Summary
Se proporciona una tubería experimental para describir cuantitativamente el patrón locomotor de ratones que caminan libremente utilizando la caja de herramientas MouseWalker (MW), que va desde grabaciones de video iniciales y seguimiento hasta análisis posteriores a la cuantificación. Se emplea un modelo de lesión por contusión de la médula espinal en ratones para demostrar la utilidad del sistema MW.
Abstract
La ejecución de programas motores complejos y altamente coordinados, como caminar y correr, depende de la activación rítmica de los circuitos espinales y supraespinales. Después de una lesión de la médula espinal torácica, la comunicación con los circuitos aguas arriba se ve afectada. Esto, a su vez, conduce a una pérdida de coordinación, con un potencial de recuperación limitado. Por lo tanto, para evaluar mejor el grado de recuperación después de la administración de medicamentos o terapias, existe la necesidad de herramientas nuevas, más detalladas y precisas para cuantificar la marcha, la coordinación de las extremidades y otros aspectos finos del comportamiento locomotor en modelos animales de lesión de la médula espinal. A lo largo de los años se han desarrollado varios ensayos para evaluar cuantitativamente el comportamiento de caminar libremente en roedores; Sin embargo, generalmente carecen de mediciones directas relacionadas con las estrategias de marcha por pasos, los patrones de huella y la coordinación. Para abordar estas deficiencias, se proporciona una versión actualizada del MouseWalker, que combina una pasarela de reflexión interna total frustrada (fTIR) con software de seguimiento y cuantificación. Este sistema de código abierto se ha adaptado para extraer varias salidas gráficas y parámetros cinemáticos, y un conjunto de herramientas de post-cuantificación puede ser para analizar los datos de salida proporcionados. Este manuscrito también demuestra cómo este método, aliado con pruebas de comportamiento ya establecidas, describe cuantitativamente los déficits locomotores después de una lesión de la médula espinal.
Introduction
La coordinación efectiva de cuatro extremidades no es exclusiva de los animales cuadrúpedos. La coordinación extremidad anterior-extremidad posterior en humanos sigue siendo importante para realizar varias tareas, como nadar y alteraciones de la velocidad al caminar1. Varios cinemáticos2 y del programa motor 1,3,4 de las extremidades, así como circuitos de retroalimentación propioceptiva5, se conservan entre humanos y otros mamíferos y deben ser considerados al analizar las opciones terapéuticas para los trastornos motores, como la lesión de la médula espinal (LME)6,7,8.
Para caminar, varias conexiones espinales de las extremidades anteriores y posteriores necesitan ser correctamente cableadas y activadas rítmicamente, lo que requiere aportes del cerebro y retroalimentación del sistema somatosensorial 2,9,10. Estas conexiones culminan en los generadores de patrones centrales (GPC), que están situados a nivel cervical y lumbar para las extremidades anteriores y posteriores, respectivamente 1,9,10. A menudo, después de la LME, la interrupción de la conectividad neuronal y la formación de una cicatriz glial inhibitoria12 limitan la recuperación de la función locomotora, con resultados que varían desde la parálisis total hasta la función restringida de un grupo de extremidades dependiendo de la gravedad de la lesión. Las herramientas para cuantificar con precisión la función locomotora después de la LME son críticas para monitorear la recuperación y evaluar los efectos de los tratamientos u otras intervenciones clínicas6.
El ensayo métrico estándar para los modelos de contusión de LME en ratones es la escala de ratón de Basso (BMS)13,14, una puntuación no paramétrica que considera la estabilidad del tronco, la posición de la cola, el paso plantar y la coordinación extremidad anterior-extremidad posterior en un campo abierto. A pesar de que el BMS es extremadamente confiable para la mayoría de los casos, requiere al menos dos evaluadores experimentados para observar todos los ángulos de movimiento de los animales para tener en cuenta la variabilidad natural y reducir el sesgo.
También se han desarrollado otros ensayos para evaluar cuantitativamente el rendimiento motor después de la SCI. Estos incluyen la prueba de rotarod, que mide el tiempo empleado en un cilindro giratorio15; la escalera horizontal, que mide el número de barandillas perdidas y la escalera positiva agarra16,17; y la prueba de marcha del haz, que mide el tiempo que tarda un animal y el número de fallos que comete al cruzar una viga estrecha18. A pesar de reflejar una combinación de déficits motores, ninguna de estas pruebas produce información locomotora directa sobre la coordinación extremidad anterior-extremidad posterior.
Para analizar específicamente y más a fondo el comportamiento al caminar, se han desarrollado otros ensayos para reconstruir los ciclos de pasos y las estrategias de marcha. Un ejemplo es la prueba de huella, donde las patas entintadas de un animal dibujan un patrón sobre una hoja de papel blanco19. Aunque simple en su ejecución, extraer parámetros cinemáticos como la longitud de zancada es engorroso e inexacto. Además, la falta de parámetros dinámicos, como la duración del ciclo escalonado o la coordinación cronometrada, limita sus aplicaciones; De hecho, estos parámetros dinámicos solo se pueden adquirir analizando videos cuadro por cuadro de roedores caminando a través de una superficie transparente. Para los estudios de SCI, los investigadores han analizado el comportamiento al caminar desde una vista lateral utilizando una cinta de correr, incluida la reconstrucción del ciclo de pasos y la medición de las variaciones angulares de cada articulación de la pierna 4,20,21. A pesar de que este enfoque puede ser extremadamente informativo6, sigue centrado en un conjunto específico de extremidades y carece de características adicionales de la marcha, como la coordinación.
Para llenar estos vacíos, Hamers y sus colegas desarrollaron una prueba cuantitativa basada en un sensor táctil óptico utilizando la reflexión interna total frustrada (fTIR)22. En este método, la luz se propaga a través del vidrio a través de la reflexión interna, se dispersa al presionar la pata y, finalmente, es capturada por una cámara de alta velocidad. Más recientemente, se puso a disposición una versión de código abierto de este método, llamada MouseWalker, y este enfoque combina una pasarela fTIR con un paquete de software de seguimiento y cuantificación23. Con este método, el usuario puede extraer un gran conjunto de parámetros cuantitativos, incluidos patrones de paso, espaciales y de marcha, posicionamiento de la huella y coordinación extremidad anterior-extremidad posterior, así como salidas visuales, como patrones de huella (imitando el ensayo de pata entintada6) o fases de postura relativas al eje del cuerpo. Es importante destacar que, debido a su naturaleza de código abierto, se pueden extraer nuevos parámetros actualizando el paquete de scripts de MATLAB.
Aquí, se actualiza el ensamblaje publicado anteriormente del sistema MouseWalker23 . Se proporciona una descripción de cómo configurarlo, con todos los pasos necesarios para lograr la mejor calidad de video, condiciones de seguimiento y adquisición de parámetros. También se comparten herramientas adicionales posteriores a la cuantificación para mejorar el análisis del conjunto de datos de salida de MouseWalker (MW). Finalmente, la utilidad de esta herramienta se demuestra mediante la obtención de valores cuantificables para el rendimiento locomotor general, específicamente los ciclos escalonados y la coordinación extremidad anterior-extremidad posterior, en un contexto de lesión medular (LME).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos los procedimientos de manipulación, quirúrgicos y cuidados postoperatorios fueron aprobados por el Comité Interno Molecular del Instituto de Medicina (ORBEA) y el Comité Portugués de Ética Animal (DGAV) de acuerdo con las directrices de la Comunidad Europea (Directiva 2010/63 / UE) y la ley portuguesa sobre cuidado de animales (DL 113/2013) bajo la licencia 0421/000/000/2022. Para el presente estudio se utilizaron ratones hembra C57Bl/6J de 9 semanas de edad. Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el número de animales y disminuir el sufrimiento de los animales utilizados en el estudio. El script de MATLAB y la versión independiente del software MW son de código abierto y están disponibles en GitHub.
repositorio (https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker). Mientras que el software MW se desarrolló en MATLAB R2012b, se ha adaptado para ejecutarse en MATLAB R2022b. La figura 1 ilustra el flujo de trabajo de análisis del MW.
1. Configuración del aparato MouseWalker (MW)
- Ensamble el aparato MW como se describió anteriormente23, o adáptese a las necesidades específicas del diseño experimental (consulte la Tabla de materiales y la Figura suplementaria 1 para obtener más detalles sobre la configuración).
NOTA: La arena para caminar se puede ampliar para acomodar animales más grandes, como ratas. -
Verifique que el plexiglás por donde caminan los animales esté limpio y libre de arañazos. Use un paño de limpieza suave y minimice el uso de solventes orgánicos como amoníaco o etanol en altas concentraciones, que pueden dañar el plexiglás (se recomienda peróxido de hidrógeno al 3%, etanol al 7% o cualquier desinfectante compatible y apropiado para plexiglás). Si es necesario, reemplace el plexiglás.
