Summary
ここでは、トランスクリプトミクスおよびプロテオミクス研究のためにアフリカツメガエルから組織サンプルを調製するための効果的な迅速な血液灌流プロトコルを示します。
Abstract
アフリカツメガエル は、100年以上にわたり脊椎動物の発育と疾患を理解するための強力なモデル生物でした。ここでは、すべての組織内の血液の一貫した劇的な減少を目的とした 、アフリカツメガエル の急速な血液灌流プロトコルが定義されています。灌流は、心臓の心室に直接針を挿入し、血管系を通してヘパリン化リン酸緩衝生理食塩水(PBS)をポンピングすることによって行われます。この手順は、動物あたり約10分で完了することができます。血液はいくつかの非常に豊富なタンパク質と細胞タイプによって支配されており、これらのタンパク質が他のほとんどの分子と関心のある細胞タイプを隠すため、多くの問題を引き起こします。定量的プロテオミクスおよび単一細胞トランスクリプトミクスによる成人アフリカ ツメガエル 組織の再現性のある特性評価は、臓器サンプリングの前にこのプロトコルを適用することで恩恵を受けます。組織サンプリングのプロトコルは、コンパニオンペーパーで定義されています。これらの手順は、性別、年齢、健康状態の異なる アフリカツメガエル 、特に X. laevis と X. tropicalisにわたる慣行の標準化を目的としています。
Introduction
両生類の全身灌流は、保存および固定の目的で日常的に完了する1,2,3,4,5,6。ただし、これらの手順は、動物ごとに採取できる新鮮なサンプルの数を制限する速度で行われます。この研究の目標は、アフリカツメガエルの効果的な血液灌流プロトコルを開発し、技術の速度を優先することです。このプロトコルは、X. tropicalisでは動物あたり10分未満、X. laevis動物では15分未満かかります。二次的な優先事項は、複製の容易さと、高品質のサンプルをアフリカツメガエルのラボ間で広く共有できるように、簡単に入手できる機器の使用です。
アフリカツメガエル は、種を超えて保存されている基本的な生物学的および病理学的プロセスを研究するために、生物医学研究で広く使用されています。この四肢動物は、他の水生モデルよりも哺乳類とより密接な進化的関係を持ち、肺、3室の心臓、指のある手足を持っています。国際社会は、 アフリカツメガエル を効果的に利用して、詳細な疾患モデリングと疾患関連遺伝子機能の分子解析を通じて、ヒトの疾患をより深く理解しています。動物モデルとしての アフリカツメガエル の多くの利点は、それらを人間の発達と病気の分子基盤を研究するための非常に貴重なツールにします。これらの利点には、卵母細胞と胚のサイズが大きい、繁殖力が高い、飼育の容易さ、迅速な外部発生、およびゲノム操作の容易さが含まれます。 アフリカツメガエル は、同定されたヒト疾患遺伝子の~80%を共有すると推定されています7。
一般的な哺乳類モデルと比較して、アフリカツメガエルは迅速で費用効果の高いモデルであり、モルホリノノックダウンが容易で、CRISPR8を使用した効率的なトランスジェニックおよび標的遺伝子変異を利用できます。定量的質量分析と単一細胞トランスクリプトミクスはアフリカツメガエルの胚にうまく適用されています9,10が、アフリカツメガエルの最近の細胞アトラスは、ほとんどの組織の組成が血球型によって支配されていることを示しています11。組織を急速に放血する技術を開発し、冷却培地を使用することにより、サンプルの鮮度は灌流による影響を最小限に抑えます。これは、生理学的に摂動されていないmRNAまたはタンパク質発現のプロファイリングを目的とするアプリケーションにとって特に重要です。
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Protocol
すべての実験は、ハーバード大学医学部IACUC(施設動物管理および使用委員会)(IS 00001365_3)の規則および規則に従って実施されました。
注:記載されている安楽死の主な方法は、米国獣医師会12によって安楽死の許容可能な技術と見なされていますが、心拍の停止につながることはわかっていません13。頻繁に使用される二次的な二重ピシングの方法でさえ、これを防ぐことはなく、動物から心臓を取り除くこともありません。麻酔をかけた動物の放血は、安楽死を成功させるための人道的で効果的な方法と考えられています12。安楽死によって新鮮な組織を維持することがこのプロトコルの目標であるため、MS-222による一次安楽死によって心臓が鼓動し続けること、および灌流自体が放血による二次安楽死法であることが有益です。
1. 事前準備
- 研究機関がこのプロトコルに記載されている安楽死および灌流技術を承認していることを確認してください。
- 5 g/L MS-222(トリカインメタンスルホン酸塩)と5 g/L重炭酸ナトリウムの溶液を調製します。体積は、安楽死させる動物を完全に覆うのに必要な体積よりも大きくなければなりません。pHをチェックして、≥7であることを確認します。
- リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中の180 U/mLヘパリンを500 μL/ラエビスあたり、またはトロピカリスあたり200 μLを調製します。
- アフリカツメガエルをこの溶液に入れて一次安楽死を行います(ステップ1.2から)。動物は合計1時間水没したままになります。
- アフリカツメガエルが痛みの反応を失ったことを確認するには、安楽死に15分間足をつまんでください。動物が反応性である場合は、この反応が失われるまで安楽死溶液に戻します。
- アフリカツメガエルの重量を量り、サンプリングする前に必要な追加の測定を行います。
- 31 Gの針を使用して、PBS中の180 U / mLヘパリンを含む250 μLのX .ラエビス と100 μLの X.トロピカリス(ステップ1.3 から)を各前肢の筋肉組織に注射します。
