Summary
Denne protokol præsenterer et optimeret løsrevet bladbioassaysystem til evaluering af effektiviteten af entomopatogene svampe (EPF) mod sennepbladlus (Lipaphis erysimi (Kalt.)), Et parthenogenetisk insekt. Metoden skitserer dataindsamlingsprocessen under petriskålforsøg, hvilket gør det muligt for forskere konsekvent at måle virulensen af EPF mod sennepbladlus og andre parthenogenetiske insekter.
Abstract
Sennepbladlusen (L. erysimi) er et skadedyr, der angriber forskellige korsblomstrede afgrøder og overfører plantevirus. For at opnå miljøvenlig skadedyrsbekæmpelse er entomopatogene svampe (EPF) potentielle mikrobielle bekæmpelsesmidler til bekæmpelse af dette skadedyr. Derfor er virulensscreening af EPF-isolater under petriskålforhold nødvendig før feltpåføring. Imidlertid er sennepbladlusen et parthenogenetisk insekt, hvilket gør det vanskeligt at registrere data under petriskålforsøg. Et modificeret system til løsrevne blade bioassays blev udviklet for at løse dette problem ved hjælp af en mikrosprøjte til at inokulere konidier på bladlus og forhindre drukning ved at lette lufttørring efter sporesuspension. Systemet opretholdt høj relativ luftfugtighed i hele observationsperioden, og bladskiven forblev frisk i over ti dage, hvilket tillod parthenogenetisk reproduktion af bladlusene. For at forhindre opbygning af afkom blev der implementeret en proces med daglig fjernelse ved hjælp af en malebørste. Denne protokol demonstrerer et stabilt system til evaluering af virulensen af EPF-isolater mod sennepsbladlus eller andre bladlus, hvilket gør det muligt at vælge potentielle isolater til bladlusbekæmpelse.
Introduction
Sennepbladlusen (L. erysimi) er et berygtet skadedyr, der angriber en række korsblomstrede afgrøder, hvilket forårsager betydelige økonomiske tab1. Selv om flere systematiske insekticider er blevet anbefalet til bekæmpelse af bladlusangreb, giver den hyppige anvendelse af disse insekticider anledning til bekymring med hensyn til pesticidresistens 2,3. Med hensyn til miljøvenlig bekæmpelse af skadegørere kan entomopatogene svampe (EPF) derfor tjene som en passende alternativ bekæmpelsesstrategi. EPF er et insektpatogen med evnen til at inficere værter ved at trænge ind i deres neglebånd, hvilket gør det til et potent middel til bekæmpelse af bladlus og andre plantesugende insekter4. Desuden har EPF vist sig at være en gennemførlig og bæredygtig skadedyrsbekæmpelsesteknik, der tilbyder fordele såsom plantepatogenantagonisme og plantevækstfremme5.
EPF kan opnås gennem lokkemad til insektjord eller isoleres fra insektkadavere imarken 6,7. Før yderligere anvendelse af svampeisolater er patogenicitetsscreening imidlertid nødvendig. Der er foretaget flere undersøgelser af effektiviteten af EPF mod bladlus, som er betydelige afgrøde skadedyr, der kan forårsage alvorlig skade 8,9. Sennepbladlus, blandt forskellige arter af bladlus, er blevet testet for modtagelighed for flere stammer af Beauveria spp., Metarhizium spp., Lecanicillium spp., Paecilomyces spp. og endda Alternaria, som primært er kendt som en saprofytisk og plantepatogen svamp, men har vist nogle dødelige virkninger mod sennepbladlus10,11,12.
For at evaluere effektiviteten af EPF mod bladlus under laboratoriebetingelser kan bioassays opdeles i to hoveddele: podningskammeret og svampeinokulation. Den nuværende protokol beskriver konstruktionen af et podningskammer, hvor bladlus kan opretholdes ved hjælp af forskellige metoder såsom et udskåret blad med en petiole indpakket i fugtig bomuld, en udskåret bladskive med en petriskål foret med dæmpet filterpapir, direkte vedligeholdelse på potteplanter eller en udskåret bladskive indlejret i vandagar i en petriskål eller beholder10. 11,13. Almindelige metoder til svampeinokulation inkluderer konidisprøjtning, bladlusnedsænkning i en konidiasuspension, bladdypning i en konidiasuspension og planteendofytinokulation11,14,15,16. Mens der findes forskellige podningsmetoder, bør bioassays simulere feltanvendelsesbetingelser. For eksempel i tilfælde af bladdyppet metode12,17 kan effektiviteten af EPF evalueres, men da bladlusene angriber de svampebelastede blade, bliver bladlusens dorsale side, som er et præferentielt penetrationssted, normalt ikke udsat for svampen.
For at evaluere EPF's afdragicide virkning under laboratoriebetingelser foreslår denne protokol at anvende den løsrevne bladmetode beskrevet af Yokomi og Gottwald18 med nogle modifikationer efterfulgt af konidiainokulation ved hjælp af en mikrosprøjte. Denne metode opretholder ca. 100% fugtighed i bioassaykammeret i mindst syv dage uden at kræve yderligere genopfyldning af vand18,19. Derudover sikrer begrænsning af bladlus til en overflade, at de udsættes for konidier sprøjtning og letter observationer20. Imidlertid kan bladlus sidde fast i den udsatte agaroverflade, mens de bevæger sig inden for podningskammeret. Desuden kan registrering af data i petriskålforsøget med sennepsbladlus, som er parthenogenetiske insekter, være udfordrende på grund af deres hurtige udvikling og reproduktion. Det er vanskeligt at skelne mellem podede voksne og deres afkom uden fjernelse. Detaljerne om, hvordan man fortsætter med dette trin, nævnes sjældent, og nogle inkonsekvente faktorer, såsom bladforbrugsområde, skal optimeres.
Denne protokol demonstrerer et stabilt system til screening af virulensen af EPF-isolater mod sennepsbladlus, hvilket gør det muligt at vælge potentielle isolater mod forskellige bladlusarter fra et omfattende EPF-bibliotek. Markindsamlede bladlus kan identificeres, og der kan etableres en tilstrækkelig laboratoriepopulation af sennepbladlus til at evaluere den apididicide virkning af forskellige svampeisolater ved hjælp af en nem og gennemførlig metode med ensartede resultater. Bladlus har udviklet flere evolutionære mekanismer som reaktion på intenst og gentaget menneskeskabt pres i agroøkosystemer, hvilket udgør udfordringer for fødevaresikkerheden9. Derfor kan denne beskrevne metode udvides til at evaluere potentielle EPF-isolater mod forskellige bladlusarter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Det komplette rutediagram er vist i figur 1.
