Summary
Предоставляется экспериментальный конвейер для количественного описания локомоторного паттерна свободно ходящих мышей с использованием набора инструментов MouseWalker (MW), начиная от первоначальных видеозаписей и отслеживания и заканчивая постколичественным анализом. Модель ушиба спинного мозга у мышей используется для демонстрации полезности системы MW.
Abstract
Выполнение сложных и высоко скоординированных двигательных программ, таких как ходьба и бег, зависит от ритмической активации спинальных и надспинальных цепей. После травмы грудного отдела спинного мозга нарушается связь с вышестоящими цепями. Это, в свою очередь, приводит к потере координации, с ограниченным потенциалом восстановления. Следовательно, чтобы лучше оценить степень выздоровления после введения лекарств или терапии, необходимы новые, более подробные и точные инструменты для количественной оценки походки, координации конечностей и других тонких аспектов двигательного поведения на животных моделях повреждения спинного мозга. За прошедшие годы было разработано несколько анализов для количественной оценки поведения грызунов при свободном хождении; Однако им обычно не хватает прямых измерений, связанных со стратегиями шаговой походки, паттернами следа и координацией. Для устранения этих недостатков предоставляется обновленная версия MouseWalker, которая сочетает в себе проход полного внутреннего отражения (fTIR) с программным обеспечением для отслеживания и количественной оценки. Эта система с открытым исходным кодом была адаптирована для извлечения нескольких графических выходных данных и кинематических параметров, а набор инструментов постколичественной оценки может быть предназначен для анализа предоставленных выходных данных. Эта рукопись также демонстрирует, как этот метод, в сочетании с уже установленными поведенческими тестами, количественно описывает двигательный дефицит после травмы спинного мозга.
Introduction
Эффективная координация четырех конечностей характерна не только для четвероногих животных. Координация передних и задних конечностей у людей по-прежнему важна для выполнения нескольких задач, таких как плавание и изменение скорости при ходьбе1. Различные кинематические2 конечностей и двигательная программа 1,3,4, а также проприоцептивные цепиобратной связи 5 сохраняются между людьми и другими млекопитающими и должны учитываться при анализе терапевтических возможностей при двигательных расстройствах, таких как повреждение спинного мозга (ТСМ)6,7,8.
Для того, чтобы ходить, несколько позвоночных соединений от передних и задних конечностей должны быть правильно подключены и ритмично активированы, что требует входных данных от мозга и обратной связи от соматосенсорной системы 2,9,10. Эти связи достигают кульминации в центральных генераторах паттернов (CPG), которые расположены на шейном и поясничном уровнях для передних и задних конечностей, соответственно 1,9,10. Часто после ТСМ нарушение нейронных связей и образование ингибирующего глиального рубца12 ограничивают восстановление двигательной функции, при этом исходы варьируются от полного паралича до ограниченной функции группы конечностей в зависимости от тяжести травмы. Инструменты для точной количественной оценки опорно-двигательной функции после ТСМ имеют решающее значение для мониторинга выздоровления и оценки эффектов лечения или других клинических вмешательств6.
Стандартным метрическим анализом для моделей ушиба мышей при ТСМ является шкала мышей Бассо (BMS)13,14, непараметрическая оценка, которая учитывает устойчивость туловища, положение хвоста, подошвенный шаг и координацию передних и задних конечностей на арене открытого поля. Несмотря на то, что BMS чрезвычайно надежен для большинства случаев, для наблюдения за всеми углами движения животных требуется, по крайней мере, два опытных оценщика, чтобы учесть естественную изменчивость и уменьшить смещение.
Другие анализы также были разработаны для количественной оценки двигательных характеристик после ТСМ. К ним относятся испытание ротародом, в ходе которого измеряется время, затраченное на вращающийся цилиндр15; горизонтальная лестница, которая измеряет количество пропущенных перил и положительных захватовлестницы 16,17; и тест на ходьбу по лучу, который измеряет время, необходимое животному, и количество отказов, которые оно совершает при пересечении узкой балки18. Несмотря на то, что они отражают комбинацию двигательного дефицита, ни один из этих тестов не дает прямой локомоторной информации о координации передних и задних конечностей.
Чтобы конкретно и более тщательно проанализировать поведение при ходьбе, были разработаны другие анализы для реконструкции циклов шагов и стратегий ходьбы. Одним из примеров является тест на след, когда нарисованные чернилами лапы животного рисуют узор на листе белой бумаги19. Несмотря на простоту выполнения, извлечение кинематических параметров, таких как длина шага, является громоздким и неточным. Кроме того, отсутствие динамических параметров, таких как продолжительность цикла шага или координация ног, ограничивает его применение; Действительно, эти динамические параметры можно получить, только анализируя покадровые видео грызунов, идущих по прозрачной поверхности. Для исследований SCI исследователи проанализировали поведение при ходьбе с бокового обзора с использованием беговой дорожки, включая реконструкцию цикла шагов и измерение угловых вариаций каждого сустава ног 4,20,21. Несмотря на то, что этот подход может быть чрезвычайно информативным6, он по-прежнему ориентирован на определенный набор конечностей и не имеет дополнительных особенностей походки, таких как координация.
Чтобы восполнить эти пробелы, Хамерс и его коллеги разработали количественный тест на основе оптического сенсорного датчика с использованием фрустрированного полного внутреннего отражения (fTIR)22. В этом методе свет распространяется через стекло через внутреннее отражение, рассеивается при нажатии на лапу и, наконец, улавливается высокоскоростной камерой. Совсем недавно была выпущена версия этого метода с открытым исходным кодом, называемая MouseWalker, и этот подход сочетает в себе проход fTIR с пакетом программного обеспечения для отслеживания и количественной оценки23. Используя этот метод, пользователь может извлечь большой набор количественных параметров, включая шаги, пространственные и походочные паттерны, позиционирование следа и координацию передних и задних конечностей, а также визуальные выходы, такие как паттерны следа (имитирующие анализ чернильной лапы6) или фазы стойки относительно оси тела. Важно отметить, что из-за его природы с открытым исходным кодом новые параметры могут быть извлечены путем обновления пакета сценариев MATLAB.
Здесь обновлена ранее опубликованная сборка системы MouseWalker23 . Предоставляется описание того, как его настроить, со всеми шагами, необходимыми для достижения наилучшего качества видео, условий отслеживания и получения параметров. Также используются дополнительные инструменты постколичественной оценки для улучшения анализа выходного набора данных MouseWalker (MW). Наконец, полезность этого инструмента демонстрируется получением количественных значений общих двигательных характеристик, в частности циклов шагов и координации передних и задних конечностей, в контексте травмы спинного мозга (ТСМ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры по обращению, хирургии и послеоперационному уходу были одобрены Комитетом по молекулярному внутреннему уходу Института медицины (ORBEA) и Португальским комитетом по этике животных (DGAV) в соответствии с руководящими принципами Европейского сообщества (Директива 2010/63/ЕС) и португальским законом об уходе за животными (DL 113/2013) в соответствии с лицензией 0421/000/000/2022. Для настоящего исследования использовались самки мышей C57Bl/6J в возрасте 9 недель. Были приложены все усилия, чтобы свести к минимуму количество животных и уменьшить страдания животных, использованных в исследовании. Скрипт MATLAB и автономная версия программного обеспечения MW имеют открытый исходный код и доступны на GitHub
репозиторий (https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker). Хотя программное обеспечение MW было разработано в MATLAB R2012b, оно было адаптировано для работы в MATLAB R2022b. На рисунке 1 показан рабочий процесс анализа MW.
1. Настройка аппарата MouseWalker (MW)
- Соберите аппарат MW, как описано ранее23, или адаптируйте его к конкретным потребностям экспериментального проекта (см. Таблицу материалов и дополнительный рисунок 1 для получения более подробной информации об установке).
ПРИМЕЧАНИЕ: Прогулочную арену можно сделать шире, чтобы разместить более крупных животных, таких как крысы. -
Убедитесь, что плексиглас, на котором гуляют животные, чистый и без царапин. Используйте гладкую чистящую ткань и сведите к минимуму использование органических растворителей, таких как аммиак или этанол в высоких концентрациях, которые могут повредить оргстекло (рекомендуется 3% перекись водорода, 7% этанол или любое совместимое и подходящее дезинфицирующее средство для оргстекла). При необходимости замените оргстекло.