- Configure la cámara de alta velocidad con una lente rápida y una apertura grande (es decir, valores F-stop más pequeños) para capturar una gran cantidad de luz, ya que esto ayuda a registrar las señales fTIR (consulte la Tabla de materiales).
NOTA: La lente no debe generar distorsiones ópticas, particularmente en los bordes de la imagen. Las distorsiones ópticas se pueden probar registrando un patrón conocido (por ejemplo, rayas o cuadrados) y luego midiendo el tamaño de los bloques en ImageJ/FIJI24 (use la herramienta de línea y luego haga clic en Analizar > medir). Por ejemplo, un cuadrado de 1 cm debe tener las mismas dimensiones de píxeles tanto en el centro de la imagen como en los bordes. Las variaciones deben ser inferiores al 5%. - Ilumine la tira de luz LED multicolor de la caja de luz de fondo.
- Encienda la tira de luz LED blanca de la caja de luces de la pasarela.
NOTA: También se puede usar un LED de color25 para facilitar la distinción de la huella / cuerpo / fondo. - Con las luces de la habitación apagadas, verifique la intensidad de la luz de fondo y la pasarela. Ajuste la intensidad, si es necesario, utilizando un potenciómetro o plástico semiopaco. Estos deben optimizarse para que la intensidad de los píxeles aumente en el siguiente orden: el cuerpo del animal < fondo < huellas.
- Para comprobar la intensidad en píxeles del cuerpo/fondo/huellas del animal, abra la secuencia de imágenes en ImageJ/FIJI24 y haga clic en Analizar > medir. La señal de huella no debe estar sobresaturada, ya que esto evitará que se definan los límites de la huella (es decir, dedos de los pies y almohadillas para los pies) (Figura complementaria 2).
- Ajuste el contraste de imagen de la pasarela en el software de grabación de video. El contraste se puede ajustar de dos maneras: atenuando o aumentando la iluminación en la tira de LED o ajustando la apertura de la lente de la cámara.
- Coloque la lente correctamente para que esté a la misma altura y en el centro del espejo reflectante de 45° y perpendicular (90°) a la pasarela. Esto generará una imagen constantemente proporcional a lo largo de la pasarela izquierda-derecha.
NOTA: Evite cambiar la posición de la cámara (distancia, altura y orientación) en las múltiples sesiones de grabación. Si es necesario, marque el piso donde se debe colocar el trípode. Esto mantendrá las características de la imagen. - Enfoca la lente en la superficie del plexiglás. Esto se puede probar utilizando un objeto no dañino que toque la superficie del plexiglás.
NOTA: Con valores de lente F-stop más bajos, la profundidad de campo se reducirá, lo que dificultará el enfoque. - Asegúrese de que todos los ajustes permanezcan inalterados durante el ensayo, ya que pueden cambiar la intensidad de píxeles de los videos grabados.
2. Adquisición de vídeo
- Asegúrese de que los ratones estén familiarizados con la habitación y el aparato antes de realizar la prueba. Ahorre al menos 1 día para la habituación (día 0). Para evitar un entrenamiento excesivo, realice la prueba de MW en un día diferente de las otras pruebas de comportamiento (preferiblemente al día siguiente).
- En el software de grabación de vídeo, asegúrese de que al menos 50 cm de la pasarela sean visibles.
- Ajuste la configuración de grabación para truncar la región de la pasarela. Esto reducirá el tamaño del video y optimizará la adquisición de video.
- Tome una foto o un video corto de una regla regular antes de cada sesión. El número de píxeles por centímetro se utilizará más tarde en la "ventana de configuración" para calibrar los videos.
- Comience la adquisición del video y coloque al animal en el borde de la pasarela agarrando la base de la cola para evitar lesiones. Asegúrese de que los animales avancen hacia el borde extremo de la plataforma. Realice las grabaciones de vídeo con al menos 100 fotogramas/s para garantizar transiciones de marcha suaves.
- Si es necesario, motive a los animales a moverse golpeando suavemente la pared de la pasarela o chasqueando / aplaudiendo los dedos. Sin embargo, evite los empujones físicos, ya que esto puede afectar los resultados.
- Guarde los videos directamente como secuencias de imágenes en formato TIFF (con compresión LZW), JPEG o PNG. En caso de que la cámara grabe como un archivo MOV sin procesar, convierta los videos en secuencias de imágenes abriendo el archivo en ImageJ / FIJI24 y haciendo clic en Archivo > Guardar como secuencia de > imagen (o utilizando otro software, como LosslessCut25).
NOTA: La mayoría de los animales comienzan a caminar inmediatamente después de ser puestos en la pasarela; Por lo tanto, se recomienda iniciar la adquisición del video antes de colocar al animal.
3. Preparación de los vídeos para el software de seguimiento MW
- Filme suficientes tiradas completas de cada ratón individual. El número de animales a filmar por condición y el número de tiradas completas deben decidirse de acuerdo con cada diseño experimental. Una carrera completa es cuando el ratón camina los 50 cm completos de la pasarela sin paradas prolongadas (en este experimento, se seleccionaron tres carreras completas).
NOTA: Dependiendo del software de adquisición de imágenes, es posible que los videos deban recortarse al ROI más bajo. Esto aumentará la velocidad de seguimiento y generación de salida. - En ImageJ/FIJI24, seleccione los fotogramas en los que está el ratón en la pantalla haciendo clic en Imagen > Pila > Herramientas > Crear una subpila. El seguimiento en el MW requiere que la cabeza y la cola sean visibles en todos los cuadros. Sin embargo, es posible hacer varias subpilas a partir de una sola grabación de video, que luego representará cada ejecución.
- Guarde cada subpila por separado en diferentes carpetas haciendo clic en Archivo > Guardar como secuencia > imagen. El software MW luego crea una subcarpeta automáticamente en cada directorio cada vez que uno comienza a analizar una ejecución.
4. Seguimiento
- Abra MATLAB, agregue la carpeta que contiene el script MW al directorio de trabajo y ejecute "MouseWalker.m" en la línea de comandos principal.
NOTA: El uso del software MW en MATLAB permite visualizar mensajes de error de seguimiento en la consola principal de MATLAB y seleccionar los datos de salida deseados (abriendo el archivo de script principal "MouseEvaluate.m" y cambiando las salidas a 1 o 0: el archivo de Excel, gráficos de pasos, trazos de postura y patrones de marcha). - Cargue la carpeta de video como el "Directorio de entrada". También se puede elegir la carpeta de salida; sin embargo, esto no es un requisito ya que el software MW crea una nueva carpeta llamada "Resultados" automáticamente dentro del "Directorio de entrada".
- Usando las flechas "<<", "<", ">>" y ">" verifique si todos los cuadros de video están cargados correctamente dentro del software MW.
- Vaya a la "Ventana de configuración" donde se encuentran todos los parámetros de calibración y umbral. Estos ajustes pueden cambiar dependiendo de la intensidad de píxeles del fondo y las huellas, así como del tamaño mínimo del cuerpo y las huellas, entre otros factores (ver ejemplo en la Figura complementaria 2). Pruebe el efecto de cambiar algunos parámetros haciendo clic en el botón Vista previa .
- Use los diferentes estilos de trama, incluidos "cuerpo + pies + cola", "solo cuerpo", "solo pies" y "solo cola", para ayudar a discriminar partes del cuerpo después de ajustar los parámetros de umbral.
- Aproveche las herramientas en el panel lateral derecho para tomar medidas del brillo o tamaño (usando los botones "brillo" y "regla", respectivamente). Todos los ajustes se pueden guardar como "predeterminados" siempre que la distancia de la cámara siga siendo la misma.
- Después de ajustar los parámetros de umbral, compruebe que el vídeo está listo para el seguimiento automatizado. Vaya al primer cuadro y haga clic en Auto para comenzar el seguimiento. Este paso se puede seguir en tiempo real, y tarda unos minutos, dependiendo del tamaño del vídeo y del rendimiento del ordenador.
- Si el seguimiento automático etiqueta incorrectamente las características del cuerpo, cancele el seguimiento automático, ingrese una nueva configuración y reinicie el proceso.
- Una vez completado el seguimiento, compruebe si se necesita una corrección manual. Para corregir, utilice el panel central para seleccionar o anular la selección e indicar la ubicación de las huellas de la pata, la cabeza, la nariz, el cuerpo (dividido en dos segmentos) y la cola (divididos en cuatro segmentos) de la parte delantera derecha (RF), la parte posterior derecha (HR), la delantera izquierda (LF) y la parte posterior izquierda (LH). Guarde los cambios pulsando el botón Guardar .
NOTA: Todos los botones y la mayoría de los comandos tienen un método abreviado de teclas (consulte el manual asociado para obtener más detalles23). Para facilitar el desplazamiento de video y la ejecución de atajos de teclado, se puede usar un controlador de hardware con botones programables y una rueda de lanzadera como el Contour ShuttlePro V2. - Haga clic en Evaluar para generar los archivos de salida del video rastreado. Dependiendo de la salida deseada seleccionada (consulte el paso 4.1), este paso puede tardar unos minutos.
