Summary
여기에 제시된 것은 전사체학 및 단백질체학 연구를 위해 아프리카 발톱 개구리의 조직 샘플을 준비하기 위한 효과적인 신속 혈액 관류 프로토콜입니다.
Abstract
제노푸스는 100년 넘게 척추동물의 발달과 질병을 이해하는 강력한 모델 유기체였습니다. 여기에서는 모든 조직 내에서 일관되고 과감한 혈액 감소를 목표로 하는 Xenopus의 신속한 혈액 관류 프로토콜이 정의됩니다. 관류는 바늘을 심장의 심실에 직접 삽입하고 혈관계를 통해 헤파린 화 인산염 완충 식염수 (PBS)를 펌핑하여 수행됩니다. 절차는 동물 당 약 10 분 안에 완료 할 수 있습니다. 혈액은 몇 가지 매우 풍부한 단백질과 세포 유형에 의해 지배되며, 이러한 단백질이 대부분의 다른 분자와 관심 세포 유형을 가리기 때문에 수많은 문제를 야기합니다. 정량적 단백질체학 및 단일 세포 전사체학을 사용한 성인 Xenopus 조직의 재현 가능한 특성화는 장기 샘플링 전에 이 프로토콜을 적용함으로써 이점을 얻을 수 있습니다. 조직 샘플링을 위한 프로토콜은 동반 논문에 정의되어 있습니다. 이 절차는 성별, 연령 및 건강 상태가 다른 Xenopus, 특히 X. laevis 및 X. tropicalis의 관행을 표준화하는 것을 목표로합니다.
Introduction
양서류의 전신 관류는 보존과 고정을 위해 일상적으로 이루어진다 1,2,3,4,5,6. 그러나 이러한 절차는 동물당 채취할 수 있는 신선한 샘플의 수를 제한하는 속도로 발생합니다. 이 연구의 목표는 Xenopus에서 효과적인 혈액 관류 프로토콜을 개발하여 기술의 속도를 우선시하는 것입니다. 이 프로토콜은 X. tropicalis의 경우 동물당 10분 미만, X. laevis 동물당 15분 미만이 소요됩니다. 두 번째 우선 순위는 복제의 용이성과 쉽게 획득할 수 있는 장비의 사용으로, 고품질 샘플을 Xenopus 실험실 간에 널리 공유할 수 있습니다.
Xenopus 개구리는 종에 걸쳐 보존된 기본적인 생물학적 및 병리학적 과정을 연구하기 위해 생물 의학 연구에서 널리 사용됩니다. 이 네발 동물은 다른 수생 모델보다 포유류와 더 밀접한 진화 관계를 가지고 있으며, 폐, 3 개의 방이있는 심장 및 손가락이있는 팔다리를 가지고 있습니다. 국제 사회는 Xenopus 를 효과적으로 사용하여 심층적인 질병 모델링 및 질병 관련 유전자 기능의 분자 분석을 통해 인간 질병에 대한 더 깊은 이해를 얻습니다. 동물 모델로서 Xenopus 의 수많은 장점은 인간 발달 및 질병의 분자 기초를 연구하는 데 매우 귀중한 도구입니다. 이러한 장점에는 큰 난모세포 및 배아 크기, 높은 생식력, 주거 용이성, 신속한 외부 발달 및 게놈 조작 용이성이 포함됩니다. 제노푸스는 확인된 인간 질병 유전자의 ~80%를 공유하는 것으로 추정된다7.
