Summary
Здесь представлен эффективный протокол быстрой перфузии крови для подготовки образцов тканей африканских когтистых лягушек для исследований транскриптомики и протеомики.
Abstract
Xenopus были мощными модельными организмами для понимания развития позвоночных и болезней на протяжении более 100 лет. Здесь определяется протокол быстрой перфузии крови в Xenopus, направленный на последовательное и резкое сокращение крови во всех тканях. Перфузия осуществляется путем введения иглы непосредственно в желудочек сердца и перекачивания гепаринизированного фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) через сосудистую систему. Процедура может быть завершена примерно за 10 минут на животное. В крови преобладают несколько очень распространенных белков и типов клеток, что создает многочисленные проблемы, поскольку эти белки маскируют большинство других молекул и типов клеток, представляющих интерес. Воспроизводимая характеристика тканей взрослого Xenopus с помощью количественной протеомики и одноклеточной транскриптомики выиграет от применения этого протокола до отбора проб органов. Протоколы отбора проб тканей определены в сопроводительных документах. Эти процедуры направлены на стандартизацию практики Xenopus разного пола, возраста и состояния здоровья, в частности X. laevis и X. tropicalis.
Introduction
Перфузия всего тела амфибий обычно завершается с целью сохранения и фиксации 1,2,3,4,5,6. Однако эти процедуры происходят со скоростью, которая ограничивает количество свежих образцов, которые могут быть взяты на одно животное. Целью данной работы является разработка эффективного протокола перфузии крови в Xenopus, отдавая приоритет скорости техники. Протокол занимает менее 10 минут на животное для X. tropicalis и менее 15 минут на животное X. laevis. Второстепенными приоритетами являются простота репликации и использование легко приобретаемого оборудования, чтобы высококачественные образцы могли широко использоваться лабораториями Xenopus.
Лягушки Xenopus широко используются в биомедицинских исследованиях для изучения фундаментальных биологических и патологических процессов, сохраняющихся у разных видов. Этот четвероногий имеет более тесные эволюционные отношения с млекопитающими, чем другие водные модели, имея легкие, трехкамерное сердце и конечности с пальцами. Международное сообщество эффективно использует Xenopus для более глубокого понимания болезней человека посредством углубленного моделирования заболеваний и молекулярного анализа функции генов, связанных с болезнью. Многочисленные преимущества Xenopus в качестве животной модели делают их бесценными инструментами для изучения молекулярных основ развития и болезней человека; К таким преимуществам относятся: большой размер ооцитов и эмбрионов, высокая плодовитость, легкость размещения, быстрое внешнее развитие и простота геномных манипуляций. По оценкам, Xenopus разделяют ~ 80% идентифицированных генов болезней человека7.
По сравнению с популярными моделями млекопитающих, Xenopus является быстрой и экономически эффективной моделью, с легкостью нокдауна морфолино и наличием эффективных трансгенов и целевых мутаций генов с использованием CRISPR8. Количественная масс-спектрометрия и одноклеточная транскриптомика были успешно применены к эмбрионам Xenopus 9,10, но недавний клеточный атлас Xenopus laevis показывает, что в составе большинства тканей преобладают типы клеток крови11. Благодаря разработке метода, который обескровливает ткани с высокой скоростью и с использованием охлажденных сред, перфузия минимально влияет на свежесть образца. Это особенно важно для приложений, где цель состоит в том, чтобы профилировать физиологически невозмущенную экспрессию мРНК или белка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты проводились в соответствии с правилами и положениями Гарвардской медицинской школы IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee) (IS 00001365_3).
ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя основной метод эвтаназии, описанный Американской ветеринарной медицинской ассоциацией, считается приемлемым методом эвтаназии12, не было обнаружено, что он приводит к прекращению сердцебиения13. Даже часто используемый вторичный метод двойной порки не предотвращает этого, равно как и удаление сердца у животного. Обескровливание животных, находящихся под наркозом, считается гуманным и эффективным методом успешной эвтаназии12. Поскольку поддержание свежих тканей посредством эвтаназии является целью этого протокола, полезно, чтобы сердце продолжало биться во время первичной эвтаназии с MS-222, и что перфузия сама по себе является методом вторичной эвтаназии путем обескровливания.
