Summary
Aquí se presenta un protocolo efectivo de perfusión sanguínea rápida para preparar muestras de tejido de ranas con garras africanas para estudios de transcriptómica y proteómica.
Abstract
Xenopus ha sido poderosos organismos modelo para comprender el desarrollo y la enfermedad de los vertebrados durante más de 100 años. Aquí, se define un protocolo de perfusión sanguínea rápida en Xenopus, dirigido a una reducción consistente y drástica de la sangre dentro de todos los tejidos. La perfusión se lleva a cabo insertando una aguja directamente en el ventrículo del corazón y bombeando solución salina tamponada con fosfato heparinizado (PBS) a través del sistema vascular. El procedimiento se puede completar en aproximadamente 10 minutos por animal. La sangre está dominada por unas pocas proteínas y tipos de células muy abundantes, creando numerosos problemas ya que estas proteínas enmascaran la mayoría de las otras moléculas y tipos de células de interés. La caracterización reproducible de tejidos adultos de Xenopus con proteómica cuantitativa y transcriptómica unicelular se beneficiará de la aplicación de este protocolo antes del muestreo de órganos. Los protocolos para el muestreo de tejidos se definen en documentos complementarios. Estos procedimientos están dirigidos a la estandarización de prácticas en Xenopus de diferente sexo, edad y estado de salud, específicamente X. laevis y X. tropicalis.
Introduction
La perfusión de todo el cuerpo de los anfibios se completa rutinariamente con fines de preservación y fijación 1,2,3,4,5,6. Sin embargo, estos procedimientos ocurren a una velocidad que limita el número de muestras frescas que se pueden tomar por animal. El objetivo de este trabajo es desarrollar un protocolo efectivo de perfusión sanguínea en Xenopus, priorizando la velocidad de la técnica. El protocolo toma menos de 10 min por animal para X. tropicalis y menos de 15 min por X. laevis animal. Las prioridades secundarias son la facilidad de replicación y el uso de equipos fáciles de adquirir para que las muestras de alta calidad puedan compartirse ampliamente entre los laboratorios Xenopus.
Las ranas Xenopus se utilizan ampliamente en la investigación biomédica para estudiar procesos biológicos y patológicos fundamentales conservados en todas las especies. Este tetrápodo tiene una relación evolutiva más cercana con los mamíferos que otros modelos acuáticos, con pulmones, un corazón de tres cámaras y extremidades con dedos. La comunidad internacional utiliza eficazmente Xenopus para obtener una comprensión más profunda de las enfermedades humanas a través de modelos de enfermedades en profundidad y análisis moleculares de la función génica relacionada con la enfermedad. Las numerosas ventajas de Xenopus como modelo animal los convierten en herramientas invaluables para estudiar las bases moleculares del desarrollo humano y la enfermedad; Estas ventajas incluyen: gran tamaño de ovocitos y embriones, alta fecundidad, facilidad de alojamiento, rápido desarrollo externo y facilidad de manipulación genómica. Se ha estimado que Xenopus comparte ~ 80% de los genes identificados de enfermedades humanas7.
En comparación con los modelos populares de mamíferos, Xenopus es un modelo rápido y rentable, con la facilidad de eliminación de morfolinos y la disponibilidad de transgénicos eficientes y mutaciones genéticas dirigidas utilizando CRISPR8. La espectrometría cuantitativa de masas y la transcriptómica unicelular se han aplicado con éxito a embriones de Xenopus9,10, pero un atlas celular reciente de Xenopus laevis muestra que la composición de la mayoría de los tejidos está dominada por los tipos de células sanguíneas 11. Al desarrollar una técnica que exangüe el tejido a un ritmo rápido y utilizando medios refrigerados, la frescura de la muestra se ve mínimamente afectada por la perfusión. Esto es particularmente importante para aplicaciones donde el objetivo es perfilar la expresión de ARNm o proteína fisiológicamente imperturbable.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las reglas y regulaciones de la Escuela de Medicina de Harvard IACUC (Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales) (IS 00001365_3).