- Настройте высокоскоростную камеру с светосильным объективом и большой диафрагмой (т. е. меньшими значениями диафрагмы) для захвата большого количества света, так как это помогает записывать сигналы fTIR (см. Таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Объектив не должен создавать оптические искажения, особенно по краям изображения. Оптические искажения можно проверить, записав известную картину (например, полосы или квадраты), а затем измерив размер блоков на ImageJ/FIJI24 (используйте инструмент «Линия», а затем нажмите « Анализировать» > «Измерить»). Например, квадрат размером 1 см должен иметь одинаковые размеры в пикселях как в центре изображения, так и по краям. Вариации должны быть менее 5%. - Зажгите разноцветную светодиодную ленту от фонового светового короба.
- Зажгите белую светодиодную ленту от светового короба дорожки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Цветной светодиод также может быть использован25 для облегчения различения посадочного места/тела/фона. - При выключенном свете в комнате проверьте интенсивность света фонового светового короба и дорожки. Отрегулируйте интенсивность, при необходимости, с помощью потенциометра или полупрозрачного пластика. Они должны быть оптимизированы таким образом, чтобы интенсивность пикселей увеличивалась в следующем порядке: тело животного < фон < следы.
- Чтобы проверить интенсивность пикселей тела/фона/следов животного, откройте последовательность изображений на ImageJ/FIJI24 и нажмите « Проанализировать > измерить». Сигнал следа не должен быть перенасыщен, так как это предотвратит определение границ следа (т. е. пальцев ног и подушечек стопы) (дополнительный рисунок 2).
- Отрегулируйте контрастность изображения дорожки с помощью программного обеспечения для записи видео. Контрастность можно регулировать двумя способами: затемнив или увеличив освещение на светодиодной ленте или отрегулировав диафрагму объектива камеры.
- Правильно расположите объектив так, чтобы он находился на одной высоте и в центре отражающего зеркала под углом 45° и перпендикулярно (90°) дорожке. Это будет генерировать постоянно пропорциональное изображение вдоль дорожки слева и справа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте изменения положения камеры (расстояния, высоты и ориентации) во время нескольких сеансов записи. При необходимости разметьте пол, на котором должен быть размещен штатив. Это сохранит характеристики изображения. - Сфокусируйте линзу на поверхности оргстекла. Это можно проверить с помощью не повреждающего предмета, касающегося поверхности оргстекла.
ПРИМЕЧАНИЕ: При более низких значениях диафрагмы объектива глубина резкости будет уменьшаться, что затруднит фокусировку. - Убедитесь, что все настройки остаются неизменными во время анализа, так как они могут изменить интенсивность пикселей записанных видео.
2. Получение видео
- Перед тестированием убедитесь, что мыши знакомы с помещением и аппаратом. Отложите хотя бы 1 день для привыкания (день 0). Чтобы избежать чрезмерных тренировок, выполняйте тест MW в день, отличный от других поведенческих тестов (желательно на следующий день).
- В программном обеспечении для записи видео убедитесь, что видно не менее 50 см дорожки.
- Отрегулируйте параметры записи, чтобы усечь область дорожки. Это уменьшит размер видео и оптимизирует получение видео.
- Фотографируйте или снимайте на видео обычную линейку перед каждым сеансом. Количество пикселей на сантиметр позже будет использоваться в «окне настроек» для калибровки видео.
- Начните сбор видео и поместите животное на край дорожки, взявшись за основание хвоста, чтобы избежать травм. Следите за тем, чтобы животные двигались вперед к крайнему краю платформы. Выполняйте видеозаписи со скоростью не менее 100 кадров в секунду, чтобы обеспечить плавные переходы походки.
- При необходимости мотивируйте животных двигаться, осторожно постукивая по стене дорожки или щелкая/хлопая пальцами. Однако избегайте физического подталкивания, так как это может повлиять на результаты.
- Сохраняйте видео непосредственно в виде последовательностей изображений в формате TIFF (со сжатием LZW), JPEG или PNG. Если камера записывает в виде необработанного файла MOV, преобразуйте видео в последовательности изображений, открыв файл в ImageJ / FIJI24 и щелкнув «Файл» > «Сохранить как последовательность изображений> (или с помощью другого программного обеспечения, такого как LosslessCut25).
ПРИМЕЧАНИЕ: Большинство животных начинают ходить сразу после того, как их ставят на дорожку; Поэтому рекомендуется начать видеосъемку перед размещением животного.
3. Подготовка видеороликов для программного обеспечения для отслеживания MW
- Снимайте достаточно полных прогонов каждой отдельной мыши. Количество животных для съемки в каждом состоянии и количество полных прогонов должны определяться в соответствии с каждым экспериментальным проектом. Полный пробег — это когда мышь проходит все 50 см дорожки без длительных остановок (в этом эксперименте было выбрано три полных пробега).
ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от программного обеспечения для получения изображений видео может потребоваться обрезать до наименьшей рентабельности инвестиций. Это увеличит скорость отслеживания и генерации вывода. - В ImageJ/FIJI24 выберите кадры, в которых мышь находится на экране, щелкнув Image > Stack > Tools > Make a substack. Слежение на MW требует, чтобы голова и хвост были видны на всех кадрах. Однако можно сделать несколько подстеков из одной видеозаписи, которые позже будут представлять каждый прогон.
- Сохраните каждый подстек отдельно в разных папках, щелкнув « Файл» > «Сохранить как последовательность изображений>». Программное обеспечение MW позже автоматически создает подпапку в каждом каталоге каждый раз, когда кто-то начинает анализировать запуск.
4. Отслеживание
- Откройте MATLAB, добавьте папку, содержащую сценарий MW, в рабочий каталог и запустите «MouseWalker.m» в главной командной строке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Использование программного обеспечения MW в MATLAB позволяет отслеживать сообщения об ошибках, которые можно просматривать на главной консоли MATLAB и выбирать желаемые выходные данные (открыв основной файл сценария «MouseEvaluate.m» и изменив выходные данные на 1 или 0: файл Excel, графики шагов, следы стойки и паттерны походки). - Загрузите папку с видео как «Входной каталог». Можно также выбрать выходную папку; однако это не является обязательным требованием, поскольку программное обеспечение MW автоматически создает новую папку с именем «Результаты» внутри «Входного каталога».
- С помощью стрелок «<<», «<», «>>» и «>» проверьте, правильно ли загружены все видеокадры внутри программного обеспечения MW.
- Перейдите в «Окно настроек», где находятся все параметры калибровки и порога. Эти настройки могут изменяться в зависимости от интенсивности пикселей фона и посадочных мест, а также от минимального размера корпуса и посадочных мест, а также от других факторов (см. пример на дополнительном рисунке 2). Протестируйте эффект изменения некоторых параметров, нажав на кнопку Предварительный просмотр .
- Используйте различные стили графика, в том числе «тело + ноги + хвост», «только тело», «только ноги» и «только хвост», чтобы помочь различить части тела после настройки пороговых параметров.
- Воспользуйтесь инструментами на правой боковой панели, чтобы измерить яркость или размер (с помощью кнопок «яркость» и «линейка» соответственно). Все настройки могут быть сохранены как «по умолчанию» до тех пор, пока расстояние до камеры остается прежним.
- После настройки пороговых параметров убедитесь, что видео готово к автоматическому отслеживанию. Перейдите к первому кадру и нажмите « Авто », чтобы начать отслеживание. Этот шаг можно выполнить в режиме реального времени, и он занимает несколько минут, в зависимости от размера видео и производительности компьютера.
- Если автоматическое отслеживание неправильно помечает функции тела, отмените автоматическое отслеживание, введите новые настройки и перезапустите процесс.
- После завершения отслеживания проверьте, не требуется ли ручная коррекция. Чтобы исправить ситуацию, используйте среднюю панель для выбора или отмены выбора и укажите расположение правого переднего (RF), правого заднего (RH), левого переднего (LF) и левого заднего (LH) следов лап, головы, носа, тела (разделенных на два сегмента) и положения хвоста (разделенных на четыре сегмента). Сохраните изменения, нажав кнопку Сохранить .
ПРИМЕЧАНИЕ: Все кнопки и большинство команд имеют сочетание клавиш (подробности см. в соответствующем руководстве23). Для облегчения прокрутки видео и выполнения сочетаний клавиш можно использовать аппаратный контроллер с программируемыми кнопками и челночным колесом, как у Contour ShuttlePro V2. - Нажмите « Оценить », чтобы сгенерировать выходные файлы из отслеживаемого видео. В зависимости от выбранного желаемого результата (см. шаг 4.1) этот шаг может занять несколько минут.
