Summary
Bu protokol, partenogenetik bir böcek olan hardal yaprak bitine (Lipaphis erysimi (Kalt.)) karşı entomopatojenik mantarların (EPF) etkinliğini değerlendirmek için optimize edilmiş bir müstakil yaprak biyo-tahlil sistemi sunar. Yöntem, Petri kabı deneyleri sırasında veri toplama sürecini özetleyerek, araştırmacıların EPF'nin hardal yaprak bitlerine ve diğer partenogenetik böceklere karşı virülansını tutarlı bir şekilde ölçmelerini sağlar.
Abstract
Hardal yaprak biti (L. erysimi), çeşitli turpgillerden bitkileri istila eden ve bitki virüslerini bulaştıran bir zararlıdır. Çevre dostu haşere yönetimi elde etmek için, entomopatojenik mantarlar (EPF), bu haşereyi kontrol etmek için potansiyel mikrobiyal kontrol ajanlarıdır. Bu nedenle, saha uygulamasından önce Petri kabı koşulları altında EPF izolatlarının virülans taraması gereklidir. Bununla birlikte, hardal yaprak biti partenogenetik bir böcektir ve Petri kabı deneyleri sırasında veri kaydetmeyi zorlaştırır. Bu sorunu çözmek için, yaprak bitlerine konidia aşılamak ve spor süspansiyonundan sonra havayla kurutmayı kolaylaştırarak boğulmayı önlemek için bir mikro püskürtücü kullanarak, müstakil yapraklı biyo-tahliller için değiştirilmiş bir sistem geliştirilmiştir. Sistem, gözlem süresi boyunca yüksek bağıl nemi korudu ve yaprak diski on günden fazla taze kaldı ve yaprak bitlerinin partenogenetik üremesine izin verdi. Yavru oluşumunu önlemek için, bir boyama fırçası kullanarak günlük bir çıkarma işlemi uygulandı. Bu protokol, EPF izolatlarının hardal yaprak bitlerine veya diğer yaprak bitlerine karşı virülansını değerlendirmek için kararlı bir sistem gösterir ve yaprak biti kontrolü için potansiyel izolatların seçilmesini sağlar.
Introduction
Hardal yaprak biti (L. erysimi), çeşitli turpgillerden bitkileri istila eden ve önemli ekonomik kayıplara neden olan kötü şöhretli bir zararlıdır1. Yaprak biti istilasıyla mücadele etmek için birkaç sistematik insektisit önerilmiş olsa da, bu insektisitlerin sık kullanımı pestisit direnciile ilgili endişeleri artırmaktadır 2,3. Bu nedenle, çevre dostu haşere yönetimi açısından, entomopatojenik mantarlar (EPF) uygun bir alternatif kontrol stratejisi olarak hizmet edebilir. EPF, konakçıların tırnak etlerine nüfuz ederek enfekte etme yeteneğine sahip bir böcek patojenidir, bu da onu yaprak bitlerini ve diğer bitki emici böcekleri kontrol etmek için güçlü bir ajan haline getirir4. Ayrıca, EPF'nin uygulanabilir ve sürdürülebilir bir haşere yönetimi tekniği olduğu kanıtlanmıştır ve bitki patojen antagonizması ve bitki büyümesinin teşviki gibi faydalar sunmaktadır5.
EPF, böcek-toprak yemleme yoluyla elde edilebilir veya tarladaki böcek kadavralarından izole edilebilir 6,7. Bununla birlikte, mantar izolatlarının daha fazla kullanılmasından önce, patojenite taraması gereklidir. EPF'nin ciddi hasara neden olabilecek önemli mahsul zararlıları olan yaprak bitlerine karşı etkinliği üzerine çeşitli çalışmalar yapılmıştır 8,9. Hardal yaprak bitleri, çeşitli yaprak biti türleri arasında, Beauveria spp., Metarhizium spp., Lecanicillium spp., Paecilomyces spp. ve hatta esas olarak saprofit ve bitki patojenik mantarı olarak bilinen ancak hardal yaprak bitlerine karşı bazı ölümcül etkiler gösteren Alternaria'nın çeşitli suşlarına duyarlılık açısından test edilmiştir10,11,12.
EPF'nin laboratuvar koşullarında yaprak bitlerine karşı etkinliğini değerlendirmek için biyoanalizler iki ana bölüme ayrılabilir: aşılama odası ve mantar aşılaması. Mevcut protokol, yaprak bitlerinin nemli pamuğa sarılmış bir yaprak sapı ile eksize edilmiş bir yaprak, nemli filtre kağıdı ile kaplanmış bir Petri kabına sahip eksize edilmiş bir yaprak diski, saksı bitkileri üzerinde doğrudan bakım veya bir Petri kabı veya kabı10 içindeki su agarına gömülü eksize edilmiş bir yaprak diski gibi çeşitli yöntemler kullanılarak korunabileceği bir aşılama odasının yapımını açıklamaktadır. 11,13. Mantar aşılaması için yaygın yöntemler arasında conidia püskürtme, yaprak bitinin bir conidia süspansiyonuna daldırılması, yaprakların bir conidia süspansiyonuna daldırılması ve bitki endofit aşılaması11,14,15,16 bulunur. Çeşitli aşılama yöntemleri mevcut olsa da, biyo-tahliller saha uygulama koşullarını simüle etmelidir. Örneğin, yaprağa daldırma yöntemi12,17 durumunda, EPF'nin etkinliği değerlendirilebilir, ancak yaprak bitleri mantar yüklü yaprakları istila ettiğinden, tercihli bir penetrasyon bölgesi olan yaprak bitinin dorsal tarafı genellikle mantara maruz kalmaz.
EPF'nin laboratuvar koşullarında yaprak öldürücü etkisini değerlendirmek için, bu protokol, Yokomi ve Gottwald18 tarafından bazı modifikasyonlarla tarif edilen müstakil yaprak yönteminin kullanılmasını ve ardından bir mikro püskürtücü kullanılarak konidia aşılamasının yapılmasını önerir. Bu yöntem, ek su ikmali gerektirmeden en az yedi gün boyunca biyo-tahlil odasında yaklaşık% 100 nemi korur18,19. Ek olarak, yaprak bitlerini tek bir yüzeyle sınırlamak, konidia püskürtmeye maruz kalmalarını sağlar ve gözlemleri kolaylaştırır20. Bununla birlikte, yaprak bitleri, aşılama odası içinde hareket ederken açıkta kalan agar yüzeyinde sıkışabilir. Ayrıca, partenogenetik böcekler olan hardal yaprak bitleri ile Petri kabı deneyinde veri kaydetmek, hızlı gelişimleri ve üremeleri nedeniyle zor olabilir. Aşılanmış yetişkinler ile soyları arasında çıkarmadan ayrım yapmak zordur. Bu adıma nasıl devam edileceğinin ayrıntılarından nadiren bahsedilir ve yaprak tüketim alanı gibi bazı tutarsız faktörlerin optimize edilmesi gerekir.
