Summary
Um pipeline experimental para descrever quantitativamente o padrão locomotor de camundongos que caminham livremente usando a caixa de ferramentas MouseWalker (MW) é fornecido, variando de gravações de vídeo iniciais e rastreamento até análise pós-quantificação. Um modelo de lesão por contusão medular em camundongos é empregado para demonstrar a utilidade do sistema MW.
Abstract
A execução de programas motores complexos e de alta coordenação, como caminhada e corrida, é dependente da ativação rítmica dos circuitos espinhal e supra-espinhal. Após uma lesão medular torácica, a comunicação com os circuitos a montante é prejudicada. Isso, por sua vez, leva a uma perda de coordenação, com potencial de recuperação limitado. Assim, para melhor avaliar o grau de recuperação após a administração de fármacos ou terapias, há necessidade de novas ferramentas, mais detalhadas e precisas, para quantificar a marcha, a coordenação dos membros e outros aspectos finos do comportamento locomotor em modelos animais de lesão medular. Vários ensaios foram desenvolvidos ao longo dos anos para avaliar quantitativamente o comportamento de marcha livre em roedores; no entanto, eles geralmente carecem de medidas diretas relacionadas a estratégias de marcha escalonada, padrões de pegadas e coordenação. Para resolver essas deficiências, uma versão atualizada do MouseWalker, que combina uma passarela de reflexão interna total frustrada (fTIR) com software de rastreamento e quantificação, é fornecida. Este sistema de código aberto foi adaptado para extrair várias saídas gráficas e parâmetros cinemáticos, e um conjunto de ferramentas de pós-quantificação pode ser para analisar os dados de saída fornecidos. Este manuscrito também demonstra como esse método, aliado a testes comportamentais já estabelecidos, descreve quantitativamente déficits locomotores após lesão medular.
Introduction
A coordenação efetiva dos quatro membros não é exclusiva dos animais quadrúpedes. A coordenação membro torácico-membro pélvico em humanos continua sendo importante para a realização de diversas tarefas, como natação e alterações da velocidade durante amarcha1. Vários programascinemáticos e motoresdos membros2,3,4, bem como circuitos de feedback proprioceptivo5, são conservados entre humanos e outros mamíferos e devem ser considerados quando se analisam opções terapêuticas para distúrbios motores, como a lesão medular (LM)6,7,8.
Para a deambulação, várias conexões espinhais dos membros torácicos e pélvicos precisam ser adequadamente conectadas e ativadas ritmicamente, o que requer inputs do cérebro e feedback do sistema somatossensorial 2,9,10. Essas conexões culminam nos geradores de padrão central (CPGs), que se situam em nível cervical e lombar para os membros torácicos e pélvicos, respectivamente 1,9,10. Muitas vezes, após a LM, a ruptura da conectividade neuronal e a formação de uma cicatriz glial inibitória12 limitam a recuperação da função locomotora, com desfechos que variam de paralisia total a função restrita de um grupo de membros, dependendo da gravidade da lesão. Ferramentas para quantificar com precisão a função locomotora após LM são fundamentais para monitorar a recuperação e avaliar os efeitos de tratamentos ou outras intervenções clínicas6.
O ensaio métrico padrão para modelos de contusão de camundongos com LM é a escala Basso de camundongos (BMS)13,14, um escore não paramétrico que considera a estabilidade do tronco, a posição da cauda, o passo plantar e a coordenação membros torácicos-membros posteriores em uma arena de campo aberto. Embora o SNF seja extremamente confiável para a maioria dos casos, ele requer pelo menos dois avaliadores experientes para observar todos os ângulos de movimento dos animais, a fim de explicar a variabilidade natural e reduzir o viés.
Outros ensaios também foram desenvolvidos para avaliar quantitativamente o desempenho motor após LMT. Estes incluem o teste de rotarod, que mede o tempo gasto em um cilindro giratório15; a escada horizontal, que mede o número de grades perdidas e pegas de escada positivas16,17; e o teste de marcha em viga, que mede o tempo que um animal leva e o número de falhas que ele comete ao atravessar uma viga estreita18. Apesar de refletir uma combinação de déficits motores, nenhum desses testes produz informações locomotoras diretas sobre a coordenação entre membros torácicos.
Para analisar de forma específica e mais aprofundada o comportamento de caminhar, outros ensaios foram desenvolvidos para reconstruir ciclos de passos e estratégias de gaiting. Um exemplo é o teste da pegada (pegada), em que as patas pintadas de um animal desenham um padrão sobre uma folha de papel branco19. Embora simples em sua execução, a extração de parâmetros cinemáticos como o comprimento da passada é complicada e imprecisa. Além disso, a falta de parâmetros dinâmicos, como a duração do ciclo do passo ou a coordenação temporizada com as pernas, limita suas aplicações; Na verdade, esses parâmetros dinâmicos só podem ser adquiridos analisando vídeos quadro a quadro de roedores caminhando por uma superfície transparente. Para os estudos de LM, pesquisadores analisaram o comportamento da marcha em vista lateral utilizando esteira, incluindo a reconstrução do ciclo do passo e a mensuração das variações angulares de cada articulação da perna 4,20,21. Embora essa abordagem possa ser extremamenteinformativa6, ela permanece focada em um conjunto específico de membros e carece de características adicionais da marcha, como coordenação.
Para preencher essas lacunas, Hamers e colaboradores desenvolveram um teste quantitativo baseado em um sensor de toque óptico usando reflexão interna total frustrada (fTIR)22. Neste método, a luz se propaga através do vidro através da reflexão interna, torna-se espalhada ao pressionar a pata e, finalmente, é capturada por uma câmera de alta velocidade. Mais recentemente, uma versão open-source desse método, denominada MouseWalker, foi disponibilizada, e essa abordagem combina uma passarela fTIR com um pacote de software de rastreamento e quantificação23. Usando esse método, o usuário pode extrair um grande conjunto de parâmetros quantitativos, incluindo padrões de passo, espacial e de marcha, posicionamento da pegada e coordenação membro anterior-membro posterior, bem como saídas visuais, como padrões de impressão (imitandoo ensaio 6 da pata com tinta) ou fases de apoio em relação ao eixo do corpo. É importante ressaltar que, devido à sua natureza de código aberto, novos parâmetros podem ser extraídos atualizando o pacote de script do MATLAB.
Aqui, o assembly publicado anteriormente do sistema MouseWalker23 é atualizado. Uma descrição de como configurá-lo é fornecida, com todas as etapas necessárias para obter a melhor qualidade de vídeo, condições de rastreamento e aquisição de parâmetros. Ferramentas adicionais de pós-quantificação também são compartilhadas para aprimorar a análise do conjunto de dados de saída do MouseWalker (MW). Finalmente, a utilidade dessa ferramenta é demonstrada pela obtenção de valores quantificáveis para o desempenho locomotor geral, especificamente ciclos de passos e coordenação membro torácico-membro pélvico, em um contexto de lesão medular (LM).
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Protocol
Todos os procedimentos de manuseamento, cirúrgicos e pós-operatórios foram aprovados pela Comissão Interna Molecular do Instituto de Medicina (ORBEA) e pela Comissão de Ética Animal (DGAV) de acordo com as diretrizes da Comunidade Europeia (Diretiva 2010/63/UE) e a lei portuguesa sobre cuidados com animais (DL 113/2013) sob a licença 0421/000/000/2022. Camundongos fêmeas C57Bl/6J com idade de 9 semanas foram utilizados para o presente estudo. Todos os esforços foram feitos para minimizar o número de animais e diminuir o sofrimento dos animais utilizados no estudo. O script MATLAB e a versão autônoma do software MW são de código aberto e estão disponíveis no GitHub
repositório (https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker). Embora o software MW tenha sido desenvolvido no MATLAB R2012b, ele foi adaptado para rodar no MATLAB R2022b. A Figura 1 ilustra o fluxo de trabalho de análise do MW.
