Summary
这里介绍的是一种有效的快速血液灌注方案，用于制备非洲爪蛙的组织样本，用于转录组学和蛋白质组学研究。
Abstract
100多年来，非洲爪蟾一直是了解脊椎动物发育和疾病的强大模式生物。在这里，定义了非洲爪蟾的快速血液灌注方案，旨在一致和急剧地减少所有组织内的血液。通过将针头直接插入心脏心室并通过血管系统泵送肝素化磷酸盐缓冲盐水（PBS）来进行灌注。每只动物可以在大约 10 分钟内完成该过程。血液由一些高度丰富的蛋白质和细胞类型主导，由于这些蛋白质掩盖了大多数其他感兴趣的分子和细胞类型，因此会产生许多问题。使用定量蛋白质组学和单细胞转录组学对成人非洲爪蟾组织的可重复表征将受益于在器官取样之前应用该协议。组织取样的方案在配套论文中定义。这些程序旨在使不同性别、年龄和健康状况的非洲爪蟾的做法标准化，特别是非洲爪蟾和热带爪蟾。
Introduction
为了保存和固定的目的，常规完成两栖动物的全身灌注1，2，3，4，5，6。然而，这些程序的发生速度限制了每只动物可以采集的新鲜样本数量。这项工作的目标是在非洲爪蟾中开发一种有效的血液灌注方案，优先考虑该技术的速度。对于热带X. laevis，每只动物需要不到10分钟，每只X. laevis动物需要不到15分钟。次要优先事项是易于复制和使用易于获取的设备，以便可以在非洲爪蟾实验室之间广泛共享高质量的样品。
非洲爪 蟾广泛用于生物医学研究，以研究跨物种保存的基本生物学和病理过程。这种四足动物与其他水生模型相比，与哺乳动物有更密切的进化关系，有肺、三腔心脏和带手指的四肢。国际社会有效地利用 非洲爪蟾 ，通过对疾病相关基因功能的深入疾病建模和分子分析，对人类疾病有了更深入的了解。 非洲爪蟾 作为动物模型的众多优点使其成为研究人类发育和疾病的分子基础的宝贵工具;这些优点包括：卵母细胞和胚胎大小大，繁殖力高，易于容纳，快速的外部发育以及易于基因组操作。据估计，非洲 爪蟾 共享~80%的已确定的人类疾病基因7。
与流行的哺乳动物模型相比，非洲爪蟾是一种快速、经济高效的模型，具有吗啉蛋白敲低的易用性，并且可以使用CRISPR8进行高效的转基因和靶向基因突变。定量质谱和单细胞转录组学已成功应用于非洲爪蟾胚胎9，10，但最近来自非洲爪蟾的细胞图谱显示，大多数组织的组成以血细胞11型为主。通过开发一种快速放血组织并使用冷却培养基的技术，样品新鲜度受灌注的影响最小。这对于以分析生理上不受干扰的mRNA或蛋白质表达为目标的应用尤其重要。
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Protocol
所有实验均按照哈佛医学院IACUC（机构动物护理和使用委员会）（IS 00001365_3）的规则和规定进行。
注意：尽管美国兽医协会12认为所描述的主要安乐死方法是一种可接受的安乐死技术，但尚未发现它会导致心跳停止13。即使是常用的二次双皮管方法也不能阻止这种情况，也不能从动物身上取出心脏。麻醉动物的放血被认为是成功安乐死的人道和有效的方法12.由于通过安乐死维持新鲜组织是该协议的目标，因此心脏继续通过MS-222的初级安乐死跳动是有益的，并且灌注本身是通过放血的继发性安乐死方法。
1. 准备
- 确保研究机构已批准本协议中描述的安乐死和灌注技术。
- 制备5 g / L MS-222（甲磺酸三卡因）和5 g / L碳酸氢钠的溶液。体积应大于完全覆盖被安乐死动物所需的体积。检查pH值以确保其为≥7。
- 每乳杆菌制备 500 μL 180 U/mL 肝素的磷酸盐缓冲盐水 （PBS），或每热带乳杆菌制备 200 μL。
- 通过将 非洲爪蟾 放入该溶液中进行初级安乐死（从步骤1.2开始）;动物将保持浸没状态总共1小时。
- 确认 非洲爪蟾 在安乐死后 15 分钟捏住脚失去了疼痛反应。如果动物有反应，请将其返回到安乐死溶液中，直到失去这种反应。
- 称量非洲爪蟾并在取样前进行所需的任何其他测量。
- 使用 31 G 针头，将 250 μL 的 X. laevis 和 100 μL 180 U/mL 肝素的 PBS（来自步骤 1.3）注射到每个前肢的肌肉组织中。
- 在PBS灌注液中制备1mL / g动物重量的54U / mL肝素溶液。对该方案更有经验的人可能会发现完成灌注所需的培养基更少。
- 使用 22 G 皮下注射针头灌注 X. laevis，使用 25 G 皮下注射针头灌注 热带弧菌。用线切割器修剪尖端，使灌注针变钝（图1）14。