Bu protokol, EPF izolatlarının hardal yaprak bitlerine karşı virülansını taramak için kararlı bir sistem gösterir ve kapsamlı bir EPF kütüphanesinden çeşitli yaprak biti türlerine karşı potansiyel izolatların seçilmesini sağlar. Tarlada toplanan yaprak bitleri tanımlanabilir ve tutarlı sonuçlarla kolay ve uygulanabilir bir metodoloji kullanılarak çeşitli mantar izolatlarının yaprak öldürücü etkisini değerlendirmek için yeterli bir hardal yaprak biti laboratuvar popülasyonu oluşturulabilir. Yaprak bitleri, tarımsal ekosistemlerdeki yoğun ve tekrarlanan antropojenik baskılara yanıt olarak çoklu evrimsel mekanizmalar geliştirmiş ve gıda güvenliğine zorluklar çıkarmıştır9. Bu nedenle, açıklanan bu yöntem, çeşitli yaprak biti türlerine karşı potansiyel EPF izolatlarını değerlendirmek için genişletilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Akış şemasının tamamı Şekil 1'de gösterilmektedir.
1. Hardal yaprak biti toplama ve bakımı
- Hardal yaprak bitlerinin toplanması
- Yaprakları çevirin ve tarladaki turpgillerden mahsullerde hardal yaprak bitlerinin istilasını görsel olarak kontrol edin.
- Numune alma sahası bilgilerini (yani GPS) ve ev sahibi tesis(ler)i kaydedin ve çiftçilerle birlikte insektisit uygulamalarının geçmişini onaylayın.
- Tarladaki turpgillerden yaklaşık 50 hardal yaprak bitini 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne toplamak için bir böcek aspiratörü veya ince boyama fırçası ( Malzeme Tablosuna bakın) kullanın ve numuneyi 3 saat içinde laboratuvara getirin.
- Eksize edilmiş turpgillerden yapraklar ve altta su sızmış filtre kağıdı bulunan geçici bir bakım Petri kabı hazırlayın.
- Beş yaprak bitini, daha fazla yetiştirmeden önce yaprak bitinin doğal düşmandan arınmış olduğunu doğrulamak için 14 gün boyunca %70 bağıl nem ve 12:12 saat (açık:koyu) fotoperiyot ile oda sıcaklığında (25 ± 2 °C) geçici bakım Petri kabına yerleştirin.
NOT: Tarlada toplanan yaprak bitlerinin parazitoid yaban arıları veya entomopatojenik mantarlar gibi doğal düşmanlardan arınmış olmasını sağlamak için, daha fazla yetiştirmeye devam etmeden önce bu organizmaların yokluğunu doğrulamak çok önemlidir.
- Hardal yaprak bitlerinin bakımı
NOT: Hardal yaprak bitlerini korumak için pestisit içermeyen (biyopestisit dahil) turpgillerden yapraklar kullanın.- Sabit ve yeterli miktarda turpgil yaprak sağlayın (yaklaşık 25cm2).
NOT: Turpgillerden yaprakları ya piyasadan temin edin ya da bitkileri yetiştirin. Hardal yaprak bitlerinin uzun vadeli, kitlesel olarak yetiştirilmesinden önce, uygun bir turpgil bulmak için birkaç farklı turpgil türü test edilebilir. Turpgillerden yaprağın türü sabitlendikten sonra değiştirmeyin. Bu çalışmada 6-7 yapraklı Komatsuna (Brassica rapa var. perviridis) kullanılmıştır ( Bkz. Malzeme Tablosu). Ek olarak, en eski 2-3 yaprağı atın. - Alttaki filtre kağıdı tamamen kurumadan su ekleyin.
- Hardal yaprak bitlerinin popülasyon yoğunluğunu günlük olarak gözlemleyin. Nüfus 7 gün sonra 2-3 katına çıkmalıdır.
- Yaprak bitlerinin sayısı arttığında, hardal yaprak bitleri ile orijinal olarak eksize edilen yaprakları 4-6 küçük parçaya kesin ve hardal yaprak bitleri olan her küçük yaprak parçasını, taze eksize edilmiş yaprak ve su sızmış filtre kağıdı içeren bir Petri kabına koyun.
- Petri kabını 12:12 saat (açık:koyu) fotoperiyot ile 25 °C'de bir inkübatöre yerleştirin ve hardal yaprak bitlerinin popülasyon yoğunluğunu günlük olarak gözlemleyin.
- Yaprak bitlerinin çoğu, orijinal yapraklar çürümeden önce taze kesilmiş yapraklara göç ettikten sonra orijinal eksize edilmiş yaprakları çıkarın.
- Sabit ve yeterli miktarda turpgil yaprak sağlayın (yaklaşık 25cm2).
2. Hardal yaprak bitinin moleküler tanımlanması
NOT: Tarlada toplanan hardal yaprak biti türlerini doğrulamak için, moleküler tanımlama iki moleküler belirteç kullanılarak gerçekleştirildi: Lu ve ark.21 tarafından tasarlanan A05Le bazlı amplifiye bölge (SCAR) dizisi ve hardal yaprak biti sitokrom oksidaz alt birimi 1 (COI) hardal yaprak bitinin bölgesi.
- Hardal yaprak biti genomik DNA'sının ekstraksiyonu
- 1.5 mL'lik bir santrifüj tüpünde yaklaşık 50 yaprak biti toplayın.
NOT: Moleküler tanımlama için kullanılan yaprak bitleri, tek bir yaprak bitinin torunları olmalıdır ve DNA ekstraksiyonu için aynı tüpte çeşitli aşamalar da toplanabilir. - Yaprak bitlerini bir pelet tokmağı ile homojenize edin ve üreticinin talimatlarını izleyerek Gene-Spin Genomik DNA İzolasyon Kitini kullanarak DNA'yı ekstrakte edin (bkz.
- Genomik DNA'yı 50 μL önceden ısıtılmış nükleaz içermeyen su ile güçlendirin.
- 1.5 mL'lik bir santrifüj tüpünde yaklaşık 50 yaprak biti toplayın.
- PCR amplifikasyonu ve DNA dizilimi
- Farklı PCR programları ile A05LeF/A05LeR ve LeCO1F/LeCO1R primer çiftleri (Tablo 1) ile PCR Master Mix (2x) kullanarak yaprak biti genomik DNA'dan hedef DNA dizilerini çoğaltın21.
NOT: Toplam hacmi 20 μL olan PCR reaksiyonu, 2 μL yaprak biti genomik DNA şablonu, 1 μL ileri ve 1 μL ters primerler, 10 μL PCR Ana Karışımı ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve 6 μLddH2O'danoluşur. - PCR'yi bir termal döngüleyicide (Malzeme Tablosuna bakın) aşağıdaki programla gerçekleştirin: 94 dakika boyunca 5 °C, 25 döngü 94 °C 45 saniye, 61 °C (A05LeF/A05LeR için) ve 58 °C (LeCO1F/LeCO1R için) 45 saniye, 72 °C 1 dakika, ardından 72 dakika boyunca 5 °C'lik son uzatma.
- Hardal yaprak bitinin kimliğini doğrulamak için PCR ürününü %1 agaroz jel elektroforezi ile analiz edin (Şekil 2).
NOT: Primer çifti A05LeF/A05LeR, DNA fragmanının doğru boyutunu başarılı bir şekilde çoğaltırsa, sahada toplanan yaprak bitini hardal yaprak biti21 olarak ikna edici bir şekilde tanımlamıştır. Primer çiftleri Tablo 2'de listelenmiştir. - Hardal yaprak biti COI ampliconunun PCR ürününü, üreticinin talimatlarını izleyerek ticari olarak temin edilebilen bir jel/PCR kiti kullanarak saflaştırın (bkz. Malzeme Tablosu) ve ticari bir dizileme hizmeti kullanarak PCR ürününü sıralayın.