1. Opsamling og vedligeholdelse af sennepbladlus
- Indsamling af sennepbladlus
- Vend bladene og kontroller visuelt for angreb af sennepbladlus på korsblomstrede afgrøder i marken.
- Registrer oplysningerne om prøveudtagningsstedet (dvs. GPS) og værtsplanten/værtsplanterne, og bekræft historien om insekticidanvendelser med landbrugerne.
- Brug en insektaspirator eller en fin pensel (se materialetabel) til at samle ca. 50 sennepbladlus i et 50 ml centrifugerør fra korsblomstrede afgrøder i marken og bringe prøven til laboratoriet inden for 3 timer.
- Forbered en midlertidig vedligeholdelse petriskål med udskårne korsblomstrede blade og vandinfiltreret filterpapir i bunden.
- Placer de fem bladlus på den midlertidige vedligeholdelse petriskål under stuetemperatur (25 ± 2 ° C) med en relativ luftfugtighed på 70% og 12:12 h (lys: mørk) fotoperiode i 14 dage for at bekræfte, at bladlus skåner naturlig fjendefri før yderligere opdræt.
BEMÆRK: For at sikre, at markindsamlede bladlus er fri for naturlige fjender såsom parasitoide hvepse eller entomopatogene svampe, er det afgørende at bekræfte fraværet af disse organismer, før man fortsætter med yderligere opdræt.
- Vedligeholdelse af sennepbladlus
BEMÆRK: For at opretholde sennepbladlus skal du bruge pesticidfrie (inklusive biopesticid) korsblomstrede blade.- Sørg for en stabil og tilstrækkelig forsyning af korsblomstrede blade (ca. 25 cm2).
BEMÆRK: Få korsblomstrede blade enten fra markedet eller dyrk planterne. Før langsigtet, massiv opdræt af sennepbladlus kunne flere forskellige slags crucifer testes for at finde en passende korsfæster. Når arten af korsblomstbladet er fastgjort, skal du ikke ændre det. I dette studie blev Komatsuna (Brassica rapa var. perviridis) på 6-7-bladet stadium anvendt (se Tabel over materialer). Bortskaf desuden de 2-3 ældste blade. - Tilsæt vand, før filterpapiret i bunden er helt tørt.
- Overhold befolkningstætheden af sennepbladlusene dagligt. Befolkningen skal vokse til 2-3 gange efter 7 dage.
- Når antallet af bladlus stiger, skæres de oprindeligt udskårne blade med sennepbladlus i 4-6 mindre stykker og lægges hvert lille bladstykke med sennepbladlus i en petriskål med frisk udskåret blad og vandinfiltreret filterpapir.
- Placer petriskålen i en inkubator ved 25 ° C med en 12:12 h (lys: mørk) fotoperiode og observer befolkningstætheden af sennepbladlus dagligt.
- Fjern de oprindelige udskårne blade, efter at de fleste bladlus migrerer til friske udskårne blade, før de originale blade rådner.
- Sørg for en stabil og tilstrækkelig forsyning af korsblomstrede blade (ca. 25 cm2).
2. Molekylær identifikation af sennepbladlus
BEMÆRK: For at bekræfte arten af feltindsamlet sennepbladlus blev molekylær identifikation udført ved hjælp af to molekylære markører: sekvenskarakteriseret amplificeret region (SCAR) baseret A05Le designet af Lu et al.21 og sennepsbladluscytokromoxidase underenhed 1 (COI) region af sennepbladlusen.
- Ekstraktion af sennepbladlus genomisk DNA
- Saml ca. 50 bladlus i et 1,5 ml centrifugerør.
BEMÆRK: Bladlus, der anvendes til molekylær identifikation, skal være efterkommere af en enkelt bladlus, og forskellige stadier kan også samles i det samme rør til DNA-ekstraktion. - Homogeniser bladlusene med en pillestøder, og ekstraher DNA'et ved hjælp af Gene-Spin Genomic DNA Isolation Kit efter producentens anvisninger (se materialetabel).
- Eluer det genomiske DNA med 50 μL forvarmet nukleasefrit vand.
- Saml ca. 50 bladlus i et 1,5 ml centrifugerør.
- PCR-amplifikation og DNA-sekventering
- Forstærk mål-DNA-sekvenserne fra bladlusgenomisk DNA ved hjælp af PCR Master Mix (2x) med primerpar A05LeF/A05LeR og LeCO1F/LeCO1R (tabel 1) med forskellige PCR-programmer21.
BEMÆRK: PCR-reaktionen med et samlet volumen på 20 μL består af 2 μL bladlusgenomisk DNA-skabelon, 1 μL fremad og 1 μL omvendte primere, 10 μL PCR Master Mix (se materialetabel) og 6 μL ddH2O. - Udfør PCR i en termisk cyklist (se materialetabel) med følgende program: 94 °C i 5 minutter, 25 cyklusser med 94 °C i 45 sekunder, 61 °C (for A05LeF/A05LeR) og 58 °C (for LeCO1F/LeCO1R) i 45 sekunder, 72 °C i 1 min, efterfulgt af en endelig forlængelse på 72 °C i 5 minutter.
- Analyser PCR-produktet med 1% agarosegelelektroforese for at bekræfte sennepbladlusens identitet (figur 2).
BEMÆRK: Hvis primerparret A05LeF/A05LeR med succes forstærker den korrekte størrelse af DNA-fragmentet, har det overbevisende identificeret den feltopsamlede bladlus som sennepsbladlus21. Primerparrene er angivet i tabel 2. - Rens PCR-produktet af sennepsbladlus COI-amplicon ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt gel/PCR-sæt efter producentens anvisninger (se materialetabellen), og sekvenser PCR-produktet ved hjælp af en kommerciel sekventeringstjeneste.
- Forstærk mål-DNA-sekvenserne fra bladlusgenomisk DNA ved hjælp af PCR Master Mix (2x) med primerpar A05LeF/A05LeR og LeCO1F/LeCO1R (tabel 1) med forskellige PCR-programmer21.
- Sekvens analyse
BEMÆRK: Ifølge Lu et al.21 er DNA-bøjningen af A05Le et sennepbladlusspecifikt DNA-fragment; derfor behøver A05Le PCR-produktet ikke at blive sekventeret yderligere.- Kontroller læsekvaliteten af Chromas-software (se materialetabel) efter opnåelse af LeCO1-sekvensen.