注意：如果移动，这降低了针头穿过心室的可能性。除了钝化外，针头可能会用磨刀石或锉刀稍微磨碎，但仍保持足够锋利以刺穿心室。 - 通过连接修剪好的针头并循环 54 U/mL 肝素化 PBS 灌注物（从步骤 1.8 开始）来准备泵。确保清除管道中的所有气泡，以消除空气栓塞的可能性，这会导致灌注效率降低或失败（见 表1）。在手术过程中将灌注介质保持在冰上。
- 如果泵不可编程，请在针头就位的情况下，测量不同设置下的泵送介质体积，以确定哪些设置最接近 5 mL/min 和 10 mL/min。无论物种如何，都将使用这些流速。如果灌注泵是可编程的，请按照制造商的说明使用针头进行校准。
- 将解剖表面（托盘或泡沫板）放在辅助容器内的斜坡处，或将其布置以方便血液引流。
- 一旦青蛙在溶液中放置1小时，初级安乐死就完成了。取出青蛙，并通过捏脚重新检查疼痛反应的丧失。
- 将青蛙放在背部并固定每个肢体（图2）。如果需要保留四肢组织，可以通过四肢周围的手指或 U 形订书钉放置细针。
- 用解剖剪刀，切开皮肤，沿着中线向上，然后横向，做两个皮瓣。（图2）
- 使用镊子抓住白线并将其从腔腔中拉开（图3）。小心地用剪刀剪开肌肉组织。从腔壁上制作两个襟翼，并将所有襟翼切开或固定。
- 使用解剖剪刀切开喙骨并切掉多余的组织，以更好地进入心脏（图3）。
- 心脏应该还在跳动。如果心脏在灌注前停止跳动，请注意样品新鲜度已受到影响。
2. 灌注
- 识别胃并轻轻移动它，使其位于肝脏左叶的顶部（在观察者的右侧），其脉管系统在手术过程中可见。识别肺并使用组织钳抓住它的尖端。将肺拉出腔腔外并将其固定在尖端（图4）。轻轻地这样做，因为破裂的血管不能很好地灌注。注意叶内是否可见血液，因为这会影响确定手术完成的能力。
- 拍摄腔腔的图像，以更好地评估灌注效率，并可能在以后识别异常组织。
- 识别薄心包并用组织钳将其拉动（图5）。使用虹膜切除剪刀的尖端轻轻穿孔心包，注意不要切割下面的组织。将心包从心脏的三个腔室剥离。
- 用镊子轻轻抓住心室的顶点。施加有限的压力，以便在镊子的牵引表面之间有足够的空间供灌注针通过（图6）。
- 通过镊子的闭合将针头插入心室腔室，注意不要穿过心室（图7）。使用止血器使用持针器将组织钳夹到位。
注意：此技术可稳定针的位置，该位置仍然锋利。将针头直接夹在心室上也会造成不必要的损伤，如果需要重新夹紧，则使重新夹紧更加困难（见 表1）。 - 以大约 5 mL/min 的速度启动泵的流量。心脏和动脉干的三个腔室会充血（图8;见 表1）。
- 用剪刀小心地用右耳廓（在观看者的左侧）;鲜血会涌出。将流速设置为 5 mL/min 或增加到 10 mL/min。
- 继续直到胃的脉管系统变白（见 表1），然后刮起心脏的左耳廓（在观察者的右侧）。如果流速仍为 5 mL/min，请将其增加到大约 10 mL/min。
- 使用移液管冲洗灌注介质中的腔腔，以帮助保持可见性并更好地评估从耳廓流出的灌注液的颜色。
- 将针保持在原位，直到从耳廓流出的灌注液清除（见 表1）并且肺失去红色（见 表1; 图9）。
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Representative Results
成功灌注后，所有组织（色素沉着爪蟾中的肝脏除外）将明显变浅，血液饱和度较低。主要血管将变得不那么明显（图10），取样后组织（不包括肝脏）将在缓冲液中干净冲洗。虽然该方案的成功执行最终只能通过出血组织样本的数据质量来确认，但故障排除表中提供了几个典型问题、可能的原因和建议的补救措施（表1和图11）。
图 1：未修剪和修剪的针14. 使用剪线钳，切断针尖来钝化针头。它将足够锋利，可以刺穿心脏，但在人为错误的情况下，穿孔心室的可能性较小。 请点击此处查看此图的大图。
图2：成熟的雌性热带X.使用带齿的解剖钳拉扯泄殖腔附近的皮肤，用解剖剪刀将其穿孔并形成两个瓣。请点击此处查看此图的大图。
图3：肌肉壁。 腹侧皮肤开放但肌肉壁完好无损，可见白线。为了减少损坏下层组织的可能性，请在切割前抓住白线并将其拉动。喙骨通过腹膜可见。一旦腔腔被打开，这些骨头应该减少，以便更好地进入心脏。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：成熟雄性 热带榕的 腔 。喙骨已经减少，可以进入心包封闭的心脏。胃已移至肝脏左叶前方，其脉管系统清晰可见。左肺的尖端被其尖端拉出腔内并固定，以确保其在冲洗过程中不会回缩。 请点击此处查看此图的大图。