- Farklı PCR programları ile A05LeF/A05LeR ve LeCO1F/LeCO1R primer çiftleri (Tablo 1) ile PCR Master Mix (2x) kullanarak yaprak biti genomik DNA'dan hedef DNA dizilerini çoğaltın21.
- Dizi analizi
NOT: Lu ve ark.21'e göre, A05Le'nin DNA bükülmesi, hardal yaprak bitine özgü bir DNA fragmanıdır; bu nedenle, A05Le PCR ürününün daha fazla dizilenmesine gerek yoktur.- LeCO1 dizisini elde ettikten sonra Chromas yazılımı ile okuma kalitesini kontrol edin ( Malzeme Tablosuna bakın).
- Bir fasta (veya txt) dosyası açıp düşük kaliteli okumaları doğrudan kaldırarak yukarı ve aşağı akış düşük kaliteli okumaları kırpın.
- Kırpılan diziyi NCBI'ye gönderin web Varsayılan parametreleri kullanarak BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
NOT: A05Le ve LeCO1 primer setlerinin amplikon boyutları doğruysa, teorik olarak, NCBI standart veritabanlarına karşı dizi patlama araması hardal yaprak biti ile eşleşmelidir.
3. Entomopatojenik mantarların hazırlanması
NOT: Bu çalışmada kullanılan EPF Tablo 1'de listelenmiştir.
- EPF'nin mantar kütüphanesinden kurtarılması
- Korunmuş mantar stoğunu (%30 gliserin içinde süspanse edilmiş conidia) -80 °C dondurucudan çözün.
- Az miktarda (yaklaşık 10 μL) conidia süspansiyonunu 6 cm 1/4 Sabouraud dekstroz agar (SDA) plakasına (100 mL ddH2O başına 1.5 g agar ile 0.75 g Sabouraud dekstroz suyu) aktarın ve laminer akış başlığında bir hücre yayıcı kullanarak eşit şekilde yayın.
- Petri kabını parafin film ile kapatın ve karanlıkta 25 °C'de 10-14 gün inkübe edin.
- Conidia22'yi hasat etmeden önce mantar kütlesini 1/4 SDA plakasına çizerek ve mantarları karanlıkta 25 °C'de 10-14 gün inkübe ederek mantar izolatlarını yeniden kültürleyin.
NOT: Mantar kültürü, yaprak bitlerini aşılamadan yaklaşık 10 gün önce kullanılmalıdır. 14 günden daha eski olan EPF kültürünün virülans testinde kullanılması önerilmez.
- Conidia süspansiyonunun hazırlanması
- 10-14 günlük mantar kültüründen conidia'yı 1/4 SDA plakasına 2-3 mL% 0.03 Tween 80 ekledikten sonra halkayı aşılayarak kazıyın (Malzeme Tablosuna bakınız).
- Mantar süspansiyonunu bir santrifüj tüpüne toplayın.
- Çözeltiyi en yüksek hızda vorteksleyin, ışık mikroskobu altında bir hemositometre kullanarak conidia sayısını sayın ve conidia süspansiyonunun konsantrasyonunu 108 conidia / mL'ye ayarlayın.
- Conidia süspansiyonunu UV ile sterilize edilmiş bir mikro püskürtücüye aktarın.
NOT: Conidia çökelmeye meyilli olduğundan, aktarmadan önce conidia süspansiyonunu tekrar vorteksleyin. Mikro püskürtücü, kullanımdan önce 30 dakika boyunca laminer akış başlığında ultraviyole radyasyona maruz bırakılmalıdır.
4. Hardal yaprak bitine karşı virülans taraması
- Yeni ortaya çıkan yetişkinlerin hazırlanması
- Aynı yaştaki yeni dölleri çoğaltmak için apterous (kanatsız) ve alat (kanatlı) yetişkinleri yetiştirme Petri kabından taze kesilmiş yapraklara taşıyın. Aşırı kalabalığı önlemek ve alated döllerin üretimini en aza indirmek için yetişkinleri 24 saat sonra çıkarın23,24. Daha sonraki deneylerde sadece apterous yetişkinler kullanılacaktır.
- Deney için yaprak bitleri arasındaki yaş değişimini önlemek için dölleri yetişkin aşamasına geri getirin ve 48 saat sonra yetişkin aşamasına gelişmeyen dölleri çıkarın (Şekil 3). Ek olarak, alated yetişkinleri çıkarın.
- Aşılama odasının hazırlanması
NOT: Yaprak diskinin katılaşmadan önce su agarına gömülebilmesi için önce 9 cm çapında turpgillerden yaprakların hazırlanması tavsiye edilir.- Turpgillerden yaprakları musluk suyuyla temizleyin, kiri ve kalıntıları ve varsa diğer eklembacaklıları temizleyin.
- Fazla suyu bir kağıt havluyla silin ve bir stereomikroskop kullanarak turpgillerden yaprakların yüzeyinde başka eklembacaklılar olup olmadığını kontrol edin. Varsa eklembacaklıları çıkarın.
- 9 cm çapında bir yaprak diskini ister kalıp olarak yaprak üzerindeki alt petri kabına doğrudan bastırarak isterseniz de makas kullanarak kesin.
NOT: Yaprakların çapı 9 cm'den küçükse, eksize edilmiş birkaç yaprağı birleştirin. - Mikrodalga kullanarak 450 mg agarı (Malzeme Tablosuna bakınız) 30 mL ddH2O'da ısıtıp çözerek her Petri kabı için% 1.5 su agar hazırlayın.
NOT: %1,5 su agar miktarı deney ölçeğine bağlı olarak ayarlanabilir. - Laminer akış başlığında katılaşmadan önce 9 cm'lik Petri kabına 30 mL %1,5 su agar dökün ve ardından agar yüzeyi yarı katılaşana kadar agarın ~40 °C'ye soğumasını bekleyin.
NOT: Petri kabını hafifçe yatay olarak sallayarak yüzeyin yarı katılaşıp katılaşmadığını kontrol edin. - Yaprak diskini, abaksiyal yüzeyi yukarı bakacak şekilde, su agarının üzerine yerleştirin ve yaprak diskini agarın içine gömün.
NOT: Agar yüzeyinin maruziyetini en aza indirin. - Su agar tamamen katılaştıktan sonra, Petri kabının kapağını kapatın.
NOT: Kapakta hemen çok sayıda damlacık yoğunlaşıyorsa, su buharlaşması için kapağı açın. - Yaprak diske 20 apterous yetişkin yerleştirin.
NOT: Ağız kısımlarının zarar görmesini önlemek için stereomikroskop altında çalıştırılması önerilir.
- EPF aşılama ve gözlem
- Aşılama odasının kapağını açın ve yaprak diskinin yaklaşık 15 cm yukarısından doğrudan yaprak bitlerine ve yaprak diskine 0.3 mL conidia süspansiyonu (3.2. adımdan itibaren) püskürtün.
NOT: Püskürtmeden önce conidia süspansiyonunu tekrar vorteksleyin. İlaçlama alanları, farklı püskürtücüler arasında değişiklik gösterebileceğinden deneyden önce test edilmelidir. Bu durumda 15 cm mesafe ile 0,3 mL önerilir. Püskürtme alanı tüm yaprak diskini kaplamalı ve ince bir conidia süspansiyon tabakası yaprak diskini örtmelidir. Damlacıklar yaprak üzerinde durgun suya birleşirse, aşılama hacmi azaltılmalıdır. Aşılamadan önce ve farklı izolatlar kullanarak masayı %70 etanol ile temizleyin. - Conidia süspansiyonunun kurumasını bekleyin ve ardından hardal yaprak bitlerinin boğulmasını önlemek için kapağı kapatın.