NOTA: Aunque el método primario de eutanasia descrito es considerado una técnica aceptable para la eutanasia por la Asociación Americana de Medicina Veterinaria12, no se ha encontrado que conduzca al cese de un latido cardíaco13. Incluso el método secundario de doble picadura utilizado con frecuencia no evita esto, ni tampoco la eliminación del corazón del animal. La exanguinación de animales anestesiados se considera un método humano y eficaz para el éxito de la eutanasia12. Como mantener tejidos frescos a través de la eutanasia es el objetivo de este protocolo, es beneficioso que el corazón continúe latiendo a través de la eutanasia primaria con MS-222, y que la perfusión sea en sí misma un método de eutanasia secundaria a través de la exanguinación.
1. Preparación
- Asegúrese de que la institución de investigación ha aprobado la técnica de eutanasia y perfusión descrita en este protocolo.
- Preparar una solución de 5 g/L MS-222 (metanosulfonato de tricaína) y 5 g/L de bicarbonato de sodio. El volumen debe ser mayor que el volumen requerido para cubrir completamente a los animales sacrificados. Compruebe el pH para asegurarse de que es ≥7.
- Preparar 500 μL de 180 U/ml de heparina en solución salina tamponada con fosfato (PBS) por X. laevis, o 200 μL por X. tropicalis.
- Realizar la eutanasia primaria colocando el Xenopus en esta solución (a partir del paso 1.2); El animal permanecerá sumergido durante un total de 1 h.
- Confirme que el Xenopus ha perdido su respuesta al dolor pellizcando el pie 15 minutos en la eutanasia. Si el animal es reactivo, devuélvalo a la solución de eutanasia hasta que se pierda esta respuesta.
- Pesar el Xenopus y tomar las medidas adicionales necesarias antes del muestreo.
- Con una aguja de 31 G, inyecte X. laevis con 250 μL y X. tropicalis con 100 μL de heparina de 180 U/ml en PBS (desde el paso 1.3) en la musculatura de cada extremidad anterior.
- Preparar una solución de 1 mL/g del peso animal de 54 U/mL de heparina en perfusión PBS. Las personas con más experiencia con este protocolo pueden encontrar que se requieren menos medios para completar la perfusión.
- Use una aguja hipodérmica de 22 G para perfundir X. laevis y una aguja hipodérmica de 25 G para X. tropicali. Embelle la aguja de perfusión recortando la punta con cortadores de alambre (Figura 1)14.
NOTA: Esto reduce la probabilidad de que la aguja perfore a través del ventrículo si se desplaza. Además de embotarse, la aguja puede ser molida ligeramente hacia abajo con una piedra de afilar o lima, pero aún así permanece lo suficientemente afilada como para perforar el ventrículo. - Prepare la bomba colocando la aguja recortada y haciendo circular 54 U/ml de perfusión heparinizada de PBS (a partir del paso 1.8). Asegúrese de purgar todas las burbujas de aire del tubo para eliminar la posibilidad de embolia de aire, lo que conduce a una disminución de la eficiencia o falla de la perfusión (ver Tabla 1). Mantenga los medios de perfusión en hielo durante la duración del procedimiento.
- Si la bomba no es programable, con la aguja en su lugar, mida el volumen bombeado de medios bajo los diferentes ajustes para determinar qué ajustes son los más cercanos a 5 mL/min y 10 mL/min. Estos caudales se utilizarán independientemente de la especie. Si la bomba de perfusión es programable, calibre con la aguja en su lugar, siguiendo las instrucciones del fabricante.
- Coloque la superficie de disección (bandeja o lámina de espuma) en una inclinación dentro de un recipiente secundario, o colóquela para facilitar el drenaje de la sangre.
- Una vez que la rana ha estado en la solución durante 1 h, se ha completado la eutanasia primaria. Retire la rana y vuelva a verificar la pérdida de respuesta al dolor realizando un pellizco en el pie.
- Coloque la rana sobre su espalda y fije cada extremidad (Figura 2). Si se requiere preservar el tejido de las extremidades, se pueden colocar alfileres delgados a través de los dedos o grapas en forma de U alrededor de las extremidades.