图5：心包。 心包是包裹心脏的一层薄而坚韧的膜。使用组织钳轻轻抓住心包，然后用虹膜切除剪刀的尖端将其穿孔。穿孔后，将其剥离，远离心脏。 请点击此处查看此图的大图。
图 6：心脏解剖学针放置图。 （A） X. laevis 心脏的腹侧图。（B）心脏图，取出心包，显示正确的针和夹子位置。请点击此处查看此图的大图。
图 7：心脏解剖结构和针头放置照片。 切除心包后，心脏和动脉干的三个腔室很容易看到。用镊子轻轻抓住心室的顶点，然后通过镊子插入针头。注意不要对心室或其他腔室造成不必要的损坏，因为这会影响灌注效率。 请点击此处查看此图的大图。
图8：灌注正在进行中。 右耳廓被切开，心室、动脉干和左耳廓明显充血。胃变白，从动物和肺组织流出的介质都被血液严重饱和。 请点击此处查看此图的大图。
图9：成功快速灌注和冲洗后的腔腔。 胃和其他器官的脉管系统不再容易看到。除非 非洲爪蟾 是白化病，否则肝脏将保持大量色素沉着。 请点击此处查看此图的大图。
图 10：来自未灌注和灌注的白化雄性 X. laevis 的组织样本。 血管系统的色素沉着和可见度的差异很明显。所有样品均在直径为3.5厘米的孔内。 请点击此处查看此图的大图。
图 11：非洲爪蟾心脏的故障排除图。 （A）心室有穿孔（红色）;这种穿孔被镊子隔离，不会影响灌注效率。（B）心室严重受损的心脏。针头可以引导到动脉干并夹紧到位。使用这种技术时，确保针头钝化尤为重要14.请点击此处查看此图的大图。
图12：评估白化病患者的灌注效率。在 （A） 和 （B） 快速灌注之前和之后的白化 X. laevis 。白化病使得确定灌注的熟练程度比在有色动物身上更容易。这在肺和肝组织中尤其明显。请点击此处查看此图的大图。
表 1：故障排除表。提供了几个典型问题、其可能的原因和建议的补救措施。请按此下载此表格。
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Discussion
该协议描述了用于进入腔腔的传统解剖技术。其他技术也是可以接受的，只要它们对组织造成的损害最小，心脏是可接近的，肺和胃是可见的。同样，列出的大多数解剖工具都可以很容易地用类似的项目代替。
虽然已经尝试优化该程序的功效，但结果可能会因一个人的经验和个体青蛙之间的变异性而异。血液灌注的一个有趣的方面仍然不在本文的范围之内，即该程序与接受手术的动物的替代灌注方式相比如何。另一个未探索的变量是血液灌注如何在非常年轻的动物或脉管系统可能过于脆弱的高龄动物中起作用。为便于本议定书的应用，提供了补充说明。 表 1 提供了几个典型问题、可能的原因和建议的补救措施。
该程序的局限性是灌注效率可能会受到其速度的负面影响。如果灌注效率优先于快速灌注，建议采用蝾螈技术1 （Saltman等人使用主动脉术语来指动脉干）。
手术的持续时间和所用培养基的体积取决于许多变量。一般来说， 热带X. tropicalis 雄性需要2-3分钟才能成功灌注15-25 mL培养基，而雌性X . tropicalis 需要3-4分钟才能成功灌注25-40 mL培养基。在灌注 X. laevis时，发现动物间的差异明显更多。虽然较高的流速会减少灌注大型动物所需的时间，但增加的管路压力很容易导致管接头脱落和泵故障。
当然，评估白化动物的灌注效率要容易得多。这种差异在肺和肝组织中尤其明显（图12）。因此，建议使用白化病，特别是在首次尝试灌注或接受训练时。
通过调整流速和针头尺寸，该方案适用于所有非洲 爪蟾物种。由于 非洲爪蟾 与大多数其他两栖动物15以及非鳄鱼爬行动物在心脏解剖学和血液循环方面的同源性，该技术可以修改为其他具有三腔心脏的模型的全身快速灌注16。如果使用非鳄鱼爬行动物模型，专门需要其中一个主动脉弓灌注，建议使用其他方案17。
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Disclosures
作者声明没有竞争利益。
Acknowledgments
这项工作得到了NIH的OD R24拨款OD031956和NICHD R01拨款HD073104的支持。我们感谢达西·凯利（Darcy Kelly）对该协议的有益讨论和初步意见。我们还要感谢Samantha Jalbert，Jill Ralston和Wil Ratzan的帮助和支持，以及我们的三位匿名同行评审员的反馈。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5x Magnifying glass with LED light and stand | amazon.com | B08QJ6J8P1 | light must not produce heat |