1. Подготовка
- Убедитесь, что научно-исследовательское учреждение одобрило метод эвтаназии и перфузии, описанный в этом протоколе.
- Приготовьте раствор из 5 г/л MS-222 (трикаинметансульфоната) и 5 г/л бикарбоната натрия. Объем должен быть больше, чем объем, необходимый для полного покрытия усыпляемых животных. Проверьте рН, чтобы убедиться, что он составляет ≥7.
- Приготовьте 500 мкл 180 ЕД/мл гепарина в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS) на X . laevis или 200 мкл на X. tropicalis.
- Проведите первичную эвтаназию, поместив Xenopus в этот раствор (из шага 1.2); Животное будет оставаться под водой в общей сложности 1 час.
- Подтвердите, что Xenopus потерял свою болевую реакцию, ущипнув ногу через 15 минут после эвтаназии. Если животное реагирует, верните его в раствор для эвтаназии до тех пор, пока этот ответ не будет потерян.
- Взвесьте Xenopus и проведите любые дополнительные измерения, необходимые перед отбором проб.
- Используя иглу весом 31 г, введите X. laevis 250 мкл и X. tropicalis 100 мкл гепарина 180 ЕД/мл в PBS (с шага 1.3) в мускулатуру каждой передней конечности.
- Готовят раствор 1 мл/г животного массой 54 ЕД/мл гепарина в перфузате PBS. Люди, более опытные с этим протоколом, могут обнаружить, что для полной перфузии требуется меньше среды.
- Используйте иглу для подкожных инъекций 22 г для перфузии X. laevis и иглу для подкожных инъекций 25 г для X. tropicali s. Затупите перфузионную иглу, обрезав кончик кусачками (рис. 1)14.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это снижает вероятность перфорации иглы через желудочек при смещении. В дополнение к притуплению, игла может быть слегка отшлифована точильным камнем или напильником, но все же остается достаточно острой, чтобы проткнуть желудочек. - Подготовьте насос, присоединив обрезанную иглу и циркулируя гепаринизированный перфузат PBS 54 ЕД/мл (из шага 1.8). Убедитесь, что все пузырьки воздуха удалены из трубки, чтобы исключить возможность воздушной эмболии, которая приводит к снижению эффективности перфузии или отказу (см. Таблицу 1). Держите перфузионную среду на льду в течение всей процедуры.
- Если насос не программируется, с установленной иглой измерьте объем перекачиваемой среды при различных настройках, чтобы определить, какие настройки наиболее близки к 5 мл/мин и 10 мл/мин. Эти скорости потока будут использоваться независимо от вида. Если перфузионный насос является программируемым, откалибруйте его с установленной иглой, следуя инструкциям производителя.
- Поместите поверхность для вскрытия (лоток или лист пенопласта) под наклоном во вторичный контейнер или расположите ее так, чтобы облегчить дренаж крови.
- После того, как лягушка находилась в растворе в течение 1 часа, первичная эвтаназия была завершена. Извлеките лягушку и еще раз проверьте потерю болевой реакции, выполнив ущипывание ногой.
- Положите лягушку на спину и прижмите каждую конечность (рисунок 2). Если требуется сохранение тканей конечностей, тонкие штифты могут быть помещены через пальцы или U-образные скобы вокруг конечностей.
- С помощью ножниц для рассечения прорежьте кожу, вверх по средней линии, а затем сбоку, сделав два лоскута. (Рисунок 2)
- Используйте щипцы, чтобы захватить белую линию и вытащить ее из целомической полости (рис. 3). Аккуратно используйте ножницы, чтобы разрезать мускулатуру. Сделайте две створки из стенки полости и отрежьте или закрепите все створки в стороне.
