Summary
마우스워커(MW) 툴박스를 사용하여 자유롭게 걷는 쥐의 운동 패턴을 정량적으로 설명하는 실험 파이프라인이 제공되며, 초기 비디오 녹화 및 추적에서 정량화 후 분석에 이르기까지 다양합니다. 생쥐의 척수 타박상 손상 모델은 MW 시스템의 유용성을 입증하기 위해 사용됩니다.
Abstract
걷기 및 달리기와 같은 복잡하고 고도로 조정 된 운동 프로그램의 실행은 척추 및 척추 상 회로의 리드미컬 한 활성화에 달려 있습니다. 흉부 척수 손상 후 업스트림 회로와의 통신이 손상됩니다. 이는 결국 조정 상실로 이어지고 회복 가능성이 제한됩니다. 따라서 약물이나 치료법 투여 후 회복 정도를 더 잘 평가하기 위해서는 척수 손상 동물 모델에서 보행, 사지 협응 및 기타 운동 행동의 미세한 측면을 정량화할 수 있는 새롭고 보다 상세하며 정확한 도구가 필요합니다. 설치류의 자유 보행 행동을 정량적으로 평가하기 위해 수년에 걸쳐 여러 분석법이 개발되었습니다. 그러나 일반적으로 보행 전략, 발자국 패턴 및 조정과 관련된 직접적인 측정이 부족합니다. 이러한 단점을 해결하기 위해 fTIR(Frustrated Total Internal Reflection) 통로와 추적 및 정량화 소프트웨어를 결합한 업데이트된 버전의 MouseWalker가 제공됩니다. 이 오픈 소스 시스템은 여러 그래픽 출력과 운동학적 매개변수를 추출하도록 조정되었으며 정량화 후 도구 세트는 제공된 출력 데이터를 분석할 수 있습니다. 이 원고는 또한 이미 확립된 행동 테스트와 결합된 이 방법이 척수 손상 후 운동 결손을 정량적으로 설명하는 방법을 보여줍니다.
Introduction
네 팔다리의 효과적인 조정은 네 발 달린 동물에만 국한된 것이 아닙니다. 인간의 앞다리-뒷다리 협응력은 수영 및 걷는 동안 속도 변경과 같은 여러 작업을 수행하는 데 여전히 중요합니다1. 고유 수용성 피드백 회로(proprioceptive feedback circuit)5 뿐만 아니라, 다양한 사지 운동학(limb kinematic)2 및운동 프로그램(motor program)1,3,4은 인간과 다른 포유류 사이에서 보존되며, 척수 손상(SCI)6,7,8 과 같은 운동 장애에 대한 치료 옵션을 분석할 때 고려되어야 한다.
걷기 위해서는 앞다리와 뒷다리의 여러 척추 연결이 적절하게 연결되고 리드미컬하게 활성화되어야 하며, 이를 위해서는 뇌의 입력과 체성 감각 시스템의 피드백이 필요합니다 2,9,10. 이러한 연결은 각각 앞다리와 뒷다리의 경추 및 요추 수준에 위치한 중앙 패턴 생성기(CPG)에서 절정에 이릅니다1,9,10. 종종 SCI 후, 신경 연결성의 붕괴와 억제성 신경교 흉터(12)의 형성은 운동 기능의 회복을 제한하며, 결과는 손상 중증도에 따라 전체 마비에서 사지 그룹의 제한된 기능에 이르기까지 다양하다. SCI 후 운동 기능을 정확하게 정량화하는 도구는 회복을 모니터링하고 치료 또는 기타 임상 개입의 효과를 평가하는 데 중요합니다6.
SCI의 마우스 타박상 모델에 대한 표준 메트릭 분석은 Basso 마우스 척도(BMS)13,14로, 오픈 필드 경기장에서 몸통 안정성, 꼬리 위치, 발바닥 스테핑 및 앞다리-뒷다리 협응을 고려하는 비모수 점수입니다. BMS는 대부분의 경우 매우 신뢰할 수 있지만 자연 변동성을 설명하고 편향을 줄이기 위해 동물 움직임의 모든 각도를 관찰하려면 최소 두 명의 숙련된 평가자가 필요합니다.
SCI 후 운동 성능을 정량적으로 평가하기 위한 다른 분석법도 개발되었습니다. 이들은 회전 실린더(15)에 소요되는 시간을 측정하는 로타로드 테스트를 포함한다; 놓친 난간 수와 긍정적 인 사다리 잡기16,17의 수를 측정하는 수평 사다리; 그리고 동물이 좁은 빔을 건널 때 걸리는 시간과 실패 횟수를 측정하는 빔 워킹 테스트(18). 운동 결손의 조합을 반영함에도 불구하고 이러한 테스트 중 어느 것도 앞다리-뒷다리 협응에 대한 직접적인 운동 정보를 생성하지 않습니다.
보행 행동을 구체적이고 철저하게 분석하기 위해 보행 주기와 보행 전략을 재구성하기 위한 다른 분석법이 개발되었습니다. 한 가지 예는 동물의 잉크로 칠한 발이 흰 종이19 위에 패턴을 그리는 발자국 테스트입니다. 실행은 간단하지만 보폭과 같은 운동학적 매개변수를 추출하는 것은 번거롭고 부정확합니다. 또한, 스텝 사이클의 지속 시간 또는 레그 타임 조정과 같은 동적 매개변수의 부족은 적용을 제한합니다. 실제로 이러한 동적 매개변수는 투명한 표면을 통과하는 설치류의 프레임별 비디오를 분석해야만 얻을 수 있습니다. SCI 연구를 위해 연구자들은 걸음 주기를 재구성하고 각 다리 관절의 각도 변화를 측정하는 것을 포함하여 트레드밀을 사용하여 측면 보기에서 보행 행동을 분석했습니다 4,20,21. 이 접근법은 매우 유익할 수 있지만6, 특정 팔다리 세트에 초점을 맞추고 조정과 같은 추가적인 보행 기능이 부족하다.
이러한 격차를 메우기 위해 Hamers와 동료들은 좌절 된 내부 반사 (fTIR) 22를 사용하는 광학 터치 센서를 기반으로 정량적 테스트를 개발했습니다. 이 방법에서 빛은 내부 반사를 통해 유리를 통해 전파되고 발을 누르면 산란되어 마지막으로 고속 카메라로 캡처됩니다. 보다 최근에, 마우스워커(MouseWalker)라고 불리는 이 방법의 오픈 소스 버전이 이용가능하게 되었고, 이 접근법은 fTIR 통로를 추적 및 정량화 소프트웨어 패키지(23)와 결합한다. 이 방법을 사용하여 사용자는 걸음 수, 공간 및 보행 패턴, 발자국 위치 지정, 앞다리-뒷다리 협응을 포함한 많은 정량적 매개변수뿐만 아니라 발자국 패턴(잉크 발 분석6 모방) 또는 신체 축에 대한 자세 단계와 같은 시각적 출력을 추출할 수 있습니다. 중요한 것은 오픈 소스 특성으로 인해 MATLAB 스크립트 패키지를 업데이트하여 새로운 파라미터를 추출할 수 있다는 것입니다.
여기에서 이전에 게시된 MouseWalker23 시스템 어셈블리가 업데이트됩니다. 최상의 비디오 품질, 추적 조건 및 매개변수 획득을 달성하는 데 필요한 모든 단계와 함께 설정 방법에 대한 설명이 제공됩니다. MouseWalker(MW) 출력 데이터 세트의 분석을 향상시키기 위해 추가 사후 정량화 도구도 공유됩니다. 마지막으로, 이 도구의 유용성은 척수 손상(SCI) 맥락에서 일반적인 운동 성능, 특히 보행 주기 및 앞다리-뒷다리 협응에 대한 정량화 가능한 값을 얻음으로써 입증됩니다.
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Protocol
모든 취급, 수술 및 수술 후 관리 절차는 라이선스 0421/000/000/2022에 따라 유럽 공동체 지침(지침 2010/63/EU) 및 동물 관리에 관한 포르투갈 법률(DL 113/2013)에 따라 Instituto de Medicina 분자 내부 위원회(ORBEA) 및 포르투갈 동물 윤리 위원회(DGAV)의 승인을 받았습니다. 9주령의 암컷 C57Bl/6J 마우스를 본 연구에 사용하였다. 동물의 수를 최소화하고 연구에 사용된 동물의 고통을 줄이기 위해 모든 노력을 기울였습니다. MATLAB 스크립트와 MW 소프트웨어의 독립 실행형 버전은 오픈 소스이며 GitHub에서 사용할 수 있습니다.
리포지토리(https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker). MW 소프트웨어는 MATLAB R2012b에서 개발되었지만 MATLAB R2022b에서 실행되도록 조정되었습니다. 그림 1 은 MW의 분석 워크플로를 보여줍니다.
1. 마우스워커(MW) 장치 설정
- 앞서 설명한 대로 MW 장치를 조립합니다23, 또는 실험 설계의 특정 요구에 적응합니다(설정에 대한 자세한 내용은 재료 표 및 보충 그림 1 참조).
