Summary
이 프로토콜은 단일유전학적 곤충인 겨자 진딧물(Lipaphis erysimi (Kalt .))에 대한 곤충병원성 곰팡이(EPF)의 효과를 평가하기 위해 최적화된 분리형 잎 생물검정 시스템을 제공합니다. 이 방법은 페트리 접시 실험 중 데이터 수집 프로세스를 간략하게 설명하여 연구원이 겨자 진딧물 및 기타 단일유전 곤충에 대한 EPF의 독성을 일관되게 측정할 수 있도록 합니다.
Abstract
겨자 진딧물(L. erysimi)은 다양한 십자화과 작물을 감염시키고 식물 바이러스를 전염시키는 해충입니다. 친환경적인 해충 관리를 달성하기 위해 곤충병원성 곰팡이(EPF)는 이 해충을 방제하기 위한 잠재적인 미생물 방제제입니다. 따라서 현장 적용 전에 페트리 접시 조건에서 분리한 EPF의 독성 스크리닝이 필요합니다. 그러나 겨자 진딧물은 단일유전학적 곤충이기 때문에 페트리 접시 실험 중에 데이터를 기록하기가 어렵습니다. 이 문제를 해결하기 위해 마이크로 분무기를 사용하여 진딧물에 분생포자를 접종하고 포자 현탁 후 공기 건조를 촉진하여 익사를 방지하는 분리 잎 생물 검정을 위한 수정된 시스템이 개발되었습니다. 시스템은 관찰 기간 내내 높은 상대 습도를 유지했으며 잎 디스크는 10일 이상 신선하게 유지되어 진딧물의 단일유전학적 번식을 허용했습니다. 자손이 쌓이는 것을 방지하기 위해 페인팅 브러시를 사용하여 매일 제거하는 과정이 구현되었습니다. 이 프로토콜은 겨자 진딧물 또는 기타 진딧물에 대한 EPF 분리물의 독성을 평가하기 위한 안정적인 시스템을 보여주며, 진딧물 방제를 위한 잠재적 분리물을 선택할 수 있습니다.
Introduction
겨자 진딧물(L. erysimi)은 다양한 십자화과 작물을 감염시켜 상당한 경제적 손실을 초래하는 악명 높은 해충입니다1. 진딧물 침입을 막기 위해 몇 가지 체계적인 살충제가 권장되었지만, 이러한 살충제의 빈번한 사용은 살충제 내성에 대한 우려를 불러일으킨다 2,3. 따라서 친환경 해충 관리 측면에서 곤충병원성 곰팡이(EPF)는 적절한 대체 방제 전략이 될 수 있습니다. EPF는 숙주의 표피를 뚫고 들어가 숙주를 감염시킬 수 있는 곤충 병원체로, 진딧물 및 기타 식물을 빨아들이는 곤충을 방제하는 강력한 약제입니다4. 또한, EPF는 식물 병원균 길항 작용 및 식물 성장 촉진과 같은 이점을 제공하는 실현 가능하고 지속 가능한 해충 관리 기술임이 입증되었습니다5.
EPF는 곤충 토양 미끼를 통해 얻거나 현장의 곤충 시체에서 분리 할 수 있습니다 6,7. 그러나 진균 분리물을 추가로 사용하기 전에 병원성 스크리닝이 필요합니다. 심각한 피해를 줄 수 있는 중요한 작물 해충인 진딧물에 대한 EPF의 효과에 대한 여러 연구가 수행되었습니다 8,9. 다양한 종의 진딧물 중에서 겨자 진딧물은 Beauveria spp., Metarhizium spp., Lecanicillium spp., Paecilomyces spp., 심지어 Alternaria의 여러 균주에 대한 감수성을 테스트했습니다.이 균주는 주로 부생균 및 식물 병원성 곰팡이로 알려져 있지만 겨자 진딧물에 대해 치명적인 효과를 보였습니다10,11,12.
실험실 조건에서 진딧물에 대한 EPF의 효과를 평가하기 위해 생물학적 검정은 접종 챔버와 곰팡이 접종의 두 가지 주요 부분으로 나눌 수 있습니다. 현재 프로토콜은 진딧물이 촉촉한 면으로 감싼 잎자루가 있는 절제된 잎, 댐핑된 여과지가 늘어선 페트리 접시가 있는 절제된 잎 디스크, 화분 식물에 대한 직접 유지 관리, 또는 페트리 접시 또는 용기(10) 내의 물 한천에 내장된 절제된 잎 디스크와 같은 다양한 방법을 사용하여 진딧물을 유지할 수 있는 접종 챔버의 구성을 설명합니다. 11,13. 진균 접종을 위한 일반적인 방법으로는 분생포자 살포, 분생포자 현탁액에 진딧물 침지, 분생포자 현탁액에 잎 담그기, 식물 내생식물 접종11,14,15,16이 있다. 다양한 접종 방법이 존재하지만 생물학적 검정은 현장 적용 조건을 시뮬레이션해야 합니다. 예를 들어, 잎 담근 방법(12,17)의 경우, EPF의 효율을 평가할 수 있지만, 진딧물이 곰팡이가 집재된 잎에 감염되기 때문에, 우선 침투 부위인 진딧물의 등쪽은 일반적으로 곰팡이에 노출되지 않는다.
실험실 조건에서 EPF의 살충 효과를 평가하기 위해 이 프로토콜은 Yokomi 및 Gottwald18에 의해 설명된 분리 잎 방법을 약간의 수정과 함께 사용한 다음 마이크로 분무기를 사용하여 분생포자 접종을 제안합니다. 이 방법은 물의 추가 보충을 요구하지 않고 최소 7일 동안 생물학적 검정 챔버에서 약 100%의 습도를 유지합니다18,19. 또한, 진딧물을 한 표면에 가두면 분생포자 살포에 노출되고 관찰이 용이해진다20. 그러나 진딧물은 접종 챔버 내에서 이동하는 동안 노출된 한천 표면에 달라붙을 수 있습니다. 또한, 단일유전학적 곤충인 겨자 진딧물에 대한 페트리 접시 실험에서 데이터를 기록하는 것은 빠른 발달과 번식으로 인해 어려울 수 있습니다. 백신을 접종한 성인과 제거하지 않고는 자손을 구별하기 어렵습니다. 이 단계를 진행하는 방법에 대한 세부 정보는 거의 언급되지 않으며 잎 소비 면적과 같은 일부 일관되지 않은 요소를 최적화해야 합니다.