1. Configuração do aparelho MouseWalker (MW)
- Montar o aparelho de MW conforme descrito anteriormente23, ou adaptar-se às necessidades específicas do planejamento experimental (ver Tabela de Materiais e Figura Suplementar 1 para mais detalhes sobre o setup).
OBS: A arena de caminhada pode ser ampliada para acomodar animais maiores, como ratos. -
Verifique se o plexiglass onde os animais caminham está limpo e livre de riscos. Use um pano de limpeza liso e minimize o uso de solventes orgânicos, como amônia ou etanol, em altas concentrações, que podem danificar o plexiglass (recomenda-se peróxido de hidrogênio a 3%, etanol a 7% ou qualquer desinfetante compatível e apropriado para plexiglass). Se necessário, substitua o plexiglass.
- Configure a câmera de alta velocidade com uma lente rápida e uma grande abertura (ou seja, valores menores de F-stop) para capturar uma grande quantidade de luz, pois isso ajuda a gravar os sinais fTIR (consulte a Tabela de Materiais).
NOTA: A lente não deve gerar distorções ópticas, particularmente nas bordas da imagem. As distorções ópticas podem ser testadas gravando um padrão conhecido (por exemplo, listras ou quadrados) e, em seguida, medindo o tamanho dos blocos no ImageJ/FIJI24 (use a ferramenta de linha e clique em Analisar > Medir). Por exemplo, um quadrado de 1 cm deve ter as mesmas dimensões de pixel no centro da imagem e nas bordas. As variações devem ser menores que 5%. - Acenda a faixa de luz LED multicolorida a partir da caixa de luz de fundo.
- Acenda a faixa de luz LED branca da caixa de luz da passarela.
NOTA: Um LED colorido também pode ser usado25 para facilitar a distinção da pegada/corpo/fundo. - Com as luzes da sala apagadas, verifique a intensidade da luz de fundo da caixa e da passarela. Ajuste a intensidade, se necessário, usando um potenciômetro ou plástico semiopaco. Estes devem ser otimizados para que a intensidade do pixel aumente na seguinte ordem: corpo do animal < fundo < pegadas.
- Para verificar a intensidade de pixels do corpo/fundo/pegadas do animal, abra a sequência de imagens no ImageJ/FIJI24 e clique em Analisar > Medir. O sinal da pegada não deve estar saturado, pois isso impedirá que os limites da pegada sejam definidos (ou seja, dedos dos pés e coxins dos pés) (Figura 2 Suplementar).
- Ajuste o contraste da imagem da passarela no software de gravação de vídeo. O contraste pode ser ajustado de duas maneiras: escurecendo ou aumentando a iluminação na fita de LED ou ajustando a abertura da lente da câmera.
- Posicione a lente corretamente para estar na mesma altura e no centro do espelho refletor de 45° e perpendicular (90°) à passarela. Isso gerará uma imagem constantemente proporcional ao longo da passarela esquerda-direita.
NOTA: Evite alterar a posição da câmera (distância, altura e orientação) nas várias sessões de gravação. Se necessário, marque o piso onde o tripé deve ser colocado. Isso manterá os recursos de imagem. - Foque a lente na superfície do plexiglass. Isso pode ser testado usando um objeto não prejudicial que toque na superfície do plexiglass.
NOTA: Com valores mais baixos de lente F-stop, a profundidade de campo se tornará menor, tornando o foco mais difícil. - Certifique-se de que todas as configurações permaneçam inalteradas durante o ensaio, pois elas podem alterar a intensidade de pixels dos vídeos gravados.
2. Aquisição de vídeo
- Certifique-se de que os ratos estejam familiarizados com a sala e o aparelho antes do teste. Guarde pelo menos 1 dia para habituação (dia 0). Para evitar treinamento excessivo, realize o teste de MW em um dia diferente dos outros testes comportamentais (preferencialmente no dia seguinte).
- No software de gravação de vídeo, verifique se pelo menos 50 cm da passarela está visível.
- Ajuste as configurações de gravação para truncar a região da passarela. Isso reduzirá o tamanho do vídeo e otimizará a aquisição de vídeo.
- Tire uma foto ou um pequeno vídeo de uma régua normal antes de cada sessão. O número de pixels por centímetro será usado posteriormente na "janela de configurações" para calibrar os vídeos.
- Inicie a aquisição do vídeo e coloque o animal na borda da passarela, segurando a base da cauda para evitar lesões. Certifique-se de que os animais avancem para a borda extrema da plataforma. Execute as gravações de vídeo com pelo menos 100 quadros / s para garantir transições suaves da marcha.
- Se necessário, motive os animais a se moverem, batendo suavemente na parede da passarela ou estalando/batendo palmas nos dedos. No entanto, evite cutucadas físicas, pois isso pode afetar os resultados.
- Salve os vídeos diretamente como sequências de imagens no formato TIFF (com compactação LZW), JPEG ou PNG. Caso a câmera grave como um arquivo MOV bruto, converta os vídeos em sequências de imagens abrindo o arquivo no ImageJ/FIJI24 e clicando em Arquivo > Salvar como > sequência de imagens (ou usando outro software, como o LosslessCut25).
OBS: A maioria dos animais inicia a deambulação imediatamente após serem colocados na passarela; Por isso, recomenda-se iniciar a aquisição do vídeo antes da colocação do animal.
3. Preparação dos vídeos para o software de rastreamento MW
- Filme bastante completo executado de cada mouse individual. O número de animais a filmar por condição e o número de tiragens completas devem ser decididos de acordo com cada desenho experimental. Uma corrida completa é quando o rato percorre os 50 cm completos da passarela sem paradas prolongadas (neste experimento, três corridas completas foram selecionadas).
NOTA: Dependendo do software de aquisição de imagens, os vídeos podem precisar ser cortados para o menor ROI. Isso aumentará a velocidade de rastreamento e geração de saída. - No ImageJ/FIJI24, selecione os quadros em que o mouse está na tela clicando em Image > Stack > Tools > Create a substack. O rastreamento no MW requer que a cabeça e a cauda estejam visíveis em todos os quadros. É possível, no entanto, fazer várias subpilhas a partir de uma única gravação de vídeo, que mais tarde representará cada execução.
- Salve cada subpilha separadamente em pastas diferentes clicando em Arquivo > Salvar como > sequência de imagens. O software MW mais tarde cria uma subpasta automaticamente em cada diretório toda vez que se começa a analisar uma execução.
4. Rastreamento
- Abra o MATLAB, adicione a pasta que contém o script MW ao diretório de trabalho e execute "MouseWalker.m" na linha de comando principal.
NOTA: O uso do software MW no MATLAB permite que as mensagens de erro de rastreamento sejam visualizadas no console principal do MATLAB e os dados de saída desejados sejam selecionados (abrindo o arquivo de script principal "MouseEvaluate.m" e alterando as saídas para 1 ou 0: o arquivo excel, gráficos de passo a passo, traços de postura e padrões de marcha). - Carregue a pasta de vídeo como o "Diretório de entrada". Pode-se também escolher a pasta de saída; no entanto, isso não é um requisito, pois o software MW cria uma nova pasta chamada "Resultados" automaticamente dentro do "Diretório de entrada".
- Usando as setas "<<", "<", ">>" e ">" verifique se os quadros de vídeo estão todos carregados corretamente dentro do software MW.
- Vá para a "janela Configurações", onde todos os parâmetros de calibração e limite estão localizados. Essas configurações podem mudar dependendo da intensidade de pixels do plano de fundo e das pegadas, bem como do tamanho mínimo do corpo e das pegadas, entre outros fatores (veja o exemplo na Figura Suplementar 2). Teste o efeito de alterar alguns parâmetros clicando no botão Visualizar .
- Use os diferentes estilos de plotagem, incluindo "corpo + pés + cauda", "somente corpo", "somente pés" e "somente cauda", para ajudar a discriminar partes do corpo após ajustar os parâmetros de limiar.