- Compruebe que todos los gráficos de datos de salida se guardan en la carpeta "Resultados". Verifique la precisión del seguimiento examinando algunas de las salidas gráficas, como las "Trazas de postura", donde se puede verificar si todas las posiciones de las patas son consistentes.
- Si se identifica un error, corrija manualmente el seguimiento (si es posible; de lo contrario, elimine la carpeta "Resultados" y realice el seguimiento automático nuevamente con la nueva configuración) y haga clic nuevamente en el comando Evaluar .
- Compruebe que todas las mediciones cuantitativas generadas por el software MW se guardan en una hoja de cálculo Excel y se resumen en "1. Info_Sheet". Asegúrese de que las opciones de Excel para las delimitaciones de fórmulas coincidan con el script. El separador decimal debe ser ",", y los mil separadores deben ser ";".
- Utilice el script "MouseMultiEvaluate.m" para congregar las mediciones de todas las ejecuciones en un nuevo archivo para su análisis.
- Para comenzar, genere un archivo .txt que contenga las rutas de carpeta para todos los videos (por ejemplo, "Videofiles.txt"). Asegúrese de que cada línea corresponde a un solo vídeo.
- Luego, escriba "MouseMultiEvaluate ('Videofiles.txt')" en la línea de comandos. Se generará un archivo de Excel llamado "ResultSummary.xls" en el directorio de trabajo (vea un ejemplo en el repositorio de GitHub).
NOTA: La Figura 2 representa las salidas gráficas obtenidas por el software MW de los videos de un animal grabado.
5. Flujo de trabajo de análisis cinemático de datos
- Edite la hoja de Excel generada en el paso 4.10, que contiene los datos para el procesamiento mediante los scripts de Python proporcionados, de acuerdo con los siguientes requisitos previos.
- En el encabezado de la primera columna, especifique la condición experimental. Asigne un nombre a cada línea después del nombre del grupo/condición (los individuos de los mismos grupos deben tener el mismo nombre). El primer grupo debe ser el control o la línea de base (esto solo es obligatorio para el trazado de mapas de calor, paso 5.6).
- En la segunda columna, especifique el identificador del animal. Esto es obligatorio, aunque esta información no se utilizará para la generación de parcelas.
- En la tercera columna en adelante, elija los parámetros motores que se utilizarán para el análisis. Asegúrese de que la primera línea es el nombre del parámetro (estos nombres aparecerán más adelante en los gráficos).
- Abra Anaconda Navigator y ejecute Spyder para abrir los scripts de Python suministrados.
NOTA: Todos los scripts se desarrollaron con Python 3.9.13, se ejecutaron con Spyder 5.2.2 en Anaconda Navigator 2.1.4 y están disponibles en la Tabla de materiales y en el repositorio de GitHub (donde se incluyen materiales adicionales, como un ejemplo de video, un archivo de ejemplo de Excel y un documento de preguntas frecuentes). Es posible ejecutar los scripts fuera del Anaconda Navigator; Sin embargo, esta interfaz gráfica de usuario es más fácil de usar. - Utilice el "Rawdata_PlotGenerator.py" para generar los gráficos de datos sin procesar. Esto permitirá la visualización de cada parámetro en función de la velocidad.
- Abra "Rawdata_PlotGenerator.py" en Spyder y ejecute el código haciendo clic en el botón Reproducir .
- Seleccione el archivo de Excel a analizar y el nombre de la hoja en la ventana automática. Si no se modificó el nombre de la hoja, escriba "Hoja1".
- Los gráficos de datos sin procesar aparecerán en la consola de gráficos (panel superior derecho). Para guardar los gráficos, haga clic en el botón Guardar imagen o Guardar todas las imágenes en la consola del trazado.
- Utilice el script "Residuals_DataAnalysis" para calcular los residuos para el análisis de datos. Este script generará un archivo CSV con los cálculos de los residuos para todos los parámetros del motor.
NOTA: Muchos de los parámetros de marcha medidos extraídos por el MW varían con la velocidad (por ejemplo, velocidad de giro, longitud del paso, duración de la postura, rectitud de la postura e índices de marcha). Por lo tanto, se recomienda realizar un modelo de regresión de mejor ajuste de cada parámetro individual frente a la velocidad para el experimento de referencia y luego determinar los valores residuales para cada grupo experimental en relación con este modelo de regresión. Los datos se expresan entonces como la diferencia con respecto a la línea normalizada residual26.- Abra "Residuals_DataAnalysis.py" en Spyder y ejecute el código haciendo clic en el botón Reproducir .
- Seleccione el archivo de Excel a analizar y el nombre de la hoja en la ventana automática. Si no se modificó el nombre de la hoja, escriba "Hoja1".
- Guarde el archivo CSV en la misma carpeta que los datos. Es obligatorio que el control (o línea base) sea el primer grupo del archivo de Excel.
- Utilice el script "PCA_PlotGenerator.py" para realizar un análisis de componentes principales (PCA).
NOTA: Este método de reducción de dimensionalidad no supervisado se utiliza para generar una representación más sucinta 27,28,29 de los datos (Figura 3A, B). El script PCA incluye los siguientes pasos. Los datos se procesan primero mediante centrado y escalado, después de lo cual el algoritmo PCA calcula la matriz de covarianza para determinar las correlaciones entre las variables y calcular los vectores propios y los valores propios de la matriz de covarianza para identificar los componentes principales. Los primeros dos o tres componentes principales se eligen para la representación de los datos en gráficos 2D o 3D, respectivamente. Cada punto en las parcelas corresponde a un animal y representa una variable abstracta diferente. Los puntos codificados por colores se utilizan para distinguir los grupos específicos. Como tal, los grupos de puntos reflejan patrones de caminar similares compartidos por los individuos correspondientes.- Abra "PCA_PlotGenerator.py" en Spyder y ejecute el código haciendo clic en el botón Reproducir .
- Seleccione el archivo de Excel a analizar y el nombre de la hoja en la ventana automática. Si no se modificó el nombre de la hoja, escriba "Hoja1".
- Asegúrese de que los gráficos PCA 2D y 3D aparecen en la consola de trazado (panel superior derecho). Cada color representa un grupo diferente y la leyenda aparece junto a la trama. Para guardar el gráfico, haga clic en Guardar imagen en la consola del trazado.
- Utilice "Heatmap_PlotGenerator.py" para generar un mapa de calor. Asegúrese de que el generador de mapas de calor cree una tabla que muestre las diferencias estadísticas entre el grupo de referencia (o grupo de control) y los otros grupos para cada parámetro motor27 (Figura 4). Cada columna representa un grupo, y cada línea se relaciona con un parámetro motor específico.
NOTA: El análisis estadístico se realizó con un ANOVA unidireccional seguido de la prueba post hoc de Tukey (para distribuciones normales) o un ANOVA de Kruskal-Wallis seguido de la prueba post hoc de Dunn (para distribuciones no normales). Los valores atípicos se excluyeron del análisis. Los valores P están representados por un código de color, con tonos rojos y azules que indican un aumento o disminución en relación con el control (o línea de base), respectivamente. El tono de color representa la significación estadística, con colores más oscuros que muestran una mayor significación y colores más claros que muestran una significación menor. corresponde a P < 0,001; ** corresponde a P < 0,01; y * corresponde a P < 0,05. El blanco indica que no hay variación.- Abra "Heatmap_PlotGenerator.py" en Spyder y ejecute el código haciendo clic en el botón Reproducir .
- Seleccione el archivo de Excel a analizar y el nombre de la hoja en la ventana automática. Si no se modificó el nombre de la hoja, escriba "Hoja1".
- Seleccione el tipo de datos en la segunda ventana automática: datos sin procesar o datos residuales. Si una opción no está seleccionada, los datos residuales son el valor predeterminado.
- El mapa de calor aparecerá en la consola de trazado (panel superior derecho). Para guardar el gráfico, haga clic en Guardar imagen en la consola del trazado.
Nota : es obligatorio que el control (o línea base) es el primer grupo en el archivo de Excel.
- Utilice "Boxplots_PlotGenerator.py" para generar los diagramas de caja. Esta herramienta permitirá la generación de diagramas de caja que representan la distribución de valores para todos los parámetros motores para cada grupo (Figura 5, Figura 6 y Figura 7).
NOTA: Cada caja contiene la mediana como línea media, y los bordes inferior y superior de las cajas representan los cuartiles 25% y 75%, respectivamente. Los bigotes representan el rango del conjunto de datos completo, excluyendo los valores atípicos. Los valores atípicos se definen como cualquier valor que sea 1,5 veces el rango intercuartil por debajo o por encima de los cuartiles 25% y 75%, respectivamente.- Abra "Boxplots_PlotGenerator.py" en Spyder y ejecute el código haciendo clic en el botón Reproducir .