- Trim opstrøms og nedstrøms læsninger af lav kvalitet ved at åbne en fasta (eller txt) fil og direkte fjerne læsninger af lav kvalitet.
- Indsend den trimmede sekvens til NCBI web BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) ved hjælp af standardparametre.
BEMÆRK: Hvis amplicon størrelserne på A05Le og LeCO1 primersæt er korrekte, teoretisk set, skal sekvensblastsøgningen mod NCBI-standarddatabaser matche sennepsbladlus.
3. Fremstilling af entomopatogene svampe
BEMÆRK: Den EPF, der anvendes i denne undersøgelse, er anført i tabel 1.
- Gendannelse af EPF fra svampebibliotek
- Den konserverede svampebestand (konidier suspenderet i 30% glycerin) optøes fra -80 °C fryseren.
- En lille mængde (ca. 10 μL) af conidia suspensionen overføres til 6 cm 1/4 Sabouraud dextrose agar (SDA) plade (0,75 g Sabouraud dextrose bouillon med 1,5 g agar pr. 100 ml ddH2O) og spredes jævnt ved hjælp af en cellespreder i en laminar strømningshætte.
- Petrifdet forsegles med paraffinfilm, og det inkuberes i mørke ved 25 °C i 10-14 dage.
- Svampeisolaterne dyrkes igen ved at stribe svampemasse på en 1/4 SDA-plade og inkubere svampe i mørke ved 25 °C i 10-14 dage, før konidierne22 høstes.
BEMÆRK: Svampekulturen skal bruges ca. 10 dage før podning af bladlusene. EPF-kultur, der er mere end 14 dage gammel, anbefales ikke til brug i virulenstesten.
- Fremstilling af conidia suspension
- Skrab konidierne fra den 10-14 dage gamle svampekultur på 1/4 SDA-plade ved podningssløjfe efter tilsætning af 2-3 ml 0,03% Tween 80 (se materialetabel).
- Opsaml svampesuspensionen i et centrifugerør.
- Vortex opløsningen med højeste hastighed, tæl antallet af konidier ved hjælp af et hæmocytometer under et lysmikroskop, og juster koncentrationen af konidier suspension til 108 konidier / ml.
- Overfør conidia suspensionen til en UV-steriliseret mikrosprøjte.
BEMÆRK: Vortex conidia suspensionen igen, før du overfører den, da konidierne er tilbøjelige til at udfælde. Mikrosprøjten skal udsættes for ultraviolet stråling i en laminar strømningshætte i 30 minutter før brug.
4. Virulensscreening mod sennepbladlus
- Forberedelse af nyopståede voksne
- Flyt apterous (uden vinge) og alate (winged) voksne fra opdræt petriskål til frisk udskårne blade for at reproducere nye afkom i samme alder. Fjern de voksne efter 24 timer for at undgå overbelægning og minimere produktionen af alated afkom23,24. Kun egnede voksne vil blive brugt i yderligere eksperimenter.
- Bageste afkom til voksenstadiet og fjern afkom, der ikke udvikler sig til voksenstadiet efter 48 timer (figur 3) for at forhindre aldersvariation mellem bladlus til forsøget. Fjern desuden alated voksne.
- Forberedelse af podningskammer
BEMÆRK: Det anbefales at forberede korsblomstrede blade med en diameter på 9 cm først, så bladskiven kan indlejres i vandagaren inden størkning.- Rens korsblomstrede blade med ledningsvand, fjern snavs og rester og andre leddyr, hvis de er til stede.
- Tør overskydende vand væk med et papirhåndklæde og kontroller for andre leddyr på overfladen af korsblomstrede blade ved hjælp af et stereomikroskop. Fjern eventuelle leddyr, hvis de er til stede.
- Klip en bladskive med en diameter på 9 cm enten ved direkte at trykke det nederste petrifad på bladet som en form eller ved hjælp af en saks.
BEMÆRK: Hvis bladene er mindre end 9 cm i diameter, kombineres et par udskårne blade. - Forbered 1,5% vandagar til hver petriskål ved opvarmning og opløsning af 450 mg agar (se materialetabel) i 30 ml ddH2O ved hjælp af mikrobølgeovn.
BEMÆRK: Mængden af 1,5% vandagar kan justeres afhængigt af eksperimentskalaen. - Hæld 30 ml 1,5% vandagar i 9 cm petriskålen før størkning i laminar flow-emhætten, og vent derefter på, at agaren køler ned til ~40 °C, indtil agarens overflade er halvstørknet.
BEMÆRK: Kontroller, om overfladen er halvstørknet ved forsigtigt at ryste petriskålen vandret. - Placer bladskiven, abaxial overflade op, oven på vandagaren, og indlejr bladskiven i agaren.
BEMÆRK: Minimer eksponeringen af agaroverfladen. - Når vandagaren er størknet helt, skal du lukke dækslet på petriskålen.
BEMÆRK: Åbn dækslet for vandfordampning, hvis mange dråber kondenserer på dækslet med det samme. - Placer 20 apterøse voksne på bladskiven.
BEMÆRK: Det anbefales at operere under et stereomikroskop for at forhindre beskadigelse af deres munddele.
- EPF-podning og observation
- Åbn dækslet til podningskammeret og sprøjt 0,3 ml konidier suspension (fra trin 3.2) direkte på bladlus og bladskive fra ca. 15 cm over bladskiven.
BEMÆRK: Vortex conidia suspensionen igen før sprøjtning. Sprøjteområderne bør testes før forsøget, da de kan variere mellem forskellige sprøjter. I dette tilfælde anbefales 0,3 ml med 15 cm afstand. Sprøjteområdet skal dække hele bladskiven, og et tyndt lag conidia suspension skal dække bladskiven. Hvis dråber konvergerer til stående vand på bladet, skal podningsvolumenet reduceres. Rengør bordet med 70% ethanol før podning og mellem forskellige isolater. - Vent til conidia suspensionen tørrer, og luk derefter dækslet for at forhindre sennepbladlus i at drukne.
BEMÆRK: Bladlus strejfer sjældent rundt under eksperimentet; Det er dog stadig nødvendigt at sikre, at bladlusene ikke undslipper. - Podningskammeret forsegles med paraffinfilm for at opretholde en høj relativ luftfugtighed, og podningskammeret anbringes i en inkubator ved 25 °C med en fotoperiode på 12:12 timer (lys:mørk).
- Åbn dækslet til podningskammeret for at tælle dødeligheden under et stereomikroskop hver 12. time i 5 dage.