- Aproveite as ferramentas no painel do lado direito para fazer medições do brilho ou tamanho (usando os botões "brilho" e "régua", respectivamente). Todas as configurações podem ser salvas como "padrão", desde que a distância da câmera permaneça a mesma.
- Depois de ajustar os parâmetros de limite, verifique se o vídeo está pronto para rastreamento automatizado. Vá para o primeiro quadro e clique em Auto para iniciar o rastreamento. Essa etapa pode ser acompanhada em tempo real e leva alguns minutos, dependendo do tamanho do vídeo e do desempenho do computador.
- Se o rastreamento automático rotular incorretamente os recursos do corpo, cancele o rastreamento automático, insira novas configurações e reinicie o processo.
- Após a conclusão do rastreamento, verifique se é necessária uma correção manual. Para corrigir, use o painel do meio para selecionar ou desmarcar e indique a localização das pegadas da pata dianteira direita (RF), traseira direita (RH), dianteira esquerda (LF) e traseira esquerda (LH), cabeça, nariz, corpo (dividido em dois segmentos) e cauda (dividido em quatro segmentos). Salve as alterações pressionando o botão Salvar .
NOTA: Todos os botões e a maioria dos comandos têm um atalho de tecla (consulte o manual associado para obter detalhes23). Para facilitar a rolagem de vídeo e a execução de atalhos de teclado, um controlador de hardware com botões programáveis e uma roda de vaivém como o Contour ShuttlePro V2 podem ser usados. - Clique em Avaliar para gerar os arquivos de saída do vídeo rastreado. Dependendo da saída desejada selecionada (consulte a etapa 4.1), essa etapa pode levar alguns minutos.
- Verifique se todos os gráficos de dados de saída estão salvos na pasta "Resultados". Verifique a precisão do rastreamento examinando algumas das saídas gráficas, como os "Traços de postura", onde se pode verificar se todas as posições da pata são consistentes.
- Se um erro for identificado, corrija manualmente o rastreamento (se possível; caso contrário, elimine a pasta "Resultados" e execute o rastreamento automático novamente com novas configurações) e clique no comando Avaliar novamente.
- Verifique se todas as medidas quantitativas geradas pelo software MW estão salvas em planilha Excel e resumidas em "1. Info_Sheet". Verifique se as opções do Excel para as delimitações de fórmula correspondem ao script. O separador decimal deve ser ",", e os separadores de mil devem ser ";".
- Use o script "MouseMultiEvaluate.m" para reunir as medidas de todas as execuções em um novo arquivo para análise.
- Para começar, gere um arquivo de .txt contendo os caminhos de pasta para todos os vídeos (por exemplo, "Videofiles.txt"). Certifique-se de que cada linha corresponde a um único vídeo.
- Em seguida, escreva "MouseMultiEvaluate('Videofiles.txt')" na linha de comando. Um arquivo do Excel chamado "ResultSummary.xls" será gerado no diretório de trabalho (veja um exemplo no repositório do GitHub).
OBS: A Figura 2 representa as saídas gráficas obtidas pelo software MW a partir dos vídeos de um animal gravado.
5. Fluxo de trabalho de análise de dados cinemáticos
- Edite a planilha do Excel gerada na etapa 4.10, que contém os dados para processamento usando os scripts Python fornecidos, de acordo com os seguintes pré-requisitos.
- No cabeçalho da primeira coluna, especifique a condição experimental. Nomeie cada linha após o nome do grupo/condição (indivíduos dos mesmos grupos devem ter o mesmo nome). O primeiro grupo deve ser o controle ou a linha de base (isso só é obrigatório para a plotagem do mapa de calor, etapa 5.6).
- Na segunda coluna, especifique o ID do animal. Isso é obrigatório, embora essa informação não seja usada para geração de parcela.
- Na terceira coluna em diante, escolha os parâmetros motores que serão utilizados para a análise. Certifique-se de que a primeira linha seja o nome do parâmetro (esses nomes aparecerão posteriormente nos gráficos).
- Abra o Anaconda Navigator e execute Spyder para abrir os scripts Python fornecidos.
NOTA: Todos os scripts foram desenvolvidos com Python 3.9.13, foram executados com Spyder 5.2.2 no Anaconda Navigator 2.1.4 e estão disponíveis na Tabela de Materiais e no repositório GitHub (onde materiais adicionais são incluídos, como um exemplo de vídeo, um arquivo de exemplo do Excel e um documento de FAQs). É possível executar os scripts fora do Anaconda Navigator; no entanto, esta interface gráfica do usuário é mais amigável. - Use o "Rawdata_PlotGenerator.py" para gerar os gráficos de dados brutos. Isso permitirá a visualização de cada parâmetro em função da velocidade.
- Abra "Rawdata_PlotGenerator.py" no Spyder e execute o código clicando no botão Play .
- Selecione o arquivo do Excel a ser analisado e o nome da planilha na janela automática. Se o nome da folha não foi alterado, escreva "Sheet1".
- Os gráficos de dados brutos aparecerão no console de plotagem (painel superior direito). Para salvar as parcelas, clique no botão Salvar imagem ou Salvar todas as imagens no console de plotagem.
- Use o script "Residuals_DataAnalysis" para calcular os resíduos para análise de dados. Este script irá gerar um arquivo CSV com os cálculos dos resíduos para todos os parâmetros do motor.
NOTA: Muitos dos parâmetros medidos da marcha extraídos pelo MW variam com a velocidade (por exemplo, velocidade de oscilação, comprimento do passo, duração do apoio, retidão do apoio e índices da marcha). Portanto, recomenda-se realizar um modelo de regressão de melhor ajuste de cada parâmetro individual versus velocidade para o experimento de linha de base e, em seguida, determinar os valores residuais para cada grupo experimental em relação a esse modelo de regressão. Os dados são então expressos como a diferença da linha residual normalizada26.- Abra "Residuals_DataAnalysis.py" no Spyder e execute o código clicando no botão Reproduzir .
- Selecione o arquivo do Excel a ser analisado e o nome da planilha na janela automática. Se o nome da folha não foi alterado, escreva "Sheet1".
- Salve o arquivo CSV na mesma pasta que os dados. É obrigatório que o controle (ou linha de base) seja o primeiro grupo no arquivo do Excel.
- Use o script "PCA_PlotGenerator.py" para executar uma análise de componente principal (PCA).
OBS: Este método de redução de dimensionalidade não supervisionado é utilizado para gerar uma representação mais sucinta27,28,29 dos dados (Figura 3A, B). O script PCA inclui as seguintes etapas. Os dados são primeiramente pré-processados por centralização e escala, após o que o algoritmo PCA calcula a matriz de covariância para determinar as correlações entre as variáveis e calcular os autovetores e autovalores da matriz de covariância para identificar os componentes principais. Os dois ou três primeiros componentes principais são escolhidos para a representação dos dados em gráficos 2D ou 3D, respectivamente. Cada ponto nos gráficos corresponde a um animal e representa uma variável abstrata diferente. Pontos codificados por cores são usados para distinguir os grupos específicos. Como tal, agrupamentos de pontos refletem padrões de marcha semelhantes compartilhados pelos indivíduos correspondentes.- Abra "PCA_PlotGenerator.py" no Spyder e execute o código clicando no botão Play .
- Selecione o arquivo do Excel a ser analisado e o nome da planilha na janela automática. Se o nome da folha não foi alterado, escreva "Sheet1".
- Verifique se os gráficos PCA 2D e 3D aparecem no console de plotagem (painel superior direito). Cada cor representa um grupo diferente, e a legenda aparece ao lado do gráfico. Para salvar o plot, clique em Salvar imagem no console de plotagem.
- Use "Heatmap_PlotGenerator.py" para gerar um mapa de calor. Certifique-se de que o gerador de mapa de calor crie uma tabela mostrando as diferenças estatísticas entre o grupo de linha de base (ou grupo de controle) e os outros grupos para cada parâmetro motor27 (Figura 4). Cada coluna representa um grupo, e cada linha se relaciona a um parâmetro motor específico.