NOT: Yaprak bitleri deney sırasında nadiren dolaşırlar; Bununla birlikte, yaprak bitlerinin kaçmamasını sağlamak hala gereklidir. - Yüksek bağıl nemi korumak için aşılama odasını parafin film ile kapatın ve aşılama odasını 12:12 saat (açık:koyu) fotoperiyot ile 25 °C'de bir inkübatöre yerleştirin.
- 5 gün boyunca her 12 saatte bir stereomikroskop altında mortaliteyi saymak için aşılama odasının kapağını açın.
- Kapağa yapışan bal özünü bir kağıt havluyla silin ve yeni ortaya çıkan yaprak bitlerini ince bir boyama fırçasıyla çıkarın. Kapağı her 24 saatte bir musluk suyuyla temizleyin.
NOT: Gözlem süresi, yetişkin ömrüne bağlı olarak farklı yaprak biti türleri için değişebilir. - Başarılı aşılamayı doğrulamak için kadavranı mikoz için yaprak diskinde tutun.
- Aşılama odasının kapağını açın ve yaprak diskinin yaklaşık 15 cm yukarısından doğrudan yaprak bitlerine ve yaprak diskine 0.3 mL conidia süspansiyonu (3.2. adımdan itibaren) püskürtün.
- Conidia çimlenme oranının doğrulanması
NOT: Bu adım isteğe bağlıdır. Conidia aktivitesini sağlamak için virülans taraması yaparken conidia çimlenme oranını çift olarak doğrulamak.- Üç kopya için 1/4 SDA üzerine bir damla 5 μL conidia süspansiyonu damlatın.
- 18 saat sonra ışık mikroskobu ile çimlenme oranını hesaplayın. Mantar çimlenme oranını doğrulamak için tek bir damlacıkta rastgele en az 100 spor sayın.
NOT: Normalde deneyde kullanılan izolatların çimlenme oranı %90'dan yüksek olmalıdır.
5. Seçilen EPF izolatlarının biyo-tahlili
NOT: Adım 4'ten seçilen yüksek virülans gösteren EPF izolatları, dört konsantrasyonda conidia süspansiyonu (104 ila 107 conidia / mL arasında değişen) kullanılarak hardal yaprak bitlerine karşı bir biyo-teste tabi tutuldu.
- Conidia süspansiyonunun hazırlanması
- Seçilen EPF izolatlarını kurtarmak için adım 3.1'i tekrarlayın.
- 10 4, 105,10 6 ve 107 conidia/mL dahil olmak üzere dört konsantrasyonda conidia süspansiyonu hazırlamak için adım 3.2'yi tekrarlayın.
- Yeni ortaya çıkan yetişkinlerin hazırlanması
- Yeni ortaya çıkan yetişkinleri hazırlamak için adım 4.1'i tekrarlayın.
- Aşılama odasının hazırlanması
- Adım 4.1'i tekrarlayın. aşılama odasını hazırlamak için.
- EPF aşılama ve gözlem
- Adım 4.3'ü tekrarlayın. EPF aşılamasını ve gözlemini sırasıyla dört konsantrasyon conidia süspansiyonu ile gerçekleştirmek.
6. İstatistiksel analiz
- Düzeltilmiş mortalitenin hesaplanması
- Aşağıda gösterildiği gibi Abbott'unformül 25'ini kullanarak düzeltilmiş ölüm oranını hesaplayın:
Düzeltilmiş mortalite (%) = [(MT− M C) × %100] / (100− MC)
MT tedavi grubunun mortalitesini temsil eder ve MC kontrol grubunun mortalitesini temsil eder.
NOT: Kontrol grubunun mortalitesi %20'den yüksek olmamalıdır. - SPSS yazılım platformunu açın (Malzeme Tablosuna bakın), "treatment" ve "cor_mor" (düzeltilmiş mortaliteyi temsil eder) dahil olmak üzere değişkenler oluşturun ve aynı zaman noktasında aynı aşılanmış konsantrasyona sahip farklı izolatların aşılanması için hesaplanan sonuçları girin.
- Bağımsız t-testi analizi için SPSS'de Analiz Et, Ortalamaları ve Oranları Karşılaştır, Bağımsız Örnekler T Testini seçin.
- SPSS'de, "Değişkeni Gruplandırma" kutusuna tedaviyi girin ve "Test Değişken(ler)i"ne cor_mor . Grupları farklı mantar izolatlarına göre tanımlayın. Analiz etmek için Tamam'a basın.
- Aşağıda gösterildiği gibi Abbott'unformül 25'ini kullanarak düzeltilmiş ölüm oranını hesaplayın:
- Ortalama öldürücü sürenin (LT 50) ve ortanca öldürücü konsantrasyonun (LC50) hesaplanması
- SPSS'yi açın, "toplam", "yanıt" ve "süre"/"konsantrasyon" değişkenlerini oluşturun ve kaydedilen sonucu elektronik tabloya girin.
- LT50 ve/veya LC50'yi hesaplamak için SPSS'de Analiz, Regresyon, Probit'i seçin.
NOT: Kümülatif mortalite sonunda %50'yi geçmezse, LT 50 ve/veya LC50 tahmin edilemez. - "Toplam Gözlemlenen" kutusuna toplamı , "Yanıt Frekansı" kutusuna yanıtı , "Ortak Değişken(ler)" kutusuna süre/konsantrasyonu girin. Analiz etmek için Tamam'a basın.
NOT: Genel olarak, Seçenek tuşuna basın ve "Heterojenlik faktörünün kullanımı için anlamlılık düzeyi"ni 0,05 olarak ayarlayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sunulan akış şeması, hardal yaprak bitlerinin tarla toplamadan virülans taramasına kadar stabil durumunu göstermektedir. Yaprak bitlerinin tarla koleksiyonundan korunması, yeterli besin kaynağı olan yaprak biti kolonilerinde istikrarlı bir artış sağlamıştır. Sahada toplanan yaprak bitleri, PCR amplikon boyutu ve LeCO1 dizilimi dahil olmak üzere moleküler belirteçler kullanılarak hardal yaprak bitleri olarak doğrulandı. Müstakil yaprak yöntemi kullanılarak gerçekleştirilen virülans taraması, hardal yaprak bitleri için tutarlı bir hayatta kalma oranı ortaya çıkardı ve kontrol grubu %85'lik bir hayatta kalma oranı sergiledi (Şekil 4).