- Tør honningduggen, der klæber til dækslet, ud med et papirhåndklæde, og fjern de nyligt fremkomne bladlus med en fin malebørste. Rengør dækslet med ledningsvand hver 24. time.
BEMÆRK: Observationsperioden kan variere for forskellige arter af bladlus baseret på voksen levetid. - Hold kadaveret på bladskiven for mykose for at bekræfte vellykket podning.
- Åbn dækslet til podningskammeret og sprøjt 0,3 ml konidier suspension (fra trin 3.2) direkte på bladlus og bladskive fra ca. 15 cm over bladskiven.
- Bekræftelse af konidier spiringshastighed
BEMÆRK: Dette trin er valgfrit. For at bekræfte konidiernes spiringshastighed parvis, når virulensscreeningen udføres for at sikre konidiernes aktivitet.- Dråbe 5 μL konidier suspension på 1/4 SDA for tre replikater.
- Efter 18 timer beregnes spiringshastigheden med lysmikroskopet. Tæl mindst 100 sporer tilfældigt i en enkelt dråbe for at bekræfte svampespiringshastigheden.
BEMÆRK: Normalt bør spireevnen for isolater, der anvendes i forsøget, være højere end 90%.
5. Bioassay af udvalgte EPF-isolater
BEMÆRK: EPF-isolater, der viste høj virulens, som blev valgt fra trin 4, blev udsat for et bioassay mod sennepbladlus ved hjælp af fire koncentrationer af konidier suspensioner (fra 104 til 107 konidier / ml).
- Fremstilling af conidia suspension
- Gentag trin 3.1 for at gendanne de valgte EPF-isolater.
- Gentag trin 3.2 for at fremstille fire koncentrationer af conidia suspension, herunder 104, 105,10 6 og 107 konidier/ml.
- Forberedelse af nyopståede voksne
- Gentag trin 4.1 for at forberede nyligt fremkomne voksne.
- Forberedelse af podningskammer
- Gentag trin 4.1. at forberede podningskammeret.
- EPF-podning og observation
- Gentag trin 4.3. at udføre EPF-podning og observation med de fire koncentrationer af henholdsvis conidia suspension.
6. Statistisk analyse
- Beregning af korrigeret dødelighed
- Beregn korrigeret dødelighed ved hjælp af Abbotts formel25, som vist nedenfor:
Korrigeret dødelighed (%) = [(MT− M C) × 100%] / (100− MC)
MT repræsenterer dødeligheden i behandlingsgruppen, og MC repræsenterer dødeligheden i kontrolgruppen.
BEMÆRK: Dødeligheden i kontrolgruppen bør ikke være højere end 20%. - Åbn SPSS-softwareplatformen (se materialetabellen), opret variabler, herunder "behandling" og "cor_mor" (repræsenterer korrigeret dødelighed), og indtast de beregnede resultater for podning af forskellige isolater på samme tidspunkt med samme podede koncentration.
- Vælg Analyser, Sammenlign gennemsnit og proportioner, Uafhængige prøver T-test i SPSS til uafhængig t-testanalyse .
- I SPSS skal du indtaste behandling i feltet "Grupperingsvariabel" og cor_mor ind i "Testvariabel (er)". Definer grupper efter forskellige svampeisolater. Tryk på OK for at analysere.
- Beregn korrigeret dødelighed ved hjælp af Abbotts formel25, som vist nedenfor:
- Beregning af median letal tid (LT 50) og median lethal koncentration (LC50)
- Åbn SPSS, opret variabler "total", "respons" og "varighed" / "koncentration", og indtast det registrerede resultat i regnearket.
- Vælg Analyser, Regression, Probit i SPSS for at beregne LT 50 og/eller LC50.
BEMÆRK: Hvis den kumulative dødelighed ikke overstiger 50 % i sidste ende, kan LT 50 og/eller LC50 ikke estimeres. - Indtast total i feltet "Samlet observeret", svar i feltet "Responsfrekvens", varighed/koncentration i feltet "Kovariat(er)". Tryk på OK for at analysere.
BEMÆRK: Tryk generelt på Valg , og indstil "Signifikansniveau for brug af heterogenitetsfaktor" til 0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det præsenterede rutediagram illustrerer sennepbladlusens stabile tilstand fra feltindsamling til virulensscreening. Vedligeholdelsen af bladlus fra feltopsamling sikrede en stabil stigning i bladluskolonier med en tilstrækkelig fødevareforsyning. De markindsamlede bladlus blev bekræftet som sennepsbladlus ved brug af molekylære markører, herunder PCR-amplikonstørrelse og LeCO1-sekventering. Virulensscreeningen, der blev udført ved hjælp af løsrevet bladmetoden, afslørede en konsekvent overlevelsesrate for sennepbladlus, hvor kontrolgruppen udviste en overlevelsesrate på 85% (figur 4).
Under virulensscreeningen viste Cc-NCHU-213 den hurtigste bladlusdræbende evne, hvilket resulterede i henholdsvis 50% og 90% dødelighed efter 3 dage og 4,5 dage efter podning (d.p.i.) (figur 4). Der blev dog observeret varierende bladlusdræbende evner blandt de fem B. bassiana-isolater. Bb-NCHU-141, -143 og -153 udviste langsomme bladlusdræbende evner, med kun 5% dødelighed ved 3 d.p.i., selv når man udelukker virkningerne af 0,03% Tween 80 sprøjtning eller andre dødelige faktorer (figur 4). Derfor blev den korrigerede dødelighedsformel anvendt til at normalisere kontroldødeligheden. De fleste EPF-isolater mod sennepsbladlus udviste korrigerede dødelighedsrater højere end 70% inden for 5 d.p.i., undtagen Pl-NCHU-152 (tabel 3). Blandt disse EPF-isolater viste Bb-NCHU-286 den højeste dødelighed på 100 % (tabel 3). Derudover blev EPF mycosis observeret på kadavere af sennepbladlus inficeret med Metarhizium spp., Beauveria spp., Purpureocillium lilacinum og Cordyceps cateniannulata under virulensscreeningen, hvilket indikerer effektiviteten af dette system (figur 5).