LEGENDA: A análise estatística foi realizada com ANOVA one-way seguida de post hoc de Tukey (para distribuições normais) ou ANOVA de Kruskal-Wallis seguida de post hoc de Dunn (para distribuições não normais). Outliers foram excluídos da análise. Os valores de p são representados por um código de cores, com tons de vermelho e azul indicando um aumento ou diminuição em relação ao controle (ou linha de base), respectivamente. A tonalidade da cor representa a significância estatística, com cores mais escuras apresentando maior significância e cores mais claras apresentando menor significância. corresponde a P < 0,001; ** corresponde a P < 0,01; e * corresponde a P < 0,05. O branco indica que não há variação.- Abra "Heatmap_PlotGenerator.py" no Spyder e execute o código clicando no botão Reproduzir .
- Selecione o arquivo do Excel a ser analisado e o nome da planilha na janela automática. Se o nome da folha não foi alterado, escreva "Sheet1".
- Selecione o tipo de dados na segunda janela automática: dados brutos ou dados residuais. Se uma opção não estiver selecionada, os dados residuais serão o padrão.
- O mapa de calor aparecerá no console de plotagem (painel superior direito). Para salvar o plot, clique em Salvar imagem no console de plotagem.
Observação : é obrigatório que o controle (ou linha de base) é o primeiro grupo no arquivo do Excel.
- Use "Boxplots_PlotGenerator.py" para gerar os boxplots. Essa ferramenta permitirá a geração de boxplots que representem a distribuição dos valores para todos os parâmetros motores de cada grupo (Figura 5, Figura 6 e Figura 7).
Observação : cada caixa contém a mediana como a linha do meio, e as bordas inferior e superior das caixas representam os quartis de 25% e 75%, respectivamente. Os bigodes representam o intervalo do conjunto de dados completo, excluindo outliers. Outliers são definidos como qualquer valor que seja 1,5 vezes o intervalo interquartil abaixo ou acima dos quartis de 25% e 75%, respectivamente.- Abra "Boxplots_PlotGenerator.py" no Spyder e execute o código clicando no botão Play .
- Selecione o arquivo do Excel a ser analisado e o nome da planilha na janela automática. Se o nome da folha não foi alterado, escreva "Sheet1".
- Selecione o tipo de dados na segunda janela automática: dados brutos ou dados residuais. Se uma opção não estiver selecionada, os dados residuais serão o padrão.
- Os boxplots aparecerão no console de plotagem (painel superior direito). Para salvar as parcelas, clique no botão Salvar imagem ou Salvar todas as imagens no console de plotagem.
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Representative Results
O sistema padrão de SNF descreve os déficits motores grossos após LM14. Devido à sua natureza subjetiva, outros ensaios quantitativos são geralmente realizados ao lado do SNF para produzir uma avaliação mais detalhada e fina da locomoção. No entanto, esses testes falham em mostrar informações específicas sobre ciclos de passos, padrões de passos e coordenação membro torácico-membro pélvico, o que é extremamente importante para entender como o circuito espinhal mantém a função e se adapta a uma LM incompleta. Esta seção mostra como a caixa de ferramentas MW pode ajudar a monitorar a recuperação da função locomotora após LM e adicionar informações relevantes sobre o comportamento de marcha.
A amostra do estudo foi dividida em dois grupos de camundongos fêmeas C57Bl/6J com 9 semanas de idade: um grupo experimental LM (n = 11), no qual os animais foram submetidos à laminectomia seguida de lesão por contusão moderada a grave ao nível da coluna vertebral T9/T10 utilizando um Impactor de Horizonte Infinito (ver Tabela de Materiais); e um grupo controle com lesão simulada (n = 10), no qual apenas a laminectomia foi realizada no mesmo nível da coluna (Figura 1, passo 1). O comportamento locomotor dos animais com LM e sham-injured foi monitorado por 30 dias. O teste de MW foi realizado no dia de habituação antes da cirurgia (basal) e 15 dias, 22 dias e 30 dias pós-lesão (dpi) (Figura 1, passo 2). Para efeito de comparação, os camundongos foram submetidos ao teste de SNF em paralelo antes da cirurgia e a 1 dpi, 3 dpi, 7 dpi, 14 dpi, 21 dpi e 30 dpi (Figura 3 Suplementar). Após o rastreamento de todos os vídeos obtidos com o MW, dois tipos de arquivos de saída foram então gerados: saídas gráficas, mostrando representações visuais de vários parâmetros após cada corrida, e saídas cinemáticas, resumindo todos os parâmetros motores mensuráveis (Figura 1, passo 3 e passo 4).
Consequentemente, usando um conjunto de scripts Python (consulte Tabela de Materiais e o link do repositório GitHub), os gráficos de dados brutos foram obtidos (Figura 1, etapa 5). Como a maioria dos parâmetros é influenciada pela velocidade do animal, foi realizado um modelo de regressão do grupo basal antes da lesão, juntamente com os valores residuais medidos para cada condição (Figura 1, passo 6). Para verificar os perfis cinemáticos e as diferenças significativas entre os grupos controle (sham) e experimental (LM), todos os parâmetros cinemáticos (total de 79) foram submetidos à análise de componentes principais (ACP) de três ordens, e um mapa de calor foi gerado com uma coleção de parâmetros motores que melhor descreviam o conjunto de dados (total de 33) (Figura 1, passo 7a,b). Finalmente, parâmetros motores específicos que foram afetados após a LM foram comparados com os basais antes da lesão (Figura 1, Passo 7c).
Figura 1: Representação esquemática do fluxo de análise dos MW. (1) Os animais são selecionados para laminectomia (grupo controle simulado) ou laminectomia seguida de lesão medular (grupo experimental). (2) Os animais são então submetidos a um ensaio comportamental no dia anterior à lesão e nos dias 15, 22 e 30 pós-lesão. (3) O MW gera dois tipos de dados de saída: (a) visualizações gráficas de vários parâmetros, como traços de postura, gaiting e padrões de passo, e (b) um resumo cinemático de todos os parâmetros motores mensuráveis. (4) Todos os dados de controle e experimentais são reunidos em um único arquivo usando o script "MouseMultiEvaluate.m" no MATLAB. (5) O script "RawData_PlotGenerator" para Python gera uma representação visual de como todos os parâmetros motores mensuráveis variam de acordo com a velocidade. Se os parâmetros não se correlacionarem com a velocidade, pode-se pular para (7); no entanto, como a maioria dos parâmetros após a SCI depende fortemente da velocidade, um modelo deve ser gerado (6) usando o script "Residual_DataAnalysis" para Python. Após a geração dos valores residuais para cada parâmetro motor, é realizada a análise dos dados (7): (a) uma análise de componentes principais (ACP) é realizada usando uma seleção de parâmetros com um script "PCA_PlotGenerator"; (b) um mapa de calor é criado com um script "Heatmap_PlotGenerator", para mostrar as diferenças estatisticamente significativas entre as condições para diferentes parâmetros; e c) vários parâmetros individuais que se alteram após a LM são avaliados com o script "BoxPlot_PlotGenerator". Todos os scripts estão disponíveis no link Tabela de Materiais e no repositório do GitHub. Os scripts são mostrados em vermelho. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A partir dos dados gráficos de saída coletados a partir dos MW, foi possível confirmar a conhecida mudança abrupta na visualização das pegadas após a LM. No ensaio "Tinta digital" gerada pelo MW, detectou-se falta de apoio das patas traseiras (Figura 2A), diminuição da área das pegadas tanto para a pata traseira esquerda quanto para a direita (Figura 2B), que foi mantida a partir de 15 dpi (dados não mostrados). Além disso, dentro de cada ciclo de passo, o MW calcula parâmetros relacionados à fase de apoio (i.e., o tempo entre o pouso da pata e antes da decolagem) e à fase de balanço (i.e., o tempo em que o membro está fora do solo). Dessa forma, o MW pode gerar "traços de postura" visuais, que levam em consideração a posição do centro e do eixo do corpo em relação a cada perna e seu centro de impressão durante as fases deapoio23. Os traços de postura global obtidos para cada animal apresentaram várias características únicas (Figura 2C). Esses dados mostraram que, após o LM, as patas traseiras apresentaram traços de apoio mais curtos e posicionamento mais aleatório da pata tanto no touchdown quanto na decolagem a partir de 15 dpi (Figura 2C).