Virülans taraması sırasında, Cc-NCHU-213 en hızlı yaprak biti öldürme yeteneğini gösterdi ve aşılamadan 3 gün ve 4.5 gün sonra (dpi) sırasıyla% 50 ve% 90 ölümle sonuçlandı (Şekil 4). Bununla birlikte, beş B. bassiana izolatı arasında değişen yaprak biti öldürme yetenekleri gözlenmiştir. Bb-NCHU-141, -143 ve -153, %0.03 Tween 80 püskürtme veya diğer öldürücü faktörlerin etkileri hariç tutulduğunda bile, 3 dpi'de sadece %5 mortalite ile yavaş yaprak biti öldürme yetenekleri sergiledi (Şekil 4). Bu nedenle, kontrol mortalitesini normalleştirmek için düzeltilmiş mortalite formülü kullanıldı. Hardal yaprak bitlerine karşı EPF izolatlarının çoğu, Pl-NCHU-152 hariç, 5 d.p.i. içinde% 70'in üzerinde düzeltilmiş ölüm oranları sergilemiştir (Tablo 3). Bu EPF izolatları arasında Bb-NCHU-286 %100 ile en yüksek mortalite oranını göstermiştir (Tablo 3). Ek olarak, virülans taraması sırasında Metarhizium spp., Beauveria spp., Purpureocillium lilacinum ve Cordyceps cateniannulata ile enfekte hardal yaprak bitlerinin kadavralarında EPF mikozu gözlenmiştir ve bu sistemin etkinliğini göstermektedir (Şekil 5).
Virülans taramasının sonuçlarına dayanarak, hardal yaprak bitlerine karşı biyo-tahlil için hızlı böcek öldürme aktivitesi (sırasıyla 3 dpi'de %40 ve %50 mortalite) sergileyen Mb-NCHU-197 ve Cc-NCHU-213 olmak üzere iki EPF izolatı seçildi. Sonuçlar, 107 conidia / mL'lik bir aşılama ile 3 ve 4 d.p.i.'de Mb-NCHU-197 ve Cc-NCHU-213 için önemli ölçüde farklı düzeltilmiş mortalite gösterdi (Şekil 6). LT50 testinde, 107 conidia / mL Cc-NCHU-213 ile tedavi, diğer tedavilere kıyasla önemli ölçüde daha kısa bir süre sergilemiştir (Tablo 4). Ayrıca, Cc-NCHU-213'ün LC50 değeri (9.32 × 104), Mb-NCHU-213'ünkinden (2.30 × 10 5) daha düşüktü, bu da Cc-NCHU-213'ün hardal yaprak bitlerine karşı daha fazla virülansa sahip olduğunu gösteriyor (Tablo 5).
Şekil 1: Hardal yaprak bitlerine karşı EPF virülansını taramak için deneysel akış şeması. (A) Hardal yaprak biti yetiştirme sisteminin kurulması. (b) EPF'nin hazırlanması. (C) Mantar aşısı. (D) İstatistiksel analiz. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: A05Le ve Le CO1 primer setleri ile amplifiye edilmiş hardal yaprak biti genomik DNA'sının elektroforezi. Elektroforez% 1'lik bir agaroz jel üzerinde gerçekleştirildi. M = 100 bp DNA merdiveni; bp = baz çiftleri. Kırmızı yıldız işareti, PCR amplifikasyonunun hedef bükülmesini gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Apterous dördüncü instar nimf ve ergin hardal yaprak bitleri arasındaki farklar . (A) Dördüncü instar nimfi. (b) Yetişkin. Dördüncü instar perisinin arka ayaklarının tibiaları beyazımsıdır (kırmızı okla işaretlenmiştir). Yeni ortaya çıkan yaprak bitleri, virülans testleri sırasında ince deve fırçası ile uzaklaştırıldı. Ölçek çubuğu = 1 mm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Müstakil yaprak yöntemiyle hardal yaprak bitlerine karşı 13 EPF izolatının ölüm ısı haritası. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: 13 EPF izolatının mantar mikozunun gözlemlenmesi. Mepe-NCHU-2 = Metarhizium pemfigi; Mp-NCHU-11 = Metarhizium pinghaense; Mb = Metarhizium baoshanense; Cc = Cordyceps cateniannulata; Ba = Beauveria australis; Bb = Beauveriabassiana; Pl = Purpureocillium lilacinum. Ölçek çubuğu = 1 mm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Hardal yaprak bitine karşı mantar izolatları Mb-NCHU-197 ve Cc-NCHU-213'ün düzeltilmiş mortalitesi. Hata çubukları standart sapmayı (SD) temsil eder. Mb-NCHU-197 ve Cc-NCHU-213'ün aynı zaman noktasındaki mortaliteleri bağımsız t-testi kullanılarak karşılaştırıldı ve yıldız işareti ile işaretlenmiş mortaliteler anlamlı olarak farklı bulundu (p < 0.05). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Ayırmak | Tür | Ana bilgisayar veya kaynak* | Yer |
| MP-NCHU-2 Serisi | Metarhizium pemfigi | toprak | Yilan Belediyesi |
| ML-NCHU-9 Serisi | Metarhizium lepidiotae | toprak | Yilan Belediyesi |
| MP-NCHU-11 Serisi | Metarhizium pinghaense | toprak | Yilan Belediyesi |
| Ba-NCHU-113 | Beauveria australis | toprak | Taichung |
| BB-NCHU-141 Serisi | Beauveria bassiana | Hipotenemus hampei | Chiayi |
| BB-NCHU-143 Serisi | Beauveria bassiana | Hipotenemus hampei | Chiayi |
| PL-NCHU-152 | Purpureocillium leylakinum | Tessaratoma papillosa | Chiayi |
| BB-NCHU-153 Serisi | Beauveria bassiana | Rhynchophorus ferrugineus (Rhynchophorus ferrugineus) | Chunghua Belediyesi |
| BB-NCHU-157 Serisi | Beauveria bassiana | Rhynchophorus ferrugineus (Rhynchophorus ferrugineus) | Chunghua Belediyesi |
| MB-NCHU-196 Serisi | Metarhizium baoshanense | toprak | Taichung |
| MB-NCHU-197 Serisi | Metarhizium baoshanense | toprak | Taichung |
| CC-NCHU-213 Serisi | Cordyceps cateniannulata | toprak | Taichung |
| BB-NCHU-286 Serisi | Beauveria bassiana | Cerambycidae (Cerambycidae) | Taichung |
Tablo 1: Bu çalışmada kullanılan EPF izolatları.
| Astar adı | Sıra (5' - 3') | Ürün boyutu (bp) | Referans | |
| A05Le | F-GGGTCTTGGATGGTGTGGTG | 953 | Lu ve ark. [21] | |
| R-AGGGGTCTTGTCGCCATTTT | ||||
| LeCO1 | F-CTTTTCCCATGATCAATTTT | 593 | Bu çalışma | |
| R-ACGTAGTGGAAATGAGCAAC | ||||
Tablo 2: Hardal yaprak bitlerinin moleküler tanımlanması için kullanılan primer çiftleri.
| Ayırmak | Tür | Düzeltilmiş mortalite (%) |
| MP-NCHU-2 Serisi | Metarhizium pemfigi | 76.47 |
| ML-NCHU-9 Serisi | Metarhizium lepidiotae | 82.35 |
| MP-NCHU-11 Serisi | Metarhizium pinghaense | 76.47 |
| Ba-NCHU-113 | Beauveria australis | 82.35 |
| BB-NCHU-141 Serisi | Beauveria bassiana | 88.24 |
| BB-NCHU-143 Serisi | Beauveria bassiana | 88.24 |
| PL-NCHU-152 | Purpureocillium leylakinum | 35.29 |
| BB-NCHU-153 Serisi | Beauveria bassiana | 82.35 |
| BB-NCHU-157 Serisi | Beauveria bassiana | 88.24 |
| MB-NCHU-196 Serisi | Metarhizium baoshanense | 76.47 |
| MB-NCHU-197 Serisi | Metarhizium baoshanense | 88.24 |
| CC-NCHU-213 Serisi | Cordyceps cateniannulata | 94.12 |
| BB-NCHU-286 Serisi | Beauveria bassiana | 100.00 |
Tablo 3: Aşılamadan 5 gün sonra hardal yaprak bitlerine karşı 13 EPF izolatının düzeltilmiş ölüm oranları (d.p.i.).
