Summary
Præsenteret her er en effektiv hurtig blodperfusionsprotokol til fremstilling af vævsprøver fra afrikanske klofrøer til transkriptomics og proteomics undersøgelser.
Abstract
Xenopus har været stærke modelorganismer til forståelse af hvirveldyrs udvikling og sygdom i over 100 år. Her defineres en hurtig blodperfusionsprotokol i Xenopus, der sigter mod en konsekvent og drastisk reduktion af blod i alle væv. Perfusion udføres ved at indsætte en nål direkte i hjertets ventrikel og pumpe hepariniseret fosfatbufret saltvand (PBS) gennem vaskulærsystemet. Proceduren kan gennemføres på ca. 10 minutter pr. dyr. Blodet domineres af nogle få meget rigelige proteiner og celletyper, hvilket skaber mange problemer, da disse proteiner maskerer de fleste andre molekyler og celletyper af interesse. Den reproducerbare karakterisering af voksent Xenopus-væv med kvantitativ proteomics og enkeltcelle transkriptomics vil drage fordel af at anvende denne protokol før organprøveudtagning. Protokollerne for vævsprøvetagning er defineret i ledsagende papirer. Disse procedurer er rettet mod standardisering af praksis på tværs af Xenopus af forskelligt køn, alder og sundhedsstatus, specifikt X. laevis og X. tropicalis.
Introduction
Hele kroppen perfusion af padder er rutinemæssigt afsluttet med henblik på konservering og fiksering 1,2,3,4,5,6. Disse procedurer forekommer imidlertid med en hastighed, der begrænser antallet af friske prøver, der kan tages pr. Dyr. Målet med dette arbejde er at udvikle en effektiv blodperfusionsprotokol i Xenopus, der prioriterer teknikkens hastighed. Protokollen tager mindre end 10 minutter pr. dyr for X. tropicalis og mindre end 15 minutter pr. X. laevis dyr. De sekundære prioriteter er let replikering og brug af let erhvervet udstyr, så prøver af høj kvalitet kan deles bredt mellem Xenopus-laboratorier.
Xenopus frøer bruges bredt i biomedicinsk forskning til at studere grundlæggende biologiske og patologiske processer bevaret på tværs af arter. Denne tetrapod har et tættere evolutionært forhold til pattedyr end andre akvatiske modeller, der har lunger, et trekammerhjerte og lemmer med cifre. Det internationale samfund bruger effektivt Xenopus til at få en dybere forståelse af menneskelig sygdom gennem dybdegående sygdomsmodellering og molekylær analyse af sygdomsrelateret genfunktion. De mange fordele ved Xenopus som dyremodel gør dem uvurderlige værktøjer til at studere det molekylære grundlag for menneskelig udvikling og sygdom; Disse fordele omfatter: stor oocyt- og embryostørrelse, høj fecundity, let bolig, hurtig ekstern udvikling og let genomisk manipulation. Xenopus er blevet anslået til at dele ~ 80% af de identificerede humane sygdomsgener7.
Sammenlignet med populære pattedyrsmodeller er Xenopus en hurtig, omkostningseffektiv model med den lette morpholino knock-down og tilgængelighed af effektive transgene og målrettede genmutationer ved hjælp af CRISPR8. Kvantitativ massespektrometri og enkeltcelletranskriptomics er med succes blevet anvendt på Xenopus-embryoner9,10, men et nyligt celleatlas fra Xenopus laevis viser, at sammensætningen af de fleste væv domineres af blodcelletyper 11. Ved at udvikle en teknik, der ekssanguinerer væv i en hurtig hastighed og ved hjælp af kølede medier, påvirkes prøvens friskhed minimalt af perfusion. Dette er især vigtigt for applikationer, hvor målet er at profilere fysiologisk uforstyrret mRNA eller proteinekspression.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter blev udført i overensstemmelse med reglerne og forskrifterne fra Harvard Medical School IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee) (IS 00001365_3).