Figura 2: Saídas gráficas representativas obtidas pelo software MW a partir dos vídeos de rastreamento. (A) Impressões de "tinta digital" para um animal de LM mostrando cada pata com uma cor diferente: vermelho (dianteiro direito), amarelo (dianteiro esquerdo), verde (traseiro direito) e azul (traseiro esquerdo) em vários pontos de tempo. (B) Pegadas para a face anterior esquerda (BF), posterior esquerda (LH), posterior direita (RF) e posterior direita (UR) de um animal com LM a 15 dpi. (C) "Traços de postura" para um animal com LM em vários momentos. O PEA e o PEP de uma das pernas são ilustrados no primeiro painel. O "agrupamento da pegada" para o PEA e PEP corresponde ao desvio padrão das coordenadas médias PEA ou PEP em cada vídeo. Abreviações: dpi = dias pós-lesão; cm = centímetro; px = pixel. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Em seguida, as saídas cinemáticas foram analisadas após serem computadas pelo MW (Figura 3 e Figura 4). Para obter uma representação mais concisa do conjunto de dados e testar se os parâmetros cinemáticos motores obtidos a partir do MW eram suficientes para retratar os déficits locomotores encontrados nos animais com LM ao longo do tempo, foi realizada uma ACP27. Notadamente, 40% da variância dos dados pôde ser explicada no primeiro componente (CP1: 40,1%), que separou o grupo de animais que apresentou LM dos demais, com p-valor menor que 0,001 baseado no teste ANOVA one-way (Figura 3A,B) em todos os momentos (15 dpi, 22 dpi e 30 dpi). Houve também fraca contribuição dos demais componentes (CP2: 11% e CP3:8,6%). O peso atribuído de cada contribuição de parâmetro motor para cada componente é ilustrado na Figura Suplementar 4. Além disso, a variância no conjunto de dados não foi suficiente para refletir diferenças ao longo do tempo (isto é, entre 15 dpi, 22 dpi e 30 dpi), o que replica o platô de recuperação locomotora descrito anteriormente14. Em conjunto, esses resultados indicam que os parâmetros cinemáticos obtidos a partir do MW descrevem fortemente os déficits motores observados após LM em todos os momentos.
Figura 3: Análise de componentes principais de todos os parâmetros cinemáticos motores (79) obtidos pelo software MW após a análise dos dados residuais . (A) Uma visualização 3D da análise de ACP tricomponente. (B) Visualização 2D com círculos representando 50% dos dados coletados. No CP1, que explicou mais de 40% da variância, o grupo LM a 15 dpi, 22 dpi e 30 dpi foi significativamente diferente do grupo sham e do basal (antes da lesão), com um valor de p < 0,001, determinado por uma ANOVA one-way. Cada pequeno ponto ou triângulo individual representa a média de três vídeos para cada animal, enquanto os pontos ou triângulos maiores representam o ponto médio (n = 10-11 por condição, n = 21 para o grupo de linha de base). A contribuição de cada componente é indicada em cada eixo. Abreviações: dpi = dias pós-lesão; LM = lesão medular; CP = componente principal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Em seguida, uma coleção de parâmetros motores foi selecionada com base na intensidade com que descreveu o conjunto de dados (33 no total), e um mapa de calor foi gerado (Figura 4). De fato, a maioria dos parâmetros locomotores mostrou uma mudança drástica após a LM em todos os momentos (15 dpi, 22 dpi e 30 dpi), enquanto os controles com lesão simulada mostraram apenas mudanças significativas em 30 dpi. Essas mudanças no grupo sham poderiam ser explicadas por uma diminuição geral na velocidade de oscilação, possivelmente devido à habituação do teste, que será discutida mais adiante.
Foi perceptível que os animais com LM caminharam mais lentamente do que os controles com lesão simulada (dados não mostrados). No entanto, independentemente da velocidade, tanto a 15 dpi quanto a 30 dpi, os animais com LM apresentaram maior duração de oscilação, menor duração do apoio e menor índice de fator de carga, que se relaciona com a duração do apoio/período de passo23. Esses resultados indicam que as alterações no posicionamento da perna descritas acima são características da LM, como visto em outros modelosanimais30,31,32, e não estão relacionadas a alterações na cadência (Figura 4).
Deve-se mencionar também que a sincronia direita e esquerda não foi afetada, pois não foi observada alteração significativa nos índices de "fase" para os membros torácicos e pélvicos10,23 (Figura 4), indicando acoplamento íntegro entre os membros esquerdo e direito.
Além disso, os camundongos LM apresentaram menor índice de "retidão de postura" (deslocamento/comprimento do trajeto) tanto nos membros torápicos quanto nos membros pélvicos (Figura 4). Esse parâmetro mede o quanto os traços são lineares em relação à condição ideal, que seria uma reta (variando de 0 a 1, indicando um traço linear)27. Portanto, esses resultados indicam uma forte incapacidade de andar em linha reta nesse grupo.
Para cada fase de apoio, o MW desenha uma reconstrução das oscilações do corpo, começando com o touchdown da pata - a posição extrema anterior, ou PEA - e terminando antes da decolagem - a posição extrema posterior, ou PEP (veja o exemplo na Figura 2C). O "agrupamento da pegada" do PEA e do PEP mede o desvio padrão das coordenadas médias de PEE ou PEP em cada vídeo. Os animais com LM apresentaram um aumento no agrupamento das pegadas da pata traseira para os PEA em todos os momentos, e um efeito significativo só foi observado para o grupo com lesão simulada a 15 dpi (Figura 4). Isso ilustra que os animais com LM não conseguiram posicionar corretamente os membros posteriores no touchdown após o balanço. Além disso, observou-se uma diminuição no "agrupamento da pegada" da pata anterior para a PEP, juntamente com uma diminuição na pegada da pata traseira para a PEP, a 30 dpi (Figura 4). Esses resultados estão de acordo com o observado nos "traços de postura" desenhados e sugerem que a posição das patas anteriores torna-se mais restrita após a lesão.
Finalmente, e de acordo com as alterações no posicionamento das patas, houve alterações nas estratégias de marcha e "pressão" provocadas pelas patas, medida pelo brilho médio sobre a área (Figura 4), que será discutida mais adiante.
Figura 4: Gráfico de mapa de calor mostrando uma coleta dos parâmetros locomotores significativamente alterados comparando animais com LM e animais lesionados simulados em relação ao dia anterior à cirurgia, como obtido pelo MW após análise de dados residuais. n = 10-11 por condição; O grupo basal inclui todos os animais na véspera da cirurgia, n = 21. Os dados são expressos pelo valor de p após análise estatística com ANOVA one-way seguida pelo teste post hoc de Tukey (para distribuições normais) ou post hoc de Dunn (para distribuições não normais). Os valores de P são representados por um código de cores, com tons de vermelho e azul indicando uma diminuição ou aumento em relação à linha de base, respectivamente. A tonalidade da cor representa a significância estatística, com cores mais escuras indicando maior significância e cores mais claras indicando menor significância; P < 0,001; **P < 0,01; *P < 0,05. O branco indica que não há variação. Abreviações: dpi = dias pós-lesão; LM = lesão medular; s = segundo; ms = milissegundo; média = média; F = dianteiro; H = posterior; PEA = posição do extremo anterior; PEP = posição extremo posterior; BF = dianteira esquerda; LH = traseira esquerda; RF = dianteira direita; UR = traseira direita. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Posteriormente, buscou-se entender quais parâmetros individuais seriam os melhores para descrever os déficits locomotores dos animais com LM em diferentes estágios da lesão (i.e., 15 dpi, 22 dpi e 30 dpi). Iniciamos examinando os parâmetros do ciclo do passo que mostraram diferenças entre os membros torácicos e os membros pélvicos à medida que os membros posteriores progrediam da paralisia total para a função parcial (Figura 5). Enquanto a velocidade média de oscilação aumentou significativamente para os membros torácicos em relação à linha de base (antes da lesão), a velocidade de oscilação dos membros posteriores não se alterou significativamente (embora houvesse uma tendência de ser menor que a basal) (Figura 5A,B). Paralelamente, o comprimento médio dos passos dos membros torácicos diminuiu, sem alterações significativas para os membros pélvicos (Figura 5C,D). Não surpreendentemente, os camundongos lesionados mostraram diminuição da duração do balanço dos membros torácicos e um aumento inverso na duração dos balanços dos membros posteriores a partir de 15 dpi (Figura 5E,F). Em conjunto, esses resultados indicam que os membros torácicos adotaram um ritmo mais rápido, com dois ciclos de membros torácicos para cada ciclo de membro pélvico. Essa relação ciclo 2:1 foi descrita anteriormente após hemissecção de LM em ratos 1,33 e ilustra um aspecto fundamental da coordenação defeituosa entre membros torádicos e membros posteriores, que não é recuperada após 30 dpi em camundongos.