- PBS灌流液中の動物体重54 U / mLヘパリンの1 mL / gの溶液を調製します。このプロトコルの経験が豊富な個人は、灌流を完了するために必要なメディアが少ないことに気付くかもしれません。
- X. laevisの灌流には22 Gの皮下注射針を使用し、X. tropicalisには25 Gの皮下注射針を使用します。ワイヤーカッターで先端を切り取って灌流針を鈍くします(図1)14。
注意: これにより、シフトした場合に針が心室に穿孔する可能性が低くなります。鈍化に加えて、針は砥石またはやすりでわずかに粉砕される場合がありますが、それでも心室を突き刺すのに十分な鋭さのままです。 - トリミングした針を取り付け、54 U / mLのヘパリン化PBS灌流液を循環させてポンプを準備します(ステップ1.8から)。チューブからすべての気泡をパージして、空気塞栓症の可能性を排除し、灌流効率の低下または故障につながります( 表1を参照)。手順の間、灌流媒体を氷上に保管してください。
- ポンプがプログラム可能でない場合は、針を取り付けた状態で、さまざまな設定で培地のポンプ量を測定し、5 mL/minと10 mL/minに最も近い設定を決定します。これらの流量は、種に関係なく使用されます。灌流ポンプがプログラム可能な場合は、製造元の指示に従って、針を所定の位置にして校正します。
- 解剖面(トレイまたは発泡シート)を二次容器内の傾斜に配置するか、血液が排出しやすいように配置します。
- カエルが1時間溶液に入ると、一次安楽死が完了します。カエルを取り除き、足をつまんで痛みの反応の喪失を再確認します。
- カエルを背中に置き、各手足を固定します(図2)。手足の組織を保存する必要がある場合は、手足の周りの数字またはU字型のステープルに細いピンを配置することができます。
- 解剖はさみを使用して、皮膚を切り、正中線を上ってから横方向に切り、2つのフラップを作ります。(図2)
- 鉗子を使用してリネアアルバをつかみ、体腔から引き離します(図3)。ハサミを慎重に使用して筋肉組織を切り取ります。キャビティ壁から 2 つのフラップを外し、すべてのフラップを邪魔にならないように切断または固定します。
- 解剖はさみを使用して烏口骨を切り取り、余分な組織を切り取って心臓へのアクセスを改善します(図3)。
- 心臓はまだ鼓動しているはずです。灌流前に心臓の鼓動が停止している場合は、サンプルの鮮度が損なわれていることに注意してください。
2.灌流
- 胃を識別し、肝臓の左葉(視聴者の右側)の上にくるようにゆっくりと移動し、処置の期間中、血管系が見えるようにします。肺を特定し、組織鉗子を使用してその先端でそれをつかみます。肺を体腔の外側に引き抜き、先端に通します(図4)。壊れた血管はうまく灌流しないので、これを穏やかに行ってください。血液が葉内に見える場合は、手順の完了を判断する能力に影響を与えるため、注意してください。
- 体腔の画像を撮影して、灌流効率をより適切に評価し、後日異常な組織を特定する可能性があります。
- 薄い心膜を特定し、組織鉗子で教えて引っ張ります(図5)。虹彩切除ハサミの先端を使用して心膜をそっと穿孔し、下にある組織を切らないように注意します。心膜を心臓の3つの部屋から剥がします。
- 鉗子を使用して、心室の頂点をそっとつかみます。灌流針が通過するのに十分なスペースが鉗子の牽引面の間にあるように、制限された圧力を加えます(図6)。
- 鉗子の閉鎖を通して心室のチャンバーに針を挿入し、心室に穴を開けないように注意します(図7)。止血材を使用して、ニードルホルダーを使用して組織鉗子を所定の位置に固定します。
注意: この技術は、まだ鋭い針の位置を安定させます。針を心室に直接クランプすると、不必要な損傷も引き起こされ、必要に応じてリクランプがより困難になります( 表1を参照)。 - ポンプの流れを約5mL/分で開始します。心臓と動脈幹の3つの部屋が充血します(図8; 表1を参照)。
- はさみで、右耳介(視聴者の左側)を慎重に槍で突きます。血が流れ出します。流量を5 mL/分に設定するか、10 mL/分に増やします。
- 胃の血管系が白くなるまで続け( 表1を参照)、次に心臓の左耳介(視聴者の右側)を槍で打ちます。それでも流量が5 mL/minの場合は、約10 mL/minに増やします。
- トランスファーピペットを使用して、灌流媒体で体腔をすすぎ、視認性を維持し、耳介から流れる灌流液の色をより適切に評価します。
- 耳介から流れる灌流液が透明になり(表1を参照)、肺が赤い色合いを失うまで(表1を参照)、針を所定の位置に保ちます(表1を参照。図9)。
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Representative Results
灌流が成功すると、すべての組織(色素性アフリカツメガエルの肝臓を除く)が明らかに明るくなり、血液の飽和度が低下します。主要な血管が目立たなくなり(図10)、組織(肝臓を除く)はサンプリング後にバッファーできれいにすすぎます。プロトコルが正常に実行されるかどうかは、最終的には放血組織サンプルからのデータの品質によってのみ確認できますが、いくつかの典型的な問題、考えられる原因、および推奨される是正措置がトラブルシューティング表に記載されています(表1および図11)。