- Используйте ножницы для рассечения, чтобы разрезать коракоидные кости и срезать лишнюю ткань, чтобы получить лучший доступ к сердцу (рис. 3).
- Сердце все еще должно биться. Если сердце перестало биться до перфузии, обратите внимание, что свежесть образца была нарушена.
2. Перфузия
- Определите желудок и аккуратно сдвиньте его так, чтобы он находился поверх левой доли печени (справа от зрителя), при этом его сосудистая сеть была видна на протяжении всей процедуры. Определите легкое и захватите его за кончик с помощью тканевых щипцов. Вытяните легкое за пределы целомической полости и проткните его через наконечник (рис. 4). Делайте это осторожно, так как лопнувшие кровеносные сосуды плохо перфузируются. Обратите внимание, видна ли кровь в доле, так как это повлияет на способность определить завершение процедуры.
- Сделайте снимок целомической полости, чтобы лучше оценить эффективность перфузии и потенциально идентифицировать аномальные ткани на более позднем этапе.
- Определите тонкий перикард и потяните его тканевыми щипцами (рисунок 5). Аккуратно перфорируйте перикард кончиком ножниц для иридэктомии, стараясь не порезать подлежащие ткани. Очистите перикард от трех камер сердца.
- Используйте щипцы, чтобы осторожно захватить желудочек за его вершину. Приложите ограниченное давление, чтобы между тракционными поверхностями щипцов оставалось достаточно места для прохождения перфузионной иглы (рис. 6).
- Введите иглу через закрытие щипцов в камеру желудочка, стараясь не перфорировать желудочек (рис. 7). Зажмите тканевые щипцы на месте с помощью иглодержателя с помощью гемостата.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта техника стабилизирует положение иглы, которая все еще острая. Прижимание иглы непосредственно к желудочку также приведет к ненужным повреждениям, что затруднит рефиксацию в случае необходимости (см. Таблицу 1). - Запустите поток насоса примерно со скоростью 5 мл/мин. Три камеры сердца и артериального ствола набухают (рис. 8; см. таблицу 1).
- Ножницами аккуратно проткните правую ушную раковину (слева от зрителя); Кровь прольется рекой. Установите скорость потока на уровне 5 мл/мин или увеличьте ее до 10 мл/мин.
- Продолжайте до тех пор, пока сосудистая сеть желудка не побледнеет (см. Таблицу 1), затем копье левой ушной раковины сердца (справа от зрителя). Если скорость потока по-прежнему составляет 5 мл/мин, увеличьте ее примерно до 10 мл/мин.
- Используйте трансферную пипетку для промывания целомической полости в перфузионных средах, чтобы помочь сохранить видимость и лучше оценить цвет перфузата, вытекающего из ушных раковин.
- Удерживайте иглу на месте до тех пор, пока перфузат, вытекающий из ушных раковин, не станет прозрачным (см. Таблицу 1) и легкое не потеряет свой красный оттенок (см. Таблицу 1; Рисунок 9).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
После успешной перфузии все ткани (за исключением печени у пигментированного ксенопуса) будут заметно светлее и менее насыщены кровью. Крупные кровеносные сосуды станут менее заметными (рис. 10), а ткани (за исключением печени) будут чисто промыты в буфере после отбора проб. Хотя успешное выполнение протокола в конечном итоге может быть подтверждено только качеством данных из обескровленных образцов тканей, несколько типичных проблем, их возможные причины и предлагаемые корректирующие действия приведены в таблице устранения неполадок (таблица 1 и рисунок 11).