- Usando tijeras de disección, corte a través de la piel, hasta la línea media, y luego lateralmente, haciendo dos colgajos. (Figura 2)
- Use fórceps para agarrar la línea alba y alejarla de la cavidad celómica (Figura 3). Use cuidadosamente tijeras para cortar a través de la musculatura. Haga dos solapas fuera de la pared de la cavidad y corte o fije todas las solapas fuera del camino.
- Use tijeras de disección para cortar a través de los huesos coracoides y cortar el exceso de tejido para obtener un mejor acceso al corazón (Figura 3).
- El corazón todavía debería estar latiendo. Si el corazón ha dejado de latir antes de la perfusión, tenga en cuenta que la frescura de la muestra se ha visto comprometida.
2. Perfusión
- Identifique el estómago y desplácelo suavemente para que esté en la parte superior del lóbulo izquierdo del hígado (a la derecha del espectador), con su vasculatura visible durante la duración del procedimiento. Identifique un pulmón y agárrelo por su punta con pinzas de tejido. Tire del pulmón fuera de la cavidad celómica y fíjelo a través de la punta (Figura 4). Haga esto suavemente, ya que los vasos sanguíneos rotos no se perfunden bien. Tenga en cuenta si la sangre es visible dentro del lóbulo, ya que esto afectará la capacidad de determinar la finalización del procedimiento.
- Tome una imagen de la cavidad celómica para evaluar mejor la eficiencia de la perfusión y potencialmente identificar tejidos anormales en una fecha posterior.
- Identifique el pericardio delgado y tire de él enseñado con pinzas de tejido (Figura 5). Perforar suavemente el pericardio con la punta de las tijeras de iridectomía, teniendo cuidado de no cortar los tejidos subyacentes. Despegue el pericardio lejos de las tres cámaras del corazón.
- Use fórceps para agarrar suavemente el ventrículo por su ápice. Aplique una presión limitada para que haya suficiente espacio entre las superficies de tracción de las pinzas para que pase la aguja de perfusión (Figura 6).
- Inserte la aguja a través del cierre de los fórceps en la cámara del ventrículo, teniendo cuidado de no perforar a través del ventrículo (Figura 7). Sujete las pinzas de tejido en su lugar con un soporte de aguja usando un hemostático.
NOTA: Esta técnica estabiliza la posición de la aguja, que todavía está afilada. Sujetar la aguja directamente al ventrículo también causará daños innecesarios, lo que dificultará la recuperación en caso de que sea necesario (ver Tabla 1). - Arranque el flujo de la bomba a aproximadamente 5 mL/min. Las tres cámaras del corazón y el tronco arterial se hincharán (Figura 8; ver Tabla 1).
- Con tijeras, lance con cuidado la aurícula derecha (a la izquierda del espectador); La sangre se derramará. Ajuste el caudal a 5 mL/min o auméntelo a 10 mL/min.
- Continúe hasta que la vasculatura del estómago se blanquee (ver Tabla 1), luego lance la aurícula izquierda del corazón (a la derecha del espectador). Si el caudal sigue siendo de 5 ml/min, auméntelo a aproximadamente 10 ml/min.
- Use una pipeta de transferencia para enjuagar la cavidad celómica en medios de perfusión, para ayudar a mantener la visibilidad y evaluar mejor el color del perfusión que fluye de las aurículas.
- Mantenga la aguja en su lugar hasta que el perfusión que fluye de las aurículas esté claro (ver Tabla 1) y el pulmón haya perdido su tono rojo (ver Tabla 1; Figura 9).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Después de una perfusión exitosa, todos los tejidos (excluyendo el hígado en Xenopus pigmentado) serán claramente más ligeros y menos saturados de sangre. Los vasos sanguíneos principales se volverán menos notables (Figura 10), y los tejidos (excluyendo el hígado) se enjuagarán limpiamente en el tampón después de ser muestreados. Si bien la ejecución exitosa del protocolo solo puede confirmarse en última instancia por la calidad de los datos de muestras de tejido exsanguinadas, en la tabla de solución de problemas se proporcionan varios problemas típicos, sus posibles causas y las acciones correctivas sugeridas (Tabla 1 y Figura 11).