- Seleccione el archivo de Excel a analizar y el nombre de la hoja en la ventana automática. Si no se modificó el nombre de la hoja, escriba "Hoja1".
- Seleccione el tipo de datos en la segunda ventana automática: datos sin procesar o datos residuales. Si una opción no está seleccionada, los datos residuales son el valor predeterminado.
- Los diagramas de caja aparecerán en la consola de trama (panel superior derecho). Para guardar los gráficos, haga clic en el botón Guardar imagen o Guardar todas las imágenes en la consola del trazado.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
El sistema BMS estándar describe los déficits motores gruesos después de SCI14. Debido a su naturaleza subjetiva, generalmente se realizan otros ensayos cuantitativos junto con el BMS para producir una evaluación más detallada y fina de la locomoción. Sin embargo, estas pruebas no muestran información específica sobre los ciclos de pasos, los patrones de paso y la coordinación de las extremidades anteriores y posteriores, lo cual es extremadamente importante para comprender cómo el circuito espinal mantiene la función y se adapta a una LME incompleta. Esta sección muestra cómo la caja de herramientas MW puede ayudar a monitorear la recuperación de la función locomotora después de una LME y agregar información relevante sobre el comportamiento al caminar.
La muestra del estudio se dividió en dos grupos de ratones hembra C57Bl/6J de 9 semanas de edad: un grupo experimental de LME (n = 11), en el que los animales se sometieron a laminectomía seguida de una lesión por contusión moderada a grave a nivel de la columna vertebral T9/T10 utilizando un impactador de horizonte infinito (ver Tabla de materiales); y un grupo control con lesión simulada (n = 10), en el que solo se realizó la laminectomía al mismo nivel de columna (Figura 1, paso 1). El comportamiento locomotor de los animales con LME y lesiones simuladas fue monitoreado durante 30 días. La prueba de MW se realizó el día de habituación antes de la cirugía (línea de base) y 15 días, 22 días y 30 días después de la lesión (dpi) (Figura 1, paso 2). En aras de la comparación, los ratones fueron sometidos a la prueba BMS en paralelo antes de la cirugía y a 1 dpi, 3 dpi, 7 dpi, 14 dpi, 21 dpi y 30 dpi (Figura complementaria 3). Después de rastrear todos los videos obtenidos con el MW, se generaron dos tipos de archivos de salida: salidas gráficas, que muestran representaciones visuales de varios parámetros después de cada ejecución, y salidas cinemáticas, que resumen todos los parámetros medibles del motor (Figura 1, paso 3 y paso 4).
En consecuencia, utilizando un conjunto de scripts de Python (consulte Tabla de materiales y el enlace del repositorio de GitHub), se obtuvieron los gráficos de datos sin procesar (Figura 1, paso 5). Como la mayoría de los parámetros están influenciados por la velocidad del animal, se realizó un modelo de regresión del grupo basal antes de la lesión junto con los valores residuales medidos para cada condición (Figura 1, paso 6). Para verificar los perfiles cinemáticos y las diferencias significativas entre los grupos control (simulado) y experimental (LME), todos los parámetros cinemáticos (total de 79) se sometieron a un análisis de componentes principales (PCA) de tres órdenes, y se generó un mapa de calor con una colección de parámetros motores que describían mejor el conjunto de datos (total de 33) (Figura 1, paso 7a, b). Finalmente, los parámetros motores específicos que se vieron afectados después de la LME se compararon con la línea de base antes de la lesión (Figura 1, Paso 7c).
Figura 1: Representación esquemática del flujo de trabajo de análisis del MW. (1) Los animales son seleccionados para laminectomía (grupo control simulado) o laminectomía seguida de una lesión de la médula espinal (grupo experimental). (2) Los animales son sometidos a un ensayo de comportamiento el día antes de la lesión y en los días 15, 22 y 30 después de la lesión. (3) El MW genera dos tipos de datos de salida: (a) visualizaciones gráficas de varios parámetros, como trazos de postura, pasos y patrones de paso, y (b) un resumen cinemático de todos los parámetros motores medibles. (4) Todos los datos de control y experimentales se congregan en un único archivo utilizando el script "MouseMultiEvaluate.m" en MATLAB. (5) El script "RawData_PlotGenerator" para Python genera una representación visual de cómo varían todos los parámetros motores medibles según la velocidad. Si los parámetros no se correlacionan con la velocidad, se podría saltar a (7); sin embargo, como la mayoría de los parámetros después de SCI dependen en gran medida de la velocidad, se debe generar un modelo (6) utilizando el script "Residual_DataAnalysis" para Python. Después de generar los valores residuales para cada parámetro del motor, se lleva a cabo el análisis de datos (7): (a) se realiza un análisis de componentes principales (PCA) utilizando una selección de parámetros con un script "PCA_PlotGenerator"; b) se crea un mapa de calor con un script de "Heatmap_PlotGenerator", para mostrar las diferencias estadísticamente significativas entre las condiciones para diferentes parámetros; y c) varios parámetros individuales que se alteran después de LME se evalúan con el guión "BoxPlot_PlotGenerator". Todos los scripts están disponibles en la Tabla de materiales y en el enlace del repositorio de GitHub. Los scripts se muestran en rojo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
A partir de los datos gráficos de salida recopilados del MW, fue posible confirmar el conocido cambio abrupto en la visualización de las huellas después de SCI. En el ensayo "Digital-ink" generado por el MW, se detectó falta de soporte de las patas traseras (Figura 2A), junto con una disminución en el área de huella para las patas traseras izquierda y derecha (Figura 2B), que se mantuvo desde 15 dpi en adelante (datos no mostrados). Además, dentro de cada ciclo de paso, el MW calcula parámetros relacionados con la fase de postura (es decir, el tiempo entre el aterrizaje de la pata y antes del despegue) y la fase de oscilación (es decir, el tiempo que la extremidad está fuera del suelo). Como tal, el MW puede generar "trazos de postura" visuales, que tienen en cuenta la posición del centro y el eje del cuerpo en relación con cada pierna y su centro de huella durante las fases de postura23. Las trazas de postura generales obtenidas para cada animal mostraron varias características únicas (Figura 2C). Estos datos mostraron que después de SCI, las patas traseras tenían trazas de postura más cortas y un posicionamiento más aleatorio de la pata tanto en el aterrizaje como en el despegue desde 15 dpi en adelante (Figura 2C).
Figura 2: Resultados gráficos representativos obtenidos por el software MW de los videos de seguimiento. (A) Impresiones de "tinta digital" para un animal SCI que muestran cada pata con un color diferente: rojo (delantero derecho), amarillo (delantero izquierdo), verde (trasero derecho) y azul (trasero izquierdo) en varios puntos de tiempo. (B) Huellas para la delantera izquierda (LF), la parte posterior izquierda (LH), la delantera derecha (RF) y la trasera derecha (RH) de un animal con LI a 15 dpi. (C) "Huellas de postura" para un animal SCI en varios puntos temporales. El AEP y el PEP para una de las patas se ilustran en el primer panel. La "agrupación de huellas" tanto para el AEP como para el PEP corresponde a la desviación estándar de las coordenadas promedio de AEP o PEP en cada video. Abreviaturas: dpi = días después de la lesión; cm = centímetro; px = píxel. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
A continuación, se analizaron las salidas cinemáticas después de ser calculadas por el MW (Figura 3 y Figura 4). Para obtener una representación más concisa del conjunto de datos y probar si los parámetros motores cinemáticos obtenidos del MW fueron suficientes para representar los déficits locomotores encontrados en animales con LME a lo largo del tiempo, se realizó un PCA27. Cabe destacar que el 40% de la varianza en los datos podría explicarse en el primer componente (PC1: 40,1%), que segregó el grupo de animales que tenían una LME del resto, con un valor de p inferior a 0,001 basado en una prueba ANOVA unidireccional (Figura 3A, B) en todos los puntos temporales (15 dpi, 22 dpi y 30 dpi). También hubo una pobre contribución de los otros componentes (PC2: 11% y PC3:8,6%). El peso asignado de cada contribución de parámetro del motor para cada componente se ilustra en la Figura suplementaria 4. Además, la varianza en el conjunto de datos no fue suficiente para reflejar las diferencias a lo largo del tiempo (es decir, entre 15 dpi, 22 dpi y 30 dpi), lo que replica la meseta de recuperación locomotora descrita anteriormente14. En conjunto, estos resultados indican que los parámetros cinemáticos obtenidos del MW describen fuertemente los déficits motores observados después de LME en todos los puntos temporales.
