Summary
يظهر هنا بروتوكول فعال لنضح الدم السريع لإعداد عينات الأنسجة من الضفادع الأفريقية ذات المخالب لدراسات النسخ والبروتينات.
Abstract
كانت Xenopus كائنات نموذجية قوية لفهم تطور الفقاريات وأمراضها لأكثر من 100 عام. هنا ، يتم تعريف بروتوكول نضح الدم السريع في Xenopus ، والذي يهدف إلى انخفاض ثابت وجذري للدم داخل جميع الأنسجة. يتم إجراء التروية عن طريق إدخال إبرة مباشرة في بطين القلب وضخ محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) عبر نظام الأوعية الدموية. يمكن إكمال الإجراء في حوالي 10 دقائق لكل. يهيمن على الدم عدد قليل من البروتينات وأنواع الخلايا الوفيرة للغاية ، مما يخلق العديد من المشكلات لأن هذه البروتينات تخفي معظم الجزيئات وأنواع الخلايا الأخرى ذات الأهمية. سيستفيد التوصيف القابل للتكرار لأنسجة Xenopus البالغة مع البروتينات الكمية والنسخ أحادي الخلية من تطبيق هذا البروتوكول قبل أخذ عينات الأعضاء. يتم تعريف بروتوكولات أخذ عينات الأنسجة في الأوراق المصاحبة. تهدف هذه الإجراءات إلى توحيد الممارسات عبر Xenopus من مختلف الجنس والعمر والحالة الصحية ، وتحديدا X. laevis و X. tropicalis.
Introduction
يتم الانتهاء من نضح البرمائيات بالكامل بشكل روتيني لأغراض الحفظ والتثبيت1،2،3،4،5،6. ومع ذلك ، تحدث هذه الإجراءات بمعدل يحد من عدد العينات الطازجة التي يمكن أخذها لكل. الهدف من هذا العمل هو تطوير بروتوكول فعال لنضح الدم في Xenopus ، مع إعطاء الأولوية لسرعة هذه التقنية. يستغرق البروتوكول أقل من 10 دقائق لكل ل X. tropicalis وأقل من 15 دقيقة لكل X. laevis. الأولويات الثانوية هي سهولة النسخ واستخدام المعدات التي يمكن الحصول عليها بسهولة بحيث يمكن مشاركة العينات عالية الجودة على نطاق واسع بين مختبرات Xenopus.
تستخدم ضفادع Xenopus على نطاق واسع في البحوث الطبية الحيوية لدراسة العمليات البيولوجية والمرضية الأساسية المحفوظة عبر الأنواع. هذا رباعي الأرجل له علاقة تطورية أوثق مع الثدييات من النماذج المائية الأخرى ، حيث يحتوي على رئتين وقلب من ثلاث غرف وأطراف ذات أرقام. يستخدم المجتمع الدولي Xenopus بشكل فعال لاكتساب فهم أعمق للأمراض البشرية من خلال نمذجة الأمراض المتعمقة والتحليل الجزيئي لوظيفة الجينات المرتبطة بالمرض. المزايا العديدة ل Xenopus كنموذج حيواني تجعلها أدوات لا تقدر بثمن لدراسة الأساس الجزيئي للتنمية البشرية والمرض. وتشمل هذه المزايا: حجم البويضة والجنين الكبير ، والخصوبة العالية ، وسهولة السكن ، والتطور الخارجي السريع ، وسهولة التلاعب الجينومي. تشير التقديرات إلى أن Xenopus يشارك ~ 80٪ من جينات الأمراض البشرية المحددة7.
