Summary
Presentato qui è un efficace protocollo di perfusione sanguigna rapida per preparare campioni di tessuto da rane artigliate africane per studi di trascrittomica e proteomica.
Abstract
Gli xenopus sono stati potenti organismi modello per comprendere lo sviluppo e le malattie dei vertebrati per oltre 100 anni. Qui viene definito un protocollo di perfusione sanguigna rapida in Xenopus, volto a una riduzione costante e drastica del sangue all'interno di tutti i tessuti. La perfusione viene effettuata inserendo un ago direttamente nel ventricolo del cuore e pompando soluzione salina eparinizzata tamponata fosfato (PBS) attraverso il sistema vascolare. La procedura può essere completata in circa 10 minuti per animale. Il sangue è dominato da poche proteine e tipi di cellule molto abbondanti, creando numerosi problemi poiché queste proteine mascherano la maggior parte delle altre molecole e tipi di cellule di interesse. La caratterizzazione riproducibile di tessuti adulti di Xenopus con proteomica quantitativa e trascrittomica monocellulare trarrà beneficio dall'applicazione di questo protocollo prima del prelievo d'organo. I protocolli per il campionamento dei tessuti sono definiti in documenti di accompagnamento. Queste procedure mirano alla standardizzazione delle pratiche in Xenopus di diverso sesso, età e stato di salute, in particolare X. laevis e X. tropicalis.
Introduction
La perfusione di anfibi su tutto il corpo viene regolarmente completata ai fini della conservazione e della fissazione 1,2,3,4,5,6. Tuttavia, queste procedure avvengono a una velocità che limita il numero di campioni freschi che possono essere prelevati per animale. L'obiettivo di questo lavoro è quello di sviluppare un protocollo di perfusione sanguigna efficace in Xenopus, dando priorità alla velocità della tecnica. Il protocollo richiede meno di 10 minuti per animale per X. tropicalis e meno di 15 minuti per X. laevis animale. Le priorità secondarie sono la facilità di replica e l'uso di apparecchiature facilmente acquisibili in modo che i campioni di alta qualità possano essere ampiamente condivisi tra i laboratori Xenopus.
Le rane Xenopus sono ampiamente utilizzate nella ricerca biomedica per studiare i processi biologici e patologici fondamentali conservati tra le specie. Questo tetrapode ha una relazione evolutiva più stretta con i mammiferi rispetto ad altri modelli acquatici, avendo polmoni, un cuore a tre camere e arti con dita. La comunità internazionale utilizza efficacemente Xenopus per ottenere una comprensione più profonda delle malattie umane attraverso modelli approfonditi della malattia e analisi molecolare della funzione genica correlata alla malattia. I numerosi vantaggi di Xenopus come modello animale li rendono strumenti inestimabili per studiare le basi molecolari dello sviluppo umano e delle malattie; Questi vantaggi includono: grandi dimensioni di ovociti ed embrioni, alta fecondità, facilità di alloggiamento, rapido sviluppo esterno e facilità di manipolazione genomica. È stato stimato che Xenopus condivida ~ 80% dei geni della malattia umana identificati7.
Rispetto ai modelli di mammiferi popolari, Xenopus è un modello rapido ed economico, con la facilità di abbattimento del morfolino e la disponibilità di transgenici efficienti e mutazioni genetiche mirate utilizzando CRISPR8. La spettrometria di massa quantitativa e la trascrittomica monocellulare sono state applicate con successo agli embrioni di Xenopus9,10, ma un recente atlante cellulare di Xenopus laevis mostra che la composizione della maggior parte dei tessuti è dominata dai tipi di cellule del sangue 11. Sviluppando una tecnica che dissangua il tessuto a un ritmo rapido e utilizzando mezzi refrigerati, la freschezza del campione è minimamente influenzata dalla perfusione. Ciò è particolarmente importante per le applicazioni in cui l'obiettivo è quello di profilare l'espressione fisiologicamente imperturbata di mRNA o proteine.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con le regole e i regolamenti della Harvard Medical School IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee) (IS 00001365_3).
NOTA: Sebbene il metodo primario di eutanasia descritto sia considerato una tecnica accettabile per l'eutanasia dall'American Veterinary Medical Association12, non è stato trovato per portare alla cessazione di un battito cardiaco13. Anche il metodo secondario frequentemente usato di doppia pithing non impedisce questo, né rimuove il cuore dall'animale. Il dissanguamento di animali anestetizzati è considerato un metodo umano ed efficace per l'eutanasia di successo12. Poiché mantenere i tessuti freschi attraverso l'eutanasia è l'obiettivo di questo protocollo, è utile che il cuore continui a battere attraverso l'eutanasia primaria con MS-222 e che la perfusione sia essa stessa un metodo di eutanasia secondario attraverso il dissanguamento.