알림: 걷는 경기장은 쥐와 같은 더 큰 동물을 수용할 수 있도록 더 넓게 만들 수 있습니다. -
동물이 걷는 플렉시 유리가 깨끗하고 흠집이 없는지 확인하십시오. 부드러운 청소용 천을 사용하고 플렉시 유리를 손상시킬 수 있는 고농도의 암모니아 또는 에탄올과 같은 유기 용제의 사용을 최소화하십시오(3% 과산화수소, 7% 에탄올 또는 플렉시 유리에 적합하고 적절한 소독제 권장). 필요한 경우 플렉시 유리를 교체하십시오.
- fTIR 신호를 기록하는 데 도움이 되므로 많은 양의 빛을 캡처하기 위해 빠른 렌즈와 큰 조리개(즉, 더 작은 F-스톱 값)로 고속 카메라를 설정합니다( 재료 표 참조).
참고: 렌즈는 특히 이미지 가장자리에서 광학 왜곡을 발생시키지 않아야 합니다. 광학 왜곡은 알려진 패턴(예: 줄무늬 또는 사각형)을 기록한 다음 ImageJ/FIJI24 에서 블록의 크기를 측정하여 테스트할 수 있습니다(선 도구를 사용한 다음 분석 > 측정 클릭). 예를 들어 1cm 크기의 정사각형은 이미지 중앙과 가장자리 모두에서 동일한 픽셀 치수를 가져야 합니다. 변형은 5%보다 작아야 합니다. - 배경 조명 상자에서 여러 가지 빛깔의 LED 조명 스트립을 켭니다.
- 통로 라이트 박스에서 백색 LED 라이트 스트립을 켭니다.
알림: 컬러 LED를 사용하여 풋프린트/본체/배경을 쉽게 구분할 수도 있습니다(25 ). - 실내 조명이 꺼진 상태에서 배경 조명 상자와 통로의 조명 강도를 확인합니다. 필요한 경우 전위차계 또는 반투명 플라스틱을 사용하여 강도를 조정하십시오. 픽셀 강도가 동물의 몸< 배경 < 발자국의 순서로 증가하도록 최적화해야 합니다.
- 동물의 몸/배경/발자국의 픽셀 강도를 확인하려면 ImageJ/FIJI24에서 이미지 시퀀스를 열고 분석 > 측정을 클릭합니다. 발자국 신호는 발자국의 경계(즉, 발가락 및 발바닥)가 정의되는 것을 방지하기 때문에 과포화되어서는 안 됩니다(보충 그림 2).
- 비디오 녹화 소프트웨어에서 보도의 이미지 대비를 조정합니다. 대비는 LED 스트립의 조명을 어둡게 하거나 높이거나 카메라 렌즈 조리개를 조정하는 두 가지 방법으로 조정할 수 있습니다.
- 렌즈를 동일한 높이와 45° 반사 거울의 중앙에 있고 통로에 수직(90°)으로 올바르게 배치합니다. 이렇게 하면 좌우 통로를 따라 일정하게 비례하는 이미지가 생성됩니다.
참고: 여러 녹화 세션에서 카메라 위치(거리, 높이 및 방향)를 변경하지 마십시오. 필요한 경우 삼각대를 놓을 바닥을 표시하십시오. 이렇게 하면 이미지 기능이 유지됩니다. - 플렉시 유리 표면에 렌즈의 초점을 맞춥니다. 이것은 플렉시 유리 표면에 닿는 손상되지 않는 물체를 사용하여 테스트 할 수 있습니다.
알림: F-스톱 렌즈 값이 낮을수록 피사계 심도가 작아져 초점을 맞추기가 더 어려워집니다. - 녹화된 비디오의 픽셀 강도가 변경될 수 있으므로 분석 중에 모든 설정이 변경되지 않은 상태로 유지되는지 확인하십시오.
2. 비디오 획득
- 테스트하기 전에 마우스가 방과 장치에 익숙한지 확인하십시오. 습관화를 위해 최소 1 일을 저장하십시오 (0 일). 과도한 훈련을 피하려면 다른 행동 테스트와 다른 날(가급적이면 다음날)에 MW 테스트를 수행하십시오.
- 비디오 녹화 소프트웨어에서 통로가 50cm 이상 보이는지 확인하십시오.
- 녹화 설정을 조정하여 보도 영역을 자릅니다. 이렇게 하면 비디오 크기가 줄어들고 비디오 획득이 최적화됩니다.
- 각 세션 전에 일반 통치자의 사진이나 짧은 비디오를 찍습니다. 센티미터당 픽셀 수는 나중에 "설정 창"에서 비디오를 보정하는 데 사용됩니다.
- 비디오 획득을 시작하고 부상을 피하기 위해 꼬리 바닥을 잡고 통로 가장자리에 동물을 놓습니다. 동물들이 플랫폼의 맨 끝으로 앞으로 나아갈 수 있도록 합니다. 부드러운 보행 전환을 위해 최소 100프레임/초로 비디오 녹화를 수행합니다.
- 필요한 경우 산책로 벽을 부드럽게 두드리거나 손가락을 튕기거나 박수를 쳐서 동물이 움직이도록 동기를 부여하십시오. 그러나 결과에 영향을 줄 수 있으므로 물리적 넛지는 피하십시오.
- 비디오를 TIFF(LZW 압축 사용), JPEG 또는 PNG 형식의 이미지 시퀀스로 직접 저장합니다. 카메라가 Raw MOV 파일로 녹화하는 경우 ImageJ/FIJI24에서 파일을 열고 파일 > > 이미지 시퀀스로 저장을 클릭하여(또는 LosslessCut25와 같은 다른 소프트웨어를 사용하여) 비디오를 이미지 시퀀스로 변환합니다.
알림: 대부분의 동물은 산책로에 들어간 직후 걷기 시작합니다. 따라서 동물을 배치하기 전에 비디오 수집을 시작하는 것이 좋습니다.
3. MW 추적 소프트웨어용 비디오 준비
- 각 개별 마우스의 전체 실행을 충분히 촬영하십시오. 조건당 촬영할 동물의 수와 전체 실행 횟수는 각 실험 설계에 따라 결정되어야 합니다. 완전 달리기는 마우스가 장기간 정지하지 않고 보도의 전체 50cm를 걷는 경우입니다(이 실험에서는 3개의 완전한 달리기가 선택됨).
참고: 이미지 획득 소프트웨어에 따라 비디오를 가장 작은 ROI로 잘라야 할 수도 있습니다. 이렇게 하면 추적 및 출력 생성 속도가 빨라집니다. - ImageJ/FIJI24에서 Image > Stack > Tools > Make a substack을 클릭하여 마우스가 화면에 있는 프레임을 선택합니다. MW에서 추적하려면 머리와 꼬리가 모든 프레임에서 볼 수 있어야 합니다. 그러나 단일 비디오 녹화에서 여러 하위 스택을 만들 수 있으며 나중에 각 실행을 나타냅니다.
- File > Save as > Image sequence(파일로 저장 를 클릭하여 각 하위 스택을 서로 다른 폴더에 별도로 저장합니다. MW 소프트웨어는 나중에 실행 분석을 시작할 때마다 각 디렉토리에 자동으로 하위 폴더를 생성합니다.
4. 추적
- MATLAB을 열고 MW 스크립트가 포함된 폴더를 작업 디렉터리에 추가한 다음 기본 명령줄에서 "MouseWalker.m"을 실행합니다.
참고: MATLAB에서 MW 소프트웨어를 사용하면 MATLAB의 메인 콘솔에서 추적 오류 메시지를 볼 수 있고 원하는 출력 데이터를 선택할 수 있습니다(기본 스크립트 파일 "MouseEvaluate.m"을 열고 출력을 1 또는 0으로 변경: Excel 파일, 발자국 플롯, 자세 추적 및 보행 패턴). - 비디오 폴더를 "입력 디렉토리"로 로드합니다. 출력 폴더를 선택할 수도 있습니다. 그러나 MW 소프트웨어는 "입력 디렉토리" 내에 자동으로 "결과"라는 새 폴더를 생성하므로 이는 요구 사항이 아닙니다.
- "<<", "<", ">>" 및 ">" 화살표를 사용하여 비디오 프레임이 모두 MW 소프트웨어 내에서 올바르게 로드되었는지 확인합니다.
- 모든 교정 및 임계값 매개변수가 있는 "설정 창"으로 이동합니다. 이러한 설정은 배경과 발자국의 픽셀 강도, 신체 및 발자국의 최소 크기 등에 따라 변경될 수 있습니다(예amp보충 그림 2의 le). 미리보기 버튼을 클릭하여 일부 매개변수 변경 효과를 테스트합니다.
- "body + feet + tail", "body only", "feet only", "tail only" 등 다양한 플롯 스타일을 사용하면 임계값 매개변수를 조정한 후 신체 부위를 구별하는 데 도움이 됩니다.