بالمقارنة مع نماذج الثدييات الشائعة ، يعد Xenopus نموذجا سريعا وفعالا من حيث التكلفة ، مع سهولة هدم المورفولينو وتوافر الجينات المحورة الفعالة والطفرات الجينية المستهدفة باستخدام CRISPR8. تم تطبيق قياس الطيف الكتلي الكمي والنسخ أحادي الخلية بنجاح على أجنة Xenopus 9,10 ، لكن أطلس الخلايا الأخير من Xenopus laevis يظهر أن تكوين معظم الأنسجة تهيمن عليه أنواع خلايا الدم 11. من خلال تطوير تقنية تقوم بإخراج الأنسجة بمعدل سريع واستخدام الوسائط المبردة ، تتأثر نضارة العينة إلى الحد الأدنى بالتروية. هذا مهم بشكل خاص للتطبيقات التي يكون الهدف فيها هو تحديد mRNA غير المضطرب من الناحية الفسيولوجية أو تعبير البروتين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم إجراء جميع التجارب وفقا لقواعد وأنظمة كلية الطب بجامعة هارفارد IACUC (اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان) (IS 00001365_3).
ملاحظة: على الرغم من أن الطريقة الأساسية للقتل الرحيم الموصوفة تعتبر تقنية مقبولة للقتل الرحيم من قبل الجمعية الطبية البيطرية الأمريكية12 ، إلا أنه لم يتم العثور عليها تؤدي إلى توقف ضربات القلب13. حتى الطريقة الثانوية المستخدمة بشكل متكرر للضرب المزدوج لا تمنع ذلك ، ولا إزالة القلب من الحيوان. يعتبر استنزاف الحيوانات المخدرة طريقة إنسانية وفعالة للقتل الرحيمالناجح 12. نظرا لأن الحفاظ على الأنسجة الطازجة من خلال القتل الرحيم هو الهدف من هذا البروتوكول ، فمن المفيد أن يستمر القلب في النبض من خلال القتل الرحيم الأولي باستخدام MS-222 ، وهذا التروية هو في حد ذاته طريقة ثانوية للقتل الرحيم من خلال الاستنزاف.
1. التحضير
- تأكد من أن المؤسسة البحثية قد وافقت على تقنية القتل الرحيم والتروية الموضحة في هذا البروتوكول.
- تحضير محلول 5 جم / لتر MS-222 (تريكايين ميثان سلفونات) و 5 جم / لتر بيكربونات الصوديوم. يجب أن يكون الحجم أكبر من الحجم المطلوب لتغطية الحيوانات التي يتم قتلها رحيما بالكامل. تحقق من الرقم الهيدروجيني للتأكد من أنه ≥7.
- تحضير 500 ميكرولتر من 180 وحدة / مل من الهيبارين في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) لكل X. laevis ، أو 200 ميكرولتر لكل X. tropicalis.
- إجراء القتل الرحيم الأولي عن طريق وضع Xenopus في هذا الحل (من الخطوة 1.2) ؛ سيبقى الحيوان مغمورا لمدة 1 ساعة.
- تأكد من أن Xenopus قد فقد استجابته للألم عن طريق قرص القدم لمدة 15 دقيقة في القتل الرحيم. إذا كان الحيوان تفاعليا ، فأعده إلى محلول القتل الرحيم حتى تضيع هذه الاستجابة.
- قم بوزن Xenopus واتخاذ أي قياسات إضافية مطلوبة قبل أخذ العينات.
- باستخدام إبرة 31 G ، حقن X. laevis مع 250 ميكرولتر و X. tropicalis مع 100 ميكرولتر من 180 U / mL الهيبارين في PBS (من الخطوة 1.3) في عضلات كل طرف أمامي.
- تحضير محلول 1 مل / جم من وزن الحيوان 54 وحدة / مل من الهيبارين في بيرفوسات PBS. قد يجد الأفراد الأكثر خبرة في هذا البروتوكول أن هناك حاجة إلى وسائط أقل لإكمال التروية.
- استخدم إبرة تحت الجلد 22 جم لإثراء X. laevis ، وإبرة تحت الجلد 25 جم ل X. tropicali s. قم بتخفيف إبرة التروية عن طريق تقليم الطرف بقواطع الأسلاك (الشكل 1)14.