이 프로토콜은 겨자 진딧물에 대한 EPF 분리물의 독성을 스크리닝하기 위한 안정적인 시스템을 보여주며, 광범위한 EPF 라이브러리에서 다양한 진딧물 종에 대한 잠재적 분리물을 선택할 수 있습니다. 현장에서 채취한 진딧물을 식별할 수 있으며, 일관된 결과를 얻을 수 있는 쉽고 실현 가능한 방법론을 사용하여 다양한 곰팡이 분리물의 살균 효과를 평가하기 위해 겨자 진딧물의 충분한 실험실 집단을 설정할 수 있습니다. 진딧물은 농업생태계의 강렬하고 반복적인 인위적 압력에 대응하여 여러 진화 메커니즘을 개발하여 식량 안보에 도전장을 내밀었다9. 그러므로, 이 기술된 방법은 다양한 진딧물 종에 대한 잠재적인 EPF 분리물을 평가하기 위해 확장될 수 있다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
참고: 전체 순서도는 그림 1에 나와 있습니다.
1. 겨자 진딧물 수집 및 유지 관리
- 겨자 진딧물의 수집
- 잎을 뒤집고 밭의 십자화과 작물에 겨자 진딧물이 침입했는지 육안으로 확인하십시오.
- 샘플링 장소 정보(예: GPS)와 숙주 식물을 기록하고 농부와 살충제 살포 이력을 확인합니다.
- 곤충 흡인기 또는 미세한 페인팅 브러시( 재료 표 참조)를 사용하여 밭의 십자화과 작물에서 약 50마리의 겨자 진딧물을 50mL 원심분리 튜브에 수집하고 샘플을 3시간 이내에 실험실로 가져옵니다.
- 절제된 십자화과 잎과 바닥에 물이 침투한 여과지가 있는 임시 유지 관리 페트리 접시를 준비합니다.
- 5 개의 진딧물을 상대 습도 70 %의 실온 (25 ± 2 ° C)과 12:12 h (밝은 : 어두운) 광주기에서 14 일 동안 임시 유지 관리 페트리 접시에 놓아 진딧물이 추가 사육 전에 천적이 없는지 확인합니다.
알림: 현장에서 채집한 진딧물에 기생 말벌이나 곤충병원성 곰팡이와 같은 천적이 없는지 확인하려면 추가 사육을 진행하기 전에 이러한 유기체가 없는지 확인하는 것이 중요합니다.
- 겨자 진딧물의 유지 관리
알림: 겨자 진딧물을 유지하려면 살충제가 없는(생물 살충제 포함) 십자화과 잎을 사용하십시오.- 십자화과 잎 (약 25cm2)의 안정적이고 충분한 공급을 제공하십시오.
알림: 십자화과 잎은 시장에서 구하거나 식물을 재배하십시오. 겨자 진딧물을 장기적으로 대량으로 사육하기 전에 여러 종류의 십자화과를 테스트하여 적합한 십자화과를 찾을 수 있었습니다. 십자화과 잎의 종이 고정되면 변경하지 마십시오. 이 연구에서는 6-7잎 단계의 Komatsuna(Brassica rapa var. perviridis)를 사용했습니다( 자료표 참조). 또한 가장 오래된 잎 2-3개를 폐기하십시오. - 바닥의 여과지가 완전히 마르기 전에 물을 추가하십시오.
- 매일 겨자 진딧물의 인구 밀도를 관찰하십시오. 개체수는 7일 후에 2-3배로 증가해야 합니다.
- 진딧물의 수가 증가하면 겨자 진딧물로 원래 절제 된 잎을 4-6 개의 작은 조각으로 자르고 겨자 진딧물이있는 각 작은 잎 조각을 신선한 절제 된 잎과 물이 침투 한 여과지와 함께 하나의 페트리 접시에 넣습니다.
- 페트리 접시를 25°C의 인큐베이터에 넣고 12:12시간(밝음:어두움) 광주기로 매일 겨자 진딧물의 개체군 밀도를 관찰합니다.
- 대부분의 진딧물이 원래 잎이 썩기 전에 신선한 절제된 잎으로 이동한 후 원래 절제된 잎을 제거하십시오.
- 십자화과 잎 (약 25cm2)의 안정적이고 충분한 공급을 제공하십시오.
2. 겨자 진딧물의 분자 식별
참고: 현장에서 채집한 겨자 진딧물의 종을 확인하기 위해, 두 개의 분자 마커, 즉 Lu et al.21이 설계한 서열 특성 증폭 영역(SCAR) 기반 A05Le와 겨자 진딧물의 겨자 진딧물 시토크롬 산화효소 소단위 1(COI) 영역을 사용하여 분자 식별을 수행했습니다.
- 겨자 진딧물 게놈 DNA 추출
- 1.5mL 원심분리 튜브에 약 50마리의 진딧물을 수집합니다.
참고: 분자 식별에 사용되는 진딧물은 단일 진딧물의 후손이어야 하며 DNA 추출을 위해 다양한 단계를 동일한 튜브에 모을 수도 있습니다. - 펠릿 유봉으로 진딧물을 균질화하고 제조업체의 지침에 따라 Gene-Spin Genomic DNA Isolation Kit를 사용하여 DNA를 추출합니다( 재료 표 참조).
- 예열된 50μL의 뉴클레아제가 없는 물로 게놈 DNA를 용출합니다.
- 1.5mL 원심분리 튜브에 약 50마리의 진딧물을 수집합니다.
- PCR 증폭 및 DNA 염기서열분석
- 프라이머 쌍 A05LeF/A05LeR 및 LeCO1F/LeCO1R(표 1)과 PCR Master Mix(2x)를 사용하여 진딧물 게놈 DNA의 표적 DNA 염기서열을 서로 다른 PCR 프로그램과 함께 증폭합니다21.
참고: 총 부피가 20μL인 PCR 반응은 2μL 진딧물 게놈 DNA 템플릿, 1μL 정방향 및 1μL 역방향 프라이머, 10μL PCR 마스터 믹스( 재료 표 참조) 및 6μL ddH2O로 구성됩니다. - 뒤에 오는 프로그램을 가진 열 cycler에 있는 PCR를 실행하십시오 ( 물자의 표 보십시오): 5 분 동안 94 °C, 45 s, 61 °C (A05LeF/A05LeR를 위해) 및 58 °C (LeCO1F/LeCO1R를 위해) 45 s, 1 분 동안 72 °C의 마지막 연장에 선행된 5 분, 25 주기를 위한 94 °C, 45 s를 위한 61 °C (A05LeF/A05LeR를 위해) 및 5 분 동안 72 °C의 마지막 연장에 선행되십시오.
- 겨자 진딧물의 정체를 확인하기 위해 1% 아가로스 겔 전기영동으로 PCR 산물을 분석합니다(그림 2).