- 오른쪽 패널의 도구를 활용하여 밝기 또는 크기를 측정합니다(각각 "밝기" 및 "눈금자" 버튼 사용). 카메라 거리가 동일하게 유지되는 한 모든 설정을 "기본값"으로 저장할 수 있습니다.
- 임계값 매개변수를 조정한 후 비디오가 자동 추적에 사용할 준비가 되었는지 확인합니다. 첫 번째 프레임으로 이동하고 자동 을 클릭하여 추적을 시작합니다. 이 단계는 실시간으로 수행할 수 있으며 비디오 크기와 컴퓨터 성능에 따라 몇 분 정도 걸립니다.
- 자동 추적이 신체 특징에 잘못 레이블을 지정하는 경우 자동 추적을 취소하고 새 설정을 입력한 다음 프로세스를 다시 시작합니다.
- 추적이 완료된 후 수동 수정이 필요한지 확인하십시오. 수정하려면 중간 패널을 사용하여 오른쪽 앞발(RF), 오른쪽 뒷다리(RH), 왼쪽 앞(LF) 및 왼쪽 뒷다리(LH) 발 발자국, 머리, 코, 몸통(두 부분으로 나뉜) 및 꼬리 위치(네 부분으로 나뉩니다)의 위치를 나타냅니다. Save 버튼을 눌러 변경 사항을 저장합니다.
알림: 모든 버튼과 대부분의 명령에는 키 단축키가 있습니다(자세한 내용은 관련 설명서23 참조). 비디오 스크롤 및 키보드 단축키 실행을 용이하게 하기 위해 프로그래밍 가능한 버튼이 있는 하드웨어 컨트롤러와 Contour ShuttlePro V2와 같은 셔틀 휠을 사용할 수 있습니다. - 평가를 클릭하여 추적된 비디오에서 출력 파일을 생성합니다. 선택한 출력(4.1단계 참조)에 따라 이 단계는 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다.
- 모든 그래픽 출력 데이터 플롯이 "Results" 폴더에 저장되어 있는지 확인합니다. 모든 발 위치가 일관되는지 확인할 수 있는 "자세 추적"과 같은 일부 그래픽 출력을 검사하여 추적의 정확성을 확인합니다.
- 오류가 식별되면 추적을 수동으로 수정하고(가능한 경우, 그렇지 않으면 "결과" 폴더를 제거하고 새 설정으로 자동 추적을 다시 수행) 평가 명령을 다시 클릭합니다.
- MW 소프트웨어에서 생성된 모든 정량적 측정값이 Excel 스프레드시트에 저장되고 "1. Info_Sheet"입니다. 수식 구분에 대한 Excel 옵션이 스크립트와 일치하는지 확인합니다. 소수 구분 기호는 ","여야 하고 1000 단위 구분 기호는 ";"여야 합니다.
- "MouseMultiEvaluate.m" 스크립트를 사용하여 모든 실행의 측정값을 분석을 위해 새 파일로 통합합니다.
- 시작하려면 모든 비디오의 폴더 경로가 포함된 .txt 파일(예: "비디오 파일.txt)을 생성하십시오. 각 줄이 단일 비디오에 해당하는지 확인합니다.
- 그런 다음 명령줄에 "MouseMultiEvaluate('Videofiles.txt')"를 입력합니다. "ResultSummary.xls"라는 Excel 파일이 작업 디렉토리에 생성됩니다(GitHub 리포지토리의 예제 참조).
알림: 그림 2 는 MW 소프트웨어가 녹화된 한 동물의 비디오에서 얻은 그래픽 출력을 나타냅니다.
5. 운동학적 데이터 분석 워크플로우
- 다음 전제조건에 따라 제공된 Python 스크립트를 사용하여 처리할 데이터가 포함된 4.10단계에서 생성된 엑셀 시트를 편집하십시오.
- 첫 번째 열 머리글에서 실험 조건을 지정합니다. 그룹/조건 이름 뒤에 각 줄의 이름을 지정합니다(동일한 그룹의 개인은 동일한 이름을 가져야 함). 첫 번째 그룹은 대조군 또는 기준선이어야 합니다(이는 히트맵 플로팅, 5.6단계에만 필수임).
- 두 번째 열에서 동물 ID를 지정합니다. 이 정보는 플롯 생성에 사용되지 않지만 필수입니다.
- 세 번째 열부터는 해석에 사용할 모터 파라미터를 선택합니다. 첫 번째 줄이 매개변수의 이름인지 확인합니다(이 이름은 나중에 플롯에 표시됨).
- Anaconda Navigator를 열고 Spyder를 실행하여 제공된 Python 스크립트를 엽니다.
참고 : 모든 스크립트는 Python 3.9.13으로 개발되었으며 Anaconda Navigator 2.1.4에서 Spyder 5.2.2로 실행되었으며 Table of Materials 및 GitHub 저장소에서 사용할 수 있습니다 (비디오 예제, Excel 예제 파일 및 FAQ 문서와 같은 추가 자료가 포함되어 있음). Anaconda Navigator 외부에서 스크립트를 실행할 수 있습니다. 그러나 이 그래픽 사용자 인터페이스는 더 사용자 친화적입니다. - "Rawdata_PlotGenerator.py"를 사용하여 원시 데이터 플롯을 생성합니다. 이렇게 하면 각 매개변수를 속도의 함수로 시각화할 수 있습니다.
- Spyder에서 "Rawdata_PlotGenerator.py"를 열고 재생 버튼을 클릭하여 코드를 실행합니다.
- 분석할 Excel 파일을 선택하고 자동 창에서 시트 이름을 선택합니다. 시트 이름이 변경되지 않은 경우 "Sheet1"을 씁니다.
- 원시 데이터 플롯이 플롯 콘솔(오른쪽 상단 패널)에 나타납니다. 플롯을 저장하려면 플롯 콘솔에서 이미지 저장 또는 모든 이미지 저장 버튼을 클릭합니다.
- 스크립트 "Residuals_DataAnalysis"를 사용하여 데이터 분석을 위한 잔차를 계산합니다. 이 스크립트는 모든 모터 매개변수에 대한 잔차 계산이 포함된 CSV 파일을 생성합니다.
참고: MW에 의해 추출된 측정된 보행 매개변수의 대부분은 속도(예: 스윙 속도, 보폭, 스탠스 지속 시간, 스탠스 직진도 및 보행 지수)에 따라 다릅니다. 따라서 기준 실험에 대한 각 개별 매개변수 대 속도에 대해 가장 적합한 회귀 모델을 수행한 다음 이 회귀 모델과 관련하여 각 실험 그룹의 잔차 값을 결정하는 것이 좋습니다. 이어서, 데이터는 잔차 정규화 라인(26)으로부터의 차이로서 표현된다.- Spyder에서 "Residuals_DataAnalysis.py"를 열고 재생 버튼을 클릭하여 코드를 실행합니다.
- 분석할 Excel 파일을 선택하고 자동 창에서 시트 이름을 선택합니다. 시트 이름이 변경되지 않은 경우 "Sheet1"을 씁니다.
- CSV 파일을 데이터와 동일한 폴더에 저장합니다. 컨트롤(또는 기준)은 Excel 파일의 첫 번째 그룹이어야 합니다.
- "PCA_PlotGenerator.py" 스크립트를 사용하여 주성분 분석(PCA)을 수행합니다.
참고: 이 비지도 차원 축소 방법은 데이터의 보다 간결한 표현(27,28,29)을 생성하는 데 사용됩니다(그림 3A, B). PCA 스크립트에는 다음 단계가 포함됩니다. 데이터는 먼저 센터링 및 스케일링을 통해 사전 처리되며, 그 후 PCA 알고리즘은 공분산 행렬을 계산하여 변수 간의 상관 관계를 결정하고 공분산 행렬의 고유 벡터와 고유값을 계산하여 주성분을 식별합니다. 처음 두 개 또는 세 개의 주성분은 각각 2D 또는 3D 플롯으로 데이터를 표현하기 위해 선택됩니다. 그림의 각 점은 동물에 해당하며 서로 다른 추상 변수를 나타냅니다. 색상으로 구분된 점은 특정 그룹을 구별하는 데 사용됩니다. 따라서 점들의 클러스터는 해당 개인이 공유하는 유사한 보행 패턴을 반영합니다.- Spyder에서 "PCA_PlotGenerator.py"를 열고 재생 버튼을 클릭하여 코드를 실행합니다.
- 분석할 Excel 파일을 선택하고 자동 창에서 시트 이름을 선택합니다. 시트 이름이 변경되지 않은 경우 "Sheet1"을 씁니다.
- PCA 2D 및 3D 플롯이 플롯 콘솔(오른쪽 위 패널)에 나타나는지 확인합니다. 각 색상은 서로 다른 그룹을 나타내며 범례는 플롯 옆에 나타납니다. 플롯을 저장하려면 플롯 콘솔에서 이미지 저장을 클릭합니다.