Figura 1: Agujas sin recortar y recortadas14. Usando cortaalambres, embote la aguja cortando su punta. Será lo suficientemente agudo como para perforar el corazón, pero perforar el ventrículo será menos probable en caso de error humano. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Hembra madura X. tropicalis clavada a través de cada extremidad. Use pinzas de disección dentadas para tirar de la piel cerca de la cloaca enseñada a perforarla con tijeras de disección y crear dos colgajos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Pared muscular. Con la piel ventral abierta pero la pared muscular intacta, la línea alba es visible. Para reducir la probabilidad de dañar los tejidos subyacentes, agarre la línea alba y tire de ella antes de cortar. Los huesos coracoides son visibles a través del peritoneo. Una vez que se ha abierto la cavidad celómica, estos huesos deben reducirse para dar un mejor acceso al corazón. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: La cavidad celómica de un macho maduro de X. tropicalis. Los huesos coracoides se han reducido, proporcionando acceso al corazón cerrado en el pericardio. El estómago se ha desplazado delante del lóbulo izquierdo del hígado, y su vasculatura es claramente visible. El pulmón izquierdo ha sido sacado de la cavidad celómica por su punta y fijado para asegurar que no se retraiga durante el proceso de enjuague. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Pericardio. El pericardio es una membrana delgada y resistente que encierra el corazón. Usando pinzas de tejido, agarre suavemente el pericardio y luego use la punta de las tijeras de iridectomía para perforarlo. Una vez perforado, pélalo, lejos del corazón. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Diagramas de colocación de agujas de anatomía cardíaca . (A) Diagrama ventral de un corazón de X. laevis. (B) Diagrama del corazón, con el pericardio extraído, que muestra la colocación correcta de la aguja y la abrazadera. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Anatomía del corazón y fotografía de colocación de la aguja. Con la extirpación del pericardio, las tres cámaras del corazón y el tronco arterial son fácilmente visibles. Use fórceps para agarrar suavemente el ventrículo por su ápice y luego inserte la aguja a través de los fórceps. Tenga cuidado de no causar daños innecesarios al ventrículo u otras cámaras, ya que esto comprometerá la eficiencia de perfusión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: La perfusión está en marcha. La aurícula derecha ha sido punzada, y el ventrículo, el tronco arterial y la aurícula izquierda están visiblemente hinchados. El estómago está blanqueando y tanto los medios que salen del animal como el tejido pulmonar están muy saturados de sangre. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 9: La cavidad celómica después de una rápida perfusión y enjuague exitosos. La vasculatura del estómago y otros órganos ya no es fácilmente visible. A menos que el Xenopus sea albino, el hígado permanecerá muy pigmentado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 10: Muestras de tejidos de un macho albino no perfundido y perfundido X. laevis. Las diferencias en pigmentación y visibilidad de la vasculatura son pronunciadas. Todas las muestras están dentro de pozos de 3,5 cm de diámetro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 11: Diagramas de solución de problemas de un corazón Xenopus . (A) El ventrículo tiene perforación (en rojo); Esta perforación está aislada por las pinzas y no afectará la eficiencia de perfusión. (B) Un corazón con un ventrículo gravemente dañado. La aguja puede ser guiada hacia el tronco arterial y sujetada en su lugar. Es especialmente importante asegurarse de que la aguja esté bien embotada cuando se utiliza esta técnica14. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 12: Evaluación de la eficiencia de perfusión en albinos. Un albino X. laevis tanto antes (A) como después de (B) perfusión rápida. El albinismo hace que sea más fácil determinar la competencia de la perfusión de lo que sería en un animal pigmentado. Esto es especialmente evidente en los tejidos pulmonares y hepáticos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: Tabla de solución de problemas. Se proporcionan varios problemas típicos, sus posibles causas y las medidas correctivas sugeridas. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Este protocolo describe las técnicas tradicionales de disección para acceder a la cavidad celómica. Otras técnicas también son aceptables, siempre que causen un daño mínimo a los tejidos, el corazón sea accesible y el pulmón y el estómago sean visibles. Del mismo modo, la mayoría de las herramientas de disección enumeradas se pueden sustituir fácilmente con elementos comparables.
