Summary
Præsenteret her er en effektiv hurtig blodperfusionsprotokol til fremstilling af vævsprøver fra afrikanske klofrøer til transkriptomics og proteomics undersøgelser.
Abstract
Xenopus har været stærke modelorganismer til forståelse af hvirveldyrs udvikling og sygdom i over 100 år. Her defineres en hurtig blodperfusionsprotokol i Xenopus, der sigter mod en konsekvent og drastisk reduktion af blod i alle væv. Perfusion udføres ved at indsætte en nål direkte i hjertets ventrikel og pumpe hepariniseret fosfatbufret saltvand (PBS) gennem vaskulærsystemet. Proceduren kan gennemføres på ca. 10 minutter pr. dyr. Blodet domineres af nogle få meget rigelige proteiner og celletyper, hvilket skaber mange problemer, da disse proteiner maskerer de fleste andre molekyler og celletyper af interesse. Den reproducerbare karakterisering af voksent Xenopus-væv med kvantitativ proteomics og enkeltcelle transkriptomics vil drage fordel af at anvende denne protokol før organprøveudtagning. Protokollerne for vævsprøvetagning er defineret i ledsagende papirer. Disse procedurer er rettet mod standardisering af praksis på tværs af Xenopus af forskelligt køn, alder og sundhedsstatus, specifikt X. laevis og X. tropicalis.
Introduction
Hele kroppen perfusion af padder er rutinemæssigt afsluttet med henblik på konservering og fiksering 1,2,3,4,5,6. Disse procedurer forekommer imidlertid med en hastighed, der begrænser antallet af friske prøver, der kan tages pr. Dyr. Målet med dette arbejde er at udvikle en effektiv blodperfusionsprotokol i Xenopus, der prioriterer teknikkens hastighed. Protokollen tager mindre end 10 minutter pr. dyr for X. tropicalis og mindre end 15 minutter pr. X. laevis dyr. De sekundære prioriteter er let replikering og brug af let erhvervet udstyr, så prøver af høj kvalitet kan deles bredt mellem Xenopus-laboratorier.
Xenopus frøer bruges bredt i biomedicinsk forskning til at studere grundlæggende biologiske og patologiske processer bevaret på tværs af arter. Denne tetrapod har et tættere evolutionært forhold til pattedyr end andre akvatiske modeller, der har lunger, et trekammerhjerte og lemmer med cifre. Det internationale samfund bruger effektivt Xenopus til at få en dybere forståelse af menneskelig sygdom gennem dybdegående sygdomsmodellering og molekylær analyse af sygdomsrelateret genfunktion. De mange fordele ved Xenopus som dyremodel gør dem uvurderlige værktøjer til at studere det molekylære grundlag for menneskelig udvikling og sygdom; Disse fordele omfatter: stor oocyt- og embryostørrelse, høj fecundity, let bolig, hurtig ekstern udvikling og let genomisk manipulation. Xenopus er blevet anslået til at dele ~ 80% af de identificerede humane sygdomsgener7.
Sammenlignet med populære pattedyrsmodeller er Xenopus en hurtig, omkostningseffektiv model med den lette morpholino knock-down og tilgængelighed af effektive transgene og målrettede genmutationer ved hjælp af CRISPR8. Kvantitativ massespektrometri og enkeltcelletranskriptomics er med succes blevet anvendt på Xenopus-embryoner9,10, men et nyligt celleatlas fra Xenopus laevis viser, at sammensætningen af de fleste væv domineres af blodcelletyper 11. Ved at udvikle en teknik, der ekssanguinerer væv i en hurtig hastighed og ved hjælp af kølede medier, påvirkes prøvens friskhed minimalt af perfusion. Dette er især vigtigt for applikationer, hvor målet er at profilere fysiologisk uforstyrret mRNA eller proteinekspression.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol beskriver traditionelle dissektionsteknikker til adgang til det coelomiske hulrum. Andre teknikker er også acceptable, forudsat at de forårsager minimal skade på vævene, hjertet er tilgængeligt, og lungen og maven er synlige. På samme måde kan de fleste dissektionsværktøjer, der er angivet, let erstattes med sammenlignelige genstande.
Mens der er gjort forsøg på at optimere effektiviteten af denne procedure, kan resultaterne variere afhængigt af ens erfaring og varia…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af NIHs OD R24-tilskud OD031956 og NICHD R01-tilskud HD073104. Vi takker Darcy Kelly for nyttige diskussioner og indledende input til denne protokol. Vi vil også gerne takke Samantha Jalbert, Jill Ralston og Wil Ratzan for deres hjælp og støtte samt vores tre anonyme fagfællebedømmere for deres feedback.