Baseret på resultaterne af virulensscreeningen blev to EPF-isolater, nemlig Mb-NCHU-197 og Cc-NCHU-213, der udviser hurtig insektdræbende aktivitet (henholdsvis 40% og 50% dødelighed ved 3 d.p.i.), udvalgt til bioassay mod sennepbladlus. Resultaterne viste signifikant forskellige korrigerede mortaliteter for Mb-NCHU-197 og Cc-NCHU-213 ved 3 og 4 dpi med en podning på 107 konidier / ml (figur 6). I LT50-analysen udviste behandlingen med 107 konidier / ml Cc-NCHU-213 en signifikant kortere varighed sammenlignet med andre behandlinger (tabel 4). Desuden var LC50-værdien af Cc-NCHU-213 (9,32 × 104) lavere end Mb-NCHU-213 (2,30 × 10 5), hvilket indikerer, at Cc-NCHU-213 har større virulens mod sennepbladlus (tabel 5).
Figur 1: Eksperimentelt rutediagram til screening af EPF-virulens mod sennepsbladlus . (A) Etablering af et sennepsbladlusproduktionssystem. b) Udarbejdelse af fredsfaciliteten. c) Svampepodning. (D) Statistisk analyse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Elektroforese af sennepbladlus genomisk DNA amplificeret med A05Le og Le CO1 primersæt. Elektroforese blev udført på en 1% agarosegel. M = 100 bp DNA-stige; bp = basepar. Den røde stjerne angiver målbøjningen af PCR-forstærkning. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Forskelle mellem apterous fjerde instar nymfe og voksne sennep bladlus . (A) Nymfe med fjerde stjerne. (b) Voksen. Tibiae af bagbenene på den fjerde instar nymfe er hvidlige (markeret med rød pil). Nyopståede bladlus blev fjernet med fin kamelbørste under virulenstest. Vægtstang = 1 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Dødelighedsvarmekort over 13 EPF-isolater mod sennepsbladlus ved løsrivelsesmetoden. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Observation af svampemykose af 13 EPF-isolater. Mepe-NCHU-2 = Metarhizium pemphigi; Mp-NCHU-11 = Metarhizium pinghaense; Mb = Metarhizium baoshanense; Cc = Cordyceps cateniannulata; Ba = Beauveria australis; Bb = Beauveriabassiana; Pl = Purpureocillium lilacinum. Vægtstang = 1 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Korrigeret dødelighed af svampeisolaterne Mb-NCHU-197 og Cc-NCHU-213 mod sennepsbladlus. Fejlbjælkerne repræsenterer standardafvigelsen (SD). Dødeligheden af Mb-NCHU-197 og Cc-NCHU-213 på samme tidspunkt med samme podede koncentration blev sammenlignet ved hjælp af uafhængig t-test, og dødeligheder markeret med en stjerne viste sig at være signifikant forskellige (p < 0,05). Klik her for at se en større version af denne figur.
| Isolere | Art | Vært eller kilde* | Sted |
| Mp-NCHU-2 | Metarhizium pemphigi | jord | Yilan |
| ML-NCHU-9 | Metarhizium lepidiotae | jord | Yilan |
| MP-NCHU-11 | Metarhizium pinghaense | jord | Yilan |
| Ba-NCHU-113 | Beauveria australis | jord | Taichung |
| BB-NCHU-141 | Beauveria bassiana | Hypothenemus hampei | Chiayi |
| BB-NCHU-143 | Beauveria bassiana | Hypothenemus hampei | Chiayi |
| PL-NCHU-152 | Purpureocillium lilacinum | Tessaratoma papillosa | Chiayi |
| BB-NCHU-153 | Beauveria bassiana | Rhynchophorus ferrugineus | Chunghua |
| BB-NCHU-157 | Beauveria bassiana | Rhynchophorus ferrugineus | Chunghua |
| MB-NCHU-196 | Metarhizium baoshanense | jord | Taichung |
| MB-NCHU-197 | Metarhizium baoshanense | jord | Taichung |
| CC-NCHU-213 | Cordyceps cateniannulata | jord | Taichung |
| BB-NCHU-286 | Beauveria bassiana | Cerambycidae | Taichung |
Tabel 1: EPF-isolater anvendt i dette studie.
| Primer navn | Sekvens (5' - 3') | Produktstørrelse (bp) | Henvisning | |
| A05Le | F-GGGTCTTGGATGGTGTGTGGTG | 953 | Lu et al. [21] | |
| R-AGGGGTCTTGTCGCCATTTT | ||||
| LeCO1 | F-CTTTTCCCATGATCAATTTT | 593 | Denne undersøgelse | |
| R-ACGTAGTGGAAATGAGCAAC | ||||
Tabel 2: Primerpar anvendt til molekylær identifikation af sennepbladlus.
| Isolere | Art | Korrigeret dødelighed (%) |
| Mp-NCHU-2 | Metarhizium pemphigi | 76.47 |
| ML-NCHU-9 | Metarhizium lepidiotae | 82.35 |
| MP-NCHU-11 | Metarhizium pinghaense | 76.47 |
| Ba-NCHU-113 | Beauveria australis | 82.35 |
| BB-NCHU-141 | Beauveria bassiana | 88.24 |
| BB-NCHU-143 | Beauveria bassiana | 88.24 |
| PL-NCHU-152 | Purpureocillium lilacinum | 35.29 |
| BB-NCHU-153 | Beauveria bassiana | 82.35 |
| BB-NCHU-157 | Beauveria bassiana | 88.24 |
| MB-NCHU-196 | Metarhizium baoshanense | 76.47 |
| MB-NCHU-197 | Metarhizium baoshanense | 88.24 |
| CC-NCHU-213 | Cordyceps cateniannulata | 94.12 |
| BB-NCHU-286 | Beauveria bassiana | 100.00 |
Tabel 3: Korrigeret dødelighed af 13 EPF-isolater mod sennepsbladlus 5 dage efter podning (d.p.i.).