- Убедитесь, что все графики графических выходных данных сохранены в папке «Результаты». Проверьте точность отслеживания, изучив некоторые графические результаты, такие как «Следы стойки», где можно проверить, все ли положения лап согласованы.
- Если обнаружена ошибка, вручную исправьте отслеживание (если это возможно; в противном случае удалите папку «Результаты» и снова выполните автоматическое отслеживание с новыми настройками) и снова нажмите на команду «Оценить ».
- Убедитесь, что все количественные измерения, сгенерированные программным обеспечением MW, сохраняются в электронной таблице Excel и суммируются в «1. Info_Sheet». Убедитесь, что параметры Excel для разделителей формул соответствуют сценарию. Десятичный разделитель должен быть «,», а тысячные разделители должны быть «;».
- Используйте сценарий "MouseMultiEvaluate.m" для объединения измерений из всех запусков в новый файл для анализа.
- Для начала сгенерируйте .txt файл, содержащий пути к папкам для всех видео (например, «Видеофайлы.txt»). Убедитесь, что каждая строка соответствует одному видео.
- Затем напишите «MouseMultiEvaluate('Videofiles.txt')» в командную строку. В рабочем каталоге будет сгенерирован файл Excel с именем «ResultSummary.xls» (см. пример в репозитории GitHub).
ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 2 представлены графические выходы, полученные программным обеспечением MW из видеозаписей одного зарегистрированного животного.
5. Рабочий процесс анализа кинематических данных
- Отредактируйте лист Excel, созданный на шаге 4.10, который содержит данные для обработки с помощью предоставленных скриптов Python, в соответствии со следующими предварительными требованиями.
- В заголовке первого столбца укажите условие эксперимента. Назовите каждую строку после имени группы/условия (пользователи из одних и тех же групп должны иметь одно и то же имя). Первая группа должна быть контрольной или базовой линией (это обязательно только для построения тепловой карты, шаг 5.6).
- Во втором столбце укажите идентификатор животного. Это обязательно, хотя эта информация не будет использоваться для генерации графика.
- В третьем столбце выберите параметры двигателя, которые будут использоваться для анализа. Убедитесь, что в первой строке указано имя параметра (эти имена позже появятся на графиках).
- Откройте Anaconda Navigator и запустите Spyder, чтобы открыть предоставленные скрипты Python.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все скрипты были разработаны с помощью Python 3.9.13, были выполнены с помощью Spyder 5.2.2 в Anaconda Navigator 2.1.4 и доступны в таблице материалов и репозитории GitHub (куда включены дополнительные материалы, такие как пример видео, файл примера Excel и документ часто задаваемых вопросов). Можно выполнять скрипты вне Anaconda Navigator; Однако этот графический пользовательский интерфейс более удобен для пользователя. - Используйте «Rawdata_PlotGenerator.py» для создания графиков необработанных данных. Это позволит визуализировать каждый параметр в зависимости от скорости.
- Откройте «Rawdata_PlotGenerator.py» в Spyder и запустите код, нажав кнопку «Воспроизвести ».
- Выберите файл Excel для анализа и имя листа в автоматическом окне. Если название листа не было изменено, напишите «Лист1».
- Графики необработанных данных появятся в консоли графика (верхняя правая панель). Чтобы сохранить графики, нажмите кнопку «Сохранить изображение » или « Сохранить все изображения » в консоли графика.
- Используйте скрипт "Residuals_DataAnalysis" для расчета остатков для анализа данных. Этот скрипт сгенерирует CSV-файл с расчетами остатков для всех параметров двигателя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Многие из измеренных параметров походки, извлеченных MW, изменяются в зависимости от скорости (например, скорость качания, длина шага, продолжительность стойки, прямолинейность стойки и индексы походки). Поэтому рекомендуется выполнить наиболее подходящую регрессионную модель зависимости каждого отдельного параметра от скорости для базового эксперимента, а затем определить остаточные значения для каждой экспериментальной группы по отношению к этой регрессионной модели. Затем данные выражаются в виде разницы с остаточной нормализованной строкой26.- Откройте «Residuals_DataAnalysis.py» в Spyder и запустите код, нажав кнопку «Воспроизвести ».
- Выберите файл Excel для анализа и имя листа в автоматическом окне. Если название листа не было изменено, напишите «Лист1».
- Сохраните CSV-файл в той же папке, что и данные. Обязательно, чтобы элемент управления (или базовый план) был первой группой в файле Excel.
- Используйте сценарий «PCA_PlotGenerator.py» для выполнения анализа главных компонент (PCA).
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот неконтролируемый метод уменьшения размерности используется для получения более краткого представления27,28,29 данных (рис. 3A, B). Сценарий PCA включает в себя следующие шаги. Данные сначала предварительно обрабатываются путем центрирования и масштабирования, после чего алгоритм PCA вычисляет ковариационную матрицу для определения корреляций между переменными и вычисляет собственные векторы и собственные значения ковариационной матрицы для идентификации основных компонентов. Первые два или три основных компонента выбираются для представления данных на 2D или 3D графиках соответственно. Каждая точка на графиках соответствует животному и представляет собой отдельную абстрактную переменную. Точки с цветовой кодировкой используются для различения конкретных групп. Таким образом, скопления точек отражают схожие паттерны ходьбы, общие для соответствующих людей.- Откройте «PCA_PlotGenerator.py» в Spyder и запустите код, нажав кнопку «Воспроизвести ».
- Выберите файл Excel для анализа и имя листа в автоматическом окне. Если название листа не было изменено, напишите «Лист1».
- Убедитесь, что 2D- и 3D-графики PCA отображаются в консоли печати (верхняя правая панель). Каждый цвет представляет отдельную группу, и легенда появляется рядом с графиком. Чтобы сохранить сюжет, нажмите « Сохранить изображение » в консоли сюжета.
- Используйте «Heatmap_PlotGenerator.py» для создания тепловой карты. Убедитесь, что генератор тепловой карты создает таблицу, показывающую статистические различия между базовой группой (или контрольной группой) и другими группами для каждого параметра27 двигателя (рис. 4). В каждом столбце изображена одна группа, и каждая строка относится к определенному параметру двигателя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Статистический анализ проводился с помощью одностороннего ANOVA, за которым следовал тест Тьюки post hoc (для нормальных распределений) или ANOVA Крускала-Уоллиса, за которым следовал тест Данна post hoc (для ненормальных распределений). Выбросы были исключены из анализа. P-значения представлены цветовым кодом, с красными и синими оттенками, указывающими на увеличение или уменьшение относительно контроля (или базового уровня) соответственно. Цветовой оттенок представляет статистическую значимость, при этом более темные цвета показывают более высокую значимость, а более светлые цвета показывают меньшую значимость. соответствует P < 0,001; ** соответствует P < 0,01; и * соответствует P < 0,05. Белый цвет указывает на отсутствие изменений.- Откройте «Heatmap_PlotGenerator.py» в Spyder и запустите код, нажав кнопку «Воспроизвести ».
- Выберите файл Excel для анализа и имя листа в автоматическом окне. Если название листа не было изменено, напишите «Лист1».
- Во втором автоматическом окне выберите тип данных: необработанные данные или данные об остатках. Если параметр не выбран, по умолчанию используются данные об остатках.
- Тепловая карта появится в консоли графика (верхняя правая панель). Чтобы сохранить сюжет, нажмите « Сохранить изображение » в консоли сюжета.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно, чтобы элемент управления (или базовый план) был первой группой в файле Excel.
- Используйте «Boxplots_PlotGenerator.py» для создания блочных диаграмм. Этот инструмент позволит создавать прямоугольные диаграммы, представляющие распределение значений для всех параметров двигателя для каждой группы (рис. 5, рис. 6 и рис. 7).
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая рамка содержит медиану в качестве средней линии, а нижний и верхний края прямоугольников представляют собой квартили 25% и 75% соответственно. Усы представляют собой диапазон полного набора данных, исключая выбросы. Выбросы определяются как любое значение, которое в 1,5 раза превышает межквартильный диапазон ниже или выше квартилей 25% и 75% соответственно.- Откройте «Boxplots_PlotGenerator.py» в Spyder и запустите код, нажав кнопку «Воспроизвести ».
- Выберите файл Excel для анализа и имя листа в автоматическом окне. Если название листа не было изменено, напишите «Лист1».