Materials
| 5x Magnifying glass with LED light and stand | amazon.com | B08QJ6J8P1 | light must not produce heat |
| Disposable transfer pipets | VWR | 414004-036 | |
| Dissecting fine-pointed forceps | Fisher Scinetific | 08-875 | |
| Dissecting scissors sharp piont, straight 6.5" | VWR | 76457-374 | |
| Dissection tray | Fisher Scinetific | 14-370-284 | styrofoam sheets are an acceptable alternative |
| Euthanasia container | US Plastic | Item 2860 | alternative opaque containers acceptable |
| Euthanasia container lid | US Plastic | Item 3047 | |
| Fine dissection pins | Living Systems Instrumentation | PIN-#3 | |
| General use hypodermic needles, 22 G | Fisher Scientific | 14-826-5A | for X. laevis |
| General use hypodermic needles, 25 G | Fisher Scientific | 14-826AA | for X. tropicalis |
| Heparin, porcine intestinal mucosa | MilliporeSigma | 37-505-410MG | |
| Iridectomy scissors 6" | vwr | 470018-938 | iris scissors are an acceptable alternative |
| Luer-to-barb adapter male Luer with lock ring | amazon.com | B09PTX6M2Z | size will be dependant on the hosing of the pump used |
| Mayo-Hegar needle holder | Fisher Scinetific | 08-966 | mosquito forceps are an acceptable alternative |
| MS-222: Syncaine (formerly tricaine) | Pentair AES | TRS1 | |
| PBS 1x | Corning | 21-040-CV | |
| Peristaltic liquid pump dosing pump 5–100 mL/min | amazon.com | B07PWY4SM6 | any peristaltic pump capable of pumping 5-10mL/min is acceptable |
| Sharpening stone | VWR | 470150-112 | optional; for dulling needles |
| Sodium bicarbonate, powder, USP | Fisher Scientific | 18-606-333 | |
| Specimen forceps, serrated | VWR | 82027-442 | |
| T-Pins for dissecting | Fisher Scinetific | S99385 | |
| Ultra-fine short insulin syringes, 31 G | VWR | BD328438 | |
| Wire flush cutters, 6-inch ultra sharp & powerful side cutter clippers | amazon.com | B087P191LP |
References
- Saltman, A. J., Barakat, M., Bryant, D. M., Brodovskaya, A., Whited, J. L. DiI perfusion as a method for vascular visualization in Ambystoma mexicanum. Journal of Visualized Experiments. (124), e55740 (2017).
- Lametschwandtner, A., Minnich, B. Microvascular anatomy of the brain of the adult pipid frog, Xenopus laevis (Daudin): A scanning electron microscopic study of vascular corrosion casts. Journal of Morphology. 279 (7), 950-969 (2018).
- Lametschwandtner, A., Minnich, B. Microvascular anatomy of the urinary bladder in the adult African clawed toad, Xenopus laevis: A scanning electron microscope study of vascular casts. Journal of Morphology. 282 (3), 368-377 (2021).
- Lametschwandtner, A., et al. Microvascular anatomy of the gallbladder of the adult South African clawed toad, Xenopus laevis Daudin: A scanning electron microscope study of vascular corrosion casts. Microscopy and Microanalysis. 13, 492-493 (2007).
- Lametschwandtner, A., Spornitz, U., Minnich, B. Microvascular anatomy of the non-lobulated liver of adult Xenopus laevis: A scanning electron microscopic study of vascular casts. Anatomical Record. 305 (2), 243-253 (2022).
- Miodoński, A. J., Bär, T. Arterial supply of the choriocapillaris of anuran amphibians (Rana temporaria, Rana esculenta). Scanning electron-microscopic (SEM) study of microcorrosion casts. Cell and Tissue Research. 249 (1), 101-109 (1987).
- Nenni, M. J., et al. Xenbase: Facilitating the use of Xenopus to model human disease. Frontiers in Physiology. 10, 154 (2019).
- Tandon, P., Conlon, F., Furlow, J. D., Horb, M. E. Expanding the genetic toolkit in Xenopus: Approaches and opportunities for human disease modeling. Developmental Biology. 426 (2), 325-335 (2017).
- Peshkin, L., et al. The protein repertoire in early vertebrate embryogenesis. bioRxiv. , (2019).
- Briggs, J. A., et al. The dynamics of gene expression in vertebrate embryogenesis at single-cell resolution. Science. 360 (6392), (2018).
- Liao, Y., et al. Cell landscape of larval and adult Xenopus laevis at single-cell resolution. Nature Communications. 13 (1), 4306 (2022).
- AVMA (American Veterinary Medical Association). AVMA guidelines for the euthanasia of animals, 2020 edition. AVMA. , 37 (2020).
- Navarro, K., Jampachaisri, K., Chu, D., Pacharinsak, C. Bupivacaine as a euthanasia agent for African Clawed Frogs (Xenopus laevis). PLoS One. 17 (12), e0279331 (2022).
- Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio-Protocol. 11 (5), e3988 (2021).
- Heinz-Taheny, K. M. Cardiovascular physiology and diseases of amphibians. Veterinary clinics of North America. The Veterinary Clinics of North America. Exotic Animal Practice. 12 (1), 39-50 (2009).
- Stephenson, A., Adams, J. W., Vaccarezza, M. The vertebrate heart: an evolutionary perspective. Journal of Anatomy. 231 (6), 787-797 (2017).
- Hoops, D. A perfusion protocol for lizards, including a method for brain removal. MethodsX. 2, 165-173 (2015).