널리 사용되는 포유류 모델과 비교할 때, Xenopus는 모르폴리노 녹다운이 용이하고 CRISPR8을 사용하여 효율적인 형질전환 및 표적 유전자 돌연변이를 사용할 수 있는 빠르고 비용 효율적인 모델입니다. 정량적 질량분석법과 단일세포 전사체학(single-cell transcriptomics)이 제노푸스 배아(Xenopus embryos)9,10에 성공적으로 적용되었지만, 제노푸스 라에비스(Xenopus laevis)의 최근 세포 지도는 대부분의 조직의 구성이 혈구 유형에 의해 지배된다는 것을 보여준다 11. 빠른 속도로 조직을 피폐화하는 기술을 개발하고 냉각 매체를 사용함으로써 시료의 신선도는 관류에 의해 최소화됩니다. 이는 생리학적으로 교란되지 않은 mRNA 또는 단백질 발현을 프로파일링하는 것이 목표인 응용 분야에서 특히 중요합니다.
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Protocol
모든 실험은 하버드 의과대학 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)(IS 00001365_3)의 규칙 및 규정에 따라 수행하였다.
참고: 미국 수의학 협회(American Veterinary Medical Association)는 안락사의 일차적인 방법이 안락사에 대해 받아들일 수 있는 것으로 간주되지만12, 심장 박동을 멈추게 하는 것으로 밝혀지지는 않았다13. 자주 사용되는 이중 pithing의 2 차 방법조차도 이것을 막지 못하며 동물에게서 심장을 제거하지도 않습니다. 마취된 동물의 방혈은 성공적인 안락사를 위한 인도적이고 효과적인 방법으로 간주된다12. 안락사를 통해 신선한 조직을 유지하는 것이 이 프로토콜의 목표이기 때문에 MS-222를 사용한 1차 안락사를 통해 심장이 계속 뛰는 것이 유익하며, 관류 자체가 방혈을 통한 2차 안락사 방법입니다.
1. 준비
- 연구 기관이 이 프로토콜에 설명된 안락사 및 관류 기술을 승인했는지 확인합니다.
- 5g/L MS-222(트리카인 메탄설포네이트) 및 5g/L 중탄산나트륨 용액을 준비합니다. 부피는 안락사되는 동물을 완전히 덮는 데 필요한 부피보다 커야 합니다. pH가 ≥7인지 확인하십시오.
- X. laevis당 인산염 완충 식염수(PBS)에 180U/mL 헤파린 500μL 또는 X. tropicalis당 200μL를 준비합니다.
- 이 용액에 Xenopus 를 넣어 1차 안락사를 수행합니다(1.2단계부터). 동물은 총 1시간 동안 물에 잠긴 상태를 유지합니다.
- Xenopus가 안락사에 15분 동안 발을 집어 통증 반응을 잃었는지 확인합니다. 동물이 반응하는 경우 이 반응이 사라질 때까지 안락사 용액으로 되돌립니다.
- Xenopus의 무게를 측정하고 샘플링 전에 필요한 추가 측정을 수행합니다.
- 31G 바늘을 사용하여 PBS(1.3단계부터)에 X. laevis 에 250μL, X. tropicalis 에 180U/mL 헤파린 100μL를 각 앞다리의 근육에 주입합니다.
- PBS 관류액에 54U/mL 헤파린의 동물 무게 1mL/g 용액을 준비합니다. 이 프로토콜에 대해 더 많은 경험을 가진 개인은 관류를 완료하는 데 더 적은 매체가 필요하다는 것을 알 수 있습니다.
- X. laevis를 관류하려면 22G 피하 주사 바늘을 사용하고 X. tropicalis에는 25G 피하 주사 바늘을 사용하십시오. 와이어 커터로 팁을 잘라내어 관류 바늘을 무디게 합니다(그림 1)14.
알림: 이렇게 하면 바늘이 이동할 경우 심실을 통해 구멍이 뚫릴 가능성이 줄어듭니다. 무뎌지는 것 외에도 바늘은 날카로운 돌이나 줄로 약간 갈아질 수 있지만 여전히 심실을 뚫을 수 있을 만큼 날카롭습니다. - 손질된 바늘을 부착하고 54U/mL 헤파린화된 PBS 관류액을 순환시켜 펌프를 준비합니다(1.8단계부터). 관류 효율 감소 또는 실패로 이어지는 공기 색전증의 가능성을 제거하기 위해 튜브에서 모든 기포를 제거해야 합니다( 표 1 참조). 시술 기간 동안 관류 매체를 얼음 위에 보관하십시오.