- Во втором автоматическом окне выберите тип данных: необработанные данные или данные об остатках. Если параметр не выбран, по умолчанию используются данные об остатках.
- Прямоугольные диаграммы появятся в консоли графика (верхняя правая панель). Чтобы сохранить графики, нажмите кнопку «Сохранить изображение » или « Сохранить все изображения » в консоли графика.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Стандартная система BMS описывает общий двигательный дефицит после SCI14. Из-за его субъективного характера другие количественные анализы обычно проводятся вместе с BMS для получения более подробной и точной оценки локомоции. Тем не менее, эти тесты не показывают конкретной информации о циклах шагов, паттернах шагов и координации передних и задних конечностей, что чрезвычайно важно для понимания того, как схема позвоночника поддерживает функцию и адаптируется к неполной ТСМ. В этом разделе показано, как набор инструментов MW может помочь контролировать восстановление двигательной функции после ТСМ и добавить соответствующую информацию о поведении при ходьбе.
Исследуемая выборка была разделена на две группы самок мышей C57Bl/6J в возрасте 9 недель: экспериментальная группа ТСМ (n = 11), в которой животным была выполнена ламинэктомия с последующей умеренной и тяжелой контузией на уровне позвоночника T9/T10 с использованием ударного элемента бесконечного горизонта (см. Таблицу материалов); и контрольная группа с фиктивной травмой (n = 10), в которой на том же уровне колонки была выполнена только ламинэктомия (рис. 1, шаг 1). Мониторинг двигательного поведения ТСМ и фиктивно травмированных животных проводился в течение 30 дней. Тест MW проводили за день привыкания до операции (исходный уровень) и через 15 дней, 22 дня и 30 дней после травмы (dpi) (рис. 1, шаг 2). Для сравнения, мыши были подвергнуты тесту BMS параллельно перед операцией и при 1 dpi, 3 dpi, 7 dpi, 14 dpi, 21 dpi и 30 dpi (дополнительный рисунок 3). После отслеживания всех видео, полученных с помощью MW, были сгенерированы два типа выходных файлов: графические выходы, показывающие визуальные представления нескольких параметров после каждого запуска, и кинематические выходы, суммирующие все измеримые параметры двигателя (рис. 1, шаг 3 и шаг 4).
Следовательно, с помощью набора скриптов Python (см. Таблицу материалов и ссылку на репозиторий GitHub) были получены графики необработанных данных (рисунок 1, шаг 5). Поскольку на большинство параметров влияет скорость животного, была выполнена регрессионная модель исходной группы до травмы вместе с измеренными остаточными значениями для каждого состояния (рис. 1, шаг 6). Для проверки кинематических профилей и значимых различий между контрольной (фиктивной) и экспериментальной группами (SCI) все кинематические параметры (всего 79) были подвергнуты анализу главных компонент трех порядков (PCA), и была создана тепловая карта с набором параметров двигателя, которые лучше всего описывали набор данных (всего 33) (рис. 1, шаг 7a, b). Наконец, конкретные двигательные параметры, которые были затронуты после ТСМ, сравнивались с исходным уровнем до травмы (рис. 1, шаг 7c).
Рисунок 1: Схематическое изображение рабочего процесса анализа MW. (1) Животные отбираются для ламинэктомии (фиктивная контрольная группа) или ламинэктомии с последующей травмой спинного мозга (экспериментальная группа). (2) Затем животных подвергают поведенческому анализу за день до травмы и на 15, 22 и 30 дни после травмы. (3) MW генерирует два типа выходных данных: (а) графическая визуализация нескольких параметров, таких как следы положения, походка и паттерны шагов, и (б) кинематическая сводка всех измеримых параметров двигателя. (4) Все контрольные и экспериментальные данные объединяются в один файл с помощью скрипта «MouseMultiEvaluate.m» в MATLAB. (5) Сценарий «RawData_PlotGenerator» для Python генерирует визуальное представление того, как все измеримые параметры двигателя изменяются в зависимости от скорости. Если параметры не коррелируют со скоростью, можно перейти к (7); однако, поскольку большинство параметров после SCI сильно зависят от скорости, модель должна быть сгенерирована (6) с использованием скрипта «Residual_DataAnalysis» для Python. После генерации остаточных значений для каждого параметра двигателя проводится анализ данных (7): (а) анализ главных компонент (PCA) выполняется с использованием выбора параметров с помощью сценария «PCA_PlotGenerator»; b) с помощью сценария «Heatmap_PlotGenerator» создается тепловая карта, показывающая статистически значимые различия между условиями для различных параметров; и в) несколько отдельных параметров, которые изменяются после того, как SCI оцениваются с помощью сценария «BoxPlot_PlotGenerator». Все скрипты доступны в таблице материалов и по ссылке на репозиторий GitHub. Скрипты показаны красным цветом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
На основе графических выходных данных, собранных с МВт, можно было подтвердить хорошо известное резкое изменение визуального отображения следов после SCI. В анализе «Цифровые чернила», сгенерированном MW, было обнаружено отсутствие поддержки задних лап (рис. 2A), а также уменьшение площади следа как для левой, так и для правой задних лап (рис. 2B), которое сохранялось с 15 dpi и далее (данные не показаны). Кроме того, в каждом цикле шага MW вычисляет параметры, связанные с фазой стойки (т. е. временем между приземлением лапы и до отрыва) и фазой замаха (т. е. временем, когда конечность отрывается от земли). Таким образом, MW может генерировать визуальные «следы стойки», которые учитывают положение центра и оси тела по отношению к каждой ноге и центру их следа во время фаз23 стойки. Общие следы, полученные для каждого животного, показали несколько уникальных особенностей (рис. 2C). Эти данные показали, что после SCI задние лапы имели более короткие следы стойки и более случайное положение лап как при приземлении, так и при взлете с 15 dpi и далее (рис. 2C).
Рисунок 2: Репрезентативные графические выходы, полученные программным обеспечением MW из видео слежения. (A) Отпечатки «цифровыми чернилами» для одного животного SCI, показывающие каждую лапу с разным цветом: красный (правый передний), желтый (левый передний), зеленый (правый задний) и синий (левый задний) в несколько временных моментов. (B) Следы ног для левого переднего (LF), левого заднего (LH), правого переднего (RF) и правого заднего (RH) одного животного с ТСМ с разрешением 15 dpi. (C) «Следы позы» для одного животного ТСМ в несколько моментов времени. AEP и PEP для одной из ног проиллюстрированы на первой панели. «Кластеризация посадочного места» как для AEP, так и для PEP соответствует стандартному отклонению средних координат AEP или PEP в каждом видео. Сокращения: dpi = дни после травмы; см = сантиметр; px = пиксель. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Затем кинематические выходы были проанализированы после вычисления MW (рис. 3 и рис. 4). Чтобы получить более краткое представление о наборе данных и проверить, достаточны ли кинематические параметры двигателя, полученные из MW, для отображения двигательного дефицита, обнаруженного у животных с ТСМ во времени, был выполнен PCA27. Примечательно, что 40% дисперсии данных можно объяснить в первом компоненте (PC1: 40,1%), который отделил группу животных, у которых была ТСМ, от остальных, с p-значением ниже 0,001 на основе одностороннего теста ANOVA (рис. 3A, B) во все моменты времени (15 dpi, 22 dpi и 30 dpi). Также был слабый вклад других компонентов (PC2: 11% и PC3: 8,6%). Присвоенный вес каждого параметра двигателя для каждого компонента проиллюстрирован на дополнительном рисунке 4. Более того, дисперсия в наборе данных была недостаточной для отражения различий во времени (т. е. между 15 dpi, 22 dpi и 30 dpi), что повторяет ранее описанное плато восстановления локомотора14. В целом, эти результаты показывают, что кинематические параметры, полученные с помощью MW, сильно описывают двигательный дефицит, наблюдаемый после SCI во все моменты времени.