1. Preparazione
- Assicurarsi che l'istituto di ricerca abbia approvato la tecnica di eutanasia e perfusione descritta in questo protocollo.
- Preparare una soluzione di 5 g/L MS-222 (tricaina metansolfonato) e 5 g/L di bicarbonato di sodio. Il volume dovrebbe essere maggiore del volume richiesto per coprire completamente gli animali sottoposti a eutanasia. Controllare il pH per assicurarsi che sia ≥7.
- Preparare 500 μL di 180 U/mL di eparina in soluzione salina tamponata fosfato (PBS) per X. laevis o 200 μL per X. tropicalis.
- Eseguire l'eutanasia primaria ponendo lo Xenopus in questa soluzione (dal punto 1.2); L'animale rimarrà sommerso per un totale di 1 ora.
- Conferma che lo Xenopus ha perso la sua risposta al dolore pizzicando il piede 15 minuti nell'eutanasia. Se l'animale è reattivo, riportarlo alla soluzione di eutanasia fino a quando questa risposta non viene persa.
- Pesare lo Xenopus ed effettuare eventuali misurazioni aggiuntive necessarie prima del campionamento.
- Utilizzando un ago da 31 G, iniettare X. laevis con 250 μL e X. tropicalis con 100 μL di 180 U/mL di eparina in PBS (dal punto 1.3) nella muscolatura di ciascun arto anteriore.
- Preparare una soluzione di 1 mL/g del peso animale di 54 U/mL di eparina in PBS perfufato. Gli individui più esperti con questo protocollo possono scoprire che è necessario meno media per completare la perfusione.
- Utilizzare un ago ipodermico da 22 G per perfondere X. laevis e un ago ipodermico da 25 G per X. tropicali s. Smussare l'ago di perfusione tagliando la punta con tronchesi (Figura 1)14.
NOTA: Questo riduce la probabilità che l'ago penetri attraverso il ventricolo se spostato. Oltre a smussare, l'ago può essere leggermente macinato con una pietra o una lima affilante, ma rimanendo comunque abbastanza affilato da perforare il ventricolo. - Preparare la pompa attaccando l'ago tagliato e facendo circolare 54 U/mL di perfusato di PBS eparinizzato (dal punto 1.8). Assicurarsi di eliminare tutte le bolle d'aria dal tubo per eliminare la possibilità di embolia d'aria, che porta a una diminuzione dell'efficienza di perfusione o al guasto (vedere Tabella 1). Mantenere il mezzo di perfusione sul ghiaccio per tutta la durata della procedura.
- Se la pompa non è programmabile, con l'ago in posizione, misurare il volume pompato del fluido con le diverse impostazioni per determinare quali impostazioni sono più vicine a 5 mL/min e 10 mL/min. Queste portate saranno utilizzate indipendentemente dalla specie. Se la pompa di perfusione è programmabile, calibrarla con l'ago in posizione, seguendo le istruzioni del produttore.
- Posizionare la superficie di dissezione (vassoio o foglio di schiuma) su un'inclinazione all'interno di un contenitore secondario o disporla per facilitare il drenaggio del sangue.
- Una volta che la rana è stata nella soluzione per 1 ora, l'eutanasia primaria è stata completata. Rimuovere la rana e ricontrollare la perdita di risposta al dolore eseguendo un pizzico del piede.
- Posizionare la rana sul dorso e fissare ogni arto (Figura 2). Se è necessario preservare il tessuto degli arti, è possibile posizionare spilli sottili attraverso le dita o graffette a forma di U intorno agli arti.
- Usando le forbici da dissezione, taglia la pelle, lungo la linea mediana e poi lateralmente, facendo due lembi. (Figura 2)
- Utilizzare una pinza per afferrare la linea alba e allontanarla dalla cavità celomica (Figura 3). Usa con attenzione le forbici per tagliare la muscolatura. Fai due lembi fuori dalla parete della cavità e taglia o appunta tutti i lembi fuori strada.
- Utilizzare le forbici da dissezione per tagliare le ossa coracoidi e tagliare via il tessuto in eccesso per ottenere un migliore accesso al cuore (Figura 3).
- Il cuore dovrebbe ancora battere. Se il cuore ha smesso di battere prima della perfusione, notare che la freschezza del campione è stata compromessa.