Figura 5: Parâmetros do ciclo do passo para as patas dianteiras e traseiras em vários momentos 1 dia antes da lesão e a 15 dpi, 22 dpi e 30 dpi nos animais com LM (n = 11). (A,B) A velocidade média de oscilação das patas dianteiras e traseiras em relação à linha de base. (C,D) O comprimento médio do passo das patas dianteiras e traseiras em relação à linha de base. (E,F) A duração média do balanço para as patas dianteiras e traseiras em relação à linha de base. Nos boxplots, a mediana é representada pela linha média, e as bordas inferior e superior das caixas representam os quartis de 25% e 75%, respectivamente; Os bigodes representam o intervalo do conjunto de dados completo. Os outliers são representados por pontos únicos. A análise estatística foi realizada com ANOVA one-way, seguida pelo teste post hoc de Tukey (para distribuições normais) ou post hoc de Dunn (para distribuições não normais). *P < 0,05; **P < 0,01; P < 0,001. Abreviações: dpi = dias pós-lesão; LM = lesão medular; cm = centímetro; s = segundo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
O software MW também é capaz de calcular os padrões de passo de camundongos medindo a fração de quadros atribuídos a uma combinação específica de pernas, e isso funciona como um proxy para a presença de estratégias de marcha específicas. Em velocidades mais lentas, ratos não lesionados tendem a adotar uma "marcha ambulante", na qual a maioria dos quadros tem um balanço de uma perna (independentemente da posição da pata). Em velocidades intermediárias, mais comuns na pista, os ratos mudam para uma marcha de trote, na qual a configuração mais representativa é o balanço diagonal-perna. Finalmente, em velocidades mais elevadas, os camundongos utilizam uma "marcha a galope", com três pernas balançando ao mesmotempo23,34. Outras configurações menos comuns incluem a marcha cadenciada, representada principalmente pelo balanço lateral da perna (tanto da perna esquerda quanto da direita), e a "marcha amarrada/saltitante", com ambos os membros posteriores ou torácicos balançando simultaneamente10. No entanto, deve-se ter em mente que, no contexto de uma LM, algumas dessas configurações, como o balanço de três pernas, podem refletir um posicionamento defeituoso da pata do membro posterior e, portanto, não correspondem exatamente a uma estratégia específica de gaiting - no caso, o galope. Portanto, a análise foi simplificada comparando-se apenas as configurações das pernas.
Após a realização da análise de resíduos, verificou-se que houve diminuição da prevalência de oscilações diagonais acompanhada de diminuição de oscilações simples em todos os momentos (Figura 6A,B). Mais interessante, houve um aumento na prevalência de oscilações laterais (Figura 6C). A marcha tipo estimulação não é típica para um camundongo C57BL/6J normal; no entanto, já foi relatado que ocorre após hemissecção de LM em ratos1. Esse padrão de fase não foi prevalente o suficiente para alterar o índice de fase do membro torácico ou do membro pélvico (como visto na Figura 3), mas ilustra o feedback espinhal defeituoso dos membros posteriores para os membros torácicos. Além disso, houve um aumento natural na prevalência de oscilações de membros torácicos/membros pélvicos (Figura 6D), possivelmente devido ao passo plantar incorreto dos membros posteriores, e um aumento dos balanços tripodais (Figura 6E).
Figura 6: Os índices médios para diferentes configurações de stepping swing . (A) Diagonal, (B) único, (C) lateral, (D) anterior/posterior e (E) balanço de três pernas em vários momentos em animais com LM (n = 11) são mostrados. Nos boxplots, a mediana é representada pela linha média, e as bordas inferior e superior das caixas representam os quartis de 25% e 75%, respectivamente; Os bigodes representam o intervalo do conjunto de dados completo. Os outliers são representados por pontos únicos. A análise estatística foi realizada com ANOVA one-way, seguida do teste post hoc de Tukey (para distribuições normais) ou post hoc de Dunn (para distribuições não normais). **P < 0,01; P < 0,001. Abreviações: dpi = dias pós-lesão; LM = lesão medular; NA = não aplicável. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Finalmente, outra leitura que pode ser extraída do MW é a "pressão" como medida de brilho/área. Com velocidades maiores, a área de contato com o solo diminui e a pressão aumenta, então uma regressão linear dos dados basais foi realizada, e os valores residuais para cada condição foram medidos. Observou-se que a pressão sobre as patas dianteiras aumentou significativamente em todos os momentos, mas a força desse efeito tendeu a diminuir com o tempo, pois a mudança para a pata anterior esquerda já perdeu significância estatística aos 30 dpi (Figura 7A,C). Esse efeito específico no lado esquerdo poderia ser explicado por uma lesão lateralizada, que poderia ter afetado preferencialmente o lado direito da medula espinhal neste estudo. No entanto, a pressão exercida pelas patas traseiras foi diminuída nos camundongos lesados, como esperado, em todos os momentos, sem tendência ao aumento (Figura 7B,D).
Figura 7: Pressão provocada pelas patas traseira e dianteira em vários momentos nos animais com LM (n = 11). Pressão provocada pela (A) pata dianteira esquerda, (B) pata traseira esquerda, (C) pata dianteira direita e (D) pata traseira direita, mostradas como diferenças relativas em relação à linha de base (um dia antes da lesão). Nos boxplots, a mediana é representada como a linha média, e as bordas inferior e superior das caixas representam os quartis de 25% e 75%, respectivamente; Os bigodes representam o intervalo do conjunto de dados completo. Os outliers são representados por pontos únicos. A análise estatística foi realizada com ANOVA one-way, seguida do teste post hoc de Tukey (para distribuições normais) ou post hoc de Dunn (para distribuições não normais). **P < 0,01; P < 0,001. Abreviações: dpi = dias pós-lesão; LM = lesão medular; cm = centímetro; px = pixel. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Em conjunto, este estudo ilustra o poder do sistema MW para descrever quantitativamente os comprometimentos motores causados pela LM que, por vezes, podem ser desconsiderados devido a outras limitações do teste. Além disso, ressalta a recuperação funcional indubitavelmente limitada ao longo do tempo no modelo de contusão em camundongos com LME.