참고 : 프라이머 쌍 A05LeF / A05LeR이 DNA 조각의 정확한 크기를 성공적으로 증폭하면 현장에서 수집 된 진딧물이 겨자 진딧물21로 설득력 있게 식별됩니다. 프라이머 쌍은 표 2에 나열되어 있습니다. - 제조업체의 지침( 재료 표 참조)에 따라 시판되는 겔/PCR 키트를 사용하여 겨자 진딧물 COI 앰플리콘의 PCR 산물을 정제하고 상용 염기서열분석 서비스를 사용하여 PCR 산물의 염기서열을 분석합니다.
- 프라이머 쌍 A05LeF/A05LeR 및 LeCO1F/LeCO1R(표 1)과 PCR Master Mix(2x)를 사용하여 진딧물 게놈 DNA의 표적 DNA 염기서열을 서로 다른 PCR 프로그램과 함께 증폭합니다21.
- 염기서열 분석
참고 : Lu et al.21에 따르면, A05Le의 DNA 굽힘은 겨자 진딧물 특이적 DNA 조각입니다. 따라서, A05Le PCR 산물은 추가 서열분석이 필요하지 않다.- LeCO1 염기서열을 얻은 후 Chromas 소프트웨어( 재료 표 참조)로 판독 품질을 확인합니다.
- fasta(또는 txt) 파일을 열고 저품질 읽기를 직접 제거하여 업스트림 및 다운스트림 저품질 읽기를 트리밍합니다.
- 기본 매개 변수를 사용하여 트리밍된 시퀀스를 NCBI 웹 BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)에 제출합니다.
참고: A05Le 및 LeCO1 프라이머 세트의 앰플리콘 크기가 올바른 경우 이론적으로 NCBI 표준 데이터베이스에 대한 염기서열 폭발 검색은 겨자 진딧물과 일치해야 합니다.
3. 곤충병원성 곰팡이의 제조
참고: 이 연구에 사용된 EPF는 표 1에 나와 있습니다.
- 곰팡이 라이브러리에서 EPF 회수
- -80°C 냉동실에서 보존된 곰팡이 육수(30% 글리세린에 현탁된 분생포자)를 해동합니다.
- 소량(약 10μL)의 분생포자 현탁액을 6cm 1/4 Sabouraud 포도당 한천(SDA) 플레이트(100mLddH2O당 1.5g의 한천이 포함된 0.75g의 Sabouraud 포도당 육수)에 옮기고 층류 후드의 셀 스프레더를 사용하여 고르게 펴 바릅니다.
- 페트리 접시를 파라핀 필름으로 밀봉하고 25-14일 동안 25°C의 어두운 곳에서 배양합니다.
- 분생포자 22를 수확하기 전에 1/4 SDA 플레이트에 곰팡이 덩어리를 줄무늬로 만들고25°C에서 10-14일 동안 어둠 속에서 곰팡이를 배양하여 분리한 곰팡이를 다시 배양합니다.
참고: 진딧물을 접종하기 약 10일 전에 곰팡이 배양을 사용해야 합니다. 14일 이상 된 EPF 배양물은 독성 검사에 사용하지 않는 것이 좋습니다.
- 분생포자 현탁액의 제조
- 2-3 mL 0.03 % 트윈 80을 첨가 한 후 루프를 접종하여 1/4 SDA 플레이트에 10-14 일 된 곰팡이 배양액에서 분생포자를 긁어냅니다 ( 재료 표 참조).
- 곰팡이 현탁액을 원심분리기 튜브에 모으십시오.
- 용액을 최고 속도로 소용돌이치고, 광학 현미경으로 혈구계를 사용하여 분생포자의 수를 세고, 분생포자 현탁액의 농도를 108 분생포자/mL로 조정합니다.
- 분생포자 현탁액을 UV 멸균 마이크로 분무기로 옮깁니다.
알림: 분생포자는 침전되기 쉽기 때문에 분생포자 현탁액을 옮기기 전에 다시 소용돌이치십시오. 마이크로 분무기는 사용하기 전에 30분 동안 층류 후드에서 자외선에 노출되어야 합니다.
4. 겨자 진딧물에 대한 독성 스크리닝
- 새롭게 떠오르는 성인의 준비
- 양육 페트리 접시에서 갓 잘라낸 잎으로 적성(날개가 없는) 성충(날개가 있는)을 움직여 같은 나이의 새로운 자손을 번식시킵니다. 과밀을 피하고 자손의 생산을 최소화하기 위해 24시간 후에 성체를 제거한다23,24. 적정성 성체만이 추가 실험에 사용될 것이다.
- 실험을 위해 진딧물 간의 연령 변화를 방지하기 위해 자손을 성체 단계로 키우고 48시간 후에 성체 단계로 발달하지 않는 자손을 제거합니다(그림 3). 또한 성충을 제거하십시오.
- 접종 챔버의 준비
알림: 먼저 직경 9cm의 십자화과 잎을 준비하여 응고 전에 잎 디스크를 물 한천에 묻을 수 있도록 하는 것이 좋습니다.- 십자화과 잎을 수돗물로 씻고 먼지와 잔여물, 기타 절지동물이 있는 경우 제거합니다.
- 종이 타월로 여분의 물을 닦아내고 실체현미경을 사용하여 십자화과 잎 표면에 다른 절지동물이 있는지 확인합니다. 절지동물이 있는 경우 제거합니다.
- 직경 9cm의 잎 디스크를 잎의 바닥 페트리 접시를 틀로 직접 누르거나 가위를 사용하여 자릅니다.
참고: 잎의 지름이 9cm보다 작으면 절제된 잎 두 개를 결합합니다. - 전자레인지를 사용하여 1.5mL ddH2O에 한천 450mg(재료 표 참조)을 가열하고 용해시켜 각 페트리 접시에 대해 2% 물 한천을 준비합니다.
참고: 1.5% 물 한천의 양은 실험 규모에 따라 조정할 수 있습니다. - 층류 후드에서 응고되기 전에 9cm 페트리 접시에 1.5 % 물 한천 30mL를 붓고 한천 표면이 반 응고될 때까지 한천이 ~ 40 ° C로 냉각 될 때까지 기다립니다.
알림: 페트리 접시를 수평으로 부드럽게 흔들어 표면이 반응고되었는지 확인하십시오. - 잎 디스크를 물 한천 위에 올려 놓고 잎 디스크를 한천에 끼웁니다.
알림: 한천 표면의 노출을 최소화하십시오. - 물 한천이 완전히 굳은 후 페트리 접시의 덮개를 닫습니다.
알림: 덮개에 많은 물방울이 응축되는 경우 즉시 수분 기화 덮개를 엽니다. - 잎 원반에 20 마리의 적성체를 놓습니다.