Рисунок 3: Анализ главных компонент всех параметров кинематического двигателя (79), полученных программным обеспечением MW после анализа остаточных данных. (A) 3D-визуализация трехкомпонентного анализа PCA. (B) 2D-визуализация с кругами, представляющими 50% собранных данных. В ПК1, который объяснял более 40% дисперсии, группа ТСМ при 15 dpi, 22 dpi и 30 dpi значительно отличалась от фиктивной группы и исходного уровня (до травмы) с p-значением < 0,001, как определено односторонним ANOVA. Каждая отдельная маленькая точка или треугольник представляет собой среднее значение трех видео для каждого животного, в то время как более крупные точки или треугольники представляют среднюю точку (n = 10-11 на условие, n = 21 для базовой группы). Вклад каждого компонента указан на каждой оси. Сокращения: dpi = дни после травмы; ТСМ = травма спинного мозга; ПК = главный компонент. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Затем был выбран набор параметров двигателя на основе того, насколько сильно он описывал набор данных (всего 33), и была сгенерирована тепловая карта (рис. 4). Действительно, большинство локомоторных параметров показали резкое изменение после ТСМ во все моменты времени (15 dpi, 22 dpi и 30 dpi), в то время как контрольная группа с фиктивными травмами показала значительные изменения только при 30 dpi. Эти изменения в фиктивной группе можно объяснить общим снижением скорости замаха, возможно, из-за привыкания к тесту, о котором будет сказано позже.
Было заметно, что животные SCI ходили медленнее, чем контрольная группа с фиктивными травмами (данные не показаны). Однако, независимо от скорости, как при 15 dpi, так и при 30 dpi, животные SCI показали более высокую продолжительность качания, меньшую продолжительность стойки и более низкий индекс коэффициента занятости, который относится к продолжительности стойки / периодушага 23. Эти результаты указывают на то, что изменения в положении ног, описанные выше, характерны для ТСМ, как это видно на других моделяхживотных 30,31,32, и не связаны с изменениями темпа (рис. 4).
Следует также упомянуть, что левая и правая синхронность не были затронуты, так как не наблюдалось существенного изменения «фазовых» индексов для передних и задних конечностей10,23 (рис. 4), что указывает на неповрежденную связь между левой и правой конечностями.
Кроме того, мыши SCI показали более низкий индекс «прямолинейности стойки» (смещение / длина пути) как в передних, так и в задних конечностях (рис. 4). Этот параметр измеряет, насколько линейны трассы по отношению к идеальному условию, которое будет представлять собой прямую линию (в диапазоне от 0 до 1, указывающую на линейную трассу)27. Таким образом, эти результаты указывают на сильную неспособность ходить прямо в этой группе.
Для каждой фазы стойки MW рисует реконструкцию колебаний тела, начиная с приземления лапы - переднее крайнее положение, или AEP, и заканчивая до отрыва - задним крайним положением, или PEP (см. пример на рисунке 2C). «Кластеризация посадочного места» как AEP, так и PEP измеряет стандартное отклонение средних координат AEP или PEP в каждом видео. Животные с ТСМ показали увеличение кластеризации следов задних лап для AEP во все моменты времени, и значительный эффект наблюдался только для группы с фиктивными травмами при 15 dpi (рис. 4). Это иллюстрирует, что животные SCI не могли правильно расположить свои задние конечности при приземлении после замаха. Кроме того, было замечено уменьшение «кластеризации отпечатков отпечатков» передней лапы для PEP вместе с уменьшением кластеризации отпечатков задних лап для PEP при 30 dpi (рис. 4). Эти результаты согласуются с тем, что наблюдается в нарисованных «следах стойки», и предполагают, что положение передних лап становится более ограниченным после травмы.
Наконец, в соответствии с изменениями в положении лап, произошли изменения в стратегиях походки и «давлении», вызванном лапами, что измеряется средней яркостью по площади (рис. 4), которые будут обсуждаться далее.
Рисунок 4: График тепловой карты, показывающий набор значительно измененных параметров опорно-двигательного аппарата, сравнивающих животных с ТСМ и животных с фиктивными травмами по сравнению с днем до операции, полученных MW после анализа остаточных данных. n = 10-11 на условие; В исходную группу входят все животные за день до операции, n = 21. Данные выражаются p-значением после статистического анализа с односторонним ANOVA, за которым следует тест Тьюки post hoc (для нормальных распределений) или тест Данна post hoc (для ненормальных распределений). P-значения представлены цветовым кодом, с красными и синими оттенками, указывающими на уменьшение или увеличение относительно базового уровня соответственно. Цветовой оттенок представляет собой статистическую значимость, при этом более темные цвета указывают на более высокую значимость, а более светлые цвета указывают на более низкую значимость; P < 0,001; **P < 0,01; *P < 0,05. Белый цвет указывает на отсутствие изменений. Сокращения: dpi = дни после травмы; ТСМ = травма спинного мозга; s = секунда; мс = миллисекунда; среднее значение = среднее; F = передний; H = задний; AEP = переднее крайнее положение; ПКП = заднее крайнее положение; LF = левый передний; LH = левая задняя часть; RF = справа вперед; RH = правая задняя часть. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Впоследствии мы попытались понять, какие индивидуальные параметры лучше всего подходят для описания двигательного дефицита животных с ТСМ на разных стадиях травмы (т.е. 15 dpi, 22 dpi и 30 dpi). Мы начали с изучения параметров ступенчатого цикла, которые показали различия между передними и задними конечностями по мере того, как задние конечности прогрессировали от полного паралича к частичной функции (рис. 5). В то время как средняя скорость качания передних конечностей значительно увеличилась по сравнению с исходным уровнем (до травмы), скорость качания задних конечностей существенно не изменилась (хотя наблюдалась тенденция к тому, что она была ниже исходного уровня) (рис. 5A, B). Параллельно уменьшилась средняя длина шага передних конечностей, без существенных изменений для задних конечностей (рис. 5C, D). Неудивительно, что у травмированных мышей наблюдалось уменьшение продолжительности качания передних конечностей и обратное увеличение продолжительности колебаний задних конечностей на 15 dpi и далее (рис. 5E, F). Взятые вместе, эти результаты показывают, что передние конечности приняли более быстрый ритм, с двумя циклами передних конечностей для каждого цикла задних конечностей. Это соотношение циклов 2:1 было описано ранее после гемисекции ТСМ у крыс 1,33 и иллюстрирует ключевой аспект дефектной координации передних и задних конечностей, которая не восстанавливается после 30 dpi у мышей.
Рисунок 5: Параметры ступенчатого цикла для передних и задних лап в несколько моментов времени за 1 день до травмы и при 15 dpi, 22 dpi и 30 dpi у животных SCI (n = 11). (А,Б) Средняя скорость замаха передних и задних лап относительно исходной линии. (С,Д) Средняя длина шага передних и задних лап относительно исходного уровня. (Е,Ж) Средняя продолжительность замаха передних и задних лап относительно исходной линии. На прямоугольных диаграммах медиана представлена средней линией, а нижний и верхний края прямоугольников представляют квартили 25% и 75% соответственно; Усы представляют собой диапазон полного набора данных. Выбросы представлены одиночными точками. Статистический анализ проводился с помощью одностороннего ANOVA, за которым следовал тест Тьюки post hoc (для нормальных распределений) или тест Данна post hoc (для ненормальных распределений). *P < 0,05; **P < 0,01; P < 0,001. Сокращения: dpi = дни после травмы; ТСМ = травма спинного мозга; см = сантиметр; s = секунда. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Программное обеспечение MW также способно вычислять паттерны шагов мышей, измеряя долю кадров, назначенных определенной комбинации ног, и это работает как прокси для наличия определенных стратегий походки. На более медленных скоростях нетравмированные мыши, как правило, принимают «походку», при которой большинство кадров имеют мах одной ногой (независимо от положения лапы). На промежуточных скоростях, наиболее распространенных на взлетно-посадочной полосе, мыши переходят на походку рысью, в которой наиболее репрезентативной конфигурацией является диагонально-ноговый мах. Наконец, на более высоких скоростях мыши используют «галопную походку», при этом одновременно раскачиваются три ноги23,34. Другие менее распространенные конфигурации включают походку, в основном представленную боковым качанием ног (как левой, так и правой ногой), и «связанную/прыгающую походку», при которой обе задние конечности или передние конечности раскачиваются одновременно10. Однако следует иметь в виду, что в контексте ТСМ некоторые из этих конфигураций, такие как взмах на трех ногах, могут отражать неправильное положение лап задних конечностей и, таким образом, не совсем соответствовать конкретной стратегии аллюра, в данном случае галопу. Поэтому анализ был упрощен за счет сравнения только конфигураций ног.