ملاحظة: هذا يقلل من احتمال ثقب الإبرة من خلال البطين إذا تم تحريكها. بالإضافة إلى التقشير ، قد يتم طحن الإبرة قليلا بحصوات أو ملف شحذ ، لكنها تظل حادة بما يكفي لاختراق البطين. - قم بإعداد المضخة عن طريق توصيل الإبرة المشذبة وتعميم 54 وحدة / مل من بيرفوسات PBS الهيبارين (من الخطوة 1.8). تأكد من تطهير جميع فقاعات الهواء من الأنبوب للقضاء على احتمال انسداد الهواء ، مما يؤدي إلى انخفاض كفاءة التروية أو الفشل (انظر الجدول 1). احتفظ بوسائط التروية على الثلج طوال مدة الإجراء.
- إذا كانت المضخة غير قابلة للبرمجة ، مع وجود الإبرة في مكانها ، فقم بقياس حجم الوسائط التي يتم ضخها تحت الإعدادات المختلفة لتحديد الإعدادات الأقرب إلى 5 مل / دقيقة و 10 مل / دقيقة. سيتم استخدام معدلات التدفق هذه بغض النظر عن الأنواع. إذا كانت مضخة التروية قابلة للبرمجة ، فقم بمعايرتها مع وضع الإبرة في مكانها ، باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
- ضع سطح التشريح (صينية أو لوح رغوي) على منحدر داخل حاوية ثانوية ، أو رتبه لتسهيل تصريف الدم.
- بمجرد أن يكون الضفدع في المحلول لمدة 1 ساعة ، يكون القتل الرحيم الأولي قد اكتمل. قم بإزالة الضفدع وأعد فحص فقدان استجابة الألم عن طريق إجراء قرصة القدم.
- ضع الضفدع على ظهره وقم بتثبيت كل طرف (الشكل 2). إذا كان الحفاظ على أنسجة الأطراف مطلوبا ، فقد يتم وضع دبابيس رفيعة من خلال الأرقام أو الدبابيس على شكل حرف U حول الأطراف.
- باستخدام مقص التشريح ، قم بقطع الجلد ، حتى خط الوسط ، ثم بشكل جانبي ، مما يجعل اثنين من اللوحات. (الشكل 2)
- استخدم الملقط للإمساك بالخط العريض وسحبه بعيدا عن التجويف القولوني (الشكل 3). استخدم المقص بعناية لتقطيع العضلات. اصنع لوحتين من جدار التجويف وقم بقص أو تثبيت جميع اللوحات بعيدا عن الطريق.
- استخدم مقص التشريح لقطع العظام الغرابية وقطع الأنسجة الزائدة للوصول بشكل أفضل إلى القلب (الشكل 3).
- يجب أن يظل القلب ينبض. إذا توقف القلب عن النبض قبل التروية ، لاحظ أن نضارة العينة قد تعرضت للخطر.
2. التروية
- حدد المعدة وقم بتحريكها برفق بحيث تكون أعلى الفص الأيسر من الكبد (على يمين المشاهد) ، مع ظهور الأوعية الدموية طوال مدة الإجراء. تحديد الرئة وإمساكها من طرفها باستخدام ملقط الأنسجة. اسحب الرئة خارج التجويف القولوني وثبتها من خلال الطرف (الشكل 4). افعل ذلك برفق ، لأن الأوعية الدموية المكسورة لا تتخلل جيدا. لاحظ ما إذا كان الدم مرئيا داخل الفص ، لأن هذا سيؤثر على القدرة على تحديد اكتمال الإجراء.
- التقط صورة للتجويف القولوني لتقييم كفاءة التروية بشكل أفضل وربما تحديد الأنسجة غير الطبيعية في وقت لاحق.
- حدد التامور الرقيق واسحبه باستخدام ملقط الأنسجة (الشكل 5). قم بثقب التامور برفق باستخدام طرف مقص استئصال القزحية ، مع الحرص على عدم قطع الأنسجة الكامنة. قشر التأمور بعيدا عن حجرات القلب الثلاث.
- استخدم الملقط للإمساك بالبطين برفق من قمته. ضع ضغطا محدودا بحيث يكون هناك مساحة كافية بين أسطح الجر للملقط حتى تمر إبرة التروية (الشكل 6).