図1:トリミングされていない針とトリミングされた針14。 ワイヤーバリカンを使用して、針の先端を切り落として針を鈍くします。心臓を突き刺すのに十分な鋭さがありますが、人為的ミスが発生した場合、心室に穴を開ける可能性は低くなります。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:成熟した雌の X.トロピカリスは 各肢に固定されています。 歯付き解剖鉗子を使用して、解剖ハサミで穿孔し、2つのフラップを作成するように教えられたクロアカの近くで皮膚を引っ張ります。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:筋肉壁。 腹側の皮膚は開いていますが、筋肉壁は無傷で、リネアアルバが見えます。下にある組織を損傷する可能性を減らすために、切断する前にリネアアルバをつかみ、教えて引っ張ります。烏口骨は腹膜を通して見えます。体腔が開いたら、心臓へのアクセスを改善するためにこれらの骨を減らす必要があります。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:成熟した X. tropicalis オスの体腔。 烏口骨が縮小され、心膜に囲まれた心臓へのアクセスが提供されています。胃は肝臓の左葉の前に移動しており、その血管系ははっきりと見えます。左肺は、その先端によって体腔から引き出され、すすぎプロセス中に収縮しないように固定されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:心膜。 心膜は、心臓を囲む薄くて丈夫な膜です。組織鉗子を使用して、心膜をそっとつかみ、虹彩切除ハサミの先端を使用して心膜に穴を開けます。穴が開いたら、心臓から離して剥がします。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:心臓の解剖学針の配置 図。 (A) X. laevis 心臓の腹側図。(B)心膜を除去した状態で、正しい針とクランプの配置を示す心臓図。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図7:心臓の解剖学的構造と針の配置写真。 心膜を除去すると、心臓と動脈幹の3つの部屋が簡単に見えます。鉗子を使用して心室の頂点をそっとつかみ、鉗子に針を挿入します。心室や他のチャンバーに不必要な損傷を与えないように注意してください これは灌流効率を損なうからです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図8:灌流が進行中です。 右耳介は穿刺されており、心室、動脈幹、左耳介は目に見えて充血しています。胃は白化しており、動物から流れる培地と肺組織の両方が血液でひどく飽和しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図9:急速な灌流とすすぎに成功した後の体腔。 胃や他の臓器の血管系はもはや容易に見えません。 アフリカツメガエル がアルビノでない限り、肝臓はひどく色素沈着したままになります。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図10:灌流されていないアルビノの雄 X.laevisからの組織サンプル。 色素沈着および血管系の視認性の違いは顕著である。すべてのサンプルは直径3.5cmのウェル内にあります。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図11:アフリカツメガエルの心臓のトラブルシューティング図。 (A)心室に穿孔(赤)があります。この穿孔は鉗子によって分離され、灌流効率に影響を与えません。(B)心室がひどく損傷している心臓。針を動脈幹に導き、所定の位置に固定することができます。この手法を使用するときは、針が十分に鈍くなっていることを確認することが特に重要です14。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図12:アルビノの灌流効率の評価。 アルビノ X.ラエビス は、(A)と(B)の急速な灌流の前と後の両方です。白皮症は、色素沈着動物よりも灌流の習熟度を判断することを容易にします。これは特に肺と肝臓の組織で顕著です。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
表1:トラブルシューティング表。 いくつかの典型的な問題、考えられる原因、および推奨される是正措置が提供されています。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルは、体腔にアクセスするための伝統的な解剖技術について説明しています。組織への損傷が最小限で、心臓にアクセスでき、肺と胃が見える限り、他の技術も受け入れられます。同様に、リストされているほとんどの解剖ツールは、同等のアイテムで簡単に置き換えることができます。
この手順の有効性を最適化する試みがなされてきましたが、結果は経験や個々のカエル間のばらつきによって異なる場合があります。この論文の範囲外であった血液灌流の興味深い側面の1つは、この手順が手術を受ける動物の代替灌流方法とどのように比較されるかです。別の未踏の変数は、血管系が過度に脆弱である可能性のある非常に若い動物または高齢の動物で血液灌流がどのように機能するかです。このプロトコルの適用を容易にするために、追加の備考が提供されています。いくつかの一般的な問題、考えられる原因、および推奨される是正措置を 表 1 に示します。
この手順の制限は、灌流効率がその速度によって悪影響を受ける可能性があることです。灌流効率が急速な灌流よりも優先される場合は、アホロートル法を採用することが推奨される1 (Saltmanらは、動脈幹を指すために大動脈という用語を使用している)。
手順の期間と使用されるメディアの量は、いくつかの変数に依存します。一般に、X.トロピカリスのオスは15〜25 mLの培地で正常に灌流するのに2〜3分かかりますが、X.トロピカリスのメスは25〜40 mLのメディアで3〜4分かかります。 X. laevisを灌流すると、動物間の変異が有意に多く見られました。流量が多いほど、大型動物を灌流するのに必要な時間は短くなりますが、ライン圧力が上昇すると、チューブ継手が外れてポンプが故障する可能性があります。
当然のことながら、アルビノ動物の灌流効率を評価する方がはるかに簡単です。この違いは、肺組織と肝臓組織で特に顕著です(図12)。したがって、特に最初に灌流を試みるとき、またはトレーニングを受けるときは、アルビノの使用が推奨されます。
流量と針のサイズを調整することにより、プロトコルは アフリカツメガエルのすべての種に適応できます。 アフリカツメガエル と他のほとんどの両生類15、および非ワニ類の爬虫類との間の心臓の解剖学的構造と血液循環の相同性のために、この技術は、3室の心臓16を持つ他のモデルの全身急速な灌流のために変更される可能性があります。大動脈弓の1つの灌流のみを必要とする非ワニ爬虫類モデルを使用する場合は、他のプロトコルが推奨されます17。