- "Heatmap_PlotGenerator.py"를 사용하여 히트맵을 생성합니다. 히트맵 생성기가 각 모터 매개변수27 에 대해 기준선 그룹(또는 통제 그룹)과 다른 그룹 간의 통계적 차이를 보여주는 표를 생성하는지 확인합니다(그림 4). 각 열은 하나의 그룹을 나타내며 각 선은 특정 모터 매개변수와 관련이 있습니다.
참고: 통계 분석은 일원 분산 분석에 이어 Tukey의 사후 검정(정규 분포의 경우) 또는 Kruskal-Wallis 분산 분석에 이어 Dunn의 사후 검정(비정규 분포의 경우)으로 수행되었습니다. 이상치는 분석에서 제외되었습니다. P-값은 색상 코드로 표시되며, 빨간색과 파란색 음영은 각각 대조군(또는 기준선)에 대한 증가 또는 감소를 나타냅니다. 색조는 통계적 유의성을 나타내며 어두운 색은 높은 유의성을 나타내고 밝은 색은 낮은 유의성을 나타냅니다. P < 0.001에 해당합니다. **는 P < 0.01에 해당합니다. *는 P < 0.05에 해당합니다. 흰색은 변동이 없음을 나타냅니다.- Spyder에서 "Heatmap_PlotGenerator.py"를 열고 재생 버튼을 클릭하여 코드를 실행합니다.
- 분석할 Excel 파일을 선택하고 자동 창에서 시트 이름을 선택합니다. 시트 이름이 변경되지 않은 경우 "Sheet1"을 씁니다.
- 두 번째 자동 창에서 데이터 유형(원시 데이터 또는 잔차 데이터)을 선택합니다. 옵션을 선택하지 않으면 잔차 데이터가 기본값입니다.
- 히트맵이 플롯 콘솔(오른쪽 상단 패널)에 나타납니다. 플롯을 저장하려면 플롯 콘솔에서 이미지 저장을 클릭합니다.
참고: 컨트롤(또는 기준선)이 Excel 파일의 첫 번째 그룹이어야 합니다.
- "Boxplots_PlotGenerator.py"를 사용하여 상자 그림을 생성합니다. 이 도구를 사용하면 각 그룹의 모든 모터 매개변수에 대한 값의 분포를 나타내는 상자 그림을 생성할 수 있습니다(그림 5, 그림 6 및 그림 7).
참고: 각 상자에는 중앙값이 중간 선으로 포함되며 상자의 아래쪽과 위쪽 가장자리는 각각 25% 및 75% 사분위수를 나타냅니다. 수염은 이상값을 제외한 전체 데이터 세트의 범위를 나타냅니다. 이상치는 각각 25% 및 75% 사분위수보다 낮거나 높은 사분위수 범위의 1.5배인 값으로 정의됩니다.- Spyder에서 "Boxplots_PlotGenerator.py"를 열고 재생 버튼을 클릭하여 코드를 실행합니다.
- 분석할 Excel 파일을 선택하고 자동 창에서 시트 이름을 선택합니다. 시트 이름이 변경되지 않은 경우 "Sheet1"을 씁니다.
- 두 번째 자동 창에서 데이터 유형(원시 데이터 또는 잔차 데이터)을 선택합니다. 옵션을 선택하지 않으면 잔차 데이터가 기본값입니다.
- 상자 그림이 플롯 콘솔(오른쪽 위 패널)에 나타납니다. 플롯을 저장하려면 플롯 콘솔에서 이미지 저장 또는 모든 이미지 저장 버튼을 클릭합니다.
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Representative Results
표준 BMS 시스템은 SCI14 이후의 총 모터 결함을 설명합니다. 주관적인 특성으로 인해 일반적으로 BMS와 함께 다른 정량적 분석을 수행하여 운동에 대한 보다 상세하고 정밀한 평가를 생성합니다. 그러나 이러한 검사는 척추 회로가 기능을 유지하고 불완전한 SCI에 적응하는 방법을 이해하는 데 매우 중요한 단계 주기, 계단 패턴 및 앞다리-뒷다리 협응에 대한 특정 정보를 보여주지 못합니다. 이 섹션에서는 MW 툴박스가 SCI 후 운동 기능 회복을 모니터링하고 보행 행동에 대한 관련 정보를 추가하는 데 어떻게 도움이 되는지 보여줍니다.
연구 샘플은 9주령의 암컷 C57Bl/6J 마우스의 두 그룹으로 나뉩니다: SCI 실험 그룹(n = 11), 동물은 추궁 절제술을 받은 후 T9/T10 수준에서 중등도에서 중증의 타박상 손상을 입었습니다. 및 가짜 손상 대조군(n = 10)에서 동일한 컬럼 수준에서 추궁 절제술만 수행되었습니다(그림 1, 단계 1). SCI 및 가짜 부상당한 동물의 운동 행동을 30일 동안 모니터링했습니다. MW 테스트는 수술 전날(기준선)과 부상 후 15일, 22일 및 30일(dpi)에 수행되었습니다(그림 1, 2단계). 비교를 위해, 마우스는 수술 전에 병렬로 1 dpi, 3 dpi, 7 dpi, 14 dpi, 21 dpi 및 30 dpi에서 BMS 테스트를 받았다 (보충 그림 3). MW로 얻은 모든 비디오를 추적한 후 두 가지 유형의 출력 파일, 즉 각 주행 후 여러 매개변수의 시각적 표현을 보여주는 그래픽 출력과 측정 가능한 모든 모터 매개변수를 요약한 운동학적 출력이 생성되었습니다(그림 1, 3단계 및 4단계).
결과적으로 Python 스크립트 세트( 재료 표 및 GitHub 리포지토리 링크 참조)를 사용하여 원시 데이터 플롯을 얻었습니다(그림 1, 5단계). 대부분의 파라미터가 동물의 속도에 의해 영향을 받기 때문에, 손상 전 기준선 그룹의 회귀 모델을 각 조건에 대해 측정된 잔존 값과 함께 수행하였다(도 1, 단계 6). 대조군(가짜)과 실험군(SCI) 간의 운동학적 프로파일과 유의미한 차이를 확인하기 위해 모든 운동학적 매개변수(총 79개)를 3차 주성분 분석(PCA)하고 데이터 세트(총 33개)를 가장 잘 설명하는 모터 매개변수 모음으로 히트맵을 생성했습니다(그림 1, 단계 7a,b). 마지막으로, SCI 후 영향을 받은 특정 운동 매개변수를 부상 전의 기준선과 비교했습니다(그림 1, 단계 7c).
그림 1: MW의 분석 워크플로우를 개략적으로 표현한 것입니다. (1) 추궁 절제술(가짜 대조군) 또는 추궁 절제술 후 척수 손상(실험군)을 위해 동물을 선택합니다. (2) 그런 다음 동물은 부상 전날과 부상 후 15일, 22일 및 30일에 행동 분석을 받습니다. (3) MW는 (a) 자세 추적, 보행 및 스테핑 패턴과 같은 여러 매개변수의 그래픽 시각화 및 (b) 측정 가능한 모든 모터 매개변수의 운동학적 요약이라는 두 가지 유형의 출력 데이터를 생성합니다. (4) 모든 제어 및 실험 데이터는 MATLAB의 "MouseMultiEvaluate.m" 스크립트를 사용하여 단일 파일로 수집됩니다. (5) Python용 "RawData_PlotGenerator" 스크립트는 측정 가능한 모든 모터 매개변수가 속도에 따라 어떻게 달라지는지에 대한 시각적 표현을 생성합니다. 매개변수가 속도와 상관 관계가 없으면 (7)로 건너뛸 수 있습니다. 그러나 SCI 이후의 대부분의 매개변수는 속도에 크게 의존하므로 Python용 "Residual_DataAnalysis" 스크립트를 사용하여 모델을 생성해야 합니다(6). 각 모터 파라미터에 대한 잔차 값을 생성한 후, 데이터 분석이 수행된다(7): (a) 주성분 분석(PCA)은 "PCA_PlotGenerator" 스크립트로 파라미터의 선택을 사용하여 수행된다; (b) 히트맵은 "Heatmap_PlotGenerator" 스크립트로 생성되어 서로 다른 매개변수에 대한 조건 간의 통계적으로 유의미한 차이를 보여줍니다. c) SCI 이후에 변경되는 여러 개별 매개변수는 "BoxPlot_PlotGenerator" 스크립트로 평가됩니다. 모든 스크립트는 재료 표 및 GitHub 리포지토리 링크에서 사용할 수 있습니다. 스크립트는 빨간색으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
MW에서 수집 된 그래픽 출력 데이터에서 SCI 이후 발자국의 시각적 표시에서 잘 알려진 급격한 변화를 확인할 수있었습니다. MW에 의해 생성된 "디지털 잉크" 분석에서 뒷발의 지지 부족이 감지되었으며(그림 2A), 왼쪽 및 오른쪽 뒷발 모두의 발자국 면적 감소(그림 2B)가 15dpi 이상으로 유지되었습니다(데이터는 표시되지 않음). 또한, 각 스텝 사이클 내에서, MW는 스탠스 단계(즉, 발 터치다운과 리프트 오프 사이의 시간) 및 스윙 단계(즉, 팔다리가 지면에서 떨어져 있는 시간)와 관련된 파라미터를 계산한다. 이와 같이, MW는 시각적 "자세 트레이스"를 생성할 수 있으며, 이는 자세 단계(23) 동안 각 다리 및 발자국 중심에 대한 신체의 중심 및 축의 위치를 고려한다. 각 동물에 대해 얻은 전반적인 자세 추적 은 몇 가지 고유한 특징을 나타냈습니다(그림 2C). 이 데이터는 SCI 후 뒷발이 15dpi 이상에서 터치다운과 리프트오프 모두에서 더 짧은 자세 추적과 더 많은 무작위 발 위치를 가졌음을 보여주었습니다(그림 2C).