- أدخل الإبرة من خلال إغلاق الملقط في حجرة البطين ، مع الحرص على عدم ثقب البطين (الشكل 7). ثبت ملقط الأنسجة في مكانه باستخدام حامل إبرة باستخدام مرقئ.
ملاحظة: تعمل هذه التقنية على تثبيت موضع الإبرة ، والذي لا يزال حادا. سيؤدي تثبيت الإبرة مباشرة إلى البطين أيضا إلى تلف غير ضروري ، مما يجعل إعادة التثبيت أكثر صعوبة إذا لزم الأمر (انظر الجدول 1). - ابدأ تدفق المضخة عند حوالي 5 مل / دقيقة. سوف تغرق الغرف الثلاث للقلب والجذع الشرياني (الشكل 8 ؛ انظر الجدول 1).
- باستخدام المقص ، قم بلف الأذن اليمنى بعناية (على يسار المشاهد) ؛ سوف يتدفق الدم. اضبط معدل التدفق على 5 مل / دقيقة أو قم بزيادته إلى 10 مل / دقيقة.
- استمر حتى تبيض الأوعية الدموية في المعدة (انظر الجدول 1) ، ثم انس الأذن اليسرى للقلب (على يمين المشاهد). إذا كان معدل التدفق لا يزال 5 مل / دقيقة ، فقم بزيادته إلى حوالي 10 مل / دقيقة.
- استخدم ماصة نقل لشطف التجويف القولوني في وسائط التروية ، للمساعدة في الحفاظ على الرؤية وتقييم لون البيرفوسات المتدفقة من الأذنين بشكل أفضل.
- حافظ على الإبرة في مكانها حتى يصبح البيروسوات المتدفقة من الأذنين صافية (انظر الجدول 1) وتفقد الرئة لونها الأحمر (انظر الجدول 1 ؛ الشكل 9).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بعد التروية الناجحة ، ستكون جميع الأنسجة (باستثناء الكبد في Xenopus المصطبغ) أخف وزنا بشكل واضح وأقل تشبعا بالدم. ستصبح الأوعية الدموية الرئيسية أقل وضوحا (الشكل 10) ، وستشطف الأنسجة (باستثناء الكبد) بشكل نظيف في المخزن المؤقت بعد أخذ العينات. في حين أن التنفيذ الناجح للبروتوكول لا يمكن تأكيده في النهاية إلا من خلال جودة البيانات من عينات الأنسجة المستنزهة ، يتم توفير العديد من المشكلات النموذجية وأسبابها المحتملة والإجراءات العلاجية المقترحة في جدول استكشاف الأخطاء وإصلاحها (الجدول 1 والشكل 11).
الشكل 1: الإبر غير المشذبة والمشذبة14. باستخدام كلصات الأسلاك ، قم بتخفيف الإبرة عن طريق قطع طرفها. سيكون حادا بما يكفي لاختراق القلب ، ولكن ثقب البطين سيكون أقل احتمالا في حالة حدوث خطأ بشري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الأنثى الناضجة X. tropicalis مثبتة في كل طرف. استخدم ملقط تشريح مسنن لسحب الجلد بالقرب من العباءة التي يتم تدريسها لثقبها بمقص التشريح وإنشاء لوحتين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: الجدار العضلي. مع فتح الجلد البطني ولكن الجدار العضلي سليم ، يكون الخط ألبا مرئيا. لتقليل احتمالية إتلاف الأنسجة الكامنة ، أمسك بالخط ألبا واسحبه قبل القطع. يمكن رؤية العظام الغرابية من خلال الصفاق. بمجرد فتح التجويف القولوني ، يجب تقليل هذه العظام لإتاحة وصول أفضل إلى القلب. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: التجويف القولوني لذكر X. tropicalis الناضج. تم تقليل العظام الغرابية ، مما يوفر الوصول إلى القلب المغلق بالتأمور. تم إزاحة المعدة أمام الفص الأيسر من الكبد ، والأوعية الدموية واضحة للعيان. تم سحب الرئة اليسرى من التجويف القولوني من طرفها وتثبيتها لضمان عدم تراجعها أثناء عملية الشطف. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: التأمور. التأمور عبارة عن غشاء رقيق وصلب يحيط بالقلب. باستخدام ملقط الأنسجة، أمسك التامور برفق ثم استخدم طرف مقص استئصال القزحية لثقبه. بمجرد ثقبه ، قشره بعيدا عن القلب. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: مخططات وضع إبرة تشريح القلب. أ: مخطط بطني لقلب X. laevis. ب: مخطط القلب، مع إزالة التأمور، يوضح موضع المؤشر والمشبك الصحيحين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: تشريح القلب وصورة وضع الإبرة. مع إزالة التامور ، يمكن رؤية الغرف الثلاث للقلب والجذع الشرياني بسهولة. استخدم الملقط للإمساك بالبطين برفق من قمته ثم أدخل الإبرة من خلال الملقط. احرص على عدم التسبب في ضرر غير ضروري للبطين أو الغرف الأخرى لأن هذا سيضر بكفاءة التروية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 8: التروية جارية. تم ربط الأذن اليمنى ، والبطين والجذع الشرياني والأذن اليسرى محتقنة بشكل واضح. المعدة تبيض وكل من الوسائط التي تعمل من الحيوان وأنسجة الرئة مشبعة بشدة بالدم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 9: التجويف القولوني بعد نجاح التروية السريعة والشطف. لم يعد من السهل رؤية الأوعية الدموية في المعدة والأعضاء الأخرى. ما لم يكن Xenopus ألبينو ، سيبقى الكبد مصطبغا بشدة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 10: عينات الأنسجة من ذكر ألبينو غير مثقوف ومثقوب X. laevis. الاختلافات في تصبغ ووضوح الأوعية الدموية واضحة. جميع العينات داخل آبار قطرها 3.5 سم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 11: استكشاف أخطاء مخطط قلب Xenopus وإصلاحه. (أ) البطين به ثقب (باللون الأحمر) ؛ يتم عزل هذا الثقب بواسطة الملقط ولن يؤثر على كفاءة التروية. ب: قلب مصاب ببطين مصاب بتلف شديد. يمكن توجيه الإبرة إلى الجذع الشرياني وتثبيتها في مكانها. من المهم بشكل خاص التأكد من ضعف الإبرة جيدا عند استخدام هذه التقنية14. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 12: تقييم كفاءة التروية في المهق. ألبينو X. laevis قبل (A) وبعد (B) التروية السريعة. يجعل المهق من السهل تحديد كفاءة التروية مقارنة بالحيوان المصطبغ. هذا واضح بشكل خاص في أنسجة الرئة والكبد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1: جدول استكشاف الأخطاء وإصلاحها. يتم توفير العديد من المشاكل النموذجية وأسبابها المحتملة والإجراءات العلاجية المقترحة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يصف هذا البروتوكول تقنيات التشريح التقليدية للوصول إلى تجويف coelomic. التقنيات الأخرى مقبولة أيضا ، بشرط أن تسبب الحد الأدنى من الضرر للأنسجة ، ويمكن الوصول إلى القلب ، وتكون الرئة والمعدة مرئية. وبالمثل ، يمكن استبدال معظم أدوات التشريح المدرجة بسهولة بعناصر قابلة للمقارنة.
في حين بذلت محاولات لتحسين فعالية هذا الإجراء ، قد تختلف النتائج اعتمادا على تجربة الفرد وتباينه بين الضفادع الفردية. أحد الجوانب المثيرة للاهتمام في نضح الدم الذي بقي خارج نطاق هذه الورقة هو كيفية مقارنة هذا الإجراء بطرق التروية البديلة للحيوانات التي تخضع لعملية جراحية. متغير آخر غير مستكشف هو كيفية عمل نضح الدم في الحيوانات الصغيرة جدا أو الحيوانات في سن متقدمة حيث قد تكون الأوعية الدموية هشة للغاية. وقدمت ملاحظات إضافية لتيسير تطبيق هذا البروتوكول. وترد في الجدول 1 عدة مشاكل نموذجية وأسبابها المحتملة والإجراءات العلاجية المقترحة.