Figura 3: Análisis de componentes principales de todos los parámetros cinemáticos motores (79) obtenidos por el software MW después del análisis de datos residuales. (A) Una visualización 3D del análisis PCA de tres componentes. (B) Una visualización 2D con círculos que representan el 50% de los datos recopilados. En PC1, que explicó más del 40% de la varianza, el grupo de LME a 15 dpi, 22 dpi y 30 dpi fue significativamente diferente del grupo simulado y la línea de base (antes de la lesión), con un valor de p < 0,001, según lo determinado por un ANOVA unidireccional. Cada punto pequeño o triángulo individual representa la media de tres videos para cada animal, mientras que los puntos o triángulos más grandes representan el punto promedio (n = 10-11 por condición, n = 21 para el grupo de referencia). La contribución de cada componente se indica en cada eje. Abreviaturas: dpi = días después de la lesión; LME = lesión de la médula espinal; PC = componente principal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Luego, se seleccionó una colección de parámetros motores en función de la fuerza con la que describía el conjunto de datos (33 en total) y se generó un mapa de calor (Figura 4). De hecho, la mayoría de los parámetros locomotores mostraron un cambio drástico después de la LME en todos los puntos temporales (15 dpi, 22 dpi y 30 dpi), mientras que los controles lesionados por simulacro solo mostraron cambios significativos a 30 dpi. Estos cambios en el grupo simulado podrían explicarse por una disminución general en la velocidad de giro, posiblemente debido a la habituación de la prueba, que se discutirá más adelante.
Se notó que los animales con LME caminaron más lentamente que los controles con lesiones simuladas (datos no mostrados). Sin embargo, independientemente de la velocidad, tanto a 15 dpi como a 30 dpi, los animales SCI mostraron una mayor duración de oscilación, menor duración de la postura y un índice de factor de trabajo más bajo, que se relaciona con la duración de la postura / período de paso23. Estos resultados indican que las alteraciones en la posición de las piernas descritas anteriormente son características de LME, como se ve en otros modelos animales30,31,32, y no están relacionadas con alteraciones en el ritmo (Figura 4).
También debe mencionarse que la sincronía izquierda y derecha no se vio afectada, ya que no se observó un cambio significativo en los índices de "fase" para las extremidades anteriores y posteriores10,23 (Figura 4), lo que indica un acoplamiento intacto entre las extremidades izquierda y derecha.
Además, los ratones SCI mostraron un índice más bajo de "rectitud de la postura" (desplazamiento / longitud del camino) tanto en las extremidades anteriores como en las posteriores (Figura 4). Este parámetro mide cuán lineales son las trazas en relación con la condición ideal, que sería una línea recta (que va de 0 a 1, indicando una traza lineal)27. Por lo tanto, estos resultados indican una fuerte incapacidad para caminar derecho en este grupo.
Para cada fase de postura, el MW dibuja una reconstrucción de las oscilaciones del cuerpo, comenzando en el aterrizaje de la pata, la posición extrema anterior, o AEP, y terminando antes del despegue, la posición extrema posterior, o PEP (ver el ejemplo en la Figura 2C). La "agrupación de huellas" tanto del AEP como del PEP mide la desviación estándar de las coordenadas promedio de AEP o PEP en cada video. Los animales con LME mostraron un aumento en la agrupación de la huella de la pata trasera para el AEP en todos los puntos temporales, y solo se observó un efecto significativo para el grupo con lesiones simuladas a 15 dpi (Figura 4). Esto ilustra que los animales SCI no podían colocar correctamente sus extremidades posteriores en el aterrizaje después del swing. Además, se observó una disminución en la "agrupación de huellas" de la pata delantera para la PEP, junto con una disminución en la agrupación de la huella de la pata trasera para la PEP, a 30 dpi (Figura 4). Estos resultados están de acuerdo con lo que se observa en los "rastros de postura" dibujados y sugieren que la posición de las patas delanteras se vuelve más restringida después de la lesión.
Finalmente, y de acuerdo con las alteraciones en el posicionamiento de la pata, hubo alteraciones en las estrategias de marcha y la "presión" provocada por las patas, medida por el brillo promedio sobre el área (Figura 4), que se discutirá más adelante.
Figura 4: Diagrama de mapa de calor que muestra una colección de los parámetros locomotores significativamente alterados que comparan animales con LME y animales con lesiones simuladas en relación con el día anterior a la cirugía, obtenidos por el MW después del análisis de datos residuales. n = 10-11 por condición; El grupo basal incluye todos los animales el día antes de la cirugía, n = 21. Los datos se expresan mediante el valor p después del análisis estadístico con un ANOVA unidireccional seguido de la prueba post hoc de Tukey (para distribuciones normales) o la prueba post hoc de Dunn (para distribuciones no normales). Los valores P están representados por un código de color, con tonos rojos y azules que indican una disminución o aumento en relación con la línea de base, respectivamente. El tono de color representa la significación estadística, con colores más oscuros que indican una mayor significación y colores más claros que indican una significación menor; P < 0,001; **P < 0,01; *P < 0,05. El blanco indica que no hay variación. Abreviaturas: dpi = días después de la lesión; LME = lesión de la médula espinal; s = segundo; ms = milisegundo; promedio = promedio; F = ante; H = hind; AEP = posición extrema anterior; PEP = posición extrema posterior; LF = delantero izquierdo; LH = trasero izquierdo; RF = frente derecho; HR = trasera derecha. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Posteriormente, buscamos comprender qué parámetros individuales serían los mejores para describir los déficits locomotores de los animales con LME en diferentes etapas de la lesión (es decir, 15 dpi, 22 dpi y 30 dpi). Comenzamos examinando los parámetros del ciclo escalonado que mostraron diferencias entre las extremidades anteriores y posteriores a medida que las extremidades posteriores progresaban de parálisis total a función parcial (Figura 5). Mientras que la velocidad media de oscilación aumentó significativamente para las extremidades anteriores en relación con la línea de base (antes de la lesión), la velocidad de oscilación de las extremidades posteriores no cambió significativamente (aunque hubo una tendencia a ser inferior a la línea de base) (Figura 5A, B). Paralelamente, la longitud media de los pasos de las extremidades anteriores disminuyó, sin cambios significativos para las extremidades posteriores (Figura 5C, D). No es sorprendente que los ratones lesionados mostraran una disminución de la duración de la oscilación de las extremidades anteriores y un aumento inverso en la duración de sus oscilaciones de las extremidades posteriores a 15 dpi en adelante (Figura 5E, F). Tomados en conjunto, estos resultados indican que las extremidades anteriores adoptaron un ritmo más rápido, con dos ciclos de extremidades anteriores para cada ciclo de las extremidades posteriores. Esta relación ciclo 2:1 se ha descrito previamente después de la hemisección de LME en ratas 1,33 e ilustra un aspecto clave de la coordinación defectuosa extremidad anterior-extremidad posterior, que no se recupera después de 30 dpi en ratones.
Figura 5: Parámetros del ciclo de pasos para las patas delanteras y traseras en varios puntos de tiempo 1 día antes de la lesión y a 15 dpi, 22 dpi y 30 dpi en animales con LME (n = 11). (A,B) La velocidad media de oscilación de las patas delanteras y traseras en relación con la línea de base. (C,D) La longitud promedio de los pasos de las patas delanteras y traseras en relación con la línea de base. (E,F) La duración promedio de la oscilación de las patas delanteras y traseras en relación con la línea de base. En los diagramas de caja, la mediana está representada por la línea media, y los bordes inferior y superior de las cajas representan los cuartiles 25% y 75%, respectivamente; Los bigotes representan el rango del conjunto de datos completo. Los valores atípicos están representados por puntos individuales. El análisis estadístico se realizó con un ANOVA unidireccional seguido de la prueba post hoc de Tukey (para distribuciones normales) o la prueba post hoc de Dunn (para distribuciones no normales). *P < 0,05; **P < 0,01; P < 0,001. Abreviaturas: dpi = días después de la lesión; LME = lesión de la médula espinal; cm = centímetro; s = segundo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
El software MW también es capaz de calcular los patrones de paso de los ratones midiendo la fracción de fotogramas asignados a una combinación específica de piernas, y esto funciona como un proxy para la presencia de estrategias específicas de marcha. A velocidades más lentas, los ratones no lesionados tienden a adoptar una "marcha para caminar", en la que la mayoría de los cuadros tienen un balanceo de una sola pierna (independientemente de la posición de la pata). A velocidades intermedias, más comunes en la pista, los ratones cambian a una marcha de trote, en la que la configuración más representativa es el balanceo diagonal de la pierna. Finalmente, a velocidades más altas, los ratones usan una "marcha al galope", con tres patas balanceándose al mismo tiempo23,34. Otras configuraciones menos comunes incluyen la marcha de ritmo, representada principalmente por el balanceo lateral de la pierna (ya sea ambas piernas izquierda o derecha), y la "marcha atada / saltando", con ambas extremidades posteriores o anteriores balanceándose simultáneamente10. Sin embargo, se debe tener en cuenta que, en el contexto de una LME, algunas de estas configuraciones, como el swing de tres patas, pueden reflejar una posición defectuosa de la pata posterior y, por lo tanto, no coinciden exactamente con una estrategia específica de marcha, en este caso, el galope. Por lo tanto, el análisis se simplificó comparando solo las configuraciones de las piernas.