그림 2: 추적 비디오에서 MW 소프트웨어가 얻은 대표적인 그래픽 출력 . (A) 여러 시점에서 빨간색(오른쪽 앞), 노란색(왼쪽 앞), 녹색(오른쪽 뒷다리) 및 파란색(왼쪽 뒷다리)과 같은 다른 색상으로 각 발을 보여주는 한 SCI 동물에 대한 "디지털 잉크" 인쇄. (B) 15dpi에서 한 SCI 동물의 왼쪽 앞(LF), 왼쪽 뒷다리(LH), 오른쪽 앞(RF) 및 오른쪽 뒷다리(RH)의 발자국. (C) 여러 시점에서 한 SCI 동물에 대한 "자세 추적". 다리 중 하나에 대한 AEP 및 PEP는 첫 번째 패널에 설명되어 있습니다. AEP 및 PEP 모두에 대한 "풋프린트 클러스터링"은 각 비디오에서 평균 AEP 또는 PEP 좌표의 표준 편차에 해당합니다. 약어: dpi = 부상 후 일수; cm = 센티미터; px = 픽셀. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
다음으로, 운동학적 출력은 MW에 의해 계산된 후 분석되었습니다(그림 3 및 그림 4). 데이터 세트에 대한 보다 간결한 묘사를 얻고 MW에서 얻은 운동학적 운동 매개변수가 시간 경과에 따른 SCI 동물에서 발견되는 운동 결손을 묘사하기에 충분한지 테스트하기 위해 PCA27을 수행했습니다. 눈에 띄게, 데이터 분산의 40%는 첫 번째 구성 요소(PC1: 40.1%)에서 설명될 수 있으며, 이는 SCI가 있는 동물 그룹을 나머지 동물과 분리했으며, p-값은 0.001보다 낮습니다. 다른 구성 요소(PC2: 11% 및 PC3:8.6%)의 기여도도 좋지 않았습니다. 각 구성 요소에 대한 각 모터 매개변수 기여도의 할당된 중량은 보충 그림 4에 나와 있습니다. 더욱이, 데이터 세트의 분산은 시간에 따른 차이(즉, 15dpi, 22dpi 및 30dpi 사이)를 반영하기에 충분하지 않았으며, 이는 이전에 설명된 운동 회복14의 고원을 복제합니다. 전체적으로, 이러한 결과는 MW에서 얻은 운동학적 매개변수가 모든 시점에서 SCI 후 관찰된 모터 결함을 강력하게 설명한다는 것을 나타냅니다.
그림 3: 잔류 데이터 분석 후 MW 소프트웨어에 의해 얻어진 모든 운동학적 모터 파라미터(79)의 주성분 분석. (A) 3성분 PCA 분석의 3D 시각화. (B) 수집된 데이터의 50%를 나타내는 원이 있는 2D 시각화. 분산의 40% 이상을 설명하는 PC1에서 15dpi, 22dpi 및 30dpi의 SCI 그룹은 단방향 ANOVA에 의해 결정된 p-값이 0.001< 가짜 그룹 및 기준선(부상 전)과 유의하게 달랐습니다. 각각의 작은 점 또는 삼각형은 각 동물에 대한 세 개의 비디오의 평균을 나타내고 큰 점 또는 삼각형은 평균 지점을 나타냅니다(조건당 n = 10-11, 기준선 그룹의 경우 n = 21). 각 구성 요소의 기여도는 각 축에 표시됩니다. 약어: dpi = 부상 후 일수; SCI = 척수 손상; PC = 주성분. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그런 다음 데이터 세트(총 33개)를 얼마나 강력하게 설명했는지에 따라 모터 매개변수 모음을 선택하고 히트맵을 생성했습니다(그림 4). 실제로, 대부분의 운동 매개변수는 모든 시점(15dpi, 22dpi 및 30dpi)에서 SCI 후 급격한 변화를 보인 반면, 가짜 부상 대조군은 30dpi에서만 유의미한 변화를 보였습니다. 가짜 그룹의 이러한 변화는 스윙 속도의 전반적인 감소로 설명될 수 있으며, 아마도 테스트 습관화로 인한 것일 수 있으며, 이에 대해서는 나중에 논의할 것입니다.
SCI 동물들이 가짜 부상당한 대조군보다 느리게 걷는 것이 눈에 띄었다 (데이터는 표시되지 않음). 그러나, 속도와는 무관하게, 15 dpi 및 30 dpi 모두에서, SCI 동물들은 더 높은 스윙 지속시간, 더 낮은 스탠스 지속시간, 및 더 낮은 듀티 팩터 지수를 나타내었는데, 이는 스탠스 지속시간/스테핑 기간(23)과 관련된다. 이러한 결과는 위에서 설명한 다리 위치의 변화가 다른 동물 모델30,31,32에서 볼 수 있듯이 SCI의 특징이며 속도의 변화와 관련이 없음을 나타냅니다(그림 4).
또한 앞다리와 뒷다리에 대한 "위상"지수의 중요한 변화가 관찰되지 않았기 때문에 왼쪽과 오른쪽 동기는 영향을받지 않았으며10,23 (그림 4), 왼쪽과 오른쪽 팔다리 사이의 손상되지 않은 결합을 나타냅니다.
또한, SCI 마우스는 앞다리와 뒷다리 모두에서 더 낮은 "자세 직진도" 지수(변위/경로 길이)를 나타냈습니다(그림 4). 이 매개변수는 이상적인 조건과 관련하여 트레이스가 얼마나 선형인지를 측정하며, 이는 직선(0에서 1까지의 범위, 선형 트레이스를 나타냄)27입니다. 따라서 이러한 결과는 이 그룹에서 똑바로 걸을 수 없다는 강한 무능력을 나타냅니다.
각 자세 단계에서 MW는 발 터치다운(전방 극한 위치 또는 AEP)에서 시작하여 이륙 전 끝인 후방 극한 위치 또는 PEP에서 시작하여 신체 진동의 재구성을 그립니다( 그림 2C의 예 참조). AEP와 PEP의 "풋프린트 클러스터링"은 각 비디오에서 평균 AEP 또는 PEP 좌표의 표준 편차를 측정합니다. SCI 동물은 모든 시점에서 AEP에 대한 뒷발 발자국 클러스터링 의 증가를 보였으며 15dpi에서 가짜 손상 그룹에 대해서만 유의미한 효과가 관찰되었습니다(그림 4). 이것은 SCI 동물이 스윙 후 터치 다운시 뒷다리를 올바르게 배치 할 수 없음을 보여줍니다. 또한 PEP에 대한 앞발 "발자국 클러스터링"의 감소와 PEP에 대한 뒷발 발자국 클러스터링의 감소가 30dpi에서 나타났습니다(그림 4). 이러한 결과는 그려진 "자세 흔적"에서 관찰된 것과 일치하며 부상 후 앞발의 위치가 더 제한됨을 시사합니다.
마지막으로, 발 위치의 변경에 따라 해당 영역의 평균 밝기로 측정한 바와 같이 발에 의해 유도된 보행 전략과 "압력"의 변경이 있었습니다(그림 4), 이에 대해서는 추가로 논의될 것입니다.