Figura suplementar 1: Os componentes de hardware MW. (A) Esta configuração é dividida da seguinte forma: I - passarela fTIR; II - base e postos de apoio fTIR; III - muro de passarela; IV - espelho de 45°; e V - luz de fundo. (B) Imagens em close-up do canal Base-U- e das laterais da passarela. (C) Projeto do muro da passarela. (D) Imagem em close-up da configuração do espelho de 45°. Abreviação: cm = centímetro. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura suplementar 2: Um único quadro de um vídeo fTIR no qual a intensidade do pixel e as áreas da região são indicadas. As intensidades de pixel para o corpo, fundo e pegadas usadas para a análise de vídeo neste estudo são apresentadas entre colchetes e indicadas em vermelho, todas otimizadas para a clareza da imagem. A intensidade luminosa deve ser ajustada para obter uma discriminação adequada entre as diferentes regiões. Áreas relativas do corpo e pegadas são indicadas por linhas amarelas tracejadas. Tanto as áreas quanto a intensidade dos pixels foram adquiridas no ImageJ/FIJI. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura 3 suplementar: (A) escore total da SNF e (B) subescore dos camundongos analisados neste estudo (n = 10-11). Todos os dados foram expressos como média ± EPM. A análise estatística foi realizada com ANOVA de duas vias para medidas repetidas, seguida do teste post hoc de Bonferroni; P < 0,001. Abreviação: BMS = Basso mouse scale. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura Suplementar 4: O peso atribuído de cada contribuição de parâmetro motor para cada componente. O peso atribuído de cada parâmetro motor (79 no total) após a análise residual para (A) CP1, (B) CP2 e (C) CP3 na ACP. A linha de corte foi traçada a 0,04 ms e −0,04. Abreviações: ms = milissegundo; média = média; DP = desvio padrão; F = dianteiro; H = posterior; PEA = posição do extremo anterior; PEP = posição extremo posterior; BF = dianteira esquerda; LH = traseira esquerda; RF = dianteira direita; UR = traseira direita; Pressione = pressão. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
Aqui, o potencial do método de MouseWalker é demonstrado pela análise do comportamento locomotor após LM. Ele fornece novos insights sobre alterações específicas nos padrões de pisada, pegada e marcha que, de outra forma, seriam perdidas por outros testes padrão. Além de fornecer uma versão atualizada do pacote MW, as ferramentas de análise de dados também são descritas usando os scripts Python fornecidos (consulte a etapa 5).
Como o MW gera um grande conjunto de dados e uma coleção de parâmetros cinemáticos que refletem um processo locomotor altamente dimensional, uma ACP foi empregada; de fato, a ACP tem sido amplamente utilizada em outros conjuntos de dados cinemáticos semelhantes a este27,35,36 (Figura 3). Esta técnica de redução de dimensionalidade é um método simples e robusto com pressupostos mínimos que permite identificar quantitativamente perfis cinemáticos e distingui-los rapidamente das condições de controle ou basais. Além disso, foram gerados mapas de calor para identificar prontamente os parâmetros estatisticamente diferentes da linha de base (Figura 4), que posteriormente puderam ser analisados individualmente (Figura 5, Figura 6 e Figura 7).
Posteriormente, foi demonstrado como parâmetros específicos que podem ser extraídos do MW ilustram os déficits locomotores robustos observados em animais com LM, como a coordenação. Coordenação é a capacidade de usar cada membro de forma organizada para executar uma tarefa. Muitas vezes, a coordenação é medida indiretamente pelo número de erros/eventos positivos em uma escada 16,17 ou pelo tempo gasto no rotarod15. Distintamente, o MW calcula tanto a variabilidade no posicionamento da pata durante o ciclo do passo (padrão da pegada) quanto o índice de "retidão de postura"27. Demonstrou-se que ambos os parâmetros foram significativamente afetados pela lesão (Figura 4).
Além disso, o MW permite ao usuário extrair parâmetros relacionados à dinâmica temporal. Observou-se uma ruptura significativa da duração do balanço/apoio nos animais com LM (Figura 4), e verificou-se que os camundongos com LM compensaram a perda de apoio nos membros pélvicos acelerando o ciclo do passo do membro torácico, reduzindo o comprimento do passo do membro torácico e o tempo médio de oscilação (Figura 5). Esse efeito pode estar relacionado ao deslocamento do centro de gravidade, que força as patas anteriores a suportarem mais peso corporal1. Da mesma forma, poderia ser atribuída à perda das longas vias ascendentes proprioespinhais, responsáveis pela interação sinérgica entre as VPCs do membro torácico e do membro pélvico1,9,32, levando à dissociação do ritmo do membro torácico-membro pélvico.
As características da marcha em passo podem ilustrar a organização modular das redes locomotoras 1,34. Embora os padrões de passo não sejam uma proxy direta para as estratégias de marcha adotadas neste caso23, algumas observações importantes ainda podem ser traçadas. Alterações importantes foram observadas nos padrões de passo de camundongos com LM (Figura 6). Os animais lesados passaram a adotar oscilações laterais (marchas cadenciadas), e houve também diminuição das oscilações diagonais. Essas adaptações parecem estar associadas a uma tentativa de coordenar os membros torácicos e os membros pélvicos, demonstrando novamente a dissociação entre os trajetos espinhais abaixo e acima da lesão, que não se recupera1,9,32.
A recuperação limitada após LM também foi verificada pela diminuição do vigor muscular nos membros pélvicos, medido pela pressão média (Figura 7). Consequentemente, os membros anteriores são forçados a suportar mais peso corporal, o que aumenta a pressão. Embora muitos parâmetros relacionados à dinâmica muscular não tenham sido aqui analisados (i.e., coordenação dos músculos flexores e extensores 7,21), essa medida quantitativa pode fornecer uma leitura direta da quantidade de apoio do membro.
Essa análise de MW também pode ser associada ao teste padrão de BMS, que mede a rotação dos membros, o posicionamento da pata, a posição da cauda e os erros de pisada. Geralmente, os camundongos com LM atingem uma pontuação máxima de 4-5, com um subescore máximo de 3, o que significa que eles podem executar passos ocasionais a frequentes, mas principalmente giram na decolagem e/ou pouso da pata14 (Figura 2 Suplementar). Fica claro por que os valores de PEA para as patas traseiras foram significativamente alterados no grupo LM, uma vez que o posicionamento não paralelo dos membros durante a fase de oscilação pode afetar as coordenadas da pata. Além disso, no SNF, o tronco é geralmente classificado como grave devido à presença de ocorrências ou eventos que impedem o pisado, como o bumbum e o pulo14. Embora não tenha sido possível quantificar o comportamento de descer o bumbum ou as ocorrências que impediam o passo, foi detectado passo restrito da pata traseira no MW, com maior duração do balanço (Figura 5F), aumento do balanço de três pernas (Figura 6E) e menor pressão (Figura 7B-D). Além disso, observou-se aumento significativo das oscilações ante/posteriores (Figura 6D). Poderia haver duas explicações complementares para essa manifestação comportamental. Primeiramente, foi mensurada a marcha tipo saltos, que já pôde ser observada no teste de SNF. No entanto, esse comportamento também pode estar relacionado à falta de passo plantar correto em ambos os membros pélvicos, resultando em arrasto ou posicionamento dorsal do pé. Em geral, essas observações apoiam a afirmação de que a estabilidade do tronco é severamente danificada após a LME. Por fim, um dos requisitos para obter pontuação maior que 5 no teste de SNF é a coordenação14 e, para isso, pelo menos três passes acessíveis devem ser observados pelos avaliadores durante o teste. Desses, dois dos três ou mais passes acessíveis precisam ser classificados como coordenados (ou seja, membros anteriores e posteriores alternados). Dos dados de MW, pode-se extrair medidas objetivas, o índice de retidão de apoio e o agrupamento das pegadas, que quantificam diretamente a coordenação independentemente da velocidade do animal ou do passe acessível (Figura 4). Além disso, a alternância entre os membros pode ser quantificada objetivamente por meio da mensuração das estratégias de passo (Figura 6). Esses parâmetros ilustram claramente que camundongos com LM consistentemente não conseguem andar em linhas retas e extraviam seus membros posteriores.