أحد قيود هذا الإجراء هو أن كفاءة التروية يمكن أن تتأثر سلبا بسرعتها. إذا كانت كفاءة التروية لها الأسبقية على التروية السريعة ، يوصى بتكييف تقنية axolotl1 (يستخدم Saltman et al. مصطلح الشريان الأورطي للإشارة إلى الجذع الشرياني).
تعتمد مدة الإجراء وحجم الوسائط المستخدمة على عدد من المتغيرات. بشكل عام ، تستغرق ذكور X. tropicalis ما بين 2-3 دقائق لتتسلل بنجاح مع 15-25 مل من الوسائط ، بينما تأخذ إناث X. tropicalis ما بين 3-4 دقائق مع 25-40 مل من الوسائط . تم العثور على تباين أكبر بكثير من إلى عند تعطير X. laevis. على الرغم من أن معدل التدفق الأعلى من شأنه أن يقلل من طول الوقت اللازم لترشيح الحيوانات الكبيرة ، إلا أن ضغط الخط المتزايد يمكن أن يؤدي بسهولة إلى إزاحة تركيبات الأنبوب وفشل المضخة.
بطبيعة الحال ، من الأسهل بكثير تقييم كفاءة التروية في الحيوانات البيضاء. الفرق واضح بشكل خاص في أنسجة الرئة والكبد (الشكل 12). وبالتالي ، يوصى باستخدام المهق ، خاصة عند محاولة التروية لأول مرة أو الخضوع للتدريب.
من خلال ضبط معدل التدفق وحجم الإبرة ، يكون البروتوكول قابلا للتكيف مع جميع أنواع Xenopus. نظرا للتماثل في تشريح القلب والدورة الدموية بين Xenopus ومعظم البرمائيات الأخرى15 ، وكذلك الزواحف غير التمساحية ، يمكن تعديل هذه التقنية للتروية السريعة لكامل الجسم لنماذج أخرى ذات قلوب ثلاثية الحجرات16. إذا تم استخدام نموذج الزواحف غير التمساحية التي تتطلب حصرا نضح أحد أقواس الأبهر ، يوصى باستخدام بروتوكولات أخرى17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من خلال منحة OD R24 التابعة للمعاهد الوطنية للصحة OD031956 ومنحة NICHD R01 HD073104. نشكر دارسي كيلي على المناقشات المفيدة والمدخلات الأولية حول هذا البروتوكول. نود أيضا أن نشكر سامانثا جالبرت وجيل رالستون وويل راتزان على مساعدتهم ودعمهم بالإضافة إلى المراجعين النظراء الثلاثة المجهولين على ملاحظاتهم.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5x Magnifying glass with LED light and stand | amazon.com | B08QJ6J8P1 | light must not produce heat |
| Disposable transfer pipets | VWR | 414004-036 | |
| Dissecting fine-pointed forceps | Fisher Scinetific | 08-875 | |
| Dissecting scissors sharp piont, straight 6.5" | VWR | 76457-374 | |
| Dissection tray | Fisher Scinetific | 14-370-284 | styrofoam sheets are an acceptable alternative |
| Euthanasia container | US Plastic | Item 2860 | alternative opaque containers acceptable |
| Euthanasia container lid | US Plastic | Item 3047 | |
| Fine dissection pins | Living Systems Instrumentation | PIN-#3 | |
| General use hypodermic needles, 22 G | Fisher Scientific | 14-826-5A | for X. laevis |
| General use hypodermic needles, 25 G | Fisher Scientific | 14-826AA | for X. tropicalis |
| Heparin, porcine intestinal mucosa | MilliporeSigma | 37-505-410MG | |
| Iridectomy scissors 6" | vwr | 470018-938 | iris scissors are an acceptable alternative |
| Luer-to-barb adapter male Luer with lock ring | amazon.com | B09PTX6M2Z | size will be dependant on the hosing of the pump used |
| Mayo-Hegar needle holder | Fisher Scinetific | 08-966 | mosquito forceps are an acceptable alternative |
| MS-222: Syncaine (formerly tricaine) | Pentair AES | TRS1 | |
| PBS 1x | Corning | 21-040-CV | |
| Peristaltic liquid pump dosing pump 5–100 mL/min | amazon.com | B07PWY4SM6 | any peristaltic pump capable of pumping 5-10mL/min is acceptable |
| Sharpening stone | VWR | 470150-112 | optional; for dulling needles |
| Sodium bicarbonate, powder, USP | Fisher Scientific | 18-606-333 | |
| Specimen forceps, serrated | VWR | 82027-442 | |
| T-Pins for dissecting | Fisher Scinetific | S99385 | |
| Ultra-fine short insulin syringes, 31 G | VWR | BD328438 | |
| Wire flush cutters, 6-inch ultra sharp & powerful side cutter clippers | amazon.com | B087P191LP |
References
- Saltman, A. J., Barakat, M., Bryant, D. M., Brodovskaya, A., Whited, J. L. DiI perfusion as a method for vascular visualization in Ambystoma mexicanum. Journal of Visualized Experiments. (124), e55740 (2017).