그림 4: 잔류 데이터 분석 후 MW로 얻은 수술 전날을 기준으로 SCI 동물과 가짜 손상 동물을 비교한 크게 변경된 운동 매개변수 모음을 보여주는 히트맵 플롯. 조건당 n = 10-11; 기준선 그룹은 수술 전날의 모든 동물을 포함하며, n=21. 데이터는 일원 분산 분석(one-way ANOVA)을 사용한 후 Tukey의 사후 검정(정규 분포의 경우) 또는 Dunn의 사후 검정(비정규 분포의 경우)을 사용한 통계 분석 후 p-값으로 표현됩니다. P-값은 색상 코드로 표시되며, 빨간색과 파란색 음영은 각각 기준선에 비해 감소 또는 증가를 나타냅니다. 음영은 통계적 유의성을 나타내며 어두운 색상은 높은 중요도를 나타내고 밝은 색상은 낮은 유의성을 나타냅니다. P < 0.001; **P < 0.01; *P < 0.05입니다. 흰색은 변동이 없음을 나타냅니다. 약어: dpi = 부상 후 일수; SCI = 척수 손상; s = 초; ms = 밀리초; 평균 = 평균; F = 전방; H = 뒷다리; AEP = 전방 극단 위치; PEP = 후방 극한 위치; LF = 왼쪽 앞; LH = 왼쪽 뒷다리; RF = 오른쪽 앞; RH = 오른쪽 뒷다리. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그 후, 우리는 부상의 여러 단계(즉, 15dpi, 22dpi 및 30dpi)에서 SCI 동물의 운동 결손을 설명하는 데 가장 적합한 개별 매개변수를 이해하려고 했습니다. 우리는 뒷다리가 전체 마비에서 부분 기능으로 진행됨에 따라 앞다리와 뒷다리 사이의 차이를 보여주는 단계 주기 매개변수를 조사하는 것으로 시작했습니다(그림 5). 평균 스윙 속도는 기준선에 비해 앞다리의 경우 유의하게 증가한 반면(부상 전), 뒷다리 스윙 속도는 크게 변하지 않았습니다(기준선보다 낮은 경향이 있었음에도 불구하고)(그림 5A, B). 동시에 앞다리의 평균 보폭은 감소했으며 뒷다리에는 큰 변화가 없었습니다(그림 5C,D). 놀랍지 않게도, 부상당한 마우스는 앞다리 스윙 지속 시간이 감소하고 뒷다리 스윙 지속 시간이 15dpi 이상에서 역으로 증가한 것으로 나타났습니다(그림 5E, F). 종합하면, 이러한 결과는 앞다리가 각 뒷다리 주기에 대해 두 개의 앞다리 주기와 함께 더 빠른 리듬을 채택했음을 나타냅니다. 이 2:1 주기 비율은 이전에 쥐 1,33에서 SCI 반절개 후에 설명되었으며 마우스에서 30dpi 후에 회복되지 않는 결함 있는 앞다리-뒷다리 협응의 주요 측면을 보여줍니다.
그림 5: 부상 1일 전 여러 시점과 SCI 동물에서 15dpi, 22dpi 및 30dpi에서 앞발과 뒷발에 대한 걸음 수 주기 매개변수(n = 11). (A,B) 기준선에 대한 앞발과 뒷발의 평균 스윙 속도. (씨, 디) 기준선에 대한 앞발과 뒷발의 평균 보폭. (E,에프) 기준선에 대한 앞발과 뒷발의 평균 스윙 지속 시간. 상자 그림에서 중앙값은 중간 선으로 표시되고 상자의 아래쪽 및 위쪽 가장자리는 각각 25% 및 75% 사분위수를 나타냅니다. 수염은 전체 데이터 세트의 범위를 나타냅니다. 이상치는 단일 점으로 표시됩니다. 통계 분석은 일원 분산 분석에 이어 Tukey의 사후 검정(정규 분포의 경우) 또는 Dunn의 사후 검정(비정규 분포의 경우)으로 수행되었습니다. *P < 0.05; **P < 0.01; P < 0.001입니다. 약어: dpi = 부상 후 일수; SCI = 척수 손상; cm = 센티미터; s = 초. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
MW 소프트웨어는 또한 특정 다리 조합에 할당된 프레임의 비율을 측정하여 마우스의 스테핑 패턴을 계산할 수 있으며, 이는 특정 보행 전략의 존재에 대한 프록시로 작동합니다. 느린 속도에서 부상 당하지 않은 마우스는 대부분의 프레임이 (발 위치에 관계없이) 단일 다리 스윙을하는 "걷는 걸음 걸이"를 채택하는 경향이 있습니다. 활주로에서 가장 흔한 중간 속도에서 마우스는 트로트 보행으로 바뀌며, 가장 대표적인 구성은 대각선 다리 스윙입니다. 마지막으로, 더 높은 속도에서, 마우스는 "갤럽 보행"을 사용하며, 3 개의 다리가 동시에 스윙합니다23,34. 다른 덜 일반적인 구성으로는 주로 옆다리 스윙(왼쪽 또는 오른쪽 다리 모두)으로 대표되는 페이싱 보행과 뒷다리 또는 앞다리가 동시에 스윙하는 "바운드/호핑 보행"이 있다10. 그러나 SCI의 맥락에서 세 다리 스윙과 같은 이러한 구성 중 일부는 결함있는 뒷다리 발 위치를 반영 할 수 있으므로 특정 보행 전략 (이 경우 갤럽)과 정확하게 일치하지 않는다는 점을 명심해야합니다. 따라서 다리 구성만 비교하여 분석을 단순화했습니다.
잔류 분석을 수행한 후 모든 시점에서 단일 스윙의 감소와 함께 대각선 스윙의 유병률이 감소하는 것으로 나타났습니다(그림 6A, B). 더 흥미롭게도 측면 스윙의 유병률이 증가했습니다(그림 6C). 페이싱과 같은 보행 은 일반 C57BL/6J 마우스에서 일반적이지 않습니다. 그러나 이미 쥐1에서 SCI 반절개 후에 발생하는 것으로 보고되었습니다. 이 위상 패턴은 앞다리 또는 뒷다리 위상 지수 를 변경할 만큼 널리 퍼지지 않았지만( 그림 3에서 볼 수 있듯이) 뒷다리에서 앞다리로의 척추 피드백 결함을 보여줍니다. 또한, 앞다리/뒷다리 스윙의 유병률이 자연적으로 증가했으며(그림 6D), 아마도 잘못된 뒷다리 발바닥 스테핑과 세 다리 스윙의 증가로 인한 것입니다(그림 6E).
그림 6: 다양한 스테핑 스윙 구성에 대한 평균 인덱스 . SCI 동물(n = 11)의 여러 시점에서 (A) 대각선, (B) 단일, (C) 측면, (D) 앞/뒤 및 (E) 세 다리 스윙이 표시됩니다. 상자 그림에서 중앙값은 중간 선으로 표시되고 상자의 아래쪽 및 위쪽 가장자리는 각각 25% 및 75% 사분위수를 나타냅니다. 수염은 전체 데이터 세트의 범위를 나타냅니다. 이상치는 단일 점으로 표시됩니다. 통계 분석은 일원 분산 분석에 이어 Tukey의 사후 검정(정규 분포의 경우) 또는 Dunn의 사후 검정(비정규 분포의 경우)으로 수행되었습니다. **P < 0.01; P < 0.001입니다. 약어: dpi = 부상 후 일수; SCI = 척수 손상; NA = 해당 사항 없음. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
마지막으로, MW에서 추출할 수 있는 또 다른 판독값은 밝기/면적의 척도인 "압력"입니다. 속도가 높을수록지면과의 접촉 면적이 감소하고 압력이 증가하므로 기준선 데이터의 선형 회귀를 수행하고 각 조건에 대한 잔류 값을 측정했습니다. 앞발에 가해지는 압력은 모든 시점에서 크게 증가했지만 왼쪽 앞발의 변화가 이미 30dpi에서 통계적 유의성을 잃었기 때문에 이 효과의 강도는 시간이 지남에 따라 감소하는 경향이 있었습니다(그림 7A,C). 왼쪽에 대한 이러한 특정 효과는 이 연구에서 척수의 오른쪽에 우선적으로 영향을 미칠 수 있는 측면 손상으로 설명할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 뒷발에 의해 가해지는 압력은 예상대로 모든 시점에서 부상당한 마우스에서 감소했으며 증가하는 경향은 없었습니다(그림 7B,D).
그림 7: SCI 동물의 여러 시점에서 뒷발과 앞발에 의해 유도된 압력(n = 11). (A) 왼쪽 앞발, (B) 왼쪽 뒷발, (C) 오른쪽 앞발, (D) 오른쪽 뒷발에 의해 유도된 압력은 기준선(부상 전날)에 대한 상대적 차이로 표시됩니다. 상자 그림에서 중앙값은 중간 선으로 표시되고 상자의 아래쪽 및 위쪽 가장자리는 각각 25% 및 75% 사분위수를 나타냅니다. 수염은 전체 데이터 세트의 범위를 나타냅니다. 이상치는 단일 점으로 표시됩니다. 통계 분석은 일원 분산 분석에 이어 Tukey의 사후 검정(정규 분포의 경우) 또는 Dunn의 사후 검정(비정규 분포의 경우)으로 수행되었습니다. **P < 0.01; P < 0.001입니다. 약어: dpi = 부상 후 일수; SCI = 척수 손상; cm = 센티미터; px = 픽셀. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
종합하면, 이 연구는 다른 테스트 제한으로 인해 때때로 무시될 수 있는 SCI로 인한 모터 장애를 정량적으로 설명하기 위한 MW 시스템의 힘을 보여줍니다. 또한 SCI의 타박상 마우스 모델에서 시간이 지남에 따라 의심할 여지 없이 제한된 기능 회복을 강조합니다.