Рисунок 1: Необрезанная и обрезанная хвоя14. С помощью кусачек для проволоки притупите иглу, отрезав ее кончик. Он будет достаточно острым, чтобы проткнуть сердце, но перфорация желудочка будет менее вероятной в случае человеческой ошибки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Половозрелая самка X. tropicalis , прижатая к каждой конечности. С помощью зубчатых рассекающих щипцов натягивайте кожу возле клоаки, научитесь перфорировать ее диссекционными ножницами и создавать два лоскута. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Мышечная стенка. При открытой вентральной коже, но неповрежденной мышечной стенке видна белая линия. Чтобы снизить вероятность повреждения подлежащих тканей, возьмитесь за белую линию и потяните ее перед разрезанием. Коракоидные кости видны через брюшину. После того, как целомическая полость была открыта, эти кости должны быть уменьшены, чтобы обеспечить лучший доступ к сердцу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Целомическая полость половозрелого самца X. tropicalis. Коракоидные кости были уменьшены, обеспечивая доступ к сердцу, окруженному перикардом. Желудок смещен перед левой долей печени, и хорошо видна его сосудистая сеть. Левое легкое было вытащено из целомической полости за кончик и закреплено, чтобы гарантировать, что оно не втягивается во время процесса промывания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Перикард. Перикард представляет собой тонкую жесткую оболочку, охватывающую сердце. Используя тканевые щипцы, осторожно возьмитесь за перикард, а затем используйте кончик ножниц для иридэктомии, чтобы перфорировать его. После перфорации снимите кожуру, подальше от сердца. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Диаграммы расположения игл в анатомии сердца. (A) Вентральная диаграмма сердца X. laevis. (B) Диаграмма сердца с удаленным перикардом, показывающая правильное размещение иглы и зажима. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Анатомия сердца и фотография размещения иглы. При удаленном перикарде хорошо видны три камеры сердца и артериального ствола. Используйте щипцы, чтобы осторожно захватить желудочек за его вершину, а затем ввести иглу через щипцы. Будьте осторожны, чтобы не вызвать ненужного повреждения желудочка или других камер, так как это поставит под угрозу эффективность перфузии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 8: Идет перфузия. Правая ушная раковина была уколота, а желудочек, артериальный ствол и левая ушная раковина заметно набухли. Желудок бледнеет, и как среда, идущая от животного, так и легочная ткань сильно насыщены кровью. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 9: Целомическая полость после успешной быстрой перфузии и полоскания. Сосудистая сеть желудка и других органов больше не видна. Если ксенопус не является альбиносом, печень останется сильно пигментированной. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 10: Образцы тканей от неперфузированного и перфузированного самца альбиноса X. laevis. Различия в пигментации и видимости сосудистой сети ярко выражены. Все образцы находятся в лунках диаметром 3,5 см. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 11: Диаграммы устранения неполадок сердца Xenopus. (А) желудочек имеет перфорацию (красным цветом); Эта перфорация изолируется щипцами и не влияет на эффективность перфузии. (B) Сердце с сильно поврежденным желудочком. Иглу можно направить в артериальный ствол и зажать на месте. При использовании этой техники особенно важно убедиться, что игла хорошо затуплена14. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 12: Оценка эффективности перфузии у альбиносов. Альбинос X. laevis как до, так и после (В) быстрой перфузии. Альбинизм облегчает определение уровня перфузии, чем у пигментированного животного. Особенно ярко это проявляется в тканях легких и печени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Таблица 1: Таблица устранения неполадок. Приводится несколько типичных проблем, их возможные причины и предлагаемые меры по их устранению. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол описывает традиционные методы диссекции для доступа к целомической полости. Другие методы также приемлемы, при условии, что они наносят минимальный ущерб тканям, сердце доступно, а легкие и желудок видны. Точно так же большинство перечисленных инструментов вскрытия можно легко заменить сопоставимыми предметами.
Несмотря на то, что были предприняты попытки оптимизировать эффективность этой процедуры, результаты могут варьироваться в зависимости от опыта и вариабельности между отдельными лягушками. Одним из интересных аспектов перфузии крови, который остался за рамками этой статьи, является то, как эта процедура сравнивается с альтернативными способами перфузии для животных, которые подвергаются хирургическому вмешательству. Еще одна неизученная переменная заключается в том, как перфузия крови будет работать у очень молодых животных или животных пожилого возраста, когда сосудистая сеть может быть чрезмерно хрупкой. Дополнительные замечания приводятся для облегчения применения этого протокола. В таблице 1 приведены несколько типичных проблем, их возможные причины и предлагаемые меры по их устранению.