- 펌프를 프로그래밍할 수 없는 경우 바늘을 제자리에 놓고 다른 설정에서 펌핑된 배지 부피를 측정하여 5mL/분 및 10mL/분에 가장 가까운 설정을 결정합니다. 이러한 유속은 종에 관계없이 사용됩니다. 관류 펌프를 프로그래밍할 수 있는 경우 제조업체의 지침에 따라 바늘을 제자리에 놓고 보정하십시오.
- 해부면(트레이 또는 폼 시트)을 2차 용기 내의 경사면에 놓거나 혈액 배출을 용이하게 하도록 배열합니다.
- 개구리가 1시간 동안 용액에 들어가면 1차 안락사가 완료됩니다. 개구리를 제거하고 발을 꼬집어 통증 반응의 상실을 다시 확인하십시오.
- 개구리를 등에 대고 각 팔다리를 고정합니다(그림 2). 팔다리의 조직을 보존해야 하는 경우 팔다리 주위의 숫자 또는 U자형 스테이플을 통해 가는 핀을 배치할 수 있습니다.
- 해부 가위를 사용하여 피부를 자르고 정중선을 위로 올린 다음 옆으로 두 개의 플랩을 만듭니다. (그림 2)
- 집게를 사용하여 linea alba를 잡고 체강에서 당겨 빼냅니다(그림 3). 조심스럽게 가위를 사용하여 근육 조직을 자릅니다. 캐비티 벽에서 두 개의 플랩을 만들고 모든 플랩을 자르거나 고정합니다.
- 해부 가위를 사용하여 코라코이드 뼈를 절단하고 과도한 조직을 잘라내어 심장에 더 잘 접근할 수 있도록 합니다(그림 3).
- 심장은 여전히 뛰고 있어야합니다. 관류 전에 심장 박동이 멈춘 경우 샘플의 신선도가 손상되었음을 확인하십시오.
2. 관류
- 위를 확인하고 간장의 왼쪽 엽 (시청자의 오른쪽) 위에 오도록 부드럽게 이동시켜 수술 기간 동안 혈관 구조를 볼 수 있도록합니다. 폐를 식별하고 조직 집게를 사용하여 끝으로 잡습니다. 폐를 체강 밖으로 당기고 팁을 통해 고정합니다(그림 4). 부러진 혈관이 잘 관류되지 않으므로 부드럽게하십시오. 엽 내에서 혈액이 보이면 절차 완료를 결정하는 능력에 영향을 미칩니다.
- 체강 공동의 이미지를 촬영하여 관류 효율을 더 잘 평가하고 나중에 비정상 조직을 식별할 수 있습니다.
- 얇은 심낭을 확인하고 조직 집게로 당깁니다 (그림 5). 홍채 절제술 가위의 끝을 사용하여 심낭을 부드럽게 천공하고 밑에있는 조직을 자르지 않도록주의하십시오. 심장의 세 방에서 심낭을 떼어냅니다.
- 집게를 사용하여 심실의 정점을 부드럽게 잡습니다. 관류 바늘이 통과할 수 있도록 집게의 견인면 사이에 충분한 공간이 있도록 제한된 압력을 가합니다(그림 6).
- 집게의 폐쇄를 통해 바늘을 심실의 챔버에 삽입하고 심실을 통해 천공되지 않도록주의하십시오 (그림 7). 지혈제를 사용하여 바늘 홀더를 사용하여 조직 집게를 제자리에 고정합니다.
알림: 이 기술은 여전히 날카로운 바늘의 위치를 안정화합니다. 바늘을 심실에 직접 클램핑하면 불필요한 손상이 발생하여 필요한 경우 재클램핑이 더 어려워집니다( 표 1 참조). - 약 5mL/min의 속도로 펌프의 흐름을 시작합니다. 심장과 동맥 줄기의 세 방이 충혈됩니다(그림 8, 표 1 참조).