| Ayırmak | Tür | Conc.(conidia/mL) | N* | LT50 (gün)† | %95 güven sınırları | Eğim (SE) | X2 (df)‡ |
| MB-NCHU-197 Serisi | Metarhizium baoshanense | 104 | 60 | 3.816 bir | 3.61–4.05 | 0.60 (0.05) | 15.64 (28) |
| 105 | 60 | 3.112 İbd | 2.95–3.28 | 0.72 (0.05) | 14.61 (28) | ||
| 106 | 60 | 2.908 milyar | 2.76–3.06 | 0.85 (0.06) | 15.04 (28) | ||
| 107 | 60 | 2.549 c | 2.40–2.69 | 0.90 (0.06) | 24.31 (28) | ||
| CC-NCHU-213 Serisi | Cordyceps cateniannulata | 104 | 60 | 3.948 bir | 3.71–4.23 | 0.53 (0.05) | 8.81 (28) |
| 105 | 60 | 3.237 gün | 3.07–3.41 | 0.72 (0.05) | 22.86 (28) | ||
| 106 | 60 | 2.414 c | 2.28–2.54 | 1.08 (0.07) | 28.30 (28) | ||
| 107 | 60 | 2.132 inç | 2.02–2.25 | 1.41 (0.10) | 28.96 (28) | ||
| *Gözlenen böcek sayısı. | |||||||
| †Farklı harflerle işaretlenmiş LT50 değerleri, %95 güven sınırları örtüşmediği için önemli ölçüde farklı kabul edildi. | |||||||
| ‡X2, Pearson'ın uyum iyiliği testinde Ki-kare değeri; df, serbestlik derecesi | |||||||
Tablo 4: Farklı konidia konsantrasyonları altında hardal yaprak bitlerine karşı mantar izolatları Mb-NCHU-197 ve Cc-NCHU-213'ün LT50 değerleri. *Gözlenen böcek sayısı. Farklı harflerle işaretlenmiş †LT50 değerleri, %95 güven sınırları örtüşmediği için önemli ölçüde farklı kabul edildi. ‡X2, Pearson'ın uyum iyiliği testinde Ki-kare değeri; df, serbestlik derecesi.
| Ayırmak | Tür | N* | LC50 (konidia/mL)† | %95 güven sınırları | Slpoe (SE) | X2 (df)‡ |
| MB-NCHU-197 Serisi | Metarhizium baoshanense | 240 | 2,30 × 105 kg A | 8,63 × 104–5,70 × 105 | 0.43 (0.08) | 10.14 (10) |
| CC-NCHU-213 Serisi | Cordyceps cateniannulata | 240 | 9.32 × 104 kg A | 4,97 × 104–1,62 × 105 | 0.76 (0.09) | 4.33 (10) |
| *Gözlenen böcek sayısı. | ||||||
| Farklı harflerle işaretlenmiş †LC50 değerleri, %95 güven sınırları örtüşmediği için önemli ölçüde farklı kabul edildi. | ||||||
| ‡X2, Pearson'ın uyum iyiliği testinde Ki-kare değeri; df, serbestlik derecesi | ||||||
Tablo 5: Hardal yaprak bitlerine karşı Mb-NCHU-197 ve Cc-NCHU-213 mantar izolatlarının LC50 değerleri. *Gözlenen böcek sayısı. Farklı harflerle işaretlenmiş †LC50 değerleri, %95 güven sınırları örtüşmediği için önemli ölçüde farklı kabul edildi. ‡X2, Pearson'ın uyum iyiliği testinde Ki-kare değeri; df, serbestlik derecesi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bir grup sebze olan turpgiller, hardal yaprak biti (L. erysimi) ve lahana yaprak biti (Brevicoryne brassicae) dahil olmak üzere birden fazla yaprak biti türü tarafından sıklıkla istila edilir26. Her iki tür de Tayvan27'de rapor edilmiştir ve toplama alanında bir arada bulunmaları mümkündür. Yakından ilişkili yaprak biti türlerini ayırt etmek için, bu çalışmada bir multipleks primer seti21 kullanılarak moleküler tanımlama tekniği kullanılmıştır. Hardal yaprak biti COI gen fragmanından moleküler bir belirteç tasarlayarak, hardal yaprak bitini başarıyla tanımladık, böylece bu amaç için moleküler belirteç A05Le'nin güvenilirliğini doğruladık21.
Gözlemler, apterous dördüncü instar nimfleri ile yetişkin hardal yaprak bitleri arasında yalnızca boyutlarına veya morfolojilerine göre ayrım yapmanın, deneyim olmadan zor olduğunu ortaya koydu. Bununla birlikte, önemli bir ayırt edici özellik, dördüncü instar nimflerde beyaz görünen, ancak yetişkinlerde beyaz olmayan arka bacakların tibiasıdır (Şekil 3). Pamuk yaprak bitlerine karşı L. attenuatum, B. bassiana ve yeşil şeftali yaprak bitlerine karşı M. brunneum ile ilgili önceki çalışmalar, tüy dökümünün enfeksiyondan kaçınmak için bir strateji olabileceğini göstermiştir28,29,30. Bu nedenle, yaprak biti aşamalarının yanlış tanımlanması, tüy dökümü EPF28,29,31'in etkinliğini etkileyebileceğinden, virülans değerlendirmesinde hatalara yol açabilir. Bu sorunu ele almak ve virülans değerlendirmesinde daha fazla doğruluk ve kesinlik sağlamak için, kasıtlı olarak yaprak biti nimfleri kullanılmadıkça yetişkin aşamasına ulaşmamış arka bacak tibialarında beyazımsı kısımları olan yaprak bitlerini hariç tutun. Bu yaprak bitleri tam olarak olgunlaşmaz ve erimeye uğrayabilir, bu da EPF'nin enfeksiyon sürecinden kaçmalarına izin verebilir. Ek olarak, her 12 saatte bir gözlem ve veri kaydı yapılması önerilir. Benzer yaprak biti öldürme yeteneklerine sahip çok sayıda umut verici izolat arasındaki farkları göstermek için 12 saatlik aralık tercih edilir ve LT50'nin hassas hesaplanmasını kolaylaştırır. Bununla birlikte, zaman aralığı, diğer böcek türlerinin farklı yaşam döngülerine göre ayarlanabilir veya küçük ölçekli bir ön test ile belirlenebilir.
Müstakil yaprak yöntemi yaprak diskinde minimum bal özü bırakabilse de, yaprak diski birbirine yakın olduğu için bal özünün çoğu Petri kabı örtüsüne yapışır. Gözlem süresi boyunca silinebilir veya yıkanabilir. Bununla birlikte, yaprak bitleri32'yi istila ettiğinde, mahsul yetiştiriciliğinin pratik ortamında şüphesiz bal özü mevcuttur. Aşılama odasında bulunan bal özü, EPF'nin tarladaki yaprak bitlerine aşılandığı durumu bir şekilde simüle edebilir. Yaprak biti kütikülleri çoğunlukla mantar için bir besin kaynağı görevi gören ve EPF16'nın çimlenmesini uyarabilen bal özü içerir. Bu nedenle, EPF uygulaması ve yaprak bitleri tarafından bal özü üretiminin kombinasyonu avantajlı olabilir.