После проведения остаточного анализа было замечено, что наблюдалось снижение распространенности диагональных колебаний, сопровождаемое уменьшением одиночных колебаний во все моменты времени (рис. 6А, В). Что еще более интересно, наблюдалось увеличение распространенности боковых колебаний (рис. 6C). Походка, похожая на темп, не типична для обычной мыши C57BL/6J; однако уже сообщалось, что это происходит после гемисекции ТСМ у крыс1. Этот синфазный паттерн не был достаточно распространен для изменения фазового индекса передних конечностей или задних конечностей (как показано на рисунке 3), но иллюстрирует дефектную обратную связь позвоночника от задних конечностей к передним конечностям. Кроме того, наблюдалось естественное увеличение распространенности колебаний передних/задних конечностей (рис. 6D), возможно, из-за неправильного подошвенного шага задних конечностей и увеличения колебаний на трех ногах (рис. 6E).
Рисунок 6: Средние индексы для различных конфигураций шаговых качелей. (A) Диагональ, (B) одиночный, (C) боковой, (D) передний/задний и (E) трехногий поворот в несколько моментов времени у животных SCI (n = 11). На прямоугольных диаграммах медиана представлена средней линией, а нижний и верхний края прямоугольников представляют квартили 25% и 75% соответственно; Усы представляют собой диапазон полного набора данных. Выбросы представлены одиночными точками. Статистический анализ проводился с помощью одностороннего ANOVA, за которым следовал тест Тьюки post hoc (для нормальных распределений) или тест Данна post hoc (для ненормальных распределений). **P < 0,01; P < 0,001. Сокращения: dpi = дни после травмы; ТСМ = травма спинного мозга; NA = не применяется. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Наконец, еще одно считывание, которое можно извлечь из СВЧ, — это «давление» как мера яркости/площади. При более высоких скоростях площадь контакта с землей уменьшается, а давление увеличивается, поэтому была выполнена линейная регрессия исходных данных, а также измерены остаточные значения для каждого условия. Было замечено, что давление на передние лапы значительно увеличивалось во все моменты времени, но сила этого эффекта имела тенденцию уменьшаться с течением времени, так как изменение для левой передней лапы уже потеряло статистическую значимость при 30 dpi (рис. 7A, C). Этот специфический эффект на левую сторону может быть объяснен латерализованным повреждением, которое могло преимущественно затронуть правую сторону спинного мозга в этом исследовании. Тем не менее, давление , оказываемое задними лапами, было уменьшено у травмированных мышей, как и ожидалось, во все моменты времени, без тенденции к увеличению (рис. 7B, D).
Рисунок 7: Давление, создаваемое задними и передними лапами в несколько моментов времени у животных с ТСМ (n = 11). Давление, вызванное (A) левой передней лапой, (B) левой задней лапой, (C) правой передней лапой и (D) правой задней лапой, показано как относительные различия к исходному уровню (за день до травмы). На прямоугольных диаграммах медиана представлена в виде средней линии, а нижний и верхний края прямоугольников представляют собой квартили 25% и 75% соответственно; Усы представляют собой диапазон полного набора данных. Выбросы представлены одиночными точками. Статистический анализ проводился с помощью одностороннего ANOVA, за которым следовал тест Тьюки post hoc (для нормальных распределений) или тест Данна post hoc (для ненормальных распределений). **P < 0,01; P < 0,001. Сокращения: dpi = дни после травмы; ТСМ = травма спинного мозга; см = сантиметр; px = пиксель. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Взятое вместе, это исследование иллюстрирует мощность системы MW для количественного описания двигательных нарушений, вызванных ТСМ, которые иногда могут игнорироваться из-за других ограничений теста. Кроме того, это подчеркивает, несомненно, ограниченное функциональное восстановление во времени в модели ТСМ с ушибом мыши.
Дополнительный рисунок 1: Аппаратные компоненты MW . А) Эта установка подразделяется следующим образом: I - проход fTIR; II - база и посты поддержки fTIR; III - стенка дорожки; IV - зеркало 45°; и V – фоновая подсветка. (B) Снимки крупным планом канала Base-U-и боковых линий пешеходной дорожки. (C) Конструкция стены пешеходной дорожки. (D) Изображение крупным планом установки зеркала под углом 45°. Аббревиатура: см = сантиметр. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок 2: Один кадр видеозаписи fTIR, в котором указаны интенсивность пикселей и области области. Интенсивность пикселей для тела, фона и следов, используемых для анализа видео в этом исследовании, представлена в скобках и обозначена красным цветом, и все они оптимизированы для четкости изображения. Интенсивность света должна быть отрегулирована, чтобы обеспечить надлежащее различие между различными областями. Относительные площади тела и следы обозначены пунктирными желтыми линиями. Как области, так и интенсивность пикселей были получены в ImageJ/FIJI. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок 3: (A) общий балл BMS и (B) промежуточный балл мышей, проанализированных в этом исследовании (n = 10-11). Все данные были выражены как среднее ± SEM. Статистический анализ проводился с помощью двусторонних повторных измерений ANOVA с последующим тестом Бонферрони post hoc; P < 0,001. Аббревиатура: BMS = Basso mouse scale. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок 4: Присвоенный вес каждого параметра двигателя для каждого компонента. Назначенный вес каждого параметра двигателя (всего 79) после остаточного анализа для (A) PC1, (B) PC2 и (C) PC3 в PCA. Линия отсечения проводилась через 0,04 мс и −0,04. Сокращения: мс = миллисекунда; среднее значение = среднее; SD = стандартное отклонение; F = передний; H = задний; AEP = переднее крайнее положение; ПКП = заднее крайнее положение; LF = левый передний; LH = левая задняя часть; RF = справа вперед; RH = правая задняя часть; Пресса = давление. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь потенциал метода MouseWalker демонстрируется анализом локомоторного поведения после ТСМ. Он дает новое представление о конкретных изменениях в шагах, посадочной площади и паттернах походки, которые в противном случае были бы пропущены другими стандартными тестами. В дополнение к предоставлению обновленной версии пакета MW, инструменты анализа данных также описаны с использованием поставляемых скриптов Python (см. шаг 5).
Поскольку MW генерирует большой набор данных и набор кинематических параметров, отражающих высокоразмерный локомоторный процесс, был использован PCA; действительно, PCA широко использовался в других наборах кинематических данных, подобных этому 27,35,36 (рис. 3). Этот метод уменьшения размерности представляет собой простой и надежный метод с минимальными допущениями, который позволяет количественно идентифицировать кинематические профили и быстро отличать их от контрольных или базовых условий. Кроме того, были созданы тепловые карты для оперативного выявления параметров, статистически отличающихся от исходных (рис. 4), которые впоследствии можно было проанализировать по отдельности (рис. 5, рис. 6 и рис. 7).
Впоследствии было показано, как конкретные параметры, которые могут быть извлечены из MW, иллюстрируют устойчивый двигательный дефицит, наблюдаемый у животных с ТСМ, такой как координация. Координация - это способность организованно использовать каждую конечность для выполнения задачи. Часто координация измеряется косвенно количеством ошибок/положительных событий на лестнице 16,17 или временем, проведенным на ротароде15. Отчетливо MW вычисляет как изменчивость положения лап во время шагового цикла (паттерн следа), так и индекс «прямолинейности стойки»27. Показано, что травма существенно повлияла на оба параметра (рис. 4).
Кроме того, MW позволяет пользователю извлекать параметры, связанные с временной динамикой. У животных с ТСМ наблюдалось значительное нарушение продолжительности качания/стойки (рис. 4), и было обнаружено, что мыши ТСМ компенсировали потерю поддержки задних конечностей, ускоряя цикл шага передних конечностей, тем самым уменьшая длину шага передней конечности и среднее время качания (рис. 5). Этот эффект может быть связан со смещением центра тяжести, что заставляет передние лапы выдерживать больший вес тела1. Точно так же это может быть связано с потерей длинных восходящих проприоспинальных путей, которые отвечают за синергетическое взаимодействие между CPG передних и задних конечностей 1,9,32, что в конечном итоге приводит к диссоциации ритма передних и задних конечностей.
Характеристики шаговых походок могут проиллюстрировать модульную организацию опорно-двигательных сетей 1,34. Хотя паттерны шагов не являются прямым показателем стратегий походки, принятых в этом случае23, все же можно сделать некоторые важные наблюдения. Важные изменения были замечены в паттернах шагов мышей с ТСМ (рис. 6). Раненые животные начали перенимать боковые колебания (походные походки), а также наблюдалось уменьшение диагональных колебаний. Эти адаптации, по-видимому, связаны с попыткой скоординировать передние и задние конечности, что снова демонстрирует диссоциацию между позвоночными дорожками ниже и над травмой, которая не восстанавливается 1,9,32.