BEMÆRK: Selvom den primære metode til eutanasi beskrevet anses for en acceptabel teknik til eutanasi af American Veterinary Medical Association12, har det ikke vist sig at føre til ophør af hjerteslag13. Selv den ofte anvendte sekundære metode med dobbelt pithing forhindrer ikke dette, og det fjerner heller ikke hjertet fra dyret. Ekssanguination af bedøvede dyr betragtes som en human og effektiv metode til vellykket eutanasi12. Da opretholdelse af frisk væv gennem eutanasi er målet med denne protokol, er det gavnligt, at hjertet fortsætter med at slå gennem primær eutanasi med MS-222, og at perfusion i sig selv er en sekundær eutanasimetode gennem ekssanguination.
1. Forberedelse
- Sørg for, at forskningsinstitutionen har godkendt den eutanasi- og perfusionsteknik, der er beskrevet i denne protokol.
- Forbered en opløsning af 5 g / l MS-222 (tricainmethansulfonat) og 5 g / l natriumbicarbonat. Volumenet skal være større end det volumen, der kræves for fuldstændigt at dække de dyr, der aflives. Kontroller pH-værdien for at sikre, at den er ≥7.
- Der fremstilles 500 μL 180 E/ml heparin i fosfatbufret saltvand (PBS) pr. X. laevis eller 200 μL pr. X. tropicalis.
- Udfør primær eutanasi ved at placere Xenopus i denne opløsning (fra trin 1.2); Dyret forbliver nedsænket i alt 1 time.
- Bekræft, at Xenopus har mistet sin smerterespons ved at klemme foden 15 minutter inde i eutanasi. Hvis dyret er reaktivt, skal du returnere det til eutanasiopløsningen, indtil dette svar går tabt.
- Vejen Xenopus og foretag eventuelle yderligere nødvendige målinger før prøveudtagningen.
- Brug en 31 G kanyle til at injicere X. laevis med 250 μL og X. tropicalis med 100 μl 180 E/ml heparin i PBS (fra trin 1.3) i muskulaturen i hvert forben.
- Der fremstilles en opløsning af 1 ml/g af dyrevægten af 54 E/ml heparin i PBS-perfusat. Personer, der har mere erfaring med denne protokol, kan opleve, at der kræves færre medier for at fuldføre perfusion.
- Brug en 22 G kanyle til perfusering af X. laevis og en 25 G kanyle til X. tropicali s. Afstump perfusionsnålen ved at trimme spidsen af med trådskærere (figur 1)14.
BEMÆRK: Dette reducerer sandsynligheden for, at nålen perforerer gennem ventriklen, hvis den forskydes. Ud over stumpning kan nålen males lidt ned med en slibesten eller fil, men forbliver stadig skarp nok til at gennembore ventriklen. - Klargør pumpen ved at sætte den trimmede kanyle på og cirkulere 54 E/ml hepariniseret PBS-perfusat (fra trin 1.8). Sørg for at rense alle luftbobler fra slangen for at eliminere muligheden for luftemboli, hvilket fører til nedsat perfusionseffektivitet eller svigt (se tabel 1). Opbevar perfusionsmediet på is under procedurens varighed.
- Hvis pumpen ikke er programmerbar, måles den pumpede medievolumen med nålen på plads under de forskellige indstillinger for at bestemme, hvilke indstillinger der er tættest på 5 ml/min og 10 ml/min. Disse strømningshastigheder vil blive brugt uanset arten. Hvis perfusionspumpen er programmerbar, kalibreres den med nålen på plads i henhold til producentens anvisninger.
- Placer dissektionsoverfladen (bakke eller skumplade) i en hældning i en sekundær beholder, eller arranger den for at lette bloddræning.
- Når frøen har været i opløsningen i 1 time, er primær dødshjælp afsluttet. Fjern frøen og kontroller tabet af smerterespons igen ved at udføre en fodklemme.
- Placer frøen på ryggen og fastgør hvert lem (figur 2). Hvis det er nødvendigt at bevare vævet i lemmerne, kan tynde stifter placeres gennem cifrene eller U-formede hæfteklammer omkring lemmerne.
