse für (A) PC1, (B) PC2 und (C) PC3 in der PCA. Die Cutoff-Linie wurde bei 0,04 ms und −0,04 gezeichnet. Abkürzungen: ms = Millisekunde; avg = Durchschnitt; SD = Standardabweichung; F = vorne; H = hind; AEP = vordere Extremstellung; PEP = hintere Extremstellung; LF = links vorne; LH = linke Hinterstrecke; RF = rechts vorne; RH = rechte Hinterseite; Drücken = Druck. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Hier wird das Potenzial der MouseWalker-Methode durch die Analyse des Bewegungsverhaltens nach Rückenmarksverletzung demonstriert. Es bietet neue Einblicke in spezifische Veränderungen der Schritt-, Fußabdruck- und Gangmuster, die sonst von anderen Standardtests übersehen würden. Neben der Bereitstellung einer aktualisierten Version des MW-Pakets werden die Datenanalysewerkzeuge auch mit den mitgelieferten Python-Skripten beschrieben (siehe Schritt 5).
Da der MW einen großen Datensatz und eine Sammlung von kinematischen Parametern erzeugt, die einen hochdimensionalen lokomotorischen Prozess widerspiegeln, wurde eine PCA verwendet; In der Tat wurde PCA in anderen kinematischen Datensätzen verwendet, die diesem ähnlich sind 27,35,36 (Abbildung 3). Diese Technik zur Dimensionsreduktion ist eine einfache und robuste Methode mit minimalen Annahmen, die es ermöglicht, kinematische Profile quantitativ zu identifizieren und schnell von Kontroll- oder Ausgangsbedingungen zu unterscheiden. Darüber hinaus wurden Heatmaps erstellt, um die Parameter, die sich statistisch von der Baseline unterschieden, zeitnah zu identifizieren (Abbildung 4), die später einzeln analysiert werden konnten (Abbildung 5, Abbildung 6 und Abbildung 7).
Anschließend wurde gezeigt, wie spezifische Parameter, die aus dem MW extrahiert werden können, die robusten lokomotorischen Defizite veranschaulichen, die bei Querschnittlähmungstieren beobachtet werden, wie z.B. Koordination. Koordination ist die Fähigkeit, jedes Glied auf organisierte Weise zu benutzen, um eine Aufgabe zu erfüllen. Oft wird die Koordination indirekt an der Anzahl der Fehler/positiven Ereignisse auf einer Leiter 16,17 oder der auf dem Rotarod15 verbrachten Zeit gemessen. Deutlich wird mit dem MW sowohl die Variabilität der Pfotenpositionierung während des Schrittzyklus (Fußabdruckmuster) als auch der "Stance Straightness"-Index27 berechnet. Es zeigte sich, dass beide Parameter signifikant durch die Verletzung beeinflusst wurden (Abbildung 4).
Darüber hinaus ermöglicht der MW dem Benutzer, Parameter zu extrahieren, die sich auf die zeitliche Dynamik beziehen. Es wurde eine signifikante Störung der Schwung-/Standdauer bei Querschnittgelähmten Tieren beobachtet (Abbildung 4), und es wurde festgestellt, dass die SCI-Mäuse den Verlust der Unterstützung auf ihren Hinterbeinen kompensierten, indem sie ihren Schrittzyklus der Vordergliedmaßen beschleunigten und so die Schrittlänge der Vordergliedmaßen und die durchschnittliche Schwungzeit reduzierten (Abbildung 5). Dieser Effekt könnte mit der Verlagerung des Schwerpunkts zusammenhängen, die die Vorderpfoten dazu zwingt, mehr Körpergewicht auszuhalten1. Ebenso könnte es auf den Verlust der langen aufsteigenden propriospinalen Bahnen zurückgeführt werden, die für die synergetische Interaktion zwischen den CPGs der Vorder- und Hintergliedmaßen verantwortlich sind 1,9,32, was letztendlich zu einer Dissoziation des Vordergliedmaßen-Hintergliedmaßen-Rhythmus führt.
Die Charakteristika von Schrittgängen können die modulare Organisation von lokomotorischen Netzwerken veranschaulichen 1,34. Obwohl die Schrittmuster kein direkter Stellvertreter für die in diesem Fall angewandten Gangstrategien sind23, lassen sich dennoch einige wichtige Beobachtungen machen. Wichtige Veränderungen wurden in den Schrittmustern von Querschnittslähmungsmäusen beobachtet (Abbildung 6). Die verletzten Tiere begannen, seitliche Schwünge (tempoartige Gangarten) anzunehmen, und auch die diagonalen Schwünge nahmen ab. Diese Anpassungen scheinen mit dem Versuch verbunden zu sein, die Vorder- und Hintergliedmaßen zu koordinieren, was wiederum die Dissoziation zwischen den Wirbelsäulenbahnen unterhalb und oberhalb der Verletzung demonstriert, die sich nicht erholt 1,9,32.