Embora a caixa de ferramentas de MW seja uma estratégia útil para o estudo de defeitos locomotores após LM, deve-se considerar algumas de suas limitações. Primeiro, é fundamental manter-se consistente com os parâmetros de aquisição (i.e., posição da câmera, foco, intensidade da luz) para que as características da imagem entre os pontos de tempo sejam mantidas. Em segundo lugar, percebeu-se que a repetição levava à habituação, que, por sua vez, levava a uma diminuição da velocidade. Isso também contribuiu para o aumento dos comportamentos de criação/tosa e paradas no meio do prazo. Para os animais feridos, também houve tendência a se apoiar nas paredes da passarela e aumento do número de paradas no meio da corrida. Como esses comportamentos não fazem parte da avaliação locomotora, não devem ser considerados. Preferencialmente, os pesquisadores devem escolher vídeos em que os animais andem continuamente com a cabeça apontada para a direita. Para neutralizar a influência desses comportamentos nos resultados deste estudo, os camundongos foram registrados continuamente por pelo menos quatro ou cinco corridas e autorizados a correr em qualquer direção ao longo da passarela. Em seguida, as três melhores corridas registradas foram selecionadas e ajustadas para a mesma direção no ImageJ/FIJI24 (rotação de 180°). Assim, cada animal foi representado por uma média de três corridas agrupadas por ponto de tempo. Um maior número de animais por condição também poderia diminuir a variabilidade esperada. Além disso, deve-se ressaltar que esse teste locomotor só é recomendado após a realização do passo plantar, uma vez que o sistema de rastreamento foi projetado para avaliação locomotora ajustada. Neste estudo, observou-se que antes de 15 dpi, o teste de MW não foi vantajoso para a avaliação locomotora devido ao aumento do arrasto dos pés e ao posicionamento plantar incorreto, o que poderia afetar a rastreabilidade (dados não mostrados). Por fim, alguns parâmetros (como o agrupamento de pegadas) são muito sensíveis às extrapolações feitas pelo modelo de regressão gerado. Portanto, o código foi ajustado de acordo (consulte a documentação no script no link do GitHub).
Em geral, demonstrou-se que o MW pode discriminar fortemente animais com LM de controles com lesão simulada, e o MW também pode ser associado a testes estabelecidos como um método valioso para estudar defeitos locomotores após LM. Além disso, foi mostrado que as saídas quantitativas poderiam ser facilmente geradas a partir do conjunto de dados MW usando os scripts Python fornecidos. Essas ferramentas fornecem um pipeline experimental eficiente para gerar um rico e diversificado conjunto de saídas quantitativas e gráficas que complementam os arquivos originais de saída de MW e podem ser alteradas para cumprir os objetivos do pesquisador em termos do tipo de análise e representação gráfica.
Esta caixa de ferramentas é um método valioso para estudar outras doenças motoras ou disfunções motoras, não apenas aquelas relacionadas à lesão medular. Skarlatou et al.10 já demonstraram que uma mutação específica na Afadina, importante proteína do arcabouço durante o desenvolvimento, causou um fenótipo aberrante na medula espinhal ao gerar dois canais centrais. Esse defeito resultou na perda da alternância do membro direito-esquerdo e maior prevalência de sincronização do membro, típica da marcha saltitante. Stauch et al.10 também ilustraram que esse tipo de sistema pode ser adaptado de acordo com a necessidade do usuário. Neste caso, foi aplicado para estudar déficits comportamentais específicos em um modelo de doença de Parkinson em ratos. Assim, esta caixa de ferramentas tem uma ampla gama de aplicações em diferentes modelos nos quais distúrbios motores são esperados e pode ser combinada com protocolos de comportamento já estabelecidos no campo.
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Disclosures
Os autores declaram não ter interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Os autores agradecem a Laura Tucker e Natasa Loncarevic pelos comentários sobre o manuscrito e pelo apoio dado pelo Serviço de Roedores do Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes. Os autores agradecem o apoio financeiro dos Prémios Santa Casa Neurociências - Prémio Melo e Castro para Investigação em Lesão Medular (MC-36/2020) a L.S. e C.S.M. Este trabalho foi apoiado pela Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) (PTDC/BIA-COM/0151/2020), iNOVA4Health (UIDB/04462/2020 e UIDP/04462/2020), e LS4FUTURE (LA/P/0087/2020) ao C.S.M. L.S. foi apoiado por um contrato de Investigador Principal Individual do CEEC (2021.02253.CEECIND). A A.F.I. foi apoiada por uma bolsa de doutoramento da FCT (2020.08168.BD). A.M.M. foi apoiado por uma bolsa de doutoramento da FCT (PD/BD/128445/2017). I.M. foi apoiado por uma bolsa de pós-doutoramento da FCT (SFRH/BPD/118051/2016). O D.N.S. foi apoiado por uma bolsa de doutoramento da FCT (SFRH/BD/138636/2018).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 45º Mirror | |||
| 2 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 16 cm height, 1 on each side | Misumi | ||
| 2 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 23 cm, @ 45° , 1 on each side | Misumi | ||
| 1 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 83 cm long | Misumi | ||
| 87 x 23 cm mirror | General glass supplier | ||
| black cardboard filler | General stationery supplier | We used 2, one with 69 x 6 cm and another with 69 x 3cm to limit the reflection on the mirror | |
| Background backlight | |||
| 109 x 23 cm plexiglass (0.9525 cm thick) | General hardware supplier | ||
| 2 lateral aluminum extrusion (4 x 4 cm), 20 cm long, 1 on each side | Misumi | ||
| multicolor LED strip | General hardware supplier | ||
| white opaque paper to cover the plexyglass | General stationery supplier | ||
| fTIR Support base and posts | |||
| 2 aluminum extrusion (4 x 4 cm), 100 cm height | Misumi | ||
| 60 x 30 cm metric breadboard | Edmund Optics | #54-641 | |
| M6 12 mm screws | Edmund Optics | ||
| M6 hex nuts and wahers | Edmund Optics | ||
| fTIR Walkway | |||
| 109 x 8.5 cm plexyglass (1.2 cm thick) | General hardware supplier | 109 x 8.5 cm plexyglass (1.2 cm thick) | |
| 109 cm long Base-U-channel aluminum with 1.6 cm height x 1.9 cm depth thick folds (to hold the plexyglass) | General hardware supplier | ||
| 2 lateral aluminum extrusion (4 x 4 cm) 20 cm length, 1 on each side | Misumi | ||
| black cardboard filler | General stationery supplier | we used 2 fillers on each side to cover the limits of the plexyglass, avoiding bright edges | |
| M6 12 mm screws | Edmund Optics | ||
| High speed camera (on a tripod) | |||
| Blackfly S USB3 | FLIR | #BFS-U3-32S4M-C | This is a reccomendation. The requirement is to record at least 100 frames per second |
| Infinite Horizon Impactor | |||
| Infinite Horizon Impactor | Precision Systems and Instrumentation, LLC. | #0400 | |
| Lens | |||
| Nikon AF Zoom-Nikkor 24-85mm | Nikon | #1929 | This lens is reccomended, however other lens can be used. Make sure it contains a large aperture (i.e., smaller F-stop values), to capture fTIR signals |
| Software | |||
| MATLAB R2022b | MathWorks | ||
| Python 3.9.13 | Python Software Foundation | ||
| Anaconda Navigator 2.1.4 | Anaconda, Inc. | ||
| Spyder 5.1.5 | Spyder Project Contributors | ||
| Walkway wall | |||
| 2 large rectagular acrilics with 100 x 15 cm | Any bricolage convenience store | ||
| 2 Trapezian acrilic laterals with 6-10 length x 15 cm height | Any bricolage convenience store | ||
| GitHub Materials | |||
| Folder name | URL | ||
| Boxplots | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Boxplots | Script to create Boxplots | |
| Docs | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Docs | Additional documents | |
| Heatmap | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Heatmaps | Script to create heatmap | |
| Matlat script | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Matlab%20Script | MouseWalker matlab script | |
| PCA | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/PCA%20plots | Script to perform Principal Component Analysis | |
| Raw data Plots | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Rawdata%20Plots | Script to create Raw data plots | |
| Residual Analysis | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Residual_Analysis | Code to compute residuals from Raw data |
References
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