- Lametschwandtner, A., Minnich, B. Microvascular anatomy of the brain of the adult pipid frog, Xenopus laevis (Daudin): A scanning electron microscopic study of vascular corrosion casts. Journal of Morphology. 279 (7), 950-969 (2018).
- Lametschwandtner, A., Minnich, B. Microvascular anatomy of the urinary bladder in the adult African clawed toad, Xenopus laevis: A scanning electron microscope study of vascular casts. Journal of Morphology. 282 (3), 368-377 (2021).
- Lametschwandtner, A., et al. Microvascular anatomy of the gallbladder of the adult South African clawed toad, Xenopus laevis Daudin: A scanning electron microscope study of vascular corrosion casts. Microscopy and Microanalysis. 13, 492-493 (2007).
- Lametschwandtner, A., Spornitz, U., Minnich, B. Microvascular anatomy of the non-lobulated liver of adult Xenopus laevis: A scanning electron microscopic study of vascular casts. Anatomical Record. 305 (2), 243-253 (2022).
- Miodoński, A. J., Bär, T. Arterial supply of the choriocapillaris of anuran amphibians (Rana temporaria, Rana esculenta). Scanning electron-microscopic (SEM) study of microcorrosion casts. Cell and Tissue Research. 249 (1), 101-109 (1987).
- Nenni, M. J., et al. Xenbase: Facilitating the use of Xenopus to model human disease. Frontiers in Physiology. 10, 154 (2019).
- Tandon, P., Conlon, F., Furlow, J. D., Horb, M. E. Expanding the genetic toolkit in Xenopus: Approaches and opportunities for human disease modeling. Developmental Biology. 426 (2), 325-335 (2017).
- Peshkin, L., et al. The protein repertoire in early vertebrate embryogenesis. bioRxiv. , (2019).
- Briggs, J. A., et al. The dynamics of gene expression in vertebrate embryogenesis at single-cell resolution. Science. 360 (6392), (2018).
- Liao, Y., et al. Cell landscape of larval and adult Xenopus laevis at single-cell resolution. Nature Communications. 13 (1), 4306 (2022).
- AVMA (American Veterinary Medical Association). AVMA guidelines for the euthanasia of animals, 2020 edition. AVMA. , Schaumburg, Illinois. 37 (2020).
- Navarro, K., Jampachaisri, K., Chu, D., Pacharinsak, C. Bupivacaine as a euthanasia agent for African Clawed Frogs (Xenopus laevis). PLoS One. 17 (12), e0279331 (2022).
- Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio-Protocol. 11 (5), e3988 (2021).
- Heinz-Taheny, K. M. Cardiovascular physiology and diseases of amphibians. Veterinary clinics of North America. The Veterinary Clinics of North America. Exotic Animal Practice. 12 (1), 39-50 (2009).
- Stephenson, A., Adams, J. W., Vaccarezza, M. The vertebrate heart: an evolutionary perspective. Journal of Anatomy. 231 (6), 787-797 (2017).
- Hoops, D. A perfusion protocol for lizards, including a method for brain removal. MethodsX. 2, 165-173 (2015).