Ограниченное восстановление после ТСМ также было подтверждено снижением мышечной силы в задних конечностях, измеренным средним давлением (рис. 7). Следовательно, передние конечности вынуждены выдерживать больший вес тела, что увеличивает давление. Хотя многие параметры, связанные с динамикой мышц, здесь не анализировались (например, координация мышц-сгибателей и разгибателей 7,21), это количественное измерение может обеспечить прямое считывание величины поддержки конечностей.
Этот анализ MW также может быть связан со стандартным тестом BMS, который измеряет вращение конечностей, размещение лап, положение хвоста и ошибки шага. Как правило, мыши с ТСМ достигают максимального балла 4-5 с максимальным промежуточным баллом 3, что означает, что они могут выполнять случайные или частые шаги, но в основном вращаются при отрыве лапы и / или приземлении14 (дополнительный рисунок 2). Становится понятным, почему значения AEP для задних лап были значительно изменены в группе SCI, поскольку непараллельное расположение конечностей во время фазы качания может повлиять на координаты лап. Кроме того, в BMS ствол обычно классифицируется как тяжелый из-за наличия случаев или событий, препятствующих наступлению, таких как удар прикладом и прыжки14. Несмотря на то, что не было возможности количественно оценить поведение при ударе прикладом или случаи, которые препятствовали шагу, было обнаружено ограниченное наступление задней лапой в MW с более высокой продолжительностью качания (рис. 5F), увеличенным взмахом на три ноги (рис. 6E) и меньшим давлением (рис. 7B-D). Кроме того, наблюдалось значительное увеличение колебаний вперед/назад (рис. 6D). У этого поведенческого проявления может быть два взаимодополняющих объяснения. Во-первых, была измерена походка, похожая на прыжки, которую уже можно было наблюдать в тесте BMS. Однако такое поведение также может быть связано с отсутствием правильного подошвенного шага в обеих задних конечностях, что приводит к перетаскиванию стопы или спинному размещению. В целом, эти наблюдения подтверждают утверждение о том, что стабильность ствола сильно нарушается после ТСМ. Наконец, одним из требований для получения баллов выше 5 в тесте BMS является координация14, и для этого оценщики должны соблюдать не менее трех доступных проходов во время теста. Из них два из трех или более доступных проходов должны быть классифицированы как скоординированные (т.е. чередование передних и задних конечностей). Из данных MW можно извлечь объективные измерения, индекс прямолинейности стойки и кластеризацию следа, которые напрямую количественно определяют координацию независимо от скорости животного или доступного прохода (рис. 4). Кроме того, чередование конечностей может быть количественно определено объективно путем измерения шаговых стратегий (рис. 6). Эти параметры ясно иллюстрируют, что мыши с ТСМ постоянно не могут ходить по прямым линиям и неправильно перемещают задние конечности.
Несмотря на то, что набор инструментов MW является полезной стратегией для изучения дефектов опорно-двигательного аппарата после ТСМ, следует учитывать некоторые из его ограничений. Во-первых, очень важно оставаться согласованным с параметрами съемки (т. е. положением камеры, фокусировкой, интенсивностью света), чтобы сохранить особенности изображения между временными точками. Во-вторых, было замечено, что повторение приводило к привыканию, что, в свою очередь, приводило к снижению скорости. Это также способствовало усилению поведения при выращивании / груминге и остановкам в середине бега. У раненых животных также наблюдалась тенденция опираться на стены дорожки и увеличивалось количество остановок в середине бега. Поскольку такое поведение не является частью оценки опорно-двигательного аппарата, его не следует рассматривать. Предпочтительно исследователи должны выбирать видео, в которых животные непрерывно ходят с прямой головой. Чтобы противодействовать влиянию такого поведения на результаты этого исследования, мышей регистрировали непрерывно в течение как минимум четырех или пяти пробежек, и им разрешалось бегать в любом направлении по дорожке. После этого были выбраны три лучших зарегистрированных пробега и скорректированы в том же направлении на ImageJ/FIJI24 (поворот на 180°). Таким образом, каждое животное было представлено в среднем тремя прогонами, объединенными вместе в определенный момент времени. Большее количество животных в одном состоянии также может снизить ожидаемую изменчивость. Кроме того, следует отметить, что этот локомоторный тест рекомендуется только после достижения подошвенного шага, поскольку система слежения была разработана для точной оценки опорно-двигательного аппарата. В этом исследовании было отмечено, что до 15 dpi тест MW не был выгодным для оценки локомотора из-за повышенного сопротивления стопы и неправильного размещения подошвенной кости, что могло повлиять на отслеживание (данные не показаны). Наконец, некоторые параметры (например, кластеризация посадочных мест) очень чувствительны к экстраполяциям, сделанным сгенерированной регрессионной моделью. Поэтому код был соответствующим образом скорректирован (см. документацию в скрипте по ссылке GitHub).
В целом, было показано, что MW может сильно отличать животных с ТСМ от людей с фиктивными травмами, и MW также может быть сотрудничать с установленными тестами в качестве ценного метода изучения дефектов опорно-двигательного аппарата после ТСМ. Кроме того, было показано, что количественные результаты могут быть легко сгенерированы из набора данных MW с использованием предоставленных скриптов Python. Эти инструменты обеспечивают эффективный экспериментальный конвейер для создания богатого и разнообразного набора количественных и графических выходных данных, которые дополняют исходные выходные файлы MW и могут быть изменены для достижения целей исследователя с точки зрения типа анализа и графического представления.
Этот набор инструментов является ценным методом для изучения других двигательных заболеваний или двигательных дисфункций, а не только тех, которые связаны с травмой спинного мозга. Skarlatou et al.10 уже продемонстрировали, что специфическая мутация в Afadin, важном белке-каркасе во время развития, вызвала аберрантный фенотип в спинном мозге, генерируя два центральных канала. Этот дефект привел к потере чередования правых и левых конечностей и более высокой распространенности синхронизации конечностей, типичной для прыгающей походки. Stauch et al.10 также проиллюстрировали, что этот тип системы может быть адаптирован в соответствии с потребностями пользователя. В этом случае он был применен для изучения специфических поведенческих дефицитов в модели болезни Паркинсона у крыс. Таким образом, этот набор инструментов имеет широкий спектр применений в различных моделях, в которых ожидаются двигательные помехи, и может сочетаться с уже установленными протоколами поведения в полевых условиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Авторы благодарят Лауру Такер и Наташу Лонкаревич за их комментарии к рукописи и поддержку, оказанную Центром грызунов Института молекулярной медицины Жуана Лобо Антунеша. Авторы выражают благодарность Prémios Santa Casa Neurociências - Премия Мело и Кастро за исследования травм спинного мозга (MC-36/2020) Лос-Анджелесу и К.С.М. Эта работа была поддержана Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) (PTDC/BIA-COM/0151/2020), iNOVA4Health (UIDB/04462/2020 и UIDP/04462/2020) и LS4FUTURE (LA/P/0087/2020) с C.S.M. L.S. была поддержана контрактом с индивидуальным главным исследователем CEEC (2021.02253.CEECIND). A.F.I. был поддержан докторской стипендией FCT (2020.08168.BD). A.M.M. был поддержан докторской стипендией FCT (PD/BD/128445/2017). I.M. был поддержан постдокторской стипендией FCT (SFRH / BPD / 118051/2016). D.N.S. был поддержан докторской стипендией FCT (SFRH / BD / 138636/2018).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 45º Mirror | |||
| 2 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 16 cm height, 1 on each side | Misumi | ||
| 2 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 23 cm, @ 45° , 1 on each side | Misumi | ||
| 1 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 83 cm long | Misumi | ||
| 87 x 23 cm mirror | General glass supplier | ||
| black cardboard filler | General stationery supplier | We used 2, one with 69 x 6 cm and another with 69 x 3cm to limit the reflection on the mirror | |
| Background backlight | |||
| 109 x 23 cm plexiglass (0.9525 cm thick) | General hardware supplier | ||