Yaprak biti ölümünün enfeksiyondan kaynaklandığını doğrulamak için, kadavralar tipik olarak EPF aşılama odasından nemli filtre kağıdına veya mantar büyümesini gözlemlemek için bir kültür ortamınaaktarılır 11,14,33,34. Bununla birlikte, bu çalışmada, yüksek nemi korumak için aşılama odasında su agar kullanılmış ve yaprak biti kadavralarının mantar büyümesi gözlemi için hareket ettirilmesine gerek kalmadan yapraklar üzerinde kalmasına izin verilmiştir. Müstakil yaprak yöntemi, EPF izolatlarının yaprak öldürücü etkisi hakkında bilgi sağlasa da, yine de sınırlamaları vardır. Yaprak diski durumunu korumak için kullanılan su agarı, aşılama odasında hareket ederken yaprak bitlerinin sıkışmasına neden olabilir. Bu sorunu çözmek için, su agar yüzdesi %3'e çıkarıldı ve Rus buğday yaprak bitlerinin (Diuraphis noxia)20 üzerinde yürümesi için yeterince sağlam bir yüzey sağlandı. Bu deneyde, hardal yaprak bitleri, %1,5 ila %3 arasında değişen konsantrasyonlarda su agar yüzeylerinde rahatça hareket edebildiler. Bununla birlikte, gözlem süresi ilerledikçe, birkaç yaprak biti bacakları yukarı bakacak şekilde baş aşağı sıkıştı ve yaprak diskine geri kurtarılması gerekiyordu. Bu, yaprak biti boyutundaki veya hareketliliğindeki farklılıklardan kaynaklanıyor olabilir, bu da tek başına agar konsantrasyonunun arttırılmasının sorunu çözmeyebileceğini gösterir. Bu nedenle, bu sorunu hafifletmeye yardımcı olabilecek Petri kabı boyutuna daha sıkı oturan bir yaprak kullanarak yaprak diskinin agar yüzeyini tamamen kapladığından emin olun. Yokomi ve Gottwald18 tarafından tanımlanan müstakil yaprak yöntemiyle karşılaştırıldığında, bu çalışma, Petri kabı için yaklaşık olarak iyi bir uyum sağlayan bir yaprak boyutu kullanarak bir yönü geliştirmiştir. Bu, gıda tüketiminin göreceli olarak ölçülmesine izin verir ve açıkta kalan agar yüzeyini en aza indirir. Ek olarak, yaprağın yarı katılaşmış su agarına "gömülmesi" gerekirken, orijinal referansta su agar18 üzerine "yerleştirilmiş" olarak tanımlanmıştır. Yaprak diskini su agarına gömmek, yaprak bitlerinin agar yüzeyine yapışma olasılığını azaltır ve yaprak bitleri bir tarafla sınırlı olduğu için gözlemi kolaylaştırır.
Bu protokol, operasyonları, gözlemleri ve tutarlı sonuçları kolaylaştıran bazı modifikasyonların yanı sıra müstakil yaprak yöntemine ve EPF aşılamasına nasıl devam edileceğine dair ayrıntılı talimatlar sağlar. Ayrıca, laboratuvar koşullarında bitki emici zararlılara karşı EPF izolatlarının seçilmesi için standartlaştırılmış bir yöntem oluşturur. Ayrıca, EPF izolatlarının gelecekte ticarileştirilmesi için bilinen etkili veya ticari olarak mevcut ürünlerle standart bir kontrol yapılması gerçekleştirilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, bu çalışmada herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu araştırma Bilim ve Teknoloji Bakanlığı'ndan (MOST) 109-2313-B-005 -048 -MY3 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 μL Inoculating Loop | NEST Scientific | 718201 | |
| 100 bp DNA Ladder III | Geneaid | DL007 | |
| 2x SuperRed PCR Master Mix | Biotools | TE-SR01 | |
| 50 mL centrifuge tube | Bioman Scientific | ET5050-12 | |
| 6 cm Petri dish | Alpha Plus Scientific | 16021 | |
| 6 mm insect aspirator | MegaView Science | BA6001 | |
| 70 mm filter paper NO.1 | Toyo Roshi Kaisha | ||
| 70% ethanol | |||
| 9 cm Petri dish | Alpha Plus Scientific | 16001 | |
| Agar | Bioman Scientific | AGR001.1 | Microbiology grade |
| Agarose | Bioman Scientific | PB1200 | |
| BioGreen Safe DNA Gel Buffer | Bioman Scientific | SDB001T | |
| Chromas | Technelysium | ||
| GeneDoc | |||
| GenepHlow Gel/PCR Kit | Geneaid | DFH300 | https://www.geneaid.com/data/files/1605861013102532959.pdf |
| Gene-Spin Genomic DNA Isolation Kit | Protech Technology | PT-GD112-V3 | http://www.protech-bio.com/UserFiles/file/Gene-Spin%20Genomic%20DNA%20Kit.pdf |
| Hemocytometer | Paul Marienfeld | 640030 | |
| Komatsuna leaves (Brassica rapa var. perviridis) | Tai Cheng Farm | 1-010-300410 | |
| Microsprayer | |||
| MiniAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A37834 | |
| Mustard aphid (Lipaphis erysimi) | |||
| Painting brush | Tian Cheng brush company | 4716608400352 | |
| Parafilm M | Bemis | PM-996 | |
| Pellet pestle | Bioman Scientific | GT100R | |
| Sabouraud Dextrose Broth | HiMedia | MH033-500G | |
| SPSS Statistics | IBM | ||
| TAE buffer 50x | Bioman Scientific | TAE501000 | |
| Tween 80 | PanReac AppliChem | 142050.1661 |
References
- Ghosh, S., Roy, A., Chatterjee, A., Sikdar, S. R. Effect of regional wind circulation and meteorological factors on long-range migration of mustard aphids over indo-gangetic plain. Scientific Reports. 9, 5626 (2019).
- Dhillon, M. K., Singh, N., Yadava, D. K. Preventable yield losses and management of mustard aphid, Lipaphis erysimi (Kaltenbach) in different cultivars of Brassica juncea(L.) Czern & Coss. Crop Protection. 161, 106070 (2022).
- Huang, F., Hao, Z., Yan, F. Influence of oilseed rape seed treatment with imidacloprid on survival, feeding behavior, and detoxifying enzymes of mustard aphid, lipaphis erysimi. Insects. 10 (5), 144 (2019).
- Mannino, M. C., Huarte-Bonnet, C., Davyt-Colo, B., Pedrini, N. Is the insect cuticle the only entry gate for fungal infection? insights into alternative modes of action of entomopathogenic fungi. Journal of Fungi. 5 (2), 33 (2019).
- Bamisile, B. S., Akutse, K. S., Siddiqui, J. A., Xu, Y. Model application of entomopathogenic fungi as alternatives to chemical pesticides: prospects, challenges, and insights for next-generation sustainable agriculture. Frontiers in Plant Science. 12, 741804 (2021).
- Scorsetti, A. C., Humber, R. A., Garcia, J. J., Lopez Lastra, C. C. Natural occurrence of entomopathogenic fungi (Zygomycetes: Entomophthorales) of aphid (Hemiptera: Aphididae) pests of horticultural crops in Argentina. Biocontrol. 52, 641-655 (2007).