알림: 입 부분의 손상을 방지하기 위해 실체현미경으로 수술하는 것이 좋습니다.
- EPF 접종 및 관찰
- 접종 챔버의 커버를 열고 0.3mL의 분생포자 현탁액(3.2단계에서)을 잎 디스크 위 약 15cm에서 진딧물과 잎 디스크에 직접 분사합니다.
알림: 분무하기 전에 분생포자 현탁액을 다시 소용돌이치십시오. 분무 영역은 분무기마다 다를 수 있으므로 실험 전에 테스트해야 합니다. 이 경우 15cm 거리에서 0.3mL를 권장합니다. 분무 영역은 잎 디스크 전체를 덮어야 하며 분생포자 현탁액의 얇은 층이 잎 디스크를 덮어야 합니다. 물방울이 잎에 고인 물로 수렴하면 접종량을 줄여야 합니다. 접종 전과 다른 분리제를 사용하는 사이에 70% 에탄올로 테이블을 청소하십시오. - 분생포자 현탁액이 마를 때까지 기다렸다가 겨자 진딧물이 익사하는 것을 방지하기 위해 덮개를 닫습니다.
참고 : 진딧물은 실험 중에 거의 돌아 다니지 않습니다. 그러나 진딧물이 탈출하지 않도록 하는 것은 여전히 필요합니다. - 높은 상대 습도를 유지하기 위해 파라핀 필름으로 접종 챔버를 밀봉하고 접종 챔버를 25°C의 인큐베이터에 12:12h(밝음:어두운) 광주기로 둡니다.
- 접종 챔버의 덮개를 열어 5일 동안 12시간마다 실체현미경으로 사망률을 계산합니다.
- 종이 타월로 덮개에 붙어있는 단물을 닦아내고 미세한 페인팅 브러시로 새로 나온 진딧물을 제거합니다. 24시간마다 수돗물로 덮개를 청소하십시오.
참고 : 관찰 기간은 성충 수명에 따라 진딧물의 종에 따라 다를 수 있습니다. - 성공적인 접종을 확인하기 위해 진균증에 대한 사체를 잎 디스크에 보관하십시오.
- 접종 챔버의 커버를 열고 0.3mL의 분생포자 현탁액(3.2단계에서)을 잎 디스크 위 약 15cm에서 진딧물과 잎 디스크에 직접 분사합니다.
- 분생포자 발아율 확인
참고: 이 단계는 선택 사항입니다. 분생포자의 활성을 보장하기 위해 독성 스크리닝을 수행할 때 분생포자 발아율을 쌍으로 확인합니다.- 5μL 분생포자 현탁액 한 방울을 1/4 SDA에 떨어뜨려 3회 반복합니다.
- 18시간 후 광학 현미경으로 발아율을 계산합니다. 곰팡이 발아 속도를 확인하기 위해 단일 방울에서 최소 100개의 포자를 무작위로 계산합니다.
참고: 일반적으로 실험에 사용된 분리물의 발아율은 90% 이상이어야 합니다.
5. 선택된 EPF 분리물의 생물학적 검정
참고: 4단계에서 선택된 높은 독성을 보인 EPF 분리물은 4가지 농도의 분생포자 현탁액(104 내지 107 분생포자/mL 범위)을 사용하여 겨자 진딧물에 대한 생물학적 검정을 실시했습니다.
- 분생포자 현탁액의 제조
- 3.1단계를 반복하여 선택한 EPF 분리를 복구합니다.
- 3.2단계를 반복하여 10 4, 105,10 6 및 107 분생포자/mL를 포함한4가지 농도의 분생포자 현탁액을 준비합니다.
- 새롭게 떠오르는 성인의 준비
- 4.1단계를 반복하여 새로 태어난 성인을 준비시킵니다.
- 접종 챔버의 준비
- 4.1단계를 반복합니다. 접종 챔버를 준비합니다.
- EPF 접종 및 관찰
- 4.3단계를 반복합니다. 각각 4가지 농도의 분생포자 현탁액으로 EPF 접종 및 관찰을 수행합니다.
6. 통계 분석
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
제시된 순서도는 현장 채집부터 독성 스크리닝에 이르기까지 겨자 진딧물의 안정적인 상태를 보여줍니다. 밭에서 채취한 진딧물의 유지는 적절한 식량 공급과 함께 진딧물 군집의 안정적인 증가를 보장했습니다. 현장에서 채취한 진딧물은 PCR 앰플리콘 크기 및 LeCO1 염기서열분석을 포함한 분자 마커를 사용하여 겨자 진딧물로 확인되었습니다. 잎 분리법을 사용하여 수행된 독성 스크리닝은 겨자 진딧물에 대한 일관된 생존율을 보여주었으며 대조군은 85%의 생존율을 보였습니다(그림 4).
독성 스크리닝 중 Cc-NCHU-213은 가장 빠른 진딧물 사멸 능력을 보였으며, 접종 후 3일 및 4.5일(d.p.i.)에 각각 50%와 90%의 사망률을 보였습니다(그림 4). 그러나 5 개의 B. bassiana 분리물에서 다양한 진딧물 살해 능력이 관찰되었습니다. Bb-NCHU-141, -143 및 -153은 0.03% 트윈 80 살포 또는 기타 치명적 요인의 효과를 제외하더라도 3 d.p.i.에서 사망률이 5%에 불과하여 느린 진딧물 사멸 능력을 보였습니다(그림 4). 따라서 대조군 사망률을 정규화하기 위해 수정된 사망률 공식이 사용되었습니다. 겨자 진딧물에 대한 대부분의 EPF 분리물은 Pl-NCHU-152를 제외하고 5 d.p.i. 내에서 70% 이상의 보정된 사망률을 나타냈다(표 3). 이들 EPF 분리체 중에서, Bb-NCHU-286은 100%의 가장 높은 사망률을 보였다(표 3). 또한, 독성 스크리닝 중에 Metarhizium spp., Beauveria spp., Purpureocillium lilacinum 및 Cordyceps cateniannulata 에 감염된 겨자 진딧물의 사체에서 EPF 진균증이 관찰되어 이 시스템의 효과를 나타냅니다(그림 5).