Después de realizar el análisis residual, se observó que hubo una disminución en la prevalencia de oscilaciones diagonales acompañada de una disminución en las oscilaciones simples en todos los puntos temporales (Figura 6A, B). Más interesante aún, hubo un aumento en la prevalencia de oscilaciones laterales (Figura 6C). La marcha similar a la estimulación no es típica de un ratón C57BL/6J normal; sin embargo, ya se ha informado que ocurre después de la hemisección de LME en ratas1. Este patrón en fase no fue lo suficientemente frecuente como para cambiar el índice de fase de las extremidades anteriores o posteriores (como se ve en la Figura 3), pero ilustra la retroalimentación espinal defectuosa de las extremidades posteriores a las extremidades anteriores. Además, hubo un aumento natural en la prevalencia de oscilaciones de las extremidades anteriores/posteriores (Figura 6D), posiblemente debido a un paso plantar incorrecto de las extremidades posteriores, y un aumento en las oscilaciones de tres patas (Figura 6E).
Figura 6: Los índices promedio para diferentes configuraciones de swing de paso. (A) Diagonal, (B) simple, (C) lateral, (D) delantero/trasero, y (E) oscilación de tres patas en varios puntos de tiempo en animales con LME (n = 11). En los diagramas de caja, la mediana está representada por la línea media, y los bordes inferior y superior de las cajas representan los cuartiles 25% y 75%, respectivamente; Los bigotes representan el rango del conjunto de datos completo. Los valores atípicos están representados por puntos individuales. El análisis estadístico se realizó con un ANOVA unidireccional seguido de la prueba post hoc de Tukey (para distribuciones normales) o la prueba post hoc de Dunn (para distribuciones no normales). **P < 0,01; P < 0,001. Abreviaturas: dpi = días después de la lesión; LME = lesión de la médula espinal; NA = no aplicable. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Finalmente, otra lectura que se puede extraer del MW es "presión" como medida de brillo / área. Con velocidades más altas, el área de contacto con el suelo disminuye y la presión aumenta, por lo que se realizó una regresión lineal de los datos de referencia y se midieron los valores residuales para cada condición. Se observó que la presión sobre las patas delanteras aumentó significativamente en todos los puntos temporales, pero la fuerza de este efecto tendió a disminuir con el tiempo, ya que el cambio para la pata delantera izquierda ya perdió significación estadística a 30 dpi (Figura 7A, C). Este efecto específico en el lado izquierdo podría explicarse por una lesión lateralizada, que podría haber afectado preferentemente el lado derecho de la médula espinal en este estudio. Sin embargo, la presión ejercida por las patas traseras disminuyó en ratones lesionados, como se esperaba, en todos los puntos temporales, sin tendencia hacia un aumento (Figura 7B, D).
Figura 7: Presión provocada por las patas traseras y delanteras en varios puntos temporales en animales con LME (n = 11). La presión provocada por (A) la pata delantera izquierda, (B) la pata trasera izquierda, (C) la pata delantera derecha y (D) la pata trasera derecha, se muestran como diferencias relativas con respecto a la línea de base (el día antes de la lesión). En los diagramas de caja, la mediana se representa como la línea media, y los bordes inferior y superior de las cajas representan los cuartiles 25% y 75%, respectivamente; Los bigotes representan el rango del conjunto de datos completo. Los valores atípicos están representados por puntos individuales. El análisis estadístico se realizó con un ANOVA unidireccional seguido de la prueba post hoc de Tukey (para distribuciones normales) o la prueba post hoc de Dunn (para distribuciones no normales). **P < 0,01; P < 0,001. Abreviaturas: dpi = días después de la lesión; LME = lesión de la médula espinal; cm = centímetro; px = píxel. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
En conjunto, este estudio ilustra la potencia del sistema MW para describir cuantitativamente las deficiencias motoras causadas por SCI que a veces pueden ignorarse debido a otras limitaciones de la prueba. Además, subraya la recuperación funcional indudablemente limitada a lo largo del tiempo en el modelo de ratón de contusión de LME.
Figura complementaria 1: Los componentes de hardware MW. (A) Esta configuración se divide de la siguiente manera: I - pasarela fTIR; II - base de apoyo y puestos del TIR; III - muro de la pasarela; IV - espejo de 45°; y V - retroiluminación de fondo. (B) Imágenes en primer plano del canal Base-U y las líneas laterales de la pasarela. (C) Diseño de la pared de la pasarela. (D) Imagen en primer plano de la configuración del espejo de 45°. Abreviatura: cm = centímetro. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria 2: Un solo fotograma de un vídeo fTIR en el que se indican la intensidad de píxeles y las áreas de región. Las intensidades de píxeles para el cuerpo, el fondo y las huellas utilizadas para el análisis de video en este estudio se presentan entre corchetes y se indican en rojo, todo optimizado para la claridad de la imagen. La intensidad de la luz debe ajustarse para obtener una discriminación adecuada entre las diferentes regiones. Las áreas relativas del cuerpo y las huellas se indican con líneas amarillas discontinuas. Tanto las áreas como la intensidad de píxeles se adquirieron en ImageJ/FIJI. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria 3: (A) puntuación total de BMS y (B) subpuntuación de los ratones analizados en este estudio (n = 10-11). Todos los datos se expresaron como media ± SEM. El análisis estadístico se realizó con un ANOVA de medidas repetidas de dos vías seguido de la prueba post hoc de Bonferroni; P < 0,001. Abreviatura: BMS = Basso mouse scale. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria 4: El peso asignado de cada contribución de parámetro motor para cada componente. El peso asignado de cada parámetro del motor (79 en total) después del análisis residual para (A) PC1, (B) PC2 y (C) PC3 en el PCA. La línea de corte se dibujó a las 0,04 ms y -0,04. Abreviaturas: ms = milisegundo; promedio = promedio; DE = desviación estándar; F = ante; H = hind; AEP = posición extrema anterior; PEP = posición extrema posterior; LF = delantero izquierdo; LH = trasero izquierdo; RF = frente derecho; HR = trasera derecha; Prensa = presión. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aquí, el potencial del método MouseWalker se demuestra mediante el análisis del comportamiento locomotor después de LME. Proporciona nuevos conocimientos sobre alteraciones específicas en los patrones de paso, huella y marcha que de otro modo se perderían en otras pruebas estándar. Además de proporcionar una versión actualizada del paquete MW, las herramientas de análisis de datos también se describen utilizando los scripts de Python suministrados (consulte el paso 5).
Como el MW genera un gran conjunto de datos y una colección de parámetros cinemáticos que reflejan un proceso locomotor altamente dimensional, se empleó un PCA; de hecho, PCA ha sido ampliamente utilizado en otros conjuntos de datos cinemáticos similares a este 27,35,36 (Figura 3). Esta técnica de reducción de dimensionalidad es un método simple y robusto con supuestos mínimos que permite identificar cuantitativamente los perfiles cinemáticos y distinguirlos rápidamente de las condiciones de control o basales. Además, se generaron mapas de calor para identificar rápidamente los parámetros que eran estadísticamente diferentes de la línea de base (Figura 4), que luego podrían analizarse individualmente (Figura 5, Figura 6 y Figura 7).
Posteriormente, se mostró cómo los parámetros específicos que se pueden extraer del MW ilustran los robustos déficits locomotores observados en animales con LME, como la coordinación. La coordinación es la capacidad de usar cada extremidad de manera organizada para realizar una tarea. A menudo, la coordinación se mide indirectamente por el número de errores/eventos positivos en una escalera 16,17 o el tiempo dedicado al rotarod15. Claramente, el MW calcula tanto la variabilidad en el posicionamiento de la pata durante el ciclo de pasos (patrón de huella) como el índice de "rectitud de la postura"27. Se demostró que ambos parámetros se vieron afectados significativamente por la lesión (Figura 4).
Además, el MW permite al usuario extraer parámetros relacionados con la dinámica temporal. Se observó una interrupción significativa de la duración de la oscilación / postura en animales con LME (Figura 4), y se encontró que los ratones con LME compensaron la pérdida de apoyo en sus extremidades posteriores acelerando su ciclo de pasos de las extremidades anteriores, reduciendo así la longitud del paso de la extremidad anterior y el tiempo promedio de oscilación (Figura 5). Este efecto podría relacionarse con el cambio en el centro de gravedad, que obliga a las patas delanteras a soportar más peso corporal1. Asimismo, podría atribuirse a la pérdida de las vías propioespinales ascendentes largas, que son responsables de la interacción sinérgica entre las GPC de la extremidad anterior y posterior 1,9,32, lo que finalmente conduce a la disociación del ritmo de las extremidades anteriores y posteriores.