- 가위로 오른쪽 귓바퀴 (시청자의 왼쪽)를 조심스럽게 랜스합니다. 피가 쏟아질 것입니다. 유속을 5mL/분으로 설정하거나 10mL/분으로 늘립니다.
- 위의 혈관 구조가 희미 해질 때까지 계속 ( 표 1 참조) 심장의 왼쪽 귓바퀴 (시청자의 오른쪽)를 랜스합니다. 유속이 여전히 5mL/분이면 약 10mL/분으로 늘립니다.
- 이송 피펫을 사용하여 관류 매체에서 체강 공동을 헹구면 가시성을 유지하고 귀에서 흐르는 관류액의 색상을 더 잘 평가할 수 있습니다.
- 귓바퀴에서 흐르는 관류액이 깨끗해지고(표 1 참조) 폐가 붉은 색조를 잃을 때까지 바늘을 제자리에 두십시오(표 1 참조; 그림 9).
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Representative Results
성공적인 관류 후, 모든 조직 (색소 Xenopus의 간 제외)은 뚜렷하게 가볍고 혈액으로 덜 포화 될 것입니다. 주요 혈관은 눈에 띄지 않게 되고(그림 10), 조직(간 제외)은 샘플링 후 완충액에서 깨끗하게 헹구어집니다. 프로토콜의 성공적인 실행은 궁극적으로 피혈된 조직 샘플의 데이터 품질에 의해서만 확인될 수 있지만 몇 가지 일반적인 문제, 가능한 원인 및 제안된 개선 조치가 문제 해결 표에 나와 있습니다(표 1 및 그림 11).
그림 1: 손질되지 않은 바늘과 손질된 바늘14. 와이어 클리퍼를 사용하여 바늘 끝을 잘라내어 바늘을 무디게 합니다. 심장을 뚫을 수 있을 만큼 날카롭지만 인적 오류가 발생할 경우 심실에 천공할 가능성이 적습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 성숙한 암컷 X. tropicalis는 각 팔다리를 통해 고정되어 있습니다. 톱니 해부 집게를 사용하여 해부 가위로 구멍을 뚫고 두 개의 플랩을 만들도록 배운 배설물 근처의 피부를 당깁니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 근육질의 벽. 복부 피부는 열려 있지만 근육벽은 손상되지 않은 상태에서 linea alba가 보입니다. 밑에있는 조직이 손상 될 가능성을 줄이려면 linea alba를 잡고 자르기 전에 가르칩니다. 코라코이드 뼈는 복막을 통해 볼 수 있습니다. 체강이 열리면 심장에 더 잘 접근할 수 있도록 이 뼈를 줄여야 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 성숙한 X. tropicalis 수컷의 체강 공동. 코라코이드 뼈가 줄어들어 심낭으로 둘러싸인 심장에 접근할 수 있습니다. 위는 간 좌엽 앞으로 이동했으며 혈관 구조가 명확하게 보입니다. 왼쪽 폐는 팁에 의해 체강 밖으로 당겨지고 헹굼 과정에서 수축되지 않도록 고정되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : 심낭. 심낭은 심장을 둘러싸고 있는 얇고 단단한 막입니다. 조직 집게를 사용하여 심낭을 부드럽게 잡은 다음 홍채 절제술 가위 끝을 사용하여 천공합니다. 구멍이 뚫리면 심장에서 떼어냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 심장 해부학 바늘 배치 다이어그램. (A) X. laevis 심장의 복부 다이어그램. (B) 심낭이 제거된 심장 다이어그램으로 올바른 바늘과 클램프 배치를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 심장 해부학 및 바늘 배치 사진. 심낭을 제거하면 심장과 동맥 줄기의 세 개의 방이 쉽게 보입니다. 집게를 사용하여 심실의 정점을 부드럽게 잡은 다음 집게를 통해 바늘을 삽입합니다. 관류 효율을 손상시킬 수 있으므로 심실이나 다른 챔버에 불필요한 손상을 일으키지 않도록 주의하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: 관류가 진행 중입니다. 