독성 스크리닝 결과에 따라 빠른 곤충 사멸 활성(3d.p.i.에서 각각 40% 및 50% 사망률)을 나타내는 두 개의 EPF 분리물, 즉 Mb-NCHU-197 및 Cc-NCHU-213이 겨자 진딧물에 대한 생물학적 분석을 위해 선택되었습니다. 그 결과, 107 conidia/mL를 접종했을 때 3 및 4 d.p.i.에서 Mb-NCHU-197 및 Cc-NCHU-213의 보정 사망률이 유의하게 다른 것으로 나타났습니다(그림 6). LT50 분석에서 Cc-NCHU-213의 107 conidia/mL를 사용한 처리는 다른 처리에 비해 유의하게 짧은 기간을 나타냈습니다(표 4). 또한, Cc-NCHU-213의 LC50 값(9.32 × 104)은 Mb-NCHU-213(2.30 × 10 5)보다 낮았으며, 이는 Cc-NCHU-213이 겨자 진딧물에 대해 더 큰 독성을 가지고 있음을 나타낸다(표 5).
그림 1: 겨자 진딧물에 대한 EPF 독성을 스크리닝하기 위한 실험 흐름도. (A) 겨자 진딧물 사육 시스템의 확립. (B) EPF의 제조. (C) 곰팡이 접종. (D) 통계 분석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: A05Le 및 Le CO1 프라이머 세트로 증폭된 겨자 진딧물 게놈 DNA의 전기영동. 전기영동은 1% 아가로스 겔에 대해 수행하였다. M = 100 bp DNA 사다리; bp = 염기쌍. 빨간색 별표는 PCR 증폭의 대상 굴곡을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 적성(apterous fourth-instar) 애벌레와 성체 겨자진딧물의 차이점 . (A) 넷째 인스타 애벌레. (b) 성인. 네 번째 인스타 애벌레의 뒷다리 경골은 희끄무레하다(빨간색 화살표로 표시). 새로 출현한 진딧물은 독성 테스트 중에 미세한 낙타 브러시로 제거되었습니다. 축척 막대 = 1mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 분리된 잎 방법을 통해 겨자 진딧물에 대해 분리한 13개의 EPF의 사망률 히트 맵. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 13개의 EPF 분리체의 진균증 관찰. Mepe-NCHU-2 = 메타히지움 펨피지; Mp-NCHU-11 = 메타히지움 핑가엔세; Mb = 메타리지움 바오샤넨세; Cc = 동충하초 cateniannulata; Ba = Beauveria australis; Bb = 보베리아바시아나; Pl = 푸르푸레오실리움 라일라시눔. 축척 막대 = 1mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 겨자 진딧물에 대한 곰팡이 분리 Mb-NCHU-197 및 Cc-NCHU-213의 보정된 사망률. 오차 막대는 표준 편차(SD)를 나타냅니다. 동일한 접종 농도로 동일한 시점의 Mb-NCHU-197 및 Cc-NCHU-213의 사망률을 독립적인 t-test를 사용하여 비교한 결과, 별표로 표시된 사망률은 유의하게 다른 것으로 나타났습니다(p < 0.05). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 격리 | 종 | 호스트 또는 소스* | 위치 |
| MP-NCHU-2 | 메타히지움 천포창(Metarhizium pemphigi) | 토양 | 이란 |
| ML-NCHU-9 | 메타리지움 레피디오타(Metarhizium lepidiotae) | 토양 | 이란 |
| MP-NCHU-11 | Metarhizium pinghaense | 토양 | 이란 |
| 바-NCHU-113 | 보베리아 오스트랄리스(Beauveria australis) | 토양 | 타이중 |
| BB-NCHU-141 시리즈 | 보베리아 바시아나 | 하이포테네무스 함페이 | 자이 |
| BB-NCHU-143 시리즈 | 보베리아 바시아나 | 하이포테네무스 함페이 | 자이 |
| PL-NCHU-152 시리즈 | 푸르푸레오실리움 라일라시눔 | 테사라토마 유두증(Tessaratoma papillosa) | 자이 |
| BB-NCHU-153 시리즈 | 보베리아 바시아나 | Rhynchophorus ferrugineus (린코포루스 페루기네우스) | 청화 |
| BB-NCHU-157 시리즈 | 보베리아 바시아나 | Rhynchophorus ferrugineus (린코포루스 페루기네우스) | 청화 |
| MB-NCHU-196 | 메타히지움 바오샤넨세 | 토양 | 타이중 |
| MB-NCHU-197 | 메타히지움 바오샤넨세 | 토양 | 타이중 |
| 참조 - NCHU-213 | 동충하초 cateniannulata | 토양 | 타이중 |
| BB-NCHU-286 시리즈 | 보베리아 바시아나 | Cerambycidae (세람비시다과) | 타이중 |
표 1: 이 연구에 사용된 EPF 분리물.
| 프라이머 이름 | 시퀀스 (5' - 3') | 제품 크기 (bp) | 참조 | |
| A05르 | F-GGGTCTTGGATGGTGTGGTG | 953 | Lu 외. [21] | |
| R-AGGGGTCTTGTCGCCATTTT | ||||
| LeCO1 (이산화탄소)1 | F-CTTTTCCCATGATCAATTTT | 593 | 본 연구는 | |
| R-ACGTAGTGGAAATGAGCAAC | ||||
표 2: 겨자 진딧물의 분자 식별에 사용되는 프라이머 쌍.
| 격리 | 종 | 수정된 사망률(%) |
| MP-NCHU-2 | 메타히지움 천포창(Metarhizium pemphigi) | 76.47 |
| ML-NCHU-9 | 메타리지움 레피디오타(Metarhizium lepidiotae) | 82.35 |
| MP-NCHU-11 | Metarhizium pinghaense | 76.47 |
| 바-NCHU-113 | 보베리아 오스트랄리스(Beauveria australis) | 82.35 |
| BB-NCHU-141 시리즈 | 보베리아 바시아나 | 88.24 |
| BB-NCHU-143 시리즈 | 보베리아 바시아나 | 88.24 |
| PL-NCHU-152 시리즈 | 푸르푸레오실리움 라일라시눔 | 35.29 |
| BB-NCHU-153 시리즈 | 보베리아 바시아나 | 82.35 |
| BB-NCHU-157 시리즈 | 보베리아 바시아나 | 88.24 |
| MB-NCHU-196 | 메타히지움 바오샤넨세 | 76.47 |
| MB-NCHU-197 | 메타히지움 바오샤넨세 | 88.24 |
| 참조 - NCHU-213 | 동충하초 cateniannulata | 94.12 |
| BB-NCHU-286 시리즈 | 보베리아 바시아나 | 100.00 |
표 3: 접종 후 5일(d.p.i.)에 겨자 진딧물에 대한 13개의 EPF 분리물의 수정된 사망률.