- Liu, Y. C., Ni, N. T., Chang, J. C., Li, Y. H., Lee, M. R., Kim, J. S., et al. Isolation and selection of entomopathogenic fungi from soil samples and evaluation of fungal virulence against insect pests. Journal of Visualized Experiments. 175, e62882 (2021).
- Francis, F., Fingu-Mabola, J. C., Fekih, I. B. Direct and endophytic effects of fungal entomopathogens for sustainable aphid control: a review. Agriculture. 12 (12), 2081 (2022).
- Simon, J., Peccoud, J. Rapid evolution of aphid pests in agricultural environments. Current Opinion in Insect Science. 26, 17-24 (2018).
- Ujjan, A. A., Shahzad, S. Use of Entomopathogenic Fungi for the Control of Mustard Aphid (Lipaphis erysimi) on canola (Brassica napus L). Pakistan Journal of Botany. 44 (6), 2081-2086 (2012).
- Sajid, M., Bashir, N. H., Batool, Q., Munir, I., Bilal, M., Jamal, M. A., et al. In-vitro evaluation of biopesticides (Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae, Bacillus thuringiensis) against mustard aphid Lipaphis erysimi kalt. (Hemiptera: Aphididae). Journal of Entomology and Zoology Studies. 5 (6), 331-335 (2017).
- Paschapur, A. U., Subbanna, A. R. N. S., Singh, A. K., Jeevan, B., Stanley, J., Rajashekara, H., Mishra, K. K., Koti, P. S., Kant, L., Pattanayak, A. Alternaria alternata strain VLH1: a potential entomopathogenic fungus native to North Western Indian Himalayas. Egyptian Journal of Biological Pest Control. 32, 138 (2022).
- Miohammed, A. A. Lecanicillium muscarium and Adalia bipunctata combination for the control of black bean aphid, Aphis fabae. Biocontrol. 63, 277-287 (2018).
- Thaochan, N., Ngampongsai, A., Prabhakar, C. S., Hu, Q. Beauveria bassiana PSUB01 simultaneously displays biocontrol activity against Lipaphis erysimi (Kalt.) (Hemiptera: Aphididae) and promotes plant growth in Chinese kale under hydroponic growing conditions. Biocontrol Science and Technology. 31 (10), 997-1015 (2021).
- Mseddi, J., Farhat-Touzri, D. B., Azzouz, H. Selection and characterization of thermotolerant Beauveria bassiana isolates and with insecticidal activity against the cotton-melon aphid Aphis gossypii (Glover) (Hemiptera: Aphididae). Pest Management Science. 78 (6), 2183-2195 (2022).
- Butt, T. M., Ibrahim, L., Clark, S. J., Beckett, A. The germination behaviour of Metarhizium anisopliae on the surface of aphid and flea beetle cuticles. Mycological Research. 99 (8), 945-950 (1995).
- Ullah, S., Raza, A. B. M., Alkafafy, M., Sayed, S., Hamid, M. I., Majeed, M. Z., Riaz, M. A., Gaber, N. M., Asim, M. Isolation, identification and virulence of indigenous entomopathogenic fungal strains against the peach-potato aphid, Myzus persicae Sulzer (Hemiptera: Aphididae), and the fall armyworm, Spodoptera frugiperda (J.E. Smith) (Lepidoptera: Noctuidae). Egyptian Journal of Biological Pest Control. 32, 2 (2022).
- Yokomi, R. K., Gottwald, T. R. Virulence of Verticillium lecanii Isolates in Aphids Determined by Detached-leaf Bioassay. Journal of Inbertebrate Pathology. 51, 250-258 (1988).
- Vu, V. H., Hong, S. I., Kim, K. Selection of entomopathogenic fungi for aphid control. Journal of Bioscience and Bioengineering. 104 (6), 498-505 (2007).
- Vandenberg, J. D. Standardized bioassay and screening of beauveria bassiana and paecilomyces fumosoroseus against the russian wheat aphid (homoptera: aphididae). Journal of Economic Entomology. 89 (6), 1418-1423 (1996).
- Lu, W. N., Wu, Y. T., Kuo, M. H. Development of species-specific primers for the identification of aphids in Taiwan. Applied Entomology and Zoology. 43 (1), 91-96 (2008).
- Liu, Y. C., et al. Isolation and selection of entomopathogenic fungi from soil samples and evaluation of fungal virulence against insect pests. Journal of Visualized Experiments. 175, e62882 (2021).
- Menger, J., Beauzay, P., Chirumamilla, A., Dierks, C., Gavloski, J., Glogoza, P., et al. Implementation of a diagnostic-concentration bioassay for detection of susceptibility to pyrethroids in soybean aphid (hemiptera: aphididae). Journal of Economic Entomology. 113 (2), 932-939 (2020).
- Zhang, R., Chen, J., Jiang, L., Qiao, G. The genes expression difference between winged and wingless bird cherry-oat aphid Rhopalosiphum padi based on transcriptomic data. Scientific Reports. 9, 4754 (2019).
- Abbott, W. S. A method of computing the effectiveness of an insecticide. Journal of Economic Entomology. 18, 265-267 (1925).
- Liu, T. X., Sparks, A. N. Jr Aphids on Cruciferous Crops: Identification and Management. , Texas A&M AgriLife Extension Service. 9-11 (2001).
- Kuo, M., Chianglin, H. Temperature dependent life table of brevicoryne brassicae (l.)(hemiptera: aphididae) on radish. Formosan Entomologist. 27, 293-302 (2007).
- Im, Y., Park, S., Lee, S. Y., Kim, J., Kim, J. J. Early-Stage defense mechanism of the cotton aphid aphis gossypii against infection with the insect-killing fungus beauveria bassiana JEF-544. Frontiers in Immunology. 13, 907088 (2022).
- Kim, J. J., Roberts, D. W. The relationship between conidial dose, moulting and insect developmental stage on the susceptibility of cotton aphid, Aphis gossypii, to conidia of Lecanicillium attenuatum, an entomopathogenic fungus. Biocontrol Science and Technology. 22 (3), 319-331 (2012).
- Reingold, V., Kottakota, C., Birnbaum, N., Goldenberg, M., Lebedev, G., Ghanim, M., et al. Intraspecies variation ofMetarhiziumbrunneumagainst the green peach aphid,Myzus persicae, provides insight into thecomplexity of disease progression. Pest Management Science. 77, 2557-2567 (2021).
- Ortiz-Urquiza, A., Keyhani, N. O. Action on the Surface: entomopathogenic fungi versus the insect cuticle. Insects. 4, 357-374 (2013).
- Knodel, J. J., Beauzay, P., Boetel, M., Prochaska, T., Chirumamilla, A. 2022 North Dakota Field Crop Insect Management Guide. , 23 North Dakota State University Extension Publication: North Dakota, USA. (2021).
- Yeo, H., Pell, J. K., Alderson, P. G., Clark, S. J., Pye, B. J. Laboratory evaluation of temperature effects on the germination and growth of entomopathogenic fungi and on their pathogenicity to two aphid species. Pest Management Science. 59 (2), 156-165 (2003).
- Erdos, Z., Chandler, D., Bass, C., Raymond, B. Controlling insecticide resistant clones of the aphid, Myzus persicae, using the entomopathogenic fungus Akanthomyces muscarius: fitness cost of resistance under pathogen challenge. Pest Management Science. 77 (11), 5286-5293 (2021).