Die eingeschränkte Erholung nach einer Rückenmarksverletzung wurde auch durch eine Abnahme der Muskelkraft in den Hintergliedmaßen bestätigt, gemessen am durchschnittlichen Druck (Abbildung 7). Folglich sind die Vordergliedmaßen gezwungen, mehr Körpergewicht zu tragen, was den Druck erhöht. Während viele Parameter, die sich auf die Muskeldynamik beziehen, hier nicht analysiert wurden (z. B. die Koordination der Beuge- und Streckmuskeln 7,21), kann diese quantitative Messung eine direkte Ablesung des Ausmaßes der Unterstützung der Gliedmaßen liefern.
Diese MW-Analyse kann auch mit dem Standard-BMS-Test kombiniert werden, der die Rotation der Gliedmaßen, die Platzierung der Pfoten, die Schwanzposition und Trittfehler misst. Im Allgemeinen erreichen SCI-Mäuse eine maximale Punktzahl von 4-5 mit einer maximalen Teilpunktzahl von 3, was bedeutet, dass sie gelegentliche bis häufige Schritte ausführen können, sich aber hauptsächlich beim Abheben der Pfote und/oder beim Aufsetzen drehen14 (ergänzende Abbildung 2). Es wird deutlich, warum die AEP-Werte für die Hinterpfoten in der SCI-Gruppe signifikant verändert wurden, da die nicht-parallele Positionierung der Gliedmaßen während der Schwungphase die Pfotenkoordinaten beeinflussen kann. Darüber hinaus wird der Rumpf im BMS in der Regel als schwerwiegend eingestuft, da Fälle oder Ereignisse vorliegen, die das Treten verhindern, wie z. B. Butt-Down und Hopping14. Obwohl es nicht möglich war, das Butt-Down-Verhalten oder Fälle, die das Treten verhinderten, zu quantifizieren, wurde ein eingeschränktes Treten der Hinterpfote im MW mit einer längeren Schwungdauer (Abbildung 5F), einem erhöhten Dreibeinschwung (Abbildung 6E) und einem geringeren Druck (Abbildung 7B-D) festgestellt. Darüber hinaus wurde eine signifikante Zunahme der Vor-/Hinterwärtsschwingungen beobachtet (Abbildung 6D). Es könnte zwei komplementäre Erklärungen für diese Verhaltensmanifestation geben. Zunächst wurde der hüpfende Gang gemessen, der bereits im BMS-Test beobachtet werden konnte. Dieses Verhalten könnte jedoch auch mit einem Mangel an korrektem Plantartritt in beiden Hintergliedmaßen zusammenhängen, was zu Fußwiderstand oder dorsaler Platzierung führt. Insgesamt stützen diese Beobachtungen die Behauptung, dass die Rumpfstabilität nach einer Rückenmarksverletzung stark geschädigt ist. Schließlich ist eine der Voraussetzungen, um im BMS-Test mehr als 5 Punkte zu erzielen, die Koordination14, und dafür müssen die Bewerter während des Tests mindestens drei zugängliche Durchgänge einhalten. Davon müssen zwei der drei oder mehr zugänglichen Pässe als koordiniert eingestuft werden (d. h. Vorder- und Hintergliedmaßen wechseln sich ab). Aus den MW-Daten lassen sich objektive Messungen, der Stance Straightness Index und das Footprint Clustering ableiten, die die Koordination unabhängig von der Geschwindigkeit des Tieres oder dem zugänglichen Durchgang direkt quantifizieren (Abbildung 4). Darüber hinaus kann der Wechsel zwischen den Gliedmaßen durch die Messung der Schrittstrategien objektiv quantifiziert werden (Abbildung 6). Diese Parameter verdeutlichen, dass Mäuse mit Rückenmarksverletzung nicht in geraden Linien gehen können und ihre Hinterbeine falsch platzieren.