오른쪽 귓바퀴가 절뚝 박혔고 심실, 동맥 줄기 및 왼쪽 귓바퀴가 눈에 띄게 충혈되었습니다. 위가 희미 해지고 동물과 폐 조직에서 나오는 매체는 혈액으로 심하게 포화되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 9: 성공적인 급속 관류 및 헹굼 후의 체강 공동. 위와 다른 기관의 혈관 구조는 더 이상 쉽게 볼 수 없습니다. Xenopus 가 알비노가 아닌 한, 간은 심하게 착색 된 채로 남아있을 것입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 10: 관류되지 않고 관류된 알비노 수컷 X. laevis의 조직 샘플. 혈관 구조의 색소 침착과 가시성의 차이가 뚜렷합니다. 모든 샘플은 직경 3.5cm의 웰 내에 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 11: Xenopus 심장의 문제 해결 다이어그램. (A) 심실에 천공이 있습니다(빨간색). 이 천공은 겸자에 의해 격리되며 관류 효율에 영향을 미치지 않습니다. (B) 심실이 심하게 손상된 심장. 바늘은 동맥 트렁크로 안내되어 제자리에 고정될 수 있습니다. 이 기술을 사용할 때 바늘이 잘 무뎌지도록 하는 것이 특히 중요하다14. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 12: 알비노의 관류 효율 평가. 알비노 X. laevis는 (A) 전과 후(B) 모두 급속 관류. 백색증은 색소가 있는 동물보다 관류의 숙련도를 더 쉽게 결정할 수 있도록 합니다. 이것은 특히 폐와 간 조직에서 분명합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: 문제 해결 표 몇 가지 일반적인 문제, 가능한 원인 및 제안된 수정 조치가 제공됩니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜은 체강에 접근하기 위한 전통적인 해부 기술을 설명합니다. 조직에 최소한의 손상을 입히고 심장에 접근 할 수 있으며 폐와 위가 보이는 경우 다른 기술도 허용됩니다. 마찬가지로, 나열된 대부분의 해부 도구는 유사한 항목으로 쉽게 대체할 수 있습니다.
이 절차의 효능을 최적화하기 위한 시도가 있었지만 결과는 개인의 경험과 개별 개구리 간의 가변성에 따라 다를 수 있습니다. 이 논문의 범위를 벗어난 혈액 관류의 한 가지 흥미로운 측면은 이 절차가 수술을 받는 동물에 대한 대체 관류 방법과 어떻게 비교되는지입니다. 또 다른 미개척 변수는 아주 어린 동물이나 혈관 구조가 지나치게 취약할 수 있는 고령 동물에서 혈액 관류가 어떻게 작용하는지입니다. 이 프로토콜의 적용을 용이하게 하기 위해 추가 설명이 제공됩니다. 몇 가지 일반적인 문제, 가능한 원인 및 제안된 개선 조치가 표 1에 나와 있습니다.
이 절차의 한계는 관류 효율이 속도에 의해 부정적인 영향을 받을 수 있다는 것입니다. 관류 효율이 급속 관류보다 우선하는 경우 axolotl 기술을 적용하는 것이 좋습니다1 (Saltman et al.은 동맥 줄기를 지칭하기 위해 대동맥이라는 용어를 사용합니다).
절차의 지속 시간과 사용되는 매체의 양은 여러 변수에 따라 달라집니다. 일반적으로 X. tropicalis 수컷은 15-25mL의 배지로 성공적으로 관류하는 데 2-3분이 소요되는 반면, X. tropicalis 암컷은 25-40mL의 배지로 3-4분이 걸립니다 . X. laevis를 관류할 때 훨씬 더 많은 동물 간 변이가 발견되었습니다. 유속이 높을수록 더 큰 동물을 관류하는 데 필요한 시간이 줄어들지만 라인 압력이 증가하면 튜브 피팅이 쉽게 빠지고 펌프가 고장날 수 있습니다.