| Isolere | Art | Konc.(conidier/ml) | N* | LT50 (dage)† | 95% konfidensgrænser | Hældning (SE) | X2 (df)‡ |
| MB-NCHU-197 | Metarhizium baoshanense | 104 | 60 | 3.816 a | 3.61–4.05 | 0.60 (0.05) | 15.64 (28) |
| 105 | 60 | 3.112 BD | 2.95–3.28 | 0.72 (0.05) | 14.61 (28) | ||
| 106 | 60 | 2.908 b | 2.76–3.06 | 0.85 (0.06) | 15.04 (28) | ||
| 107 | 60 | 2,549 c | 2.40–2.69 | 0.90 (0.06) | 24.31 (28) | ||
| CC-NCHU-213 | Cordyceps cateniannulata | 104 | 60 | 3.948 a | 3.71–4.23 | 0.53 (0.05) | 8.81 (28) |
| 105 | 60 | 3.237 D | 3.07–3.41 | 0.72 (0.05) | 22.86 (28) | ||
| 106 | 60 | 2,414 c | 2.28–2.54 | 1.08 (0.07) | 28.30 (28) | ||
| 107 | 60 | 2.132 e | 2.02–2.25 | 1.41 (0.10) | 28.96 (28) | ||
| *Antal observerede insekter. | |||||||
| †LT50-værdier markeret med forskellige bogstaver blev betragtet som signifikant forskellige, da deres 95% konfidensgrænser ikke overlappede hinanden. | |||||||
| ‡X2, Chi-kvadratisk værdi i Pearsons goodness-of-fit-test; DF, frihedsgrader | |||||||
Tabel 4: LT50-værdier af svampeisolater Mb-NCHU-197 og Cc-NCHU-213 mod sennepbladlus under forskellige konidikoncentrationer. *Antal observerede insekter. †LT50-værdier markeret med forskellige bogstaver blev betragtet som væsentligt forskellige, da deres 95% konfidensgrænser ikke overlappede hinanden. ‡X2, Chi-kvadratisk værdi i Pearsons goodness-of-fit-test; DF, frihedsgrader.
| Isolere | Art | N* | LC50 (konidier/ml)† | 95% konfidensgrænser | Slpoe (SE) | X2 (df)‡ |
| MB-NCHU-197 | Metarhizium baoshanense | 240 | 2.30 × 105 a | 8,63 × 104–5,70 × 105 | 0.43 (0.08) | 10.14 (10) |
| CC-NCHU-213 | Cordyceps cateniannulata | 240 | 9.32 × 104 a | 4,97 × 104–1,62 × 105 | 0.76 (0.09) | 4.33 (10) |
| *Antal observerede insekter. | ||||||
| †LC50-værdier markeret med forskellige bogstaver blev betragtet som signifikant forskellige, da deres 95% konfidensgrænser ikke overlappede hinanden. | ||||||
| ‡X2, Chi-kvadratisk værdi i Pearsons goodness-of-fit-test; DF, frihedsgrader | ||||||
Tabel 5: LC 50-værdier for svampeisolater Mb-NCHU-197 og Cc-NCHU-213 mod sennepbladlus. *Antal observerede insekter. †LC50-værdier markeret med forskellige bogstaver blev betragtet som væsentligt forskellige, da deres 95% konfidensgrænser ikke overlappede hinanden. ‡X2, Chi-kvadratisk værdi i Pearsons goodness-of-fit-test; DF, frihedsgrader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Korsblomstrer, en gruppe grøntsager, er ofte angrebet af flere bladlusarter, herunder sennepbladlus (L. erysimi) og kålbladlus (Brevicoryne brassicae)26. Begge arter er blevet rapporteret i Taiwan27, og det er muligt for dem at sameksistere på indsamlingsstedet. For at skelne nært beslægtede bladlusarter anvendte denne undersøgelse en molekylær identifikationsteknik ved hjælp af et multiplexprimersæt21. Ved at designe en molekylær markør fra sennepsbladlusens COI-genfragment identificerede vi sennepsbladlusen med succes og bekræftede dermed pålideligheden af molekylmarkøren A05Le til dette formål21.
Observationerne afslørede, at det er udfordrende at skelne mellem apterøse fjerde stjernenymfer og voksne sennepbladlus udelukkende baseret på deres størrelse eller morfologi uden erfaring. Et afgørende kendetegn er imidlertid skinnebenet på bagbenene, som ser hvidt ud hos fjerdestjernenymfer, men ikke hos voksne (figur 3). Tidligere undersøgelser af L. attenuatum, B. bassiana mod bomuldsbladlus og M. brunneum mod grønne ferskenbladlus har vist, at smeltning kan være en strategi for at undgå infektion28,29,30. Derfor kan fejlidentifikation af bladlusstadier føre til fejl i virulensvurderingen, da smeltning kan påvirke effektiviteten af EPF28,29,31. For at løse dette problem og sikre større nøjagtighed og præcision i virulensevaluering skal du udelukke bladlus med hvidlige dele på deres bagbens skinneben, der ikke har nået voksenstadiet, medmindre de bevidst bruger bladlusnymfer. Disse bladlus modnes ikke fuldt ud og kan gennemgå smeltning, hvilket kan give dem mulighed for at undslippe infektionsprocessen af EPF. Derudover anbefales et tidsforløb med observation og dataregistrering hver 12. time. Intervallet på 12 timer er at foretrække til at påvise forskelle mellem flere lovende isolater med lignende bladlusdræbende egenskaber og letter den præcise beregning af LT50. Tidsintervallet kan dog justeres baseret på andre insektarters forskellige livscyklusser eller bestemmes gennem en lille prætest.
Selvom løsbladsmetoden kan efterlade minimal honningdug på bladskiven, klæber det meste af honningduggen til petriskåldækslet, da bladskiven er i nærheden. Det kan tørres af eller vaskes væk i observationsperioden. Imidlertid er honningdug utvivlsomt til stede i det praktiske miljø for afgrødedyrkning, når bladlus invaderer32. Den honningdug, der er til stede i podningskammeret, kan noget simulere situationen, når EPF podes i bladlus i marken. Bladlusneglebånd indeholder for det meste honningdug, som tjener som en kilde til næringsstoffer til svampen og kan stimulere spiring af EPF16. Således kan kombinationen af EPF-applikation og honningdugproduktion af bladlus være fordelagtig.