| 격리 | 종 | 농도(분생포자/mL) | N* | LT50 (일)† | 95% 신뢰 한계 | 경사(SE) | X2 (df)‡ |
| MB-NCHU-197 | 메타히지움 바오샤넨세 | 104 | 60 | 3.816 암페어 | 3.61–4.05 | 0.60 (0.05) | 15.64 (28) |
| 105호 | 60 | 3.112 보드 | 2.95–3.28 | 0.72 (0.05) | 14.61 (28) | ||
| 106 | 60 | 2.908 b | 2.76–3.06 | 0.85 (0.06) | 15.04 (28) | ||
| 107호 | 60 | 2.549 씨 | 2.40–2.69 | 0.90 (0.06) | 24.31 (28) | ||
| 참조 - NCHU-213 | 동충하초 cateniannulata | 104 | 60 | 3.948 암페어 | 3.71–4.23 | 0.53 (0.05) | 8.81 (28) |
| 105호 | 60 | 3.237 디 | 3.07–3.41 | 0.72 (0.05) | 22.86 (28) | ||
| 106 | 60 | 2.414 씨 | 2.28–2.54 | 1.08 (0.07) | 28.30 (28) | ||
| 107호 | 60 | 2.132 전자 | 2.02–2.25 | 1.41 (0.10) | 28.96 (28) | ||
| *관찰된 곤충의 수. | |||||||
| †다른 문자로 표시된 LT50 값은 95% 신뢰 한계가 겹치지 않기 때문에 크게 다른 것으로 간주되었습니다. | |||||||
| ‡X2, Pearson의 적합도 검정의 카이제곱 값; DF, 자유도 | |||||||
표 4: 진균 분리 Mb-NCHU-197 및 Cc-NCHU-213의 LT50 값은 다양한 분생포자 농도에서 겨자 진딧물에 대해 분리됩니다. *관찰된 곤충의 수. 다른 문자로 표시된 †LT50 값은 95% 신뢰 한계가 겹치지 않기 때문에 유의하게 다른 것으로 간주되었습니다. ‡X2, Pearson의 적합도 검정의 카이제곱 값; DF, 자유도.
| 격리 | 종 | N* | LC50 (분생포자/mL)† | 95% 신뢰 한계 | 슬로포(SE) | X2 (df)‡ |
| MB-NCHU-197 | 메타히지움 바오샤넨세 | 240 | 2.30 × 105 암페어 | 8.63 × 104–5.70 × 105 | 0.43 (0.08) | 10.14 (10) |
| 참조 - NCHU-213 | 동충하초 cateniannulata | 240 | 9.32 × 104 암페어 | 4.97 × 104–1.62 × 105 | 0.76 (0.09) | 4.33 (10) |
| *관찰된 곤충의 수. | ||||||
| †다른 문자로 표시된 LC50 값은 95% 신뢰 한계가 겹치지 않기 때문에 크게 다른 것으로 간주되었습니다. | ||||||
| ‡X2, Pearson의 적합도 검정의 카이제곱 값; DF, 자유도 | ||||||
표 5: 겨자 진딧물에 대한 곰팡이 분리 Mb-NCHU-197 및 Cc-NCHU-213의 LC50 값. *관찰된 곤충의 수. 다른 문자로 표시된 †LC50 값은 95% 신뢰 한계가 겹치지 않기 때문에 크게 다른 것으로 간주되었습니다. ‡X2, Pearson의 적합도 검정의 카이제곱 값; DF, 자유도.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
채소의 일종인 십자화과는 겨자 진딧물(L. erysimi)과 양배추 진딧물(Brevicoryne brassicae)을 포함한 여러 진딧물 종에 의해 자주 감염됩니다.26 두 종 모두 대만27에서 보고되었으며, 채취 장소에서 공존할 가능성이 있다. 밀접하게 관련된 진딧물 종을 구별하기 위해 본 연구는 다중 프라이머 세트21을 이용한 분자 식별 기법을 사용하였다. 겨자 진딧물 COI 유전자 단편으로부터 분자 마커를 설계함으로써, 우리는 겨자 진딧물을 성공적으로 식별하여, 이를 위한 분자 마커 A05Le의 신뢰성을 확인하였다21.
관찰 결과, 크기나 형태만으로 적성충 제4 인스타 애벌레와 성체 겨자 진딧물을 구별하는 것은 경험 없이는 어려운 일이라는 사실이 밝혀졌습니다. 그러나 결정적인 특징은 뒷다리의 경골인데, 이 경골은 4번째 애벌레에서는 하얗게 보이지만 성충에서는 그렇지 않다(그림 3). 목화 진딧물에 대한 L. attenuatum, B. bassiana, 녹색 복숭아 진딧물에 대한 M. brunneum에 대한 이전 연구는 털갈이가 감염을 피하기 위한 전략이 될 수 있음을 보여주었습니다28,29,30. 따라서 진딧물 단계를 잘못 식별하면 탈피가 EPF28,29,31의 효과에 영향을 미칠 수 있으므로 독성 평가에 오류가 발생할 수 있습니다. 이 문제를 해결하고 독성 평가의 정확성과 정밀도를 높이려면 의도적으로 진딧물 애벌레를 사용하지 않는 한 성충 단계에 도달하지 않은 뒷다리 경골에 희끄무레한 부분이 있는 진딧물을 제외하십시오. 이 진딧물은 완전히 성숙하지 않고 털갈이를 할 수 있으므로 EPF의 감염 과정을 피할 수 있습니다. 또한 12시간마다 관찰 및 데이터 기록의 시간 과정을 사용하는 것이 좋습니다. 12시간 간격은 유사한 진딧물 사멸 능력을 가진 여러 유망한 분리체 간의 차이점을 입증하는 데 선호되며 LT50의 정확한 계산을 용이하게 합니다. 그러나 시간 간격은 다른 곤충 종의 다른 생활주기에 따라 조정되거나 소규모 사전 테스트를 통해 결정될 수 있습니다.
분리된 잎 방법은 잎 디스크에 최소한의 단물을 남길 수 있지만 잎 디스크가 가까이 있기 때문에 대부분의 단물은 페트리 접시 덮개에 부착됩니다. 관찰 기간 동안 닦거나 씻겨 나갈 수 있습니다. 그러나 단물은 의심할 여지 없이 진딧물이 침입할 때 작물 재배의 실제 환경에 존재합니다32. 접종 챔버에 존재하는 단물은 EPF가 현장에서 진딧물에 접종될 때의 상황을 다소 시뮬레이션할 수 있습니다. 진딧물 표피는 대부분 곰팡이의 영양분 공급원 역할을 하고 EPF16의 발아를 자극할 수 있는 단물을 함유하고 있습니다. 따라서, EPF 적용과 진딧물에 의한 단물 생산의 조합이 유리할 수 있다.