Während die MW-Toolbox eine hilfreiche Strategie für die Untersuchung von Bewegungsdefekten nach einer Rückenmarksverletzung ist, sollte man einige ihrer Einschränkungen berücksichtigen. Zunächst ist es wichtig, die Erfassungsparameter (d. h. Kameraposition, Fokus, Lichtintensität) konsistent zu halten, damit die Bildmerkmale zwischen den Zeitpunkten erhalten bleiben. Zweitens wurde festgestellt, dass die Wiederholung zu einer Gewöhnung führte, was wiederum zu einer verringerten Geschwindigkeit führte. Dies trug auch zu einem erhöhten Aufzucht-/Pflegeverhalten und zu Stopps während des Laufs bei. Bei verletzten Tieren gab es auch eine Tendenz zum Anlehnen an die Gehwegwände und eine erhöhte Anzahl von Stopps während des Laufs. Da diese Verhaltensweisen nicht Teil der lokomotorischen Beurteilung sind, dürfen sie nicht berücksichtigt werden. Vorzugsweise sollten Forscher Videos wählen, in denen die Tiere kontinuierlich mit geradem Kopf laufen. Um dem Einfluss dieser Verhaltensweisen auf die Ergebnisse dieser Studie entgegenzuwirken, wurden Mäuse kontinuierlich für mindestens vier oder fünf Läufe aufgezeichnet und durften in beide Richtungen entlang des Gehwegs laufen. Anschließend wurden die drei besten aufgezeichneten Läufe ausgewählt und auf ImageJ/FIJI24 (180°-Drehung) in die gleiche Richtung eingestellt. So wurde jedes Tier durch einen Mittelwert von drei Läufen repräsentiert, die pro Zeitpunkt zusammengefasst wurden. Eine größere Anzahl von Tieren pro Bedingung könnte auch die erwartete Variabilität verringern. Darüber hinaus ist zu beachten, dass dieser Bewegungstest erst nach Erreichen des Plantarschritts empfohlen wird, da das Tracking-System für die Feinabstimmung der lokomotorischen Beurteilung konzipiert wurde. In dieser Studie wurde festgestellt, dass der MW-Test vor 15 dpi aufgrund des erhöhten Fußwiderstands und der falschen plantaren Platzierung, die das Tracking beeinträchtigen könnte, nicht vorteilhaft für die Beurteilung des Bewegungsapparates war (Daten nicht gezeigt). Schließlich reagieren einige Parameter (z. B. Footprint-Clustering) sehr empfindlich auf die Extrapolationen, die durch das generierte Regressionsmodell vorgenommen werden. Daher wurde der Code entsprechend angepasst (siehe die Dokumentation im Skript im GitHub-Link).
Insgesamt konnte gezeigt werden, dass die MW Querschnittlähmungstiere stark von scheingeschädigten Kontrollen unterscheiden kann, und MW könnte auch mit etablierten Tests als wertvolle Methode zur Untersuchung von Bewegungsdefekten nach Rückenmarksverletzung kombiniert werden. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass mit den mitgelieferten Python-Skripten auf einfache Weise quantitative Outputs aus dem MW-Datensatz generiert werden können. Diese Werkzeuge bieten eine effiziente experimentelle Pipeline, um einen reichhaltigen und vielfältigen Satz quantitativer und grafischer Ergebnisse zu generieren, die die ursprünglichen MW-Ausgabedateien ergänzen und geändert werden können, um die Ziele des Forschers in Bezug auf die Art der Analyse und grafischen Darstellung zu erfüllen.