For at bekræfte, at bladlusdød skyldes infektion, overføres kadavere typisk fra EPF-podningskammeret til fugtigt filterpapir eller et dyrkningsmedium til observation af svampeudvækst 11,14,33,34. I denne undersøgelse blev vandagar imidlertid brugt i podningskammeret for at opretholde høj luftfugtighed, hvilket gjorde det muligt for bladluskadavere at forblive på bladene uden at skulle flyttes til observation af svampeudvækst. Selvom løsbladsmetoden giver information om EPF-isolaters afdragsdræbende virkning, har den stadig begrænsninger. Vandagaren, der bruges til at opretholde bladskivens tilstand, kan få bladlus til at sidde fast, mens de bevæger sig i podningskammeret. For at løse dette problem blev procentdelen af vandagar øget til 3%, hvilket gav en fast nok overflade til, at russiske hvedebladlus (Diuraphis noxia) kunne gå på20. I dette forsøg var sennepbladlus i stand til at bevæge sig komfortabelt på vandagaroverflader med koncentrationer fra 1,5% til 3%. Men som observationsperioden skred frem, blev nogle få bladlus fast på hovedet med benene opad og måtte reddes tilbage til bladskiven. Dette kan skyldes forskellene i bladlusstørrelse eller mobilitet, hvilket indikerer, at forøgelse af agarkoncentrationen alene muligvis ikke løser problemet. Sørg derfor for, at bladskiven dækker agaroverfladen helt ved at bruge et blad, der passer tættere til petriskålens størrelse, hvilket kan hjælpe med at afhjælpe dette problem. I sammenligning med løsrevningsbladmetoden beskrevet af Yokomi og Gottwald18 har denne undersøgelse forbedret et aspekt ved at bruge en bladstørrelse, der passer omtrent godt til petriskålen. Dette giver mulighed for relativ kvantificering af fødevareforbruget og minimerer den eksponerede agaroverflade. Derudover skal bladet "indlejres" i den halvstørknede vandagar, mens det i den oprindelige reference blev beskrevet som "placeret" på vandagaren18. Indlejring af bladskiven i vandagaren reducerer sandsynligheden for, at bladlus sidder fast på agaroverfladen og letter observation, da bladlusene er begrænset til den ene side.
Denne protokol giver detaljerede instruktioner om, hvordan man fortsætter med løsrevet bladmetode og EPF-podning sammen med nogle ændringer, der har lettet operationer, observationer og konsistente resultater. Det fastlægger også en standardiseret metode til udvælgelse af EPF-isolater mod plantesugende skadedyr under laboratorieforhold. Desuden kan der udføres en standardkontrol med kendte effektive eller kommercielt tilgængelige produkter til fremtidig kommercialisering af EPF-isolater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at der ikke er nogen interessekonflikt involveret i dette arbejde.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af 109-2313-B-005 -048 -MY3 fra Ministeriet for Videnskab og Teknologi (MOST).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 μL Inoculating Loop | NEST Scientific | 718201 | |
| 100 bp DNA Ladder III | Geneaid | DL007 | |
| 2x SuperRed PCR Master Mix | Biotools | TE-SR01 | |
| 50 mL centrifuge tube | Bioman Scientific | ET5050-12 | |
| 6 cm Petri dish | Alpha Plus Scientific | 16021 | |
| 6 mm insect aspirator | MegaView Science | BA6001 | |
| 70 mm filter paper NO.1 | Toyo Roshi Kaisha | ||
| 70% ethanol | |||
| 9 cm Petri dish | Alpha Plus Scientific | 16001 | |
| Agar | Bioman Scientific | AGR001.1 | Microbiology grade |
| Agarose | Bioman Scientific | PB1200 | |
| BioGreen Safe DNA Gel Buffer | Bioman Scientific | SDB001T | |
| Chromas | Technelysium | ||
| GeneDoc | |||
| GenepHlow Gel/PCR Kit | Geneaid | DFH300 | https://www.geneaid.com/data/files/1605861013102532959.pdf |
| Gene-Spin Genomic DNA Isolation Kit | Protech Technology | PT-GD112-V3 | http://www.protech-bio.com/UserFiles/file/Gene-Spin%20Genomic%20DNA%20Kit.pdf |
| Hemocytometer | Paul Marienfeld | 640030 | |
| Komatsuna leaves (Brassica rapa var. perviridis) | Tai Cheng Farm | 1-010-300410 | |
| Microsprayer | |||
| MiniAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A37834 | |
| Mustard aphid (Lipaphis erysimi) | |||
| Painting brush | Tian Cheng brush company | 4716608400352 | |
| Parafilm M | Bemis | PM-996 | |
| Pellet pestle | Bioman Scientific | GT100R | |
| Sabouraud Dextrose Broth | HiMedia | MH033-500G | |
| SPSS Statistics | IBM | ||
| TAE buffer 50x | Bioman Scientific | TAE501000 | |
| Tween 80 | PanReac AppliChem | 142050.1661 |
References
- Ghosh, S., Roy, A., Chatterjee, A., Sikdar, S. R. Effect of regional wind circulation and meteorological factors on long-range migration of mustard aphids over indo-gangetic plain. Scientific Reports. 9, 5626 (2019).
- Dhillon, M. K., Singh, N., Yadava, D. K. Preventable yield losses and management of mustard aphid, Lipaphis erysimi (Kaltenbach) in different cultivars of Brassica juncea(L.) Czern & Coss. Crop Protection. 161, 106070 (2022).
- Huang, F., Hao, Z., Yan, F. Influence of oilseed rape seed treatment with imidacloprid on survival, feeding behavior, and detoxifying enzymes of mustard aphid, lipaphis erysimi. Insects. 10 (5), 144 (2019).
- Mannino, M. C., Huarte-Bonnet, C., Davyt-Colo, B., Pedrini, N. Is the insect cuticle the only entry gate for fungal infection? insights into alternative modes of action of entomopathogenic fungi. Journal of Fungi. 5 (2), 33 (2019).
- Bamisile, B. S., Akutse, K. S., Siddiqui, J. A., Xu, Y. Model application of entomopathogenic fungi as alternatives to chemical pesticides: prospects, challenges, and insights for next-generation sustainable agriculture. Frontiers in Plant Science. 12, 741804 (2021).
- Scorsetti, A. C., Humber, R. A., Garcia, J. J., Lopez Lastra, C. C. Natural occurrence of entomopathogenic fungi (Zygomycetes: Entomophthorales) of aphid (Hemiptera: Aphididae) pests of horticultural crops in Argentina. Biocontrol. 52, 641-655 (2007).
- Liu, Y. C., Ni, N. T., Chang, J. C., Li, Y. H., Lee, M. R., Kim, J. S., et al. Isolation and selection of entomopathogenic fungi from soil samples and evaluation of fungal virulence against insect pests. Journal of Visualized Experiments. 175, e62882 (2021).
- Francis, F., Fingu-Mabola, J. C., Fekih, I. B. Direct and endophytic effects of fungal entomopathogens for sustainable aphid control: a review. Agriculture. 12 (12), 2081 (2022).
- Simon, J., Peccoud, J. Rapid evolution of aphid pests in agricultural environments. Current Opinion in Insect Science. 26, 17-24 (2018).
- Ujjan, A. A., Shahzad, S. Use of Entomopathogenic Fungi for the Control of Mustard Aphid (Lipaphis erysimi) on canola (Brassica napus L). Pakistan Journal of Botany. 44 (6), 2081-2086 (2012).