| Disposable transfer pipets | VWR | 414004-036 | |
| Dissecting fine-pointed forceps | Fisher Scinetific | 08-875 | |
| Dissecting scissors sharp piont, straight 6.5" | VWR | 76457-374 | |
| Dissection tray | Fisher Scinetific | 14-370-284 | styrofoam sheets are an acceptable alternative |
| Euthanasia container | US Plastic | Item 2860 | alternative opaque containers acceptable |
| Euthanasia container lid | US Plastic | Item 3047 | |
| Fine dissection pins | Living Systems Instrumentation | PIN-#3 | |
| General use hypodermic needles, 22 G | Fisher Scientific | 14-826-5A | for X. laevis |
| General use hypodermic needles, 25 G | Fisher Scientific | 14-826AA | for X. tropicalis |
| Heparin, porcine intestinal mucosa | MilliporeSigma | 37-505-410MG | |
| Iridectomy scissors 6" | vwr | 470018-938 | iris scissors are an acceptable alternative |
| Luer-to-barb adapter male Luer with lock ring | amazon.com | B09PTX6M2Z | size will be dependant on the hosing of the pump used |
| Mayo-Hegar needle holder | Fisher Scinetific | 08-966 | mosquito forceps are an acceptable alternative |
| MS-222: Syncaine (formerly tricaine) | Pentair AES | TRS1 | |
| PBS 1x | Corning | 21-040-CV | |
| Peristaltic liquid pump dosing pump 5–100 mL/min | amazon.com | B07PWY4SM6 | any peristaltic pump capable of pumping 5-10mL/min is acceptable |
| Sharpening stone | VWR | 470150-112 | optional; for dulling needles |
| Sodium bicarbonate, powder, USP | Fisher Scientific | 18-606-333 | |
| Specimen forceps, serrated | VWR | 82027-442 | |
| T-Pins for dissecting | Fisher Scinetific | S99385 | |
| Ultra-fine short insulin syringes, 31 G | VWR | BD328438 | |
| Wire flush cutters, 6-inch ultra sharp & powerful side cutter clippers | amazon.com | B087P191LP |
References
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