Ограничением этой процедуры является то, что ее скорость может отрицательно повлиять на эффективность перфузии. Если эффективность перфузии имеет приоритет над быстрой перфузией, рекомендуется адаптировать технику аксолотля1 (Saltman et al. используют термин аорта для обозначения артериального ствола).
Продолжительность процедуры и объем используемой среды зависят от ряда переменных. Как правило, самцам X. tropicalis требуется от 2 до 3 минут для успешной перфузии с 15-25 мл среды, в то время как самкам X. tropicalis требуется от 3 до 4 минут с 25-40 мл среды . Значительно больше вариаций от животного к животному было обнаружено при перфузии X. laevis. Хотя более высокая скорость потока сократит время, необходимое для перфузии более крупных животных, повышенное давление в трубопроводе может легко привести к смещению трубных фитингов и выходу насоса из строя.
Естественно, гораздо проще оценить эффективность перфузии у животных-альбиносов. Разница особенно заметна в тканях легких и печени (рис. 12). Таким образом, рекомендуется использовать альбиносов, особенно при первой попытке перфузии или прохождении тренировки.
Регулируя скорость потока и размер иглы, протокол можно адаптировать для всех видов Xenopus. Из-за гомологии в анатомии сердца и кровообращении между Xenopus и большинством других амфибий15, а также некрокодиловыми рептилиями, этот метод может быть модифицирован для быстрой перфузии всего тела других моделей с трехкамерным сердцем16. Если используется модель рептилии, не относящейся к крокодилам, которая требует исключительно перфузии одной из дуг аорты, рекомендуются другие протоколы17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантом NIH OD R24 OD031956 и грантом NICHD R01 HD073104. Мы благодарим Дарси Келли за полезные обсуждения и первоначальный вклад в этот протокол. Мы также хотели бы поблагодарить Саманту Джалберт, Джилл Ралстон и Уила Ратцана за их помощь и поддержку, а также трех наших анонимных рецензентов за их отзывы.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5x Magnifying glass with LED light and stand | amazon.com | B08QJ6J8P1 | light must not produce heat |
| Disposable transfer pipets | VWR | 414004-036 | |
| Dissecting fine-pointed forceps | Fisher Scinetific | 08-875 | |
| Dissecting scissors sharp piont, straight 6.5" | VWR | 76457-374 | |
| Dissection tray | Fisher Scinetific | 14-370-284 | styrofoam sheets are an acceptable alternative |
| Euthanasia container | US Plastic | Item 2860 | alternative opaque containers acceptable |
| Euthanasia container lid | US Plastic | Item 3047 | |
| Fine dissection pins | Living Systems Instrumentation | PIN-#3 | |
| General use hypodermic needles, 22 G | Fisher Scientific | 14-826-5A | for X. laevis |
| General use hypodermic needles, 25 G | Fisher Scientific | 14-826AA | for X. tropicalis |
| Heparin, porcine intestinal mucosa | MilliporeSigma | 37-505-410MG | |
| Iridectomy scissors 6" | vwr | 470018-938 | iris scissors are an acceptable alternative |
| Luer-to-barb adapter male Luer with lock ring | amazon.com | B09PTX6M2Z | size will be dependant on the hosing of the pump used |
| Mayo-Hegar needle holder | Fisher Scinetific | 08-966 | mosquito forceps are an acceptable alternative |
| MS-222: Syncaine (formerly tricaine) | Pentair AES | TRS1 | |
| PBS 1x | Corning | 21-040-CV | |
| Peristaltic liquid pump dosing pump 5–100 mL/min | amazon.com | B07PWY4SM6 | any peristaltic pump capable of pumping 5-10mL/min is acceptable |
| Sharpening stone | VWR | 470150-112 | optional; for dulling needles |
| Sodium bicarbonate, powder, USP | Fisher Scientific | 18-606-333 | |
| Specimen forceps, serrated | VWR | 82027-442 | |
| T-Pins for dissecting | Fisher Scinetific | S99385 | |
| Ultra-fine short insulin syringes, 31 G | VWR | BD328438 | |
| Wire flush cutters, 6-inch ultra sharp & powerful side cutter clippers | amazon.com | B087P191LP |
References
- Saltman, A. J., Barakat, M., Bryant, D. M., Brodovskaya, A., Whited, J. L. DiI perfusion as a method for vascular visualization in Ambystoma mexicanum. Journal of Visualized Experiments. (124), e55740 (2017).