진딧물의 죽음이 감염에 의한 것임을 확인하기 위해, 시체는 전형적으로 EPF 접종 챔버로부터 축축한 여과지 또는 곰팡이 파생물을 관찰하기 위한 배양 배지로 옮겨진다 11,14,33,34. 그러나 이 연구에서는 높은 습도를 유지하기 위해 접종 챔버에서 물 한천을 사용하여 진딧물 사체를 곰팡이 발육 관찰을 위해 이동할 필요 없이 잎에 남아 있을 수 있도록 했습니다. 분리형 분석법은 EPF 분리물의 살충 효과에 대한 정보를 제공하지만, 여전히 한계가 있습니다. 잎 디스크 상태를 유지하기 위해 사용되는 물 한천은 접종 챔버에서 이동하는 동안 진딧물이 달라붙을 수 있습니다. 이 문제를 해결하기 위해 물 한천의 비율을 3%로 높여 러시아 밀 진딧물(Diuraphis noxia)이20을 걸을 수 있을 만큼 단단한 표면을 제공했습니다. 이 실험에서 겨자 진딧물은 농도가 1.5 %에서 3 % 사이 인 물 한천 표면에서 편안하게 움직일 수있었습니다. 그러나 관찰 기간이 진행됨에 따라 몇 마리의 진딧물이 다리를 위로 향하게 한 채 거꾸로 꼼짝없이 갇혀 잎 원반으로 다시 구조되어야 했습니다. 이는 진딧물의 크기나 이동성의 차이 때문일 수 있으며, 한천 농도를 높이는 것만으로는 문제가 해결되지 않을 수 있음을 나타냅니다. 따라서 이 문제를 완화하는 데 도움이 될 수 있는 페트리 접시 크기에 더 꼭 맞는 잎을 사용하여 잎 디스크가 한천 표면을 완전히 덮는지 확인하십시오. Yokomi와 Gottwald18에 의해 기술된 분리된 잎 방법과 비교하여, 이 연구는 페트리 접시에 거의 잘 맞는 잎 크기를 사용함으로써 한 가지 측면을 개선했습니다. 이를 통해 식품 소비를 상대적으로 정량화할 수 있고 노출된 한천 표면을 최소화할 수 있습니다. 추가적으로, 그 잎은 반-응고된 물 한천에 "매립"될 필요가 있는 반면, 원래의 참고문헌에서는 물 한천(18) 상에 "놓인" 것으로 설명되었다. 잎 디스크를 물 한천에 넣으면 진딧물이 한천 표면에 달라붙을 가능성이 줄어들고 진딧물이 한쪽에 국한되기 때문에 관찰이 용이합니다.
이 프로토콜은 분리형 분석법 및 EPF 접종을 진행하는 방법에 대한 자세한 지침과 함께 작업, 관찰 및 일관된 결과를 용이하게 하는 몇 가지 수정 사항을 제공합니다. 또한 실험실 조건에서 식물을 빨아들이는 해충에 대해 EPF 분리물을 선택하기 위한 표준화된 방법을 확립합니다. 또한, EPF 분리물의 향후 상용화를 위해 알려진 효과적인 제품 또는 상업적으로 이용 가능한 제품으로 표준 검사를 수행할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 이 작업에 이해 상충이 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 과학기술부(MOST)의 109-2313-B-005 -048 -MY3의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 μL Inoculating Loop | NEST Scientific | 718201 | |
| 100 bp DNA Ladder III | Geneaid | DL007 | |
| 2x SuperRed PCR Master Mix | Biotools | TE-SR01 | |
| 50 mL centrifuge tube | Bioman Scientific | ET5050-12 | |
| 6 cm Petri dish | Alpha Plus Scientific | 16021 | |
| 6 mm insect aspirator | MegaView Science | BA6001 | |
| 70 mm filter paper NO.1 | Toyo Roshi Kaisha | ||
| 70% ethanol | |||
| 9 cm Petri dish | Alpha Plus Scientific | 16001 | |
| Agar | Bioman Scientific | AGR001.1 | Microbiology grade |
| Agarose | Bioman Scientific | PB1200 | |
| BioGreen Safe DNA Gel Buffer | Bioman Scientific | SDB001T | |
| Chromas | Technelysium | ||
| GeneDoc | |||
| GenepHlow Gel/PCR Kit | Geneaid | DFH300 | https://www.geneaid.com/data/files/1605861013102532959.pdf |
| Gene-Spin Genomic DNA Isolation Kit | Protech Technology | PT-GD112-V3 | http://www.protech-bio.com/UserFiles/file/Gene-Spin%20Genomic%20DNA%20Kit.pdf |
| Hemocytometer | Paul Marienfeld | 640030 | |
| Komatsuna leaves (Brassica rapa var. perviridis) | Tai Cheng Farm | 1-010-300410 | |
| Microsprayer | |||
| MiniAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A37834 | |
| Mustard aphid (Lipaphis erysimi) | |||
| Painting brush | Tian Cheng brush company | 4716608400352 | |
| Parafilm M | Bemis | PM-996 | |
| Pellet pestle | Bioman Scientific | GT100R | |
| Sabouraud Dextrose Broth | HiMedia | MH033-500G | |
| SPSS Statistics | IBM | ||
| TAE buffer 50x | Bioman Scientific | TAE501000 | |
| Tween 80 | PanReac AppliChem | 142050.1661 |
References
- Ghosh, S., Roy, A., Chatterjee, A., Sikdar, S. R. Effect of regional wind circulation and meteorological factors on long-range migration of mustard aphids over indo-gangetic plain. Scientific Reports. 9, 5626 (2019).
- Dhillon, M. K., Singh, N., Yadava, D. K. Preventable yield losses and management of mustard aphid, Lipaphis erysimi (Kaltenbach) in different cultivars of Brassica juncea(L.) Czern & Coss. Crop Protection. 161, 106070 (2022).
- Huang, F., Hao, Z., Yan, F. Influence of oilseed rape seed treatment with imidacloprid on survival, feeding behavior, and detoxifying enzymes of mustard aphid, lipaphis erysimi. Insects. 10 (5), 144 (2019).
- Mannino, M. C., Huarte-Bonnet, C., Davyt-Colo, B., Pedrini, N. Is the insect cuticle the only entry gate for fungal infection? insights into alternative modes of action of entomopathogenic fungi. Journal of Fungi. 5 (2), 33 (2019).
- Bamisile, B. S., Akutse, K. S., Siddiqui, J. A., Xu, Y. Model application of entomopathogenic fungi as alternatives to chemical pesticides: prospects, challenges, and insights for next-generation sustainable agriculture. Frontiers in Plant Science. 12, 741804 (2021).