보충 그림 1: MW 하드웨어 구성 요소. (A) 이 설정은 다음과 같이 나뉩니다: I - fTIR 보도; II - fTIR 지원 기반 및 게시물; III - 보도 벽; IV - 45° 거울; 및 V - 배경 백라이트. (B) Base-U- 채널 및 보도 측선의 클로즈업 이미지. (C) 보도 벽의 디자인. (D) 45° 미러 설정의 클로즈업 이미지. 약어: cm = 센티미터. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 2: 픽셀 강도 및 영역 영역이 표시되는 fTIR 비디오의 단일 프레임. 이 연구에서 비디오 분석에 사용된 본체, 배경 및 풋프린트의 픽셀 강도는 브래킷 사이에 표시되고 빨간색으로 표시되며 모두 이미지 선명도에 최적화되어 있습니다. 서로 다른 영역을 적절하게 구별할 수 있도록 광도를 조정해야 합니다. 신체의 상대적 영역과 발자국은 노란색 점선으로 표시됩니다. 영역과 픽셀 강도는 모두 ImageJ/FIJI에서 획득했습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충도 3: (A) 본 연구에서 분석된 마우스의 BMS 총점 및 (B) 하위점수(n=10-11). 모든 데이터는 평균 ± SEM으로 표현되었습니다. 통계 분석은 양방향 반복 측정 ANOVA에 이어 Bonferroni의 사후 테스트로 수행되었습니다. P < 0.001입니다. 약어: BMS = Basso 마우스 스케일. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 4: 각 구성 요소에 대한 각 모터 매개변수 기여도의 할당된 무게. PCA에서 (A) PC1, (B) PC2, 및 (C) PC3에 대한 잔류 분석 후 각 모터 파라미터(총 79개)의 할당된 중량. 컷오프 라인은 0.04ms 및 -0.04로 그려졌습니다. 약어: ms = 밀리초; 평균 = 평균; SD = 표준 편차; F = 전방; H = 뒷다리; AEP = 전방 극단 위치; PEP = 후방 극한 위치; LF = 왼쪽 앞; LH = 왼쪽 뒷다리; RF = 오른쪽 앞; RH = 오른쪽 뒷다리; = 압력을 누릅니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에서 MouseWalker 방법의 잠재력은 SCI 후 운동 행동을 분석하여 입증됩니다. 다른 표준 테스트에서는 놓칠 수 있는 걸음 걸기, 발자국 및 보행 패턴의 특정 변경에 대한 새로운 통찰력을 제공합니다. MW 패키지의 업데이트된 버전을 제공하는 것 외에도 제공된 Python 스크립트를 사용하여 데이터 분석 도구에 대해 설명합니다(5단계 참조).
MW가 대규모 데이터 세트와 고차원 운동 과정을 반영하는 운동학적 매개변수 모음을 생성함에 따라 PCA가 사용되었습니다. 실제로 PCA는 27,35,36과 유사한 다른 운동학적 데이터 세트에서 널리 사용되었습니다(그림 3). 이 차원 축소 기법은 최소한의 가정을 가진 간단하고 강력한 방법으로, 운동학적 프로파일을 정량적으로 식별하고 제어 또는 기준선 조건과 빠르게 구별할 수 있습니다. 또한 기준선과 통계적으로 다른 매개 변수를 즉시 식별하기 위해 히트맵이 생성되었으며(그림 4), 나중에 개별적으로 분석할 수 있습니다(그림 5, 그림 6 및 그림 7).
그 후, MW에서 추출할 수 있는 특정 매개변수가 조정과 같은 SCI 동물에서 볼 수 있는 강력한 운동 결함을 어떻게 설명하는지 보여주었습니다. 조정은 작업을 수행하기 위해 조직적인 방식으로 각 팔다리를 사용하는 능력입니다. 종종 조정은 래더에서의 실수/긍정적인 사건의 수(16,17) 또는 로타로드(15)에서 보낸 시간에 의해 간접적으로 측정된다. 뚜렷하게, MW는 스텝 사이클 동안 발 위치의 가변성(발자국 패턴)과 "자세 직진성" 지수(27)를 모두 계산한다. 두 매개변수 모두 부상에 의해 유의한 영향을 받는 것으로 나타났습니다(그림 4).
또한 MW를 통해 사용자는 시간 역학과 관련된 매개 변수를 추출 할 수 있습니다. SCI 동물에서 스윙/스탠스 지속 시간의 상당한 중단이 관찰되었으며(그림 4), SCI 마우스는 앞다리 스텝 주기를 가속화하여 앞다리 스텝 길이와 평균 스윙 시간을 줄임으로써 뒷다리의 지지 손실을 보상하는 것으로 나타났습니다(그림 5). 이 효과는 앞발이 더 많은 체중을 견디도록 하는 무게 중심의 이동과 관련이 있을 수있습니다 1. 마찬가지로, 앞다리와 뒷다리 CPG 1,9,32 사이의 시너지 상호작용을 담당하는 긴 상행 고유척수 경로의 손실에 기인할 수 있으며, 이는 궁극적으로 앞다리-뒷다리 리듬 해리로 이어집니다.
스테핑 보행의 특성은 운동 네트워크 1,34의 모듈 식 조직을 설명 할 수 있습니다. 스테핑 패턴이 이 경우23에서 채택된 보행 전략에 대한 직접적인 대용물은 아니지만, 몇 가지 중요한 관찰은 여전히 도출될 수 있다. SCI 마우스의 스테핑 패턴에서 중요한 변화가 나타났습니다(그림 6). 부상당한 동물들은 측면 스윙 (페이싱과 같은 보행)을 채택하기 시작했으며 대각선 스윙도 감소했습니다. 이러한 적응은 앞다리와 뒷다리를 조정하려는 시도와 관련이있는 것으로 보이며, 1,9,32를 회복하지 못하는 부상 아래와 위의 척추 트랙 사이의 해리를 다시 보여줍니다.
SCI 후 제한된 회복은 평균 압력으로 측정한 바와 같이 뒷다리의 근육 활력 감소로도 확인되었습니다(그림 7). 결과적으로, 앞다리는 더 많은 체중을 지탱해야하므로 압력이 증가합니다. 근육 역학과 관련된 많은 매개변수가 여기에서 분석되지 않았지만(즉, 굴근 및 신근 협응 7,21), 이 정량적 측정은 사지 지지대의 양을 직접 판독할 수 있습니다.
이 MW 분석은 사지 회전, 발 위치, 꼬리 위치 및 스테핑 실수를 측정하는 표준 BMS 테스트와 함께 사용할 수도 있습니다. 일반적으로, SCI 마우스는 4-5의 최대 점수를 달성하고, 최대 하위 점수는 3이며, 이는 그들이 가끔씩 또는 빈번한 걸음을 밟을 수 있지만, 대부분 발의 리프트 오프 및/또는 터치다운에서 회전한다는 것을 의미한다14 (보충 그림 2). 스윙 단계 동안 팔다리의 평행하지 않은 위치가 발 좌표에 영향을 미칠 수 있기 때문에 뒷발의 AEP 값이 SCI 그룹에서 크게 변경된 이유가 분명해집니다. 또한, BMS에서, 트렁크는 일반적으로 버트 다운 및 호핑14와 같이 스텝 다운을 방해하는 인스턴스 또는 이벤트의 존재로 인해 심각한 것으로 분류된다. 엉덩이를 아래로 내리는 행동이나 스테핑을 방해하는 사례를 정량화하는 것은 불가능했지만, MW에서 제한된 뒷발 스텝핑이 감지되었으며, 더 높은 스윙 지속 시간(그림 5F), 3개의 다리 스윙 증가(그림 6E) 및 더 낮은 압력(그림 7B-D). 또한, 앞/뒷다리 스윙의 상당한 증가가 관찰되었습니다(그림 6D). 이 행동 징후에 대한 두 가지 보완적인 설명이 있을 수 있습니다. 먼저, BMS 테스트에서 이미 관찰 할 수있는 호핑과 같은 보행을 측정했습니다. 그러나 이 행동은 양쪽 뒷다리에 올바른 발바닥 발판이 부족하여 발이 끌리거나 등쪽에 배치되는 것과 관련이 있을 수도 있습니다. 전반적으로, 이러한 관찰은 SCI 후 트렁크 안정성이 심각하게 손상되었다는 주장을 뒷받침합니다. 마지막으로, BMS 시험에서 5점 이상의 점수를 받기 위한 요구 사항 중 하나는 조정14이며, 이를 위해 시험 중에 채점자는 최소 3개의 접근 가능한 패스를 준수해야 합니다. 그 중 3개 이상의 접근 가능한 패스 중 2개는 조정된 것으로 분류되어야 합니다(즉, 앞다리와 뒷다리가 번갈아 가며). MW 데이터에서 객관적인 측정, 자세 직진도 지수 및 발자국 클러스터링을 추출할 수 있으며, 이는 동물의 속도 또는 접근 가능한 패스와 독립적으로 조정을 직접 정량화합니다(그림 4). 또한 팔다리 간의 교대는 스테핑 전략을 측정하여 객관적으로 정량화할 수 있습니다(그림 6). 이러한 매개변수는 SCI 마우스가 일관되게 직선으로 걸을 수 없고 뒷다리를 잘못 배치할 수 있음을 분명히 보여줍니다.