당연히 알비노 동물의 관류 효율을 평가하는 것이 훨씬 쉽습니다. 그 차이는 특히 폐와 간 조직에서 두드러집니다(그림 12). 따라서 알비노를 사용하는 것이 좋으며, 특히 처음 관류를 시도하거나 훈련을받을 때 권장됩니다.
유속과 바늘 크기를 조정함으로써 프로토콜은 모든 종의 Xenopus에 적용할 수 있습니다. 크세노푸 스와 대부분의 다른 양서류(15), 그리고 악어가 아닌 파충류(non-crocodilian reptiles) 사이의 심장 해부학적 구조와 혈액순환의 상동성으로 인해, 이 기술은 3개의 방이 있는 심장(16)을 가진 다른 모델의 전신 신속 관류를 위해 수정될 수 있다. 악어가 아닌 파충류 모델을 사용하는 경우 대동맥궁 중 하나의 관류만 필요한 경우 다른 프로토콜이 권장됩니다17.
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Disclosures
저자는 경쟁 이익을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작업은 NIH의 OD R24 보조금 OD031956 및 NICHD R01 보조금 HD073104의 지원을 받았습니다. 이 프로토콜에 대한 유용한 토론과 초기 의견을 주신 Darcy Kelly에게 감사드립니다. 또한 도움과 지원을 해주신 Samantha Jalbert, Jill Ralston, Wil Ratzan과 피드백을 주신 익명의 피어 리뷰어 3명에게도 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5x Magnifying glass with LED light and stand | amazon.com | B08QJ6J8P1 | light must not produce heat |
| Disposable transfer pipets | VWR | 414004-036 | |
| Dissecting fine-pointed forceps | Fisher Scinetific | 08-875 | |
| Dissecting scissors sharp piont, straight 6.5" | VWR | 76457-374 | |
| Dissection tray | Fisher Scinetific | 14-370-284 | styrofoam sheets are an acceptable alternative |
| Euthanasia container | US Plastic | Item 2860 | alternative opaque containers acceptable |
| Euthanasia container lid | US Plastic | Item 3047 | |
| Fine dissection pins | Living Systems Instrumentation | PIN-#3 | |
| General use hypodermic needles, 22 G | Fisher Scientific | 14-826-5A | for X. laevis |
| General use hypodermic needles, 25 G | Fisher Scientific | 14-826AA | for X. tropicalis |
| Heparin, porcine intestinal mucosa | MilliporeSigma | 37-505-410MG | |
| Iridectomy scissors 6" | vwr | 470018-938 | iris scissors are an acceptable alternative |
| Luer-to-barb adapter male Luer with lock ring | amazon.com | B09PTX6M2Z | size will be dependant on the hosing of the pump used |
| Mayo-Hegar needle holder | Fisher Scinetific | 08-966 | mosquito forceps are an acceptable alternative |
| MS-222: Syncaine (formerly tricaine) | Pentair AES | TRS1 | |
| PBS 1x | Corning | 21-040-CV | |
| Peristaltic liquid pump dosing pump 5–100 mL/min | amazon.com | B07PWY4SM6 | any peristaltic pump capable of pumping 5-10mL/min is acceptable |
| Sharpening stone | VWR | 470150-112 | optional; for dulling needles |
| Sodium bicarbonate, powder, USP | Fisher Scientific | 18-606-333 | |
| Specimen forceps, serrated | VWR | 82027-442 | |
| T-Pins for dissecting | Fisher Scinetific | S99385 | |
| Ultra-fine short insulin syringes, 31 G | VWR | BD328438 | |
| Wire flush cutters, 6-inch ultra sharp & powerful side cutter clippers | amazon.com | B087P191LP |
References
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