- Brug dissektionssaks til at skære gennem huden, op ad midterlinjen og derefter sideværts, hvilket gør to klapper. (Figur 2)
- Brug tang til at gribe linea alba og træk den væk fra det coelomiske hulrum (figur 3). Brug forsigtigt en saks til at skære op gennem muskulaturen. Lav to klapper ud af hulrumsvæggen og skær eller pin alle klapperne ud af vejen.
- Brug dissektionssaks til at skære op gennem coracoidknoglerne og skære overskydende væv væk for at få bedre adgang til hjertet (figur 3).
- Hjertet skal stadig slå. Hvis hjertet er holdt op med at slå før perfusion, skal du bemærke, at prøvens friskhed er blevet kompromitteret.
2. Perfusion
- Identificer maven og skift den forsigtigt, så den er oven på leverens venstre lap (til højre for seeren), med dens vaskulatur synlig i procedurens varighed. Identificer en lunge og tag fat i den ved dens spids ved hjælp af vævspincet. Træk lungen uden for det coelomiske hulrum og pin den gennem spidsen (figur 4). Gør dette forsigtigt, da brudte blodkar ikke perfuserer godt. Bemærk, om blod er synligt i lapen, da dette vil påvirke evnen til at bestemme afslutningen af proceduren.
- Tag et billede af det coelomiske hulrum for bedre at vurdere perfusionseffektiviteten og potentielt identificere unormale væv på et senere tidspunkt.
- Identificer det tynde hjertesækken og træk det undervist med vævspincet (figur 5). Perforer forsigtigt perikardiet ved hjælp af spidsen af iridectomy saksen, pas på ikke at skære de underliggende væv. Skræl hjertesækken op væk fra hjertets tre kamre.
- Brug tang til forsigtigt at gribe ventriklen ved dens spids. Påfør begrænset tryk, så der er tilstrækkelig plads mellem tangens trækkraftflader til, at perfusionsnålen kan passere (figur 6).
- Indsæt nålen gennem lukningen af tangen i kammeret i ventriklen, pas på ikke at perforere gennem ventriklen (figur 7). Klem vævspincetten på plads ved hjælp af en nåleholder ved hjælp af en hæmostat.
BEMÆRK: Denne teknik stabiliserer nålens position, som stadig er skarp. Fastspænding af nålen direkte til ventriklen vil også forårsage unødvendig skade, hvilket gør genfastspænding vanskeligere, hvis det er nødvendigt (se tabel 1). - Start pumpens flow ved ca. 5 ml/min. De tre kamre i hjertet og arteriestammen vil opsluge hinanden (figur 8; se tabel 1).
- Med en saks skal du forsigtigt lanse den højre auricle (til venstre for seeren); Blod vil hælde ud. Indstil flowhastigheden til 5 ml/min, eller øg den til 10 ml/min.
- Fortsæt, indtil vaskulaturen i maven blancherer (se tabel 1), og lanse derefter hjertets venstre auricle (til højre for seeren). Hvis strømningshastigheden stadig er 5 ml/min, øges den til ca. 10 ml/min.
- Brug en overførselspipette til at skylle det coelomiske hulrum i perfusionsmedier for at hjælpe med at opretholde synligheden og for bedre at vurdere farven på perfusat, der strømmer fra auriklerne.
- Hold nålen på plads, indtil perfusatet, der strømmer fra auriklerne, er klart (se tabel 1), og lungen har mistet sin røde nuance (se tabel 1; Figur 9).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter vellykket perfusion vil alle væv (undtagen leveren i pigmenteret Xenopus) være tydeligt lettere og mindre mættet med blod. Større blodkar vil blive mindre synlige (figur 10), og væv (undtagen leveren) skylles rent i bufferen efter prøveudtagning. Mens en vellykket gennemførelse af protokollen i sidste ende kun kan bekræftes af kvaliteten af dataene fra ekssanguinerede vævsprøver, er der angivet flere typiske problemer, deres mulige årsager og foreslåede afhjælpende foranstaltninger i fejlfindingstabellen (tabel 1 og figur 11).