2. Perfusione
- Identificare lo stomaco e spostarlo delicatamente in modo che sia sopra il lobo sinistro del fegato (alla destra dello spettatore), con la sua vascolarizzazione visibile per tutta la durata della procedura. Identificare un polmone e afferrarlo per la punta usando una pinza tissutale. Tirare il polmone all'esterno della cavità celomica e fissarlo attraverso la punta (Figura 4). Fallo delicatamente, poiché i vasi sanguigni rotti non si fondono bene. Nota se il sangue è visibile all'interno del lobo, in quanto ciò influenzerà la capacità di determinare il completamento della procedura.
- Prendere un'immagine della cavità celomica per valutare meglio l'efficienza della perfusione e potenzialmente identificare i tessuti anomali in un secondo momento.
- Identificare il pericardio sottile e tirarlo insegnato con una pinza tissutale (Figura 5). Perforare delicatamente il pericardio usando la punta delle forbici per iridectomia, facendo attenzione a non tagliare i tessuti sottostanti. Staccare il pericardio dalle tre camere del cuore.
- Utilizzare una pinza per afferrare delicatamente il ventricolo dal suo apice. Applicare una pressione limitata in modo che vi sia spazio sufficiente tra le superfici di trazione della pinza per il passaggio dell'ago di perfusione (Figura 6).
- Inserire l'ago attraverso la chiusura della pinza nella camera del ventricolo, facendo attenzione a non perforare attraverso il ventricolo (Figura 7). Bloccare la pinza tissutale in posizione utilizzando un supporto per aghi utilizzando un emostato.
NOTA: Questa tecnica stabilizza la posizione dell'ago, che è ancora affilato. Anche il serraggio dell'ago direttamente al ventricolo causerà danni inutili, rendendo più difficile il riserraggio in caso di necessità (vedere Tabella 1). - Avviare il flusso della pompa a circa 5 ml/min. Le tre camere del cuore e del tronco arterioso si ingorgeranno (Figura 8; vedi Tabella 1).
- Con le forbici, lanciare con attenzione il padiglione auricolare destro (alla sinistra dello spettatore); Il sangue si riverserà. Impostare la portata a 5 ml/min o aumentarla a 10 ml/min.
- Continuare fino a quando la vascolarizzazione dello stomaco sbianca (vedi Tabella 1), quindi lanciare il padiglione auricolare sinistro del cuore (alla destra dello spettatore). Se la portata è ancora di 5 ml/min, aumentarla a circa 10 ml/min.
- Utilizzare una pipetta di trasferimento per sciacquare la cavità celomica nei mezzi di perfusione, per aiutare a mantenere la visibilità e per valutare meglio il colore del perfusato che scorre dai padiglioni auricolari.
- Tenere l'ago in posizione fino a quando il perfusato che scorre dai padiglioni auricolari è chiaro (vedere Tabella 1) e il polmone ha perso la sua tonalità rossa (vedere Tabella 1; Figura 9).
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Representative Results
Dopo una perfusione riuscita, tutti i tessuti (escluso il fegato in Xenopus pigmentato) saranno nettamente più leggeri e meno saturi di sangue. I principali vasi sanguigni diventeranno meno evidenti (Figura 10) e i tessuti (escluso il fegato) risciacqueranno in modo pulito nel tampone dopo essere stati campionati. Mentre la corretta esecuzione del protocollo può essere confermata solo dalla qualità dei dati provenienti da campioni di tessuto dissanguato, diversi problemi tipici, le loro possibili cause e le azioni correttive suggerite sono forniti nella tabella di risoluzione dei problemi (Tabella 1 e Figura 11).