Si bien se han hecho intentos para optimizar la eficacia de este procedimiento, los resultados pueden variar dependiendo de la experiencia y la variabilidad entre las ranas individuales. Un aspecto interesante de la perfusión sanguínea que permaneció fuera del alcance de este documento es cómo este procedimiento se compara con formas alternativas de perfusión para animales que se someten a cirugía. Otra variable inexplorada es cómo funcionaría la perfusión sanguínea en animales muy jóvenes o animales de edad avanzada donde la vasculatura podría ser excesivamente frágil. Se formulan observaciones adicionales para facilitar la aplicación del presente protocolo. En la Tabla 1 se proporcionan varios problemas típicos, sus posibles causas y las medidas correctivas sugeridas.
Una limitación de este procedimiento es que la eficiencia de perfusión puede verse afectada negativamente por su velocidad. Si la eficiencia de la perfusión tiene prioridad sobre la perfusión rápida, se recomienda adaptar una técnica de axolotl1 (Saltman et al. usan el término aorta para referirse al tronco arterial).
La duración del procedimiento y el volumen de los medios utilizados dependen de una serie de variables. Generalmente, los machos de X. tropicalis tardan entre 2-3 min en perfundir con éxito con 15-25 mL de medios, mientras que las hembras de X. tropicalis toman entre 3-4 min con 25-40 mL de medios. Se encontró una variación significativamente mayor de animal a animal al perfundir X. laevis. Aunque un caudal más alto reduciría el tiempo requerido para perfundir animales más grandes, el aumento de la presión de la línea puede provocar fácilmente que los accesorios del tubo se desprendan y fallen la bomba.
Naturalmente, es mucho más fácil evaluar la eficiencia de perfusión en animales albinos. La diferencia es especialmente evidente en los tejidos pulmonares y hepáticos (Figura 12). Por lo tanto, se recomienda el uso de albinos, especialmente cuando se intenta la perfusión por primera vez o se está entrenando.
Al ajustar el caudal y el tamaño de la aguja, el protocolo es adaptable para todas las especies de Xenopus. Debido a la homología en la anatomía del corazón y la circulación sanguínea entre Xenopus y la mayoría de los otros anfibios15, así como reptiles no cocodrilos, esta técnica puede ser modificada para la perfusión rápida de cuerpo completo de otros modelos con corazones de tres cámaras16. Si se utiliza un modelo de reptil no cocodrilo que requiere exclusivamente la perfusión de uno de los arcos aórticos, se recomiendan otros protocolos17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores declaran que no hay intereses contrapuestos.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la subvención OD R24 de los NIH OD031956 y la subvención R01 del NICHD HD073104. Agradecemos a Darcy Kelly por las útiles discusiones y los aportes iniciales sobre este protocolo. También nos gustaría agradecer a Samantha Jalbert, Jill Ralston y Wil Ratzan por su asistencia y apoyo, así como a nuestros tres revisores anónimos por sus comentarios.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5x Magnifying glass with LED light and stand | amazon.com | B08QJ6J8P1 | light must not produce heat |
| Disposable transfer pipets | VWR | 414004-036 | |
| Dissecting fine-pointed forceps | Fisher Scinetific | 08-875 | |
| Dissecting scissors sharp piont, straight 6.5" | VWR | 76457-374 | |
| Dissection tray | Fisher Scinetific | 14-370-284 | styrofoam sheets are an acceptable alternative |
| Euthanasia container | US Plastic | Item 2860 | alternative opaque containers acceptable |
| Euthanasia container lid | US Plastic | Item 3047 | |
| Fine dissection pins | Living Systems Instrumentation | PIN-#3 | |
| General use hypodermic needles, 22 G | Fisher Scientific | 14-826-5A | for X. laevis |
| General use hypodermic needles, 25 G | Fisher Scientific | 14-826AA | for X. tropicalis |
| Heparin, porcine intestinal mucosa | MilliporeSigma | 37-505-410MG | |
| Iridectomy scissors 6" | vwr | 470018-938 | iris scissors are an acceptable alternative |
| Luer-to-barb adapter male Luer with lock ring | amazon.com | B09PTX6M2Z | size will be dependant on the hosing of the pump used |
| Mayo-Hegar needle holder | Fisher Scinetific | 08-966 | mosquito forceps are an acceptable alternative |
| MS-222: Syncaine (formerly tricaine) | Pentair AES | TRS1 | |
| PBS 1x | Corning | 21-040-CV | |
| Peristaltic liquid pump dosing pump 5–100 mL/min | amazon.com | B07PWY4SM6 | any peristaltic pump capable of pumping 5-10mL/min is acceptable |
| Sharpening stone | VWR | 470150-112 | optional; for dulling needles |
| Sodium bicarbonate, powder, USP | Fisher Scientific | 18-606-333 | |
| Specimen forceps, serrated | VWR | 82027-442 | |
| T-Pins for dissecting | Fisher Scinetific | S99385 | |
| Ultra-fine short insulin syringes, 31 G | VWR | BD328438 | |
| Wire flush cutters, 6-inch ultra sharp & powerful side cutter clippers | amazon.com | B087P191LP |
References
- Saltman, A. J., Barakat, M., Bryant, D. M., Brodovskaya, A., Whited, J. L. DiI perfusion as a method for vascular visualization in Ambystoma mexicanum. Journal of Visualized Experiments. (124), e55740 (2017).