Figur 1: Utrimmede og trimmede nåle14. Brug trådklippere til at stumpe nålen ved at skære spidsen af. Det vil være skarpt nok til at gennembore hjertet, men perforering af ventriklen vil være mindre sandsynligt i tilfælde af menneskelige fejl. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Ældre kvindelige X. tropicalis fastgjort gennem hvert lem. Brug tanddissekerende tang til at trække huden nær cloacaen, lært at perforere den med dissektionssaks og skabe to klapper. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Muskuløs væg. Med den ventrale hud åben, men muskelvæggen intakt, er linea alba synlig. For at reducere sandsynligheden for at beskadige det underliggende væv skal du tage fat i linea alba og trække det undervist før skæring. De coracoid knogler er synlige gennem bughinden. Når det coelomiske hulrum er blevet åbnet, bør disse knogler reduceres for at give bedre adgang til hjertet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Det coelomiske hulrum hos en moden X. tropicalis mand. De coracoid knogler er blevet reduceret, hvilket giver adgang til perikardiet-lukkede hjerte. Maven er blevet forskudt foran leverens venstre lap, og dens vaskulatur er tydeligt synlig. Den venstre lunge er trukket ud af det coelomiske hulrum ved spidsen og fastgjort for at sikre, at den ikke trækker sig tilbage under skylleprocessen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Hjertesækken. Perikardiet er en tynd, hård membran, der omslutter hjertet. Brug vævspinkel til forsigtigt at tage fat i perikardiet og brug derefter spidsen af iridectomy saks til at perforere det. Når det er perforeret, skræl det op, væk fra hjertet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Diagrammer over placering af nålen i hjertets anatomi . (A) Ventral diagram over et X. laevis hjerte. (B) Hjertediagram, hvor hjertesækken er fjernet, og som viser den korrekte placering af nålen og klemmen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Fotografi af hjertets anatomi og nålens placering. Når perikardiet fjernes, er de tre kamre i hjertet og arteriestammen let synlige. Brug tang til forsigtigt at gribe ventriklen ved dens spids og derefter indsætte nålen gennem tangen. Pas på ikke at forårsage unødig skade på ventriklen eller andre kamre, da dette vil kompromittere perfusionseffektiviteten. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 8: Perfusion er i gang. Den højre auricle er blevet lanceret, og ventriklen, arteriel bagagerum og venstre auricle er synligt engorged. Maven blancherer, og både medierne, der løber fra dyret og lungevævet, er stærkt mættet med blod. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 9: Det coelomiske hulrum efter vellykket hurtig perfusion og skylning. Vaskulaturen i maven og andre organer er ikke længere let synlig. Medmindre Xenopus er albino, vil leveren forblive stærkt pigmenteret. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 10: Vævsprøver fra en ikke-perfuseret og perfuseret albinohan X. laevis. Forskellene i pigmentering og synlighed af vaskulaturen er udtalt. Alle prøver er inden for brønde med en diameter på 3,5 cm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 11: Fejlfinding diagrammer af et Xenopus hjerte. (A) Ventriklen har perforering (i rødt); Denne perforering isoleres af tangen og påvirker ikke perfusionseffektiviteten. (B) Et hjerte med en alvorligt beskadiget ventrikel. Nålen kan føres ind i arteriestammen og fastspændes på plads. Det er især vigtigt at sikre, at nålen er godt afstumpet, når du bruger denne teknik14. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 12: Vurdering af perfusionseffektivitet i albinoer. En albino X. laevis både før (A) og efter (B) hurtig perfusion. Albinismen gør det lettere at bestemme perfusionens færdigheder, end det ville være i et pigmenteret dyr. Dette er især tydeligt i lunge- og levervæv. Klik her for at se en større version af denne figur.
Tabel 1: Fejlfindingstabel. Flere typiske problemer, deres mulige årsager og foreslåede afhjælpende foranstaltninger er angivet. Klik her for at downloade denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol beskriver traditionelle dissektionsteknikker til adgang til det coelomiske hulrum. Andre teknikker er også acceptable, forudsat at de forårsager minimal skade på vævene, hjertet er tilgængeligt, og lungen og maven er synlige. På samme måde kan de fleste dissektionsværktøjer, der er angivet, let erstattes med sammenlignelige genstande.