Figura 1: Aghi non tagliati e tagliati14. Usando il tagliafili, smussare l'ago tagliando la sua punta. Sarà abbastanza affilato da perforare il cuore, ma perforare il ventricolo sarà meno probabile in caso di errore umano. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Femmina matura di X. tropicalis bloccata attraverso ogni arto. Usa una pinza da dissezione dentata per tirare la pelle vicino alla cloaca insegnata a perforarla con le forbici da dissezione e creare due lembi. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Parete muscolare. Con la pelle ventrale aperta ma la parete muscolare intatta, la linea alba è visibile. Per ridurre la probabilità di danneggiare i tessuti sottostanti, afferrare la linea alba e tirarla insegnata prima del taglio. Le ossa coracoidi sono visibili attraverso il peritoneo. Una volta aperta la cavità celomica, queste ossa dovrebbero essere ridotte per dare un migliore accesso al cuore. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: La cavità celomica di un maschio maturo di X. tropicalis. Le ossa coracoidi sono state ridotte, fornendo accesso al cuore chiuso nel pericardio. Lo stomaco è stato spostato davanti al lobo sinistro del fegato e la sua vascolarizzazione è chiaramente visibile. Il polmone sinistro è stato estratto dalla cavità celomica dalla punta e bloccato per garantire che non si ritragga durante il processo di risciacquo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Pericardio. Il pericardio è una membrana sottile e dura che racchiude il cuore. Usando una pinza tissutale, afferrare delicatamente il pericardio e quindi utilizzare la punta delle forbici per iridectomia per perforarlo. Una volta perforato, sbucciarlo, lontano dal cuore. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6: Diagrammi di posizionamento dell'ago di anatomia del cuore. (A) Diagramma ventrale di un cuore di X. laevis. (B) Diagramma cardiaco, con il pericardio rimosso, che mostra il corretto posizionamento dell'ago e del morsetto. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 7: Anatomia del cuore e fotografia del posizionamento dell'ago. Con il pericardio rimosso, le tre camere del cuore e del tronco arterioso sono facilmente visibili. Utilizzare una pinza per afferrare delicatamente il ventricolo dal suo apice e quindi inserire l'ago attraverso la pinza. Fare attenzione a non causare danni inutili al ventricolo o ad altre camere in quanto ciò comprometterebbe l'efficienza della perfusione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 8: La perfusione è in corso. Il padiglione auricolare destro è stato forato e il ventricolo, il tronco arterioso e il padiglione auricolare sinistro sono visibilmente ingorgati. Lo stomaco è sbiancato e sia i mezzi che fuoriescono dall'animale che il tessuto polmonare sono pesantemente saturi di sangue. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 9: La cavità celomica dopo una rapida perfusione e risciacquo riusciti. La vascolarizzazione dello stomaco e di altri organi non è più facilmente visibile. A meno che lo Xenopus non sia albino, il fegato rimarrà fortemente pigmentato. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 10: Campioni di tessuti da un maschio albino non perfuso e perfuso X. laevis. Le differenze nella pigmentazione e nella visibilità della vascolarizzazione sono pronunciate. Tutti i campioni sono all'interno di pozzetti di 3,5 cm di diametro. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 11: Diagrammi di risoluzione dei problemi di un cuore di Xenopus . (A) Il ventricolo ha perforazione (in rosso); Questa perforazione è isolata dalla pinza e non influirà sull'efficienza della perfusione. (B) Un cuore con un ventricolo gravemente danneggiato. L'ago può essere guidato nel tronco arterioso e bloccato in posizione. È particolarmente importante assicurarsi che l'ago sia ben smussato quando si utilizza questa tecnica14. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 12: Valutazione dell'efficienza di perfusione negli albini. Un albino X. laevis sia prima (A) che dopo (B) rapida perfusione. L'albinismo rende più facile determinare la competenza della perfusione di quanto non sarebbe in un animale pigmentato. Ciò è particolarmente evidente nei tessuti polmonari ed epatici. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Tabella 1: tabella dei problemi relativi alla risoluzione dei problemi. Vengono forniti diversi problemi tipici, le loro possibili cause e le azioni correttive suggerite. Clicca qui per scaricare questa tabella.
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Discussion
Questo protocollo descrive le tecniche tradizionali di dissezione per accedere alla cavità celomica. Anche altre tecniche sono accettabili, a condizione che causino danni minimi ai tessuti, che il cuore sia accessibile e che il polmone e lo stomaco siano visibili. Allo stesso modo, la maggior parte degli strumenti di dissezione elencati può essere facilmente sostituita con elementi comparabili.
Mentre sono stati fatti tentativi per ottimizzare l'efficacia di questa procedura, i risultati possono variare a seconda della propria esperienza e variabilità tra le singole rane. Un aspetto interessante della perfusione sanguigna che è rimasto al di fuori dello scopo di questo documento è il modo in cui questa procedura si confronta con modi alternativi di perfusione per gli animali sottoposti a intervento chirurgico. Un'altra variabile inesplorata è come funzionerebbe la perfusione sanguigna in animali molto giovani o di età avanzata in cui la vascolarizzazione potrebbe essere eccessivamente fragile. Ulteriori osservazioni sono fornite per facilitare l'applicazione di questo protocollo. Diversi problemi tipici, le loro possibili cause e le azioni correttive suggerite sono forniti nella Tabella 1.