- Lametschwandtner, A., Minnich, B. Microvascular anatomy of the brain of the adult pipid frog, Xenopus laevis (Daudin): A scanning electron microscopic study of vascular corrosion casts. Journal of Morphology. 279 (7), 950-969 (2018).
- Lametschwandtner, A., Minnich, B. Microvascular anatomy of the urinary bladder in the adult African clawed toad, Xenopus laevis: A scanning electron microscope study of vascular casts. Journal of Morphology. 282 (3), 368-377 (2021).
- Lametschwandtner, A., et al. Microvascular anatomy of the gallbladder of the adult South African clawed toad, Xenopus laevis Daudin: A scanning electron microscope study of vascular corrosion casts. Microscopy and Microanalysis. 13, 492-493 (2007).
- Lametschwandtner, A., Spornitz, U., Minnich, B. Microvascular anatomy of the non-lobulated liver of adult Xenopus laevis: A scanning electron microscopic study of vascular casts. Anatomical Record. 305 (2), 243-253 (2022).
- Miodoński, A. J., Bär, T. Arterial supply of the choriocapillaris of anuran amphibians (Rana temporaria, Rana esculenta). Scanning electron-microscopic (SEM) study of microcorrosion casts. Cell and Tissue Research. 249 (1), 101-109 (1987).
- Nenni, M. J., et al. Xenbase: Facilitating the use of Xenopus to model human disease. Frontiers in Physiology. 10, 154 (2019).
- Tandon, P., Conlon, F., Furlow, J. D., Horb, M. E. Expanding the genetic toolkit in Xenopus: Approaches and opportunities for human disease modeling. Developmental Biology. 426 (2), 325-335 (2017).
- Peshkin, L., et al. The protein repertoire in early vertebrate embryogenesis. bioRxiv. , (2019).
- Briggs, J. A., et al. The dynamics of gene expression in vertebrate embryogenesis at single-cell resolution. Science. 360 (6392), (2018).
- Liao, Y., et al. Cell landscape of larval and adult Xenopus laevis at single-cell resolution. Nature Communications. 13 (1), 4306 (2022).
- AVMA (American Veterinary Medical Association). AVMA guidelines for the euthanasia of animals, 2020 edition. AVMA. , Schaumburg, Illinois. 37 (2020).
- Navarro, K., Jampachaisri, K., Chu, D., Pacharinsak, C. Bupivacaine as a euthanasia agent for African Clawed Frogs (Xenopus laevis). PLoS One. 17 (12), e0279331 (2022).
- Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio-Protocol. 11 (5), e3988 (2021).
- Heinz-Taheny, K. M. Cardiovascular physiology and diseases of amphibians. Veterinary clinics of North America. The Veterinary Clinics of North America. Exotic Animal Practice. 12 (1), 39-50 (2009).
- Stephenson, A., Adams, J. W., Vaccarezza, M. The vertebrate heart: an evolutionary perspective. Journal of Anatomy. 231 (6), 787-797 (2017).
- Hoops, D. A perfusion protocol for lizards, including a method for brain removal. MethodsX. 2, 165-173 (2015).