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Disclosures
著者は、競合する利益を宣言しません。
Acknowledgments
この研究は、NIHのOD R24グラントOD031956とNICHD R01グラントHD073104によってサポートされました。このプロトコルに関する有益な議論と最初のインプットを提供してくれたDarcy Kellyに感謝します。また、Samantha Jalbert、Jill Ralston、Wil Ratzanの支援とサポート、およびフィードバックを提供してくれた3人の匿名の査読者にも感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5x Magnifying glass with LED light and stand | amazon.com | B08QJ6J8P1 | light must not produce heat |
| Disposable transfer pipets | VWR | 414004-036 | |
| Dissecting fine-pointed forceps | Fisher Scinetific | 08-875 | |
| Dissecting scissors sharp piont, straight 6.5" | VWR | 76457-374 | |
| Dissection tray | Fisher Scinetific | 14-370-284 | styrofoam sheets are an acceptable alternative |
| Euthanasia container | US Plastic | Item 2860 | alternative opaque containers acceptable |
| Euthanasia container lid | US Plastic | Item 3047 | |
| Fine dissection pins | Living Systems Instrumentation | PIN-#3 | |
| General use hypodermic needles, 22 G | Fisher Scientific | 14-826-5A | for X. laevis |
| General use hypodermic needles, 25 G | Fisher Scientific | 14-826AA | for X. tropicalis |
| Heparin, porcine intestinal mucosa | MilliporeSigma | 37-505-410MG | |
| Iridectomy scissors 6" | vwr | 470018-938 | iris scissors are an acceptable alternative |
| Luer-to-barb adapter male Luer with lock ring | amazon.com | B09PTX6M2Z | size will be dependant on the hosing of the pump used |
| Mayo-Hegar needle holder | Fisher Scinetific | 08-966 | mosquito forceps are an acceptable alternative |
| MS-222: Syncaine (formerly tricaine) | Pentair AES | TRS1 | |
| PBS 1x | Corning | 21-040-CV | |
| Peristaltic liquid pump dosing pump 5–100 mL/min | amazon.com | B07PWY4SM6 | any peristaltic pump capable of pumping 5-10mL/min is acceptable |
| Sharpening stone | VWR | 470150-112 | optional; for dulling needles |
| Sodium bicarbonate, powder, USP | Fisher Scientific | 18-606-333 | |
| Specimen forceps, serrated | VWR | 82027-442 | |
| T-Pins for dissecting | Fisher Scinetific | S99385 | |
| Ultra-fine short insulin syringes, 31 G | VWR | BD328438 | |
| Wire flush cutters, 6-inch ultra sharp & powerful side cutter clippers | amazon.com | B087P191LP |
References
- Saltman, A. J., Barakat, M., Bryant, D. M., Brodovskaya, A., Whited, J. L. DiI perfusion as a method for vascular visualization in Ambystoma mexicanum. Journal of Visualized Experiments. (124), e55740 (2017).