Una limitazione di questa procedura è che l'efficienza della perfusione può essere influenzata negativamente dalla sua velocità. Se l'efficienza della perfusione ha la precedenza sulla perfusione rapida, si raccomanda di adattare una tecnica axolotl1 (Saltman et al. usano il termine aorta per riferirsi al tronco arterioso).
La durata della procedura e il volume dei supporti utilizzati dipendono da una serie di variabili. Generalmente, i maschi di X. tropicalis impiegano tra 2-3 minuti per perfondere con successo con 15-25 ml di media, mentre le femmine di X. tropicalis impiegano tra 3-4 minuti con 25-40 ml di media. Significativamente più variazione da animale ad animale è stata trovata quando si perfondeva X. laevis. Sebbene una portata più elevata ridurrebbe il tempo necessario per perfondere animali più grandi, l'aumento della pressione della linea può facilmente portare allo spostamento dei raccordi del tubo e al guasto della pompa.
Naturalmente, è molto più facile valutare l'efficienza della perfusione negli animali albini. La differenza è particolarmente evidente nei tessuti polmonari ed epatici (Figura 12). Pertanto, si raccomanda l'uso di albini, specialmente quando si tenta per la prima volta la perfusione o si subisce un allenamento.
Regolando la portata e la dimensione dell'ago, il protocollo è adattabile a tutte le specie di Xenopus. A causa dell'omologia nell'anatomia cardiaca e nella circolazione sanguigna tra Xenopus e la maggior parte degli altri anfibi15, così come i rettili non coccodrilli, questa tecnica può essere modificata per la perfusione rapida di tutto il corpo di altri modelli con cuori a tre camere16. Se viene utilizzato un modello di rettile non coccodrillo che richiede esclusivamente la perfusione di uno degli archi aortici, si raccomandano altri protocolli17.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dal OD031956 di sovvenzione OD R24 del NIH e dal HD073104 della sovvenzione NICHD R01. Ringraziamo Darcy Kelly per le utili discussioni e gli input iniziali su questo protocollo. Vorremmo anche ringraziare Samantha Jalbert, Jill Ralston e Wil Ratzan per la loro assistenza e supporto, nonché i nostri tre revisori anonimi per il loro feedback.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5x Magnifying glass with LED light and stand | amazon.com | B08QJ6J8P1 | light must not produce heat |
| Disposable transfer pipets | VWR | 414004-036 | |
| Dissecting fine-pointed forceps | Fisher Scinetific | 08-875 | |
| Dissecting scissors sharp piont, straight 6.5" | VWR | 76457-374 | |
| Dissection tray | Fisher Scinetific | 14-370-284 | styrofoam sheets are an acceptable alternative |
| Euthanasia container | US Plastic | Item 2860 | alternative opaque containers acceptable |
| Euthanasia container lid | US Plastic | Item 3047 | |
| Fine dissection pins | Living Systems Instrumentation | PIN-#3 | |
| General use hypodermic needles, 22 G | Fisher Scientific | 14-826-5A | for X. laevis |
| General use hypodermic needles, 25 G | Fisher Scientific | 14-826AA | for X. tropicalis |
| Heparin, porcine intestinal mucosa | MilliporeSigma | 37-505-410MG | |
| Iridectomy scissors 6" | vwr | 470018-938 | iris scissors are an acceptable alternative |
| Luer-to-barb adapter male Luer with lock ring | amazon.com | B09PTX6M2Z | size will be dependant on the hosing of the pump used |
| Mayo-Hegar needle holder | Fisher Scinetific | 08-966 | mosquito forceps are an acceptable alternative |
| MS-222: Syncaine (formerly tricaine) | Pentair AES | TRS1 | |
| PBS 1x | Corning | 21-040-CV | |
| Peristaltic liquid pump dosing pump 5–100 mL/min | amazon.com | B07PWY4SM6 | any peristaltic pump capable of pumping 5-10mL/min is acceptable |
| Sharpening stone | VWR | 470150-112 | optional; for dulling needles |
| Sodium bicarbonate, powder, USP | Fisher Scientific | 18-606-333 | |
| Specimen forceps, serrated | VWR | 82027-442 | |
| T-Pins for dissecting | Fisher Scinetific | S99385 | |
| Ultra-fine short insulin syringes, 31 G | VWR | BD328438 | |
| Wire flush cutters, 6-inch ultra sharp & powerful side cutter clippers | amazon.com | B087P191LP |
References
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