Las características de las marchas escalonadas pueden ilustrar la organización modular de las redes locomotoras 1,34. Aunque los patrones de paso no son un proxy directo de las estrategias de marcha adoptadas en este caso23, todavía se pueden extraer algunas observaciones importantes. Se observaron alteraciones importantes en los patrones de paso de ratones con LME (Figura 6). Los animales heridos comenzaron a adoptar oscilaciones laterales (marchas parecidas a pasos), y también hubo una disminución en las oscilaciones diagonales. Estas adaptaciones parecen estar asociadas con un intento de coordinar las extremidades anteriores y posteriores, demostrando nuevamente la disociación entre las vías espinales por debajo y por encima de la lesión, que no se recupera 1,9,32.
La recuperación limitada después de LME también se verificó por una disminución del vigor muscular en las extremidades posteriores, medida por la presión promedio (Figura 7). En consecuencia, las extremidades anteriores se ven obligadas a soportar más peso corporal, lo que aumenta la presión. Si bien muchos parámetros relacionados con la dinámica muscular no se analizaron aquí (es decir, la coordinación muscular flexora y extensora 7,21), esta medición cuantitativa puede proporcionar una lectura directa de la cantidad de soporte de la extremidad.
Este análisis de MW también se puede combinar con la prueba BMS estándar, que mide la rotación de las extremidades, la colocación de las patas, la posición de la cola y los errores de paso. En general, los ratones con LME alcanzan una puntuación máxima de 4-5, con una subpuntuación máxima de 3, lo que significa que pueden realizar pasos ocasionales o frecuentes, pero en su mayoría giran en el despegue de la pata y / o toma de contacto14 (Figura suplementaria 2). Queda claro por qué los valores de AEP para las patas traseras se alteraron significativamente en el grupo SCI, ya que el posicionamiento no paralelo de las extremidades durante la fase de oscilación puede afectar las coordenadas de la pata. Además, en el BMS, el tronco generalmente se clasifica como severo debido a la presencia de casos o eventos que impiden pisar, como el trasero hacia abajo y el salto14. Aunque no fue posible cuantificar el comportamiento de tope hacia abajo o los casos que impidieron el paso, se detectó un paso restringido de la pata trasera en el MW, con mayor duración de oscilación (Figura 5F), aumento de tres oscilaciones de piernas (Figura 6E) y menor presión (Figura 7B-D). Además, se observó un aumento significativo en las oscilaciones delanteras y traseras (Figura 6D). Podría haber dos explicaciones complementarias para esta manifestación conductual. Primero, se midió la marcha similar a un salto, que ya se pudo observar en la prueba BMS. Sin embargo, este comportamiento también podría estar relacionado con la falta de un paso plantar correcto en ambas extremidades posteriores, lo que resulta en el arrastre del pie o la colocación dorsal. En general, estas observaciones apoyan la afirmación de que la estabilidad del tronco está severamente dañada después de la LME. Finalmente, uno de los requisitos para obtener una puntuación superior a 5 en la prueba BMS es la coordinación14, y para ello, los evaluadores deben observar al menos tres pases accesibles durante la prueba. De ellos, dos de los tres o más pases accesibles deben clasificarse como coordinados (es decir, extremidades anteriores y posteriores alternas). A partir de los datos de MW, se pueden extraer mediciones objetivas, el índice de rectitud de postura y la agrupación de huellas, que cuantifican directamente la coordinación independientemente de la velocidad del animal o del paso accesible (Figura 4). Además, la alternancia entre extremidades se puede cuantificar objetivamente midiendo las estrategias de paso (Figura 6). Estos parámetros ilustran claramente que los ratones con LME consistentemente no pueden caminar en línea recta y extraviar sus extremidades posteriores.
Si bien la caja de herramientas MW es una estrategia útil para estudiar los defectos locomotores después de la LME, se deben considerar algunas de sus limitaciones. En primer lugar, es fundamental mantener la coherencia con los parámetros de adquisición (es decir, posición de la cámara, enfoque, intensidad de la luz) para que se mantengan las características de la imagen entre los puntos de tiempo. En segundo lugar, se observó que la repetición conducía a la habituación, lo que, a su vez, conducía a una disminución de la velocidad. Esto también contribuyó a aumentar los comportamientos de crianza / aseo y se detiene a mitad de carrera. Para los animales heridos, también hubo una tendencia a apoyarse en las paredes de la pasarela y un mayor número de paradas a mitad de carrera. Como estos comportamientos no son parte de la evaluación locomotora, no deben ser considerados. Preferentemente, los investigadores deben elegir videos en los que los animales caminen continuamente con la cabeza apuntando recta. Para contrarrestar la influencia de estos comportamientos en los resultados de este estudio, los ratones se registraron continuamente durante al menos cuatro o cinco carreras y se les permitió correr en cualquier dirección a lo largo de la pasarela. Después, se seleccionaron las tres mejores carreras registradas y se ajustaron en la misma dirección en ImageJ/FIJI24 (rotación de 180°). Por lo tanto, cada animal fue representado por una media de tres carreras agrupadas por punto de tiempo. Un mayor número de animales por condición también podría disminuir la variabilidad esperada. Además, debe tenerse en cuenta que esta prueba locomotora solo se recomienda después de lograr el paso plantar, ya que el sistema de seguimiento fue diseñado para una evaluación locomotora ajustada. En este estudio, se observó que antes de 15 dpi, la prueba de MW no era ventajosa para la evaluación locomotora debido al aumento de las resistencias del pie y la colocación plantar incorrecta, lo que podría afectar el seguimiento (datos no mostrados). Por último, algunos parámetros (como el clustering de huellas) son muy sensibles a las extrapolaciones realizadas por el modelo de regresión generado. Por lo tanto, el código se ajustó en consecuencia (consulte la documentación en el script en el enlace GitHub).
En general, se demostró que el MW podría discriminar fuertemente a los animales con LME de los controles con lesiones simuladas, y el MW también podría asociarse con pruebas establecidas como un método valioso para estudiar los defectos locomotores después de la LME. Además, se demostró que los resultados cuantitativos podrían generarse fácilmente a partir del conjunto de datos MW utilizando los scripts de Python suministrados. Estas herramientas proporcionan una tubería experimental eficiente para generar un conjunto rico y diverso de salidas cuantitativas y gráficas que complementan los archivos de salida originales de MW y se pueden cambiar para cumplir con los objetivos del investigador en términos del tipo de análisis y representación gráfica.