- Sajid, M., Bashir, N. H., Batool, Q., Munir, I., Bilal, M., Jamal, M. A., et al. In-vitro evaluation of biopesticides (Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae, Bacillus thuringiensis) against mustard aphid Lipaphis erysimi kalt. (Hemiptera: Aphididae). Journal of Entomology and Zoology Studies. 5 (6), 331-335 (2017).
- Paschapur, A. U., Subbanna, A. R. N. S., Singh, A. K., Jeevan, B., Stanley, J., Rajashekara, H., Mishra, K. K., Koti, P. S., Kant, L., Pattanayak, A. Alternaria alternata strain VLH1: a potential entomopathogenic fungus native to North Western Indian Himalayas. Egyptian Journal of Biological Pest Control. 32, 138 (2022).
- Miohammed, A. A. Lecanicillium muscarium and Adalia bipunctata combination for the control of black bean aphid, Aphis fabae. Biocontrol. 63, 277-287 (2018).
- Thaochan, N., Ngampongsai, A., Prabhakar, C. S., Hu, Q. Beauveria bassiana PSUB01 simultaneously displays biocontrol activity against Lipaphis erysimi (Kalt.) (Hemiptera: Aphididae) and promotes plant growth in Chinese kale under hydroponic growing conditions. Biocontrol Science and Technology. 31 (10), 997-1015 (2021).
- Mseddi, J., Farhat-Touzri, D. B., Azzouz, H. Selection and characterization of thermotolerant Beauveria bassiana isolates and with insecticidal activity against the cotton-melon aphid Aphis gossypii (Glover) (Hemiptera: Aphididae). Pest Management Science. 78 (6), 2183-2195 (2022).
- Butt, T. M., Ibrahim, L., Clark, S. J., Beckett, A. The germination behaviour of Metarhizium anisopliae on the surface of aphid and flea beetle cuticles. Mycological Research. 99 (8), 945-950 (1995).
- Ullah, S., Raza, A. B. M., Alkafafy, M., Sayed, S., Hamid, M. I., Majeed, M. Z., Riaz, M. A., Gaber, N. M., Asim, M. Isolation, identification and virulence of indigenous entomopathogenic fungal strains against the peach-potato aphid, Myzus persicae Sulzer (Hemiptera: Aphididae), and the fall armyworm, Spodoptera frugiperda (J.E. Smith) (Lepidoptera: Noctuidae). Egyptian Journal of Biological Pest Control. 32, 2 (2022).
- Yokomi, R. K., Gottwald, T. R. Virulence of Verticillium lecanii Isolates in Aphids Determined by Detached-leaf Bioassay. Journal of Inbertebrate Pathology. 51, 250-258 (1988).
- Vu, V. H., Hong, S. I., Kim, K. Selection of entomopathogenic fungi for aphid control. Journal of Bioscience and Bioengineering. 104 (6), 498-505 (2007).
- Vandenberg, J. D. Standardized bioassay and screening of beauveria bassiana and paecilomyces fumosoroseus against the russian wheat aphid (homoptera: aphididae). Journal of Economic Entomology. 89 (6), 1418-1423 (1996).
- Lu, W. N., Wu, Y. T., Kuo, M. H. Development of species-specific primers for the identification of aphids in Taiwan. Applied Entomology and Zoology. 43 (1), 91-96 (2008).
- Liu, Y. C., et al. Isolation and selection of entomopathogenic fungi from soil samples and evaluation of fungal virulence against insect pests. Journal of Visualized Experiments. 175, e62882 (2021).
- Menger, J., Beauzay, P., Chirumamilla, A., Dierks, C., Gavloski, J., Glogoza, P., et al. Implementation of a diagnostic-concentration bioassay for detection of susceptibility to pyrethroids in soybean aphid (hemiptera: aphididae). Journal of Economic Entomology. 113 (2), 932-939 (2020).
- Zhang, R., Chen, J., Jiang, L., Qiao, G. The genes expression difference between winged and wingless bird cherry-oat aphid Rhopalosiphum padi based on transcriptomic data. Scientific Reports. 9, 4754 (2019).
- Abbott, W. S. A method of computing the effectiveness of an insecticide. Journal of Economic Entomology. 18, 265-267 (1925).
- Liu, T. X., Sparks, A. N. Jr Aphids on Cruciferous Crops: Identification and Management. , Texas A&M AgriLife Extension Service. 9-11 (2001).
- Kuo, M., Chianglin, H. Temperature dependent life table of brevicoryne brassicae (l.)(hemiptera: aphididae) on radish. Formosan Entomologist. 27, 293-302 (2007).
- Im, Y., Park, S., Lee, S. Y., Kim, J., Kim, J. J. Early-Stage defense mechanism of the cotton aphid aphis gossypii against infection with the insect-killing fungus beauveria bassiana JEF-544. Frontiers in Immunology. 13, 907088 (2022).
- Kim, J. J., Roberts, D. W. The relationship between conidial dose, moulting and insect developmental stage on the susceptibility of cotton aphid, Aphis gossypii, to conidia of Lecanicillium attenuatum, an entomopathogenic fungus. Biocontrol Science and Technology. 22 (3), 319-331 (2012).
- Reingold, V., Kottakota, C., Birnbaum, N., Goldenberg, M., Lebedev, G., Ghanim, M., et al. Intraspecies variation ofMetarhiziumbrunneumagainst the green peach aphid,Myzus persicae, provides insight into thecomplexity of disease progression. Pest Management Science. 77, 2557-2567 (2021).
- Ortiz-Urquiza, A., Keyhani, N. O. Action on the Surface: entomopathogenic fungi versus the insect cuticle. Insects. 4, 357-374 (2013).
- Knodel, J. J., Beauzay, P., Boetel, M., Prochaska, T., Chirumamilla, A. 2022 North Dakota Field Crop Insect Management Guide. , 23 North Dakota State University Extension Publication: North Dakota, USA. (2021).
- Yeo, H., Pell, J. K., Alderson, P. G., Clark, S. J., Pye, B. J. Laboratory evaluation of temperature effects on the germination and growth of entomopathogenic fungi and on their pathogenicity to two aphid species. Pest Management Science. 59 (2), 156-165 (2003).
- Erdos, Z., Chandler, D., Bass, C., Raymond, B. Controlling insecticide resistant clones of the aphid, Myzus persicae, using the entomopathogenic fungus Akanthomyces muscarius: fitness cost of resistance under pathogen challenge. Pest Management Science. 77 (11), 5286-5293 (2021).