| 2 lateral aluminum extrusion (4 x 4 cm), 20 cm long, 1 on each side | Misumi | ||
| multicolor LED strip | General hardware supplier | ||
| white opaque paper to cover the plexyglass | General stationery supplier | ||
| fTIR Support base and posts | |||
| 2 aluminum extrusion (4 x 4 cm), 100 cm height | Misumi | ||
| 60 x 30 cm metric breadboard | Edmund Optics | #54-641 | |
| M6 12 mm screws | Edmund Optics | ||
| M6 hex nuts and wahers | Edmund Optics | ||
| fTIR Walkway | |||
| 109 x 8.5 cm plexyglass (1.2 cm thick) | General hardware supplier | 109 x 8.5 cm plexyglass (1.2 cm thick) | |
| 109 cm long Base-U-channel aluminum with 1.6 cm height x 1.9 cm depth thick folds (to hold the plexyglass) | General hardware supplier | ||
| 2 lateral aluminum extrusion (4 x 4 cm) 20 cm length, 1 on each side | Misumi | ||
| black cardboard filler | General stationery supplier | we used 2 fillers on each side to cover the limits of the plexyglass, avoiding bright edges | |
| M6 12 mm screws | Edmund Optics | ||
| High speed camera (on a tripod) | |||
| Blackfly S USB3 | FLIR | #BFS-U3-32S4M-C | This is a reccomendation. The requirement is to record at least 100 frames per second |
| Infinite Horizon Impactor | |||
| Infinite Horizon Impactor | Precision Systems and Instrumentation, LLC. | #0400 | |
| Lens | |||
| Nikon AF Zoom-Nikkor 24-85mm | Nikon | #1929 | This lens is reccomended, however other lens can be used. Make sure it contains a large aperture (i.e., smaller F-stop values), to capture fTIR signals |
| Software | |||
| MATLAB R2022b | MathWorks | ||
| Python 3.9.13 | Python Software Foundation | ||
| Anaconda Navigator 2.1.4 | Anaconda, Inc. | ||
| Spyder 5.1.5 | Spyder Project Contributors | ||
| Walkway wall | |||
| 2 large rectagular acrilics with 100 x 15 cm | Any bricolage convenience store | ||
| 2 Trapezian acrilic laterals with 6-10 length x 15 cm height | Any bricolage convenience store | ||
| GitHub Materials | |||
| Folder name | URL | ||
| Boxplots | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Boxplots | Script to create Boxplots | |
| Docs | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Docs | Additional documents | |
| Heatmap | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Heatmaps | Script to create heatmap | |
| Matlat script | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Matlab%20Script | MouseWalker matlab script | |
| PCA | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/PCA%20plots | Script to perform Principal Component Analysis | |
| Raw data Plots | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Rawdata%20Plots | Script to create Raw data plots | |
| Residual Analysis | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Residual_Analysis | Code to compute residuals from Raw data |
References
- Frigon, A. The neural control of interlimb coordination during mammalian locomotion. Journal of Neurophysiology. 117 (6), 2224-2241 (2017).
- Grillner, S. Biological pattern generation: The cellular and computational logic of networks in motion. Neuron. 52 (5), 751-766 (2006).
- Dominici, N., et al. locomotor primitives in newborn babies and their development. Science. 334 (6058), 997-999 (2011).
- Courtine, G., et al. Kinematic and EMG determinants in quadrupedal locomotion of a non-human primate (Rhesus). Journal of Neurophysiology. 93 (6), 3127-3145 (2005).
- Clarac, F., Cattaert, D., le Ray, D. Central control components of a 'simple' stretch reflex. Trends Neuroscience. 23 (5), 199-208 (2000).
- Squair, J. W., Gautier, M., Sofroniew, M. V., Courtine, G., Anderson, M. A.
- Wenger, N., et al. Spatiotemporal neuromodulation therapies engaging muscle synergies improve motor control after spinal cord injury. Nature Medicine. 22 (2), 138-145 (2016).
- Grillner, S. The spinal locomotor CPG: A target after spinal cord injury. Progress in Brain Research. 137, 97-108 (2002).
- Boulain, M., et al. Synergistic interaction between sensory inputs and propriospinal signalling underlying quadrupedal locomotion. Journal of Physiology. 599 (19), 4477-4496 (2021).
- Skarlatou, S., et al. Afadin signaling at the spinal neuroepithelium regulates central canal formation and gait selection. Cell Reports. 31 (10), 107741 (2020).
- Viala, D., Vidal, C. Evidence for distinct spinal locomotion generators supplying respectively fore-and hindlimbs in the rabbit. Brain Research. 155 (1), 182-186 (1978).
- Silver, J., Miller, J. H.
- Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. Journal of Neurotrauma. 12 (1), 1-21 (1995).
- Basso, D. M., et al. Basso mouse scale for locomotion detects differences in recovery after spinal cord injury in five common mouse strains. Journal of Neurotrauma. 23 (5), 635-659 (2006).
- Jones, B. J., Roberts, D. J. The quantitative measurement of motor inco-ordination in naive mice using an accelerating rotarod. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 20 (4), 302-304 (1968).
- Metz, G. A., Whishaw, I. Q. The ladder rung walking task: A scoring system and its practical application. Journal of Visualized Experiments. (28), e1204 (2009).
- Metz, G. A., Whishaw, I. Q. Cortical and subcortical lesions impair skilled walking in the ladder rung walking test: A new task to evaluate fore-and hindlimb stepping, placing, and coordination. Journal of Neuroscience Methods. 115 (2), 169-179 (2002).
- Wallace, J. E., Krauter, E. E., Campbell, B. A. Motor and reflexive behavior in the aging rat. Journal of Gerontology. 35 (3), 364-370 (1980).
- Carter, R. J., et al. Characterization of progressive motor deficits in mice transgenic for the human Huntington's disease mutation. The Journal of Neuroscience. 19 (8), 3248-3257 (1999).
- Leblond, H., L'espérance, M., Orsal, D., Rossignol, S. Behavioral/systems/cognitive treadmill locomotion in the intact and spinal mouse. The Journal of Neuroscience. 23 (36), 11411-11419 (2003).
- Courtine, G., et al. Recovery of supraspinal control of stepping via indirect propriospinal relay connections after spinal cord injury. Nature Medicine. 14 (1), 69-74 (2008).
- Hamers, F. P. T., Koopmans, G. C., Joosten, E. A. J. CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 23 (3-4), 537-548 (2006).
- Mendes, C. S., et al. Quantification of gait parameters in freely walking rodents. BMC Biology. 13 (1), 50 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Stauch, K. L., et al. Applying the ratwalker system for gait analysis in a genetic rat model of Parkinson's disease. Journal of Visualized Experiments. (167), e62002 (2021).
- Mendes, C. S., Rajendren, S. V., Bartos, I., Márka, S., Mann, R. S. Kinematic responses to changes in walking orientation and gravitational load in Drosophila melanogaster. PLoS One. 9 (10), e109204 (2014).
- Cabrita, A., et al. Motor dysfunction in Drosophila melanogaster as a biomarker for developmental neurotoxicity. iScience. 25 (7), 104541 (2022).
- Bishop, C. M. Pattern Recognition and Machine Learning. , Springer. Delhi, India. (2006).
- vander Maaten, L., Postma, E., vanden Herik, J. Dimensionality reduction: A comparative review. , Tilburg University. The Netherlands.. http://www.uvt.nl/ticc (2009).
- Courtine, G., et al. Performance of locomotion and foot grasping following a unilateral thoracic corticospinal tract lesion in monkeys (Macaca mulatta). Brain. 128 (10), 2338-2358 (2005).
- Drew, T., Jiang, W., Kably, B., Lavoie, S. Role of the motor cortex in the control of visually triggered gait modifications. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 74 (4), 426-442 (1996).
- Cheng, H., et al. Gait analysis of adult paraplegic rats after spinal cord repair. Experimental Neurology. 148 (2), 544-557 (1997).
- Thibaudier, Y., et al. Interlimb coordination during tied-belt and transverse split-belt locomotion before and after an incomplete spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 34 (9), 1751-1765 (2017).
- Bellardita, C., Kiehn, O. Phenotypic characterization of speed-associated gait changes in mice reveals modular organization of locomotor networks. Current Biology. 25 (11), 1426-1436 (2015).
- Machado, A. S., Marques, H. G., Duarte, D. F., Darmohray, D. M., Carey, M. R. Shared and specific signatures of locomotor ataxia in mutant mice. eLife. 9, 55356 (2020).
- Takeoka, A., Vollenweider, I., Courtine, G., Arber, S. Muscle spindle feedback directs locomotor recovery and circuit reorganization after spinal cord injury. Cell. 159 (7), 1626-1639 (2014).