Mens der er gjort forsøg på at optimere effektiviteten af denne procedure, kan resultaterne variere afhængigt af ens erfaring og variabilitet mellem individuelle frøer. Et interessant aspekt af blodperfusion, der forblev uden for dette papirs anvendelsesområde, er, hvordan denne procedure sammenlignes med alternative måder at perfusionere på for dyr, der gennemgår kirurgi. En anden uudforsket variabel er, hvordan blodperfusion ville fungere hos meget unge dyr eller dyr i fremskreden alder, hvor vaskulaturen kan være for skrøbelig. Der fremsættes yderligere bemærkninger for at lette anvendelsen af denne protokol. Flere typiske problemer, deres mulige årsager og forslag til afhjælpende foranstaltninger findes i tabel 1.
En begrænsning af denne procedure er, at perfusionseffektiviteten kan påvirkes negativt af dens hastighed. Hvis perfusionseffektivitet har forrang for hurtig perfusion, anbefales tilpasning af en axolotl-teknik1 (Saltman et al. bruger udtrykket aorta til at henvise til arteriestammen).
Procedurens varighed og mængden af anvendte medier afhænger af en række variabler. Generelt tager X. tropicalis-hanner mellem 2-3 minutter at perfusere med 15-25 ml medier, mens X. tropicalis-hunner tager mellem 3-4 minutter med 25-40 ml medier . Der blev fundet signifikant mere variation fra dyr til dyr ved perfusering af X. laevis. Selvom en højere strømningshastighed ville mindske den tid, der kræves for at perfusere større dyr, kan det øgede ledningstryk let føre til, at rørfittings løsner sig og pumpesvigt.
Det er naturligvis meget lettere at vurdere perfusionseffektiviteten hos albinodyr. Forskellen er især tydelig i lunge- og levervæv (figur 12). Således anbefales brug af albinoer, især når man først forsøger perfusion eller undergår træning.
Ved at justere strømningshastigheden og nålestørrelsen kan protokollen tilpasses til alle arter af Xenopus. På grund af homologien i hjerteanatomi og blodcirkulation mellem Xenopus og de fleste andre padder15, såvel som ikke-krokodillekrybdyr, kan denne teknik ændres til hurtig perfusion af hele kroppen af andre modeller med trekammerhjerter16. Hvis der anvendes en ikke-krokodillereptilmodel, der udelukkende kræver perfusion af en af aortabuerne, anbefales andre protokoller17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af NIHs OD R24-tilskud OD031956 og NICHD R01-tilskud HD073104. Vi takker Darcy Kelly for nyttige diskussioner og indledende input til denne protokol. Vi vil også gerne takke Samantha Jalbert, Jill Ralston og Wil Ratzan for deres hjælp og støtte samt vores tre anonyme fagfællebedømmere for deres feedback.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5x Magnifying glass with LED light and stand | amazon.com | B08QJ6J8P1 | light must not produce heat |
| Disposable transfer pipets | VWR | 414004-036 | |
| Dissecting fine-pointed forceps | Fisher Scinetific | 08-875 | |
| Dissecting scissors sharp piont, straight 6.5" | VWR | 76457-374 | |
| Dissection tray | Fisher Scinetific | 14-370-284 | styrofoam sheets are an acceptable alternative |
| Euthanasia container | US Plastic | Item 2860 | alternative opaque containers acceptable |
| Euthanasia container lid | US Plastic | Item 3047 | |
| Fine dissection pins | Living Systems Instrumentation | PIN-#3 | |
| General use hypodermic needles, 22 G | Fisher Scientific | 14-826-5A | for X. laevis |
| General use hypodermic needles, 25 G | Fisher Scientific | 14-826AA | for X. tropicalis |
| Heparin, porcine intestinal mucosa | MilliporeSigma | 37-505-410MG | |
| Iridectomy scissors 6" | vwr | 470018-938 | iris scissors are an acceptable alternative |
| Luer-to-barb adapter male Luer with lock ring | amazon.com | B09PTX6M2Z | size will be dependant on the hosing of the pump used |
| Mayo-Hegar needle holder | Fisher Scinetific | 08-966 | mosquito forceps are an acceptable alternative |
| MS-222: Syncaine (formerly tricaine) | Pentair AES | TRS1 | |
| PBS 1x | Corning | 21-040-CV | |
| Peristaltic liquid pump dosing pump 5–100 mL/min | amazon.com | B07PWY4SM6 | any peristaltic pump capable of pumping 5-10mL/min is acceptable |
| Sharpening stone | VWR | 470150-112 | optional; for dulling needles |
| Sodium bicarbonate, powder, USP | Fisher Scientific | 18-606-333 | |
| Specimen forceps, serrated | VWR | 82027-442 | |
| T-Pins for dissecting | Fisher Scinetific | S99385 | |
| Ultra-fine short insulin syringes, 31 G | VWR | BD328438 | |
| Wire flush cutters, 6-inch ultra sharp & powerful side cutter clippers | amazon.com | B087P191LP |
References
- Saltman, A. J., Barakat, M., Bryant, D. M., Brodovskaya, A., Whited, J. L. DiI perfusion as a method for vascular visualization in Ambystoma mexicanum. Journal of Visualized Experiments. (124), e55740 (2017).