Diese Toolbox ist eine wertvolle Methode zur Untersuchung anderer motorischer Erkrankungen oder motorischer Funktionsstörungen, nicht nur solcher, die mit Rückenmarksverletzungen zusammenhängen. Skarlatou et al.10 zeigten bereits, dass eine spezifische Mutation in Afadin, einem wichtigen Gerüstprotein während der Entwicklung, einen abweichenden Phänotyp im Rückenmark verursachte, indem sie zwei zentrale Kanäle erzeugte. Dieser Defekt führte zum Verlust des Rechts-Links-Extremitätenwechsels und zu einer höheren Prävalenz der Extremitätensynchronisation, die typisch für einen hüpfenden Gang ist. Stauch et al.10 zeigten auch, dass diese Art von System an die Bedürfnisse des Benutzers angepasst werden kann. In diesem Fall wurde es angewendet, um spezifische Verhaltensdefizite in einem Rattenmodell für die Parkinson-Krankheit zu untersuchen. Somit hat dieser Werkzeugkasten ein breites Anwendungsspektrum in verschiedenen Modellen, in denen motorische Störungen zu erwarten sind, und kann mit bereits etablierten Verhaltensprotokollen im Feld kombiniert werden.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Die Autoren danken Laura Tucker und Natasa Loncarevic für ihre Kommentare zum Manuskript und die Unterstützung durch die Nagetiereinrichtung des Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes. Die Autoren bedanken sich für die finanzielle Unterstützung von Prémios Santa Casa Neurociências - Prize Melo e Castro for Spinal Cord Injury Research (MC-36/2020) an L.S. und C.S.M. Diese Arbeit wurde von der Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) (PTDC/BIA-COM/0151/2020), iNOVA4Health (UIDB/04462/2020 und UIDP/04462/2020) und LS4FUTURE (LA/P/0087/2020) an C.S.M. L.S. durch einen CEEC Individual Principal Investigator-Vertrag (2021.02253.CEECIND) unterstützt. A.F.I. wurde durch ein Promotionsstipendium des FCT (2020.08168.BD) unterstützt. A.M.M. wurde durch ein Promotionsstipendium des FCT (PD/BD/128445/2017) unterstützt. I.M. wurde durch ein Postdoktoranden-Stipendium des FCT unterstützt (SFRH/BPD/118051/2016). D.N.S. wurde durch ein Promotionsstipendium des FCT (SFRH/BD/138636/2018) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 45º Mirror | |||
| 2 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 16 cm height, 1 on each side | Misumi | ||
| 2 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 23 cm, @ 45° , 1 on each side | Misumi | ||
| 1 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 83 cm long | Misumi | ||
| 87 x 23 cm mirror | General glass supplier | ||
| black cardboard filler | General stationery supplier | We used 2, one with 69 x 6 cm and another with 69 x 3cm to limit the reflection on the mirror | |
| Background backlight | |||
| 109 x 23 cm plexiglass (0.9525 cm thick) | General hardware supplier | ||
| 2 lateral aluminum extrusion (4 x 4 cm), 20 cm long, 1 on each side | Misumi | ||
| multicolor LED strip | General hardware supplier | ||
| white opaque paper to cover the plexyglass | General stationery supplier | ||
| fTIR Support base and posts | |||
| 2 aluminum extrusion (4 x 4 cm), 100 cm height | Misumi | ||
| 60 x 30 cm metric breadboard | Edmund Optics | #54-641 | |
| M6 12 mm screws | Edmund Optics | ||
| M6 hex nuts and wahers | Edmund Optics | ||
| fTIR Walkway | |||
| 109 x 8.5 cm plexyglass (1.2 cm thick) | General hardware supplier | 109 x 8.5 cm plexyglass (1.2 cm thick) | |
| 109 cm long Base-U-channel aluminum with 1.6 cm height x 1.9 cm depth thick folds (to hold the plexyglass) | General hardware supplier | ||
| 2 lateral aluminum extrusion (4 x 4 cm) 20 cm length, 1 on each side | Misumi | ||
| black cardboard filler | General stationery supplier | we used 2 fillers on each side to cover the limits of the plexyglass, avoiding bright edges | |
| M6 12 mm screws | Edmund Optics | ||
| High speed camera (on a tripod) | |||
| Blackfly S USB3 | FLIR | #BFS-U3-32S4M-C | This is a reccomendation. The requirement is to record at least 100 frames per second |
| Infinite Horizon Impactor | |||
| Infinite Horizon Impactor | Precision Systems and Instrumentation, LLC. | #0400 | |
| Lens | |||
| Nikon AF Zoom-Nikkor 24-85mm | Nikon | #1929 | This lens is reccomended, however other lens can be used. Make sure it contains a large aperture (i.e., smaller F-stop values), to capture fTIR signals |
| Software | |||
| MATLAB R2022b | MathWorks | ||
| Python 3.9.13 | Python Software Foundation | ||
| Anaconda Navigator 2.1.4 | Anaconda, Inc. | ||
| Spyder 5.1.5 | Spyder Project Contributors | ||
| Walkway wall | |||
| 2 large rectagular acrilics with 100 x 15 cm | Any bricolage convenience store | ||
| 2 Trapezian acrilic laterals with 6-10 length x 15 cm height | Any bricolage convenience store | ||
| GitHub Materials | |||
| Folder name | URL | ||
| Boxplots | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Boxplots | Script to create Boxplots | |
| Docs | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Docs | Additional documents | |
| Heatmap | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Heatmaps | Script to create heatmap | |
| Matlat script | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Matlab%20Script | MouseWalker matlab script | |
| PCA | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/PCA%20plots | Script to perform Principal Component Analysis | |
| Raw data Plots | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Rawdata%20Plots | Script to create Raw data plots | |
| Residual Analysis | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Residual_Analysis | Code to compute residuals from Raw data |
References
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