- Lametschwandtner, A., Minnich, B. Microvascular anatomy of the brain of the adult pipid frog, Xenopus laevis (Daudin): A scanning electron microscopic study of vascular corrosion casts. Journal of Morphology. 279 (7), 950-969 (2018).
- Lametschwandtner, A., Minnich, B. Microvascular anatomy of the urinary bladder in the adult African clawed toad, Xenopus laevis: A scanning electron microscope study of vascular casts. Journal of Morphology. 282 (3), 368-377 (2021).
- Lametschwandtner, A., et al. Microvascular anatomy of the gallbladder of the adult South African clawed toad, Xenopus laevis Daudin: A scanning electron microscope study of vascular corrosion casts. Microscopy and Microanalysis. 13, 492-493 (2007).
- Lametschwandtner, A., Spornitz, U., Minnich, B. Microvascular anatomy of the non-lobulated liver of adult Xenopus laevis: A scanning electron microscopic study of vascular casts. Anatomical Record. 305 (2), 243-253 (2022).
- Miodoński, A. J., Bär, T. Arterial supply of the choriocapillaris of anuran amphibians (Rana temporaria, Rana esculenta). Scanning electron-microscopic (SEM) study of microcorrosion casts. Cell and Tissue Research. 249 (1), 101-109 (1987).
- Nenni, M. J., et al. Xenbase: Facilitating the use of Xenopus to model human disease. Frontiers in Physiology. 10, 154 (2019).
- Tandon, P., Conlon, F., Furlow, J. D., Horb, M. E. Expanding the genetic toolkit in Xenopus: Approaches and opportunities for human disease modeling. Developmental Biology. 426 (2), 325-335 (2017).
- Peshkin, L., et al. The protein repertoire in early vertebrate embryogenesis. bioRxiv. , (2019).
- Briggs, J. A., et al. The dynamics of gene expression in vertebrate embryogenesis at single-cell resolution. Science. 360 (6392), (2018).
- Liao, Y., et al. Cell landscape of larval and adult Xenopus laevis at single-cell resolution. Nature Communications. 13 (1), 4306 (2022).
- AVMA (American Veterinary Medical Association). AVMA guidelines for the euthanasia of animals, 2020 edition. AVMA. , Schaumburg, Illinois. 37 (2020).
- Navarro, K., Jampachaisri, K., Chu, D., Pacharinsak, C. Bupivacaine as a euthanasia agent for African Clawed Frogs (Xenopus laevis). PLoS One. 17 (12), e0279331 (2022).
- Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio-Protocol. 11 (5), e3988 (2021).
- Heinz-Taheny, K. M. Cardiovascular physiology and diseases of amphibians. Veterinary clinics of North America. The Veterinary Clinics of North America. Exotic Animal Practice. 12 (1), 39-50 (2009).
- Stephenson, A., Adams, J. W., Vaccarezza, M. The vertebrate heart: an evolutionary perspective. Journal of Anatomy. 231 (6), 787-797 (2017).
- Hoops, D. A perfusion protocol for lizards, including a method for brain removal. MethodsX. 2, 165-173 (2015).