- Lametschwandtner, A., Minnich, B. Microvascular anatomy of the brain of the adult pipid frog, Xenopus laevis (Daudin): A scanning electron microscopic study of vascular corrosion casts. Journal of Morphology. 279 (7), 950-969 (2018).
- Lametschwandtner, A., Minnich, B. Microvascular anatomy of the urinary bladder in the adult African clawed toad, Xenopus laevis: A scanning electron microscope study of vascular casts. Journal of Morphology. 282 (3), 368-377 (2021).
- Lametschwandtner, A., et al. Microvascular anatomy of the gallbladder of the adult South African clawed toad, Xenopus laevis Daudin: A scanning electron microscope study of vascular corrosion casts. Microscopy and Microanalysis. 13, 492-493 (2007).
- Lametschwandtner, A., Spornitz, U., Minnich, B. Microvascular anatomy of the non-lobulated liver of adult Xenopus laevis: A scanning electron microscopic study of vascular casts. Anatomical Record. 305 (2), 243-253 (2022).
- Miodoński, A. J., Bär, T. Arterial supply of the choriocapillaris of anuran amphibians (Rana temporaria, Rana esculenta). Scanning electron-microscopic (SEM) study of microcorrosion casts. Cell and Tissue Research. 249 (1), 101-109 (1987).
- Nenni, M. J., et al. Xenbase: Facilitating the use of Xenopus to model human disease. Frontiers in Physiology. 10, 154 (2019).
- Tandon, P., Conlon, F., Furlow, J. D., Horb, M. E. Expanding the genetic toolkit in Xenopus: Approaches and opportunities for human disease modeling. Developmental Biology. 426 (2), 325-335 (2017).
- Peshkin, L., et al. The protein repertoire in early vertebrate embryogenesis. bioRxiv. , (2019).
- Briggs, J. A., et al. The dynamics of gene expression in vertebrate embryogenesis at single-cell resolution. Science. 360 (6392), (2018).
- Liao, Y., et al. Cell landscape of larval and adult Xenopus laevis at single-cell resolution. Nature Communications. 13 (1), 4306 (2022).
- AVMA (American Veterinary Medical Association). AVMA guidelines for the euthanasia of animals, 2020 edition. AVMA. , Schaumburg, Illinois. 37 (2020).
- Navarro, K., Jampachaisri, K., Chu, D., Pacharinsak, C. Bupivacaine as a euthanasia agent for African Clawed Frogs (Xenopus laevis). PLoS One. 17 (12), e0279331 (2022).
- Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio-Protocol. 11 (5), e3988 (2021).
- Heinz-Taheny, K. M. Cardiovascular physiology and diseases of amphibians. Veterinary clinics of North America. The Veterinary Clinics of North America. Exotic Animal Practice. 12 (1), 39-50 (2009).
- Stephenson, A., Adams, J. W., Vaccarezza, M. The vertebrate heart: an evolutionary perspective. Journal of Anatomy. 231 (6), 787-797 (2017).
- Hoops, D. A perfusion protocol for lizards, including a method for brain removal. MethodsX. 2, 165-173 (2015).