Esta caja de herramientas es un método valioso para estudiar otras enfermedades motoras o disfunciones motoras, no solo las relacionadas con la lesión de la médula espinal. Skarlatou et al.10 ya demostraron que una mutación específica en Afadin, una importante proteína del andamio durante el desarrollo, causaba un fenotipo aberrante en la médula espinal al generar dos canales centrales. Este defecto resultó en la pérdida de la alternancia de la extremidad derecha-izquierda y una mayor prevalencia de sincronización de las extremidades, típica de una marcha de salto. Stauch et al.10 también ilustraron que este tipo de sistema puede adaptarse según las necesidades del usuario. En este caso, se aplicó para estudiar déficits de comportamiento específicos en un modelo de enfermedad de Parkinson de rata. Así, esta caja de herramientas tiene una amplia gama de aplicaciones en diferentes modelos en los que se esperan perturbaciones motoras y se pueden combinar con protocolos de comportamiento ya establecidos en el campo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Acknowledgments
Los autores agradecen a Laura Tucker y Natasa Loncarevic por sus comentarios sobre el manuscrito y el apoyo brindado por el Centro de Roedores del Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes. Los autores quieren agradecer el apoyo financiero de Prémios Santa Casa Neurociências - Premio Melo e Castro para la Investigación de Lesiones de la Médula Espinal (MC-36/2020) a L.S. y C.S.M. Este trabajo fue apoyado por la Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) (PTDC/BIA-COM/0151/2020), iNOVA4Health (UIDB/04462/2020 y UIDP/04462/2020), y LS4FUTURE (LA/P/0087/2020) a C.S.M. L.S. fue apoyado por un contrato de Investigador Principal Individual de CEEC (2021.02253.CEECIND). A.F.I. fue apoyado por una beca doctoral de FCT (2020.08168.BD). A.M.M. fue apoyado por una beca doctoral de FCT (PD/BD/128445/2017). I.M. fue apoyado por una beca postdoctoral de FCT (SFRH / BPD / 118051 / 2016). D.N.S. fue apoyado por una beca doctoral de FCT (SFRH / BD / 138636 / 2018).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 45º Mirror | |||
| 2 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 16 cm height, 1 on each side | Misumi | ||
| 2 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 23 cm, @ 45° , 1 on each side | Misumi | ||
| 1 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 83 cm long | Misumi | ||
| 87 x 23 cm mirror | General glass supplier | ||
| black cardboard filler | General stationery supplier | We used 2, one with 69 x 6 cm and another with 69 x 3cm to limit the reflection on the mirror | |
| Background backlight | |||
| 109 x 23 cm plexiglass (0.9525 cm thick) | General hardware supplier | ||
| 2 lateral aluminum extrusion (4 x 4 cm), 20 cm long, 1 on each side | Misumi | ||
| multicolor LED strip | General hardware supplier | ||
| white opaque paper to cover the plexyglass | General stationery supplier | ||
| fTIR Support base and posts | |||
| 2 aluminum extrusion (4 x 4 cm), 100 cm height | Misumi | ||
| 60 x 30 cm metric breadboard | Edmund Optics | #54-641 | |
| M6 12 mm screws | Edmund Optics | ||
| M6 hex nuts and wahers | Edmund Optics | ||
| fTIR Walkway | |||
| 109 x 8.5 cm plexyglass (1.2 cm thick) | General hardware supplier | 109 x 8.5 cm plexyglass (1.2 cm thick) | |
| 109 cm long Base-U-channel aluminum with 1.6 cm height x 1.9 cm depth thick folds (to hold the plexyglass) | General hardware supplier | ||
| 2 lateral aluminum extrusion (4 x 4 cm) 20 cm length, 1 on each side | Misumi | ||
| black cardboard filler | General stationery supplier | we used 2 fillers on each side to cover the limits of the plexyglass, avoiding bright edges | |
| M6 12 mm screws | Edmund Optics | ||
| High speed camera (on a tripod) | |||
| Blackfly S USB3 | FLIR | #BFS-U3-32S4M-C | This is a reccomendation. The requirement is to record at least 100 frames per second |
| Infinite Horizon Impactor | |||
| Infinite Horizon Impactor | Precision Systems and Instrumentation, LLC. | #0400 | |
| Lens | |||
| Nikon AF Zoom-Nikkor 24-85mm | Nikon | #1929 | This lens is reccomended, however other lens can be used. Make sure it contains a large aperture (i.e., smaller F-stop values), to capture fTIR signals |
| Software | |||
| MATLAB R2022b | MathWorks | ||
| Python 3.9.13 | Python Software Foundation | ||
| Anaconda Navigator 2.1.4 | Anaconda, Inc. | ||
| Spyder 5.1.5 | Spyder Project Contributors | ||
| Walkway wall | |||
| 2 large rectagular acrilics with 100 x 15 cm | Any bricolage convenience store | ||
| 2 Trapezian acrilic laterals with 6-10 length x 15 cm height | Any bricolage convenience store | ||
| GitHub Materials | |||
| Folder name | URL | ||
| Boxplots | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Boxplots | Script to create Boxplots | |
| Docs | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Docs | Additional documents | |
| Heatmap | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Heatmaps | Script to create heatmap | |
| Matlat script | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Matlab%20Script | MouseWalker matlab script | |
| PCA | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/PCA%20plots | Script to perform Principal Component Analysis | |
| Raw data Plots | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Rawdata%20Plots | Script to create Raw data plots | |
| Residual Analysis | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Residual_Analysis | Code to compute residuals from Raw data |
References
- Frigon, A. The neural control of interlimb coordination during mammalian locomotion. Journal of Neurophysiology. 117 (6), 2224-2241 (2017).
- Grillner, S. Biological pattern generation: The cellular and computational logic of networks in motion. Neuron. 52 (5), 751-766 (2006).
- Dominici, N., et al. locomotor primitives in newborn babies and their development. Science. 334 (6058), 997-999 (2011).
- Courtine, G., et al. Kinematic and EMG determinants in quadrupedal locomotion of a non-human primate (Rhesus). Journal of Neurophysiology. 93 (6), 3127-3145 (2005).
- Clarac, F., Cattaert, D., le Ray, D. Central control components of a 'simple' stretch reflex. Trends Neuroscience. 23 (5), 199-208 (2000).
- Squair, J. W., Gautier, M., Sofroniew, M. V., Courtine, G., Anderson, M. A.
- Wenger, N., et al. Spatiotemporal neuromodulation therapies engaging muscle synergies improve motor control after spinal cord injury. Nature Medicine. 22 (2), 138-145 (2016).
- Grillner, S. The spinal locomotor CPG: A target after spinal cord injury. Progress in Brain Research. 137, 97-108 (2002).
- Boulain, M., et al. Synergistic interaction between sensory inputs and propriospinal signalling underlying quadrupedal locomotion. Journal of Physiology. 599 (19), 4477-4496 (2021).
- Skarlatou, S., et al. Afadin signaling at the spinal neuroepithelium regulates central canal formation and gait selection. Cell Reports. 31 (10), 107741 (2020).
- Viala, D., Vidal, C. Evidence for distinct spinal locomotion generators supplying respectively fore-and hindlimbs in the rabbit. Brain Research. 155 (1), 182-186 (1978).
- Silver, J., Miller, J. H.
- Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. Journal of Neurotrauma. 12 (1), 1-21 (1995).
- Basso, D. M., et al. Basso mouse scale for locomotion detects differences in recovery after spinal cord injury in five common mouse strains. Journal of Neurotrauma. 23 (5), 635-659 (2006).
- Jones, B. J., Roberts, D. J. The quantitative measurement of motor inco-ordination in naive mice using an accelerating rotarod. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 20 (4), 302-304 (1968).
- Metz, G. A., Whishaw, I. Q. The ladder rung walking task: A scoring system and its practical application. Journal of Visualized Experiments. (28), e1204 (2009).
- Metz, G. A., Whishaw, I. Q. Cortical and subcortical lesions impair skilled walking in the ladder rung walking test: A new task to evaluate fore-and hindlimb stepping, placing, and coordination. Journal of Neuroscience Methods. 115 (2), 169-179 (2002).
- Wallace, J. E., Krauter, E. E., Campbell, B. A. Motor and reflexive behavior in the aging rat. Journal of Gerontology. 35 (3), 364-370 (1980).
- Carter, R. J., et al. Characterization of progressive motor deficits in mice transgenic for the human Huntington's disease mutation. The Journal of Neuroscience. 19 (8), 3248-3257 (1999).
- Leblond, H., L'espérance, M., Orsal, D., Rossignol, S. Behavioral/systems/cognitive treadmill locomotion in the intact and spinal mouse. The Journal of Neuroscience. 23 (36), 11411-11419 (2003).
- Courtine, G., et al. Recovery of supraspinal control of stepping via indirect propriospinal relay connections after spinal cord injury. Nature Medicine. 14 (1), 69-74 (2008).
- Hamers, F. P. T., Koopmans, G. C., Joosten, E. A. J. CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 23 (3-4), 537-548 (2006).
- Mendes, C. S., et al. Quantification of gait parameters in freely walking rodents. BMC Biology. 13 (1), 50 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Stauch, K. L., et al. Applying the ratwalker system for gait analysis in a genetic rat model of Parkinson's disease. Journal of Visualized Experiments. (167), e62002 (2021).
- Mendes, C. S., Rajendren, S. V., Bartos, I., Márka, S., Mann, R. S. Kinematic responses to changes in walking orientation and gravitational load in Drosophila melanogaster. PLoS One. 9 (10), e109204 (2014).
- Cabrita, A., et al. Motor dysfunction in Drosophila melanogaster as a biomarker for developmental neurotoxicity. iScience. 25 (7), 104541 (2022).
- Bishop, C. M. Pattern Recognition and Machine Learning. , Springer. Delhi, India. (2006).
- vander Maaten, L., Postma, E., vanden Herik, J. Dimensionality reduction: A comparative review. , Tilburg University. The Netherlands.. http://www.uvt.nl/ticc (2009).
- Courtine, G., et al. Performance of locomotion and foot grasping following a unilateral thoracic corticospinal tract lesion in monkeys (Macaca mulatta). Brain. 128 (10), 2338-2358 (2005).
- Drew, T., Jiang, W., Kably, B., Lavoie, S. Role of the motor cortex in the control of visually triggered gait modifications. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 74 (4), 426-442 (1996).
- Cheng, H., et al. Gait analysis of adult paraplegic rats after spinal cord repair. Experimental Neurology. 148 (2), 544-557 (1997).
- Thibaudier, Y., et al. Interlimb coordination during tied-belt and transverse split-belt locomotion before and after an incomplete spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 34 (9), 1751-1765 (2017).
- Bellardita, C., Kiehn, O. Phenotypic characterization of speed-associated gait changes in mice reveals modular organization of locomotor networks. Current Biology. 25 (11), 1426-1436 (2015).
- Machado, A. S., Marques, H. G., Duarte, D. F., Darmohray, D. M., Carey, M. R. Shared and specific signatures of locomotor ataxia in mutant mice. eLife. 9, 55356 (2020).
- Takeoka, A., Vollenweider, I., Courtine, G., Arber, S. Muscle spindle feedback directs locomotor recovery and circuit reorganization after spinal cord injury. Cell. 159 (7), 1626-1639 (2014).