MW 도구 상자는 SCI 후 운동 결함을 연구하는 데 유용한 전략이지만 몇 가지 한계를 고려해야 합니다. 첫째, 획득 파라미터(즉, 카메라 위치, 초점, 광도)와 일관성을 유지하여 시점 간의 이미지 특징이 유지되도록 하는 것이 중요합니다. 둘째, 반복이 습관화로 이어져 속도가 감소한다는 사실이 밝혀졌습니다. 이것은 또한 양육/그루밍 행동 증가에 기여했으며 달리기 중간에 멈춥니다. 부상당한 동물의 경우 보도 벽에 기대는 경향이 있었고 달리기 중간에 정류장 수가 증가했습니다. 이러한 행동은 운동 평가의 일부가 아니므로 고려해서는 안 됩니다. 우선적으로 연구자들은 동물들이 머리를 똑바로 향하게 하고 계속 걷는 비디오를 선택해야 합니다. 이 연구 결과에 대한 이러한 행동의 영향을 상쇄하기 위해, 마우스는 적어도 4 개 또는 5 개의 달리기 동안 연속적으로 기록되었고 보도를 따라 어느 방향 으로든 달릴 수있었습니다. 그 후, 가장 잘 기록된 3개의 런을 선택하고 ImageJ/FIJI24 (180° 회전)에서 같은 방향으로 조정했습니다. 따라서, 각 동물은 시점 당 함께 풀링된 3개의 런의 평균으로 표현되었다. 조건당 동물 수가 많을수록 예상되는 변동성이 감소할 수도 있습니다. 또한, 이 운동 테스트는 추적 시스템이 미세 조정된 운동 평가를 위해 설계되었기 때문에 발바닥 스테핑을 달성한 후에만 권장된다는 점에 유의해야 합니다. 이 연구에서 15dpi 이전에는 MW 테스트가 추적에 영향을 미칠 수 있는 발 항력 증가와 잘못된 발바닥 배치로 인해 운동 평가에 유리하지 않다는 점에 주목했습니다(데이터는 표시되지 않음). 마지막으로, 일부 매개 변수(예: 풋프린트 클러스터링)는 생성된 회귀 모델에 의해 만들어진 외삽에 매우 민감합니다. 따라서 코드가 그에 따라 조정되었습니다(GitHub 링크의 스크립트에 있는 설명서 참조).
전반적으로, MW는 SCI 동물과 가짜 부상 대조군을 강력하게 구별할 수 있는 것으로 나타났으며, MW는 SCI 후 운동 결함을 연구하는 귀중한 방법으로 확립된 테스트와 협력할 수도 있습니다. 또한 제공된 Python 스크립트를 사용하여 MW 데이터 세트에서 정량적 출력을 쉽게 생성할 수 있는 것으로 나타났습니다. 이러한 도구는 원본 MW 출력 파일을 보완하는 풍부하고 다양한 정량적 및 그래픽 출력 세트를 생성하는 효율적인 실험 파이프라인을 제공하며 분석 유형 및 그래픽 표현 측면에서 연구원의 목표를 달성하기 위해 변경할 수 있습니다.
이 도구 상자는 척수 손상과 관련된 질병뿐만 아니라 다른 운동 관련 질병이나 운동 기능 장애를 연구하는 데 유용한 방법입니다. Skarlatou et al.10 은 이미 발달 중 중요한 스캐폴드 단백질인 Afadin의 특정 돌연변이가 두 개의 중심관을 생성하여 척수에 비정상적인 표현형을 유발한다는 것을 입증했습니다. 이 결함으로 인해 오른쪽-왼쪽 사지 교대가 상실되고 호핑 보행의 전형적인 사지 동기화가 더 많이 발생했습니다. Stauch 등[10 ]은 또한 이러한 유형의 시스템이 사용자의 필요에 따라 적응될 수 있음을 설명하였다. 이 경우, 랫트 파킨슨병 모델에서 특정 행동 결손을 연구하기 위해 적용되었다. 따라서 이 도구 상자는 운동 장애가 예상되는 다양한 모델에서 광범위한 응용 분야를 가지고 있으며 현장에서 이미 확립된 동작 프로토콜과 결합할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 경쟁하는 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
저자는 Laura Tucker와 Natasa Loncarevic에게 원고에 대한 의견과 Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes의 설치류 시설에서 제공 한 지원에 감사드립니다. 저자는 Prémios Santa Casa Neurociências - 척수 손상 연구 상 Melo e Castro(MC-36/2020)가 LS 및 CSM에 대한 재정 지원을 인정하고자 합니다. 이 작업은 Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) (PTDC/BIA-COM/0151/2020), iNOVA4Health (UIDB/04462/2020 및 UIDP/04462/2020) 및 LS4FUTURE (LA/P/0087/2020)에서 C.S.M. L.S.는 CEEC Individual Principal Investigator 계약(2021.02253.CEECIND)에 의해 지원되었습니다. AFI는 FCT (2020.08168.BD)의 박사 학위의 지원을 받았습니다. AMM은 FCT의 박사 과정 (PD / BD / 128445 / 2017)의 지원을 받았습니다. IM은 FCT(SFRH/BPD/118051/2016)의 박사후 연구원의 지원을 받았습니다. DNS는 FCT(SFRH/BD/138636/2018)의 박사 펠로우십의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 45º Mirror | |||
| 2 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 16 cm height, 1 on each side | Misumi | ||
| 2 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 23 cm, @ 45° , 1 on each side | Misumi | ||
| 1 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 83 cm long | Misumi | ||
| 87 x 23 cm mirror | General glass supplier | ||
| black cardboard filler | General stationery supplier | We used 2, one with 69 x 6 cm and another with 69 x 3cm to limit the reflection on the mirror | |
| Background backlight | |||
| 109 x 23 cm plexiglass (0.9525 cm thick) | General hardware supplier | ||
| 2 lateral aluminum extrusion (4 x 4 cm), 20 cm long, 1 on each side | Misumi | ||
| multicolor LED strip | General hardware supplier | ||
| white opaque paper to cover the plexyglass | General stationery supplier | ||
| fTIR Support base and posts | |||
| 2 aluminum extrusion (4 x 4 cm), 100 cm height | Misumi | ||
| 60 x 30 cm metric breadboard | Edmund Optics | #54-641 | |
| M6 12 mm screws | Edmund Optics | ||
| M6 hex nuts and wahers | Edmund Optics | ||
| fTIR Walkway | |||
| 109 x 8.5 cm plexyglass (1.2 cm thick) | General hardware supplier | 109 x 8.5 cm plexyglass (1.2 cm thick) | |
| 109 cm long Base-U-channel aluminum with 1.6 cm height x 1.9 cm depth thick folds (to hold the plexyglass) | General hardware supplier | ||
| 2 lateral aluminum extrusion (4 x 4 cm) 20 cm length, 1 on each side | Misumi | ||
| black cardboard filler | General stationery supplier | we used 2 fillers on each side to cover the limits of the plexyglass, avoiding bright edges | |
| M6 12 mm screws | Edmund Optics | ||
| High speed camera (on a tripod) | |||
| Blackfly S USB3 | FLIR | #BFS-U3-32S4M-C | This is a reccomendation. The requirement is to record at least 100 frames per second |
| Infinite Horizon Impactor | |||
| Infinite Horizon Impactor | Precision Systems and Instrumentation, LLC. | #0400 | |
| Lens | |||
| Nikon AF Zoom-Nikkor 24-85mm | Nikon | #1929 | This lens is reccomended, however other lens can be used. Make sure it contains a large aperture (i.e., smaller F-stop values), to capture fTIR signals |
| Software | |||
| MATLAB R2022b | MathWorks | ||
| Python 3.9.13 | Python Software Foundation | ||
| Anaconda Navigator 2.1.4 | Anaconda, Inc. | ||
| Spyder 5.1.5 | Spyder Project Contributors | ||
| Walkway wall | |||
| 2 large rectagular acrilics with 100 x 15 cm | Any bricolage convenience store | ||
| 2 Trapezian acrilic laterals with 6-10 length x 15 cm height | Any bricolage convenience store | ||
| GitHub Materials | |||
| Folder name | URL | ||
| Boxplots | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Boxplots | Script to create Boxplots | |
| Docs | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Docs | Additional documents | |
| Heatmap | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Heatmaps | Script to create heatmap | |
| Matlat script | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Matlab%20Script | MouseWalker matlab script | |
| PCA | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/PCA%20plots | Script to perform Principal Component Analysis | |
| Raw data Plots | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Rawdata%20Plots | Script to create Raw data plots | |
| Residual Analysis | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Residual_Analysis | Code to compute residuals from Raw data |
References
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