- Lametschwandtner, A., Minnich, B. Microvascular anatomy of the brain of the adult pipid frog, Xenopus laevis (Daudin): A scanning electron microscopic study of vascular corrosion casts. Journal of Morphology. 279 (7), 950-969 (2018).
- Lametschwandtner, A., Minnich, B. Microvascular anatomy of the urinary bladder in the adult African clawed toad, Xenopus laevis: A scanning electron microscope study of vascular casts. Journal of Morphology. 282 (3), 368-377 (2021).
- Lametschwandtner, A., et al. Microvascular anatomy of the gallbladder of the adult South African clawed toad, Xenopus laevis Daudin: A scanning electron microscope study of vascular corrosion casts. Microscopy and Microanalysis. 13, 492-493 (2007).
- Lametschwandtner, A., Spornitz, U., Minnich, B. Microvascular anatomy of the non-lobulated liver of adult Xenopus laevis: A scanning electron microscopic study of vascular casts. Anatomical Record. 305 (2), 243-253 (2022).
- Miodoński, A. J., Bär, T. Arterial supply of the choriocapillaris of anuran amphibians (Rana temporaria, Rana esculenta). Scanning electron-microscopic (SEM) study of microcorrosion casts. Cell and Tissue Research. 249 (1), 101-109 (1987).
- Nenni, M. J., et al. Xenbase: Facilitating the use of Xenopus to model human disease. Frontiers in Physiology. 10, 154 (2019).
- Tandon, P., Conlon, F., Furlow, J. D., Horb, M. E. Expanding the genetic toolkit in Xenopus: Approaches and opportunities for human disease modeling. Developmental Biology. 426 (2), 325-335 (2017).
- Peshkin, L., et al. The protein repertoire in early vertebrate embryogenesis. bioRxiv. , (2019).
- Briggs, J. A., et al. The dynamics of gene expression in vertebrate embryogenesis at single-cell resolution. Science. 360 (6392), (2018).
- Liao, Y., et al. Cell landscape of larval and adult Xenopus laevis at single-cell resolution. Nature Communications. 13 (1), 4306 (2022).
- AVMA (American Veterinary Medical Association). AVMA guidelines for the euthanasia of animals, 2020 edition. AVMA. , Schaumburg, Illinois. 37 (2020).
- Navarro, K., Jampachaisri, K., Chu, D., Pacharinsak, C. Bupivacaine as a euthanasia agent for African Clawed Frogs (Xenopus laevis). PLoS One. 17 (12), e0279331 (2022).
- Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio-Protocol. 11 (5), e3988 (2021).
- Heinz-Taheny, K. M. Cardiovascular physiology and diseases of amphibians. Veterinary clinics of North America. The Veterinary Clinics of North America. Exotic Animal Practice. 12 (1), 39-50 (2009).
- Stephenson, A., Adams, J. W., Vaccarezza, M. The vertebrate heart: an evolutionary perspective. Journal of Anatomy. 231 (6), 787-797 (2017).
- Hoops, D. A perfusion protocol for lizards, including a method for brain removal. MethodsX. 2, 165-173 (2015).