- Scorsetti, A. C., Humber, R. A., Garcia, J. J., Lopez Lastra, C. C. Natural occurrence of entomopathogenic fungi (Zygomycetes: Entomophthorales) of aphid (Hemiptera: Aphididae) pests of horticultural crops in Argentina. Biocontrol. 52, 641-655 (2007).
- Liu, Y. C., Ni, N. T., Chang, J. C., Li, Y. H., Lee, M. R., Kim, J. S., et al. Isolation and selection of entomopathogenic fungi from soil samples and evaluation of fungal virulence against insect pests. Journal of Visualized Experiments. 175, e62882 (2021).
- Francis, F., Fingu-Mabola, J. C., Fekih, I. B. Direct and endophytic effects of fungal entomopathogens for sustainable aphid control: a review. Agriculture. 12 (12), 2081 (2022).
- Simon, J., Peccoud, J. Rapid evolution of aphid pests in agricultural environments. Current Opinion in Insect Science. 26, 17-24 (2018).
- Ujjan, A. A., Shahzad, S. Use of Entomopathogenic Fungi for the Control of Mustard Aphid (Lipaphis erysimi) on canola (Brassica napus L). Pakistan Journal of Botany. 44 (6), 2081-2086 (2012).
- Sajid, M., Bashir, N. H., Batool, Q., Munir, I., Bilal, M., Jamal, M. A., et al. In-vitro evaluation of biopesticides (Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae, Bacillus thuringiensis) against mustard aphid Lipaphis erysimi kalt. (Hemiptera: Aphididae). Journal of Entomology and Zoology Studies. 5 (6), 331-335 (2017).
- Paschapur, A. U., Subbanna, A. R. N. S., Singh, A. K., Jeevan, B., Stanley, J., Rajashekara, H., Mishra, K. K., Koti, P. S., Kant, L., Pattanayak, A. Alternaria alternata strain VLH1: a potential entomopathogenic fungus native to North Western Indian Himalayas. Egyptian Journal of Biological Pest Control. 32, 138 (2022).
- Miohammed, A. A. Lecanicillium muscarium and Adalia bipunctata combination for the control of black bean aphid, Aphis fabae. Biocontrol. 63, 277-287 (2018).
- Thaochan, N., Ngampongsai, A., Prabhakar, C. S., Hu, Q. Beauveria bassiana PSUB01 simultaneously displays biocontrol activity against Lipaphis erysimi (Kalt.) (Hemiptera: Aphididae) and promotes plant growth in Chinese kale under hydroponic growing conditions. Biocontrol Science and Technology. 31 (10), 997-1015 (2021).
- Mseddi, J., Farhat-Touzri, D. B., Azzouz, H. Selection and characterization of thermotolerant Beauveria bassiana isolates and with insecticidal activity against the cotton-melon aphid Aphis gossypii (Glover) (Hemiptera: Aphididae). Pest Management Science. 78 (6), 2183-2195 (2022).
- Butt, T. M., Ibrahim, L., Clark, S. J., Beckett, A. The germination behaviour of Metarhizium anisopliae on the surface of aphid and flea beetle cuticles. Mycological Research. 99 (8), 945-950 (1995).
- Ullah, S., Raza, A. B. M., Alkafafy, M., Sayed, S., Hamid, M. I., Majeed, M. Z., Riaz, M. A., Gaber, N. M., Asim, M. Isolation, identification and virulence of indigenous entomopathogenic fungal strains against the peach-potato aphid, Myzus persicae Sulzer (Hemiptera: Aphididae), and the fall armyworm, Spodoptera frugiperda (J.E. Smith) (Lepidoptera: Noctuidae). Egyptian Journal of Biological Pest Control. 32, 2 (2022).
- Yokomi, R. K., Gottwald, T. R. Virulence of Verticillium lecanii Isolates in Aphids Determined by Detached-leaf Bioassay. Journal of Inbertebrate Pathology. 51, 250-258 (1988).
- Vu, V. H., Hong, S. I., Kim, K. Selection of entomopathogenic fungi for aphid control. Journal of Bioscience and Bioengineering. 104 (6), 498-505 (2007).
- Vandenberg, J. D. Standardized bioassay and screening of beauveria bassiana and paecilomyces fumosoroseus against the russian wheat aphid (homoptera: aphididae). Journal of Economic Entomology. 89 (6), 1418-1423 (1996).
- Lu, W. N., Wu, Y. T., Kuo, M. H. Development of species-specific primers for the identification of aphids in Taiwan. Applied Entomology and Zoology. 43 (1), 91-96 (2008).
- Liu, Y. C., et al. Isolation and selection of entomopathogenic fungi from soil samples and evaluation of fungal virulence against insect pests. Journal of Visualized Experiments. 175, e62882 (2021).
- Menger, J., Beauzay, P., Chirumamilla, A., Dierks, C., Gavloski, J., Glogoza, P., et al. Implementation of a diagnostic-concentration bioassay for detection of susceptibility to pyrethroids in soybean aphid (hemiptera: aphididae). Journal of Economic Entomology. 113 (2), 932-939 (2020).
- Zhang, R., Chen, J., Jiang, L., Qiao, G. The genes expression difference between winged and wingless bird cherry-oat aphid Rhopalosiphum padi based on transcriptomic data. Scientific Reports. 9, 4754 (2019).
- Abbott, W. S. A method of computing the effectiveness of an insecticide. Journal of Economic Entomology. 18, 265-267 (1925).
- Liu, T. X., Sparks, A. N. Jr Aphids on Cruciferous Crops: Identification and Management. , Texas A&M AgriLife Extension Service. 9-11 (2001).
- Kuo, M., Chianglin, H. Temperature dependent life table of brevicoryne brassicae (l.)(hemiptera: aphididae) on radish. Formosan Entomologist. 27, 293-302 (2007).
- Im, Y., Park, S., Lee, S. Y., Kim, J., Kim, J. J. Early-Stage defense mechanism of the cotton aphid aphis gossypii against infection with the insect-killing fungus beauveria bassiana JEF-544. Frontiers in Immunology. 13, 907088 (2022).
- Kim, J. J., Roberts, D. W. The relationship between conidial dose, moulting and insect developmental stage on the susceptibility of cotton aphid, Aphis gossypii, to conidia of Lecanicillium attenuatum, an entomopathogenic fungus. Biocontrol Science and Technology. 22 (3), 319-331 (2012).
- Reingold, V., Kottakota, C., Birnbaum, N., Goldenberg, M., Lebedev, G., Ghanim, M., et al. Intraspecies variation ofMetarhiziumbrunneumagainst the green peach aphid,Myzus persicae, provides insight into thecomplexity of disease progression. Pest Management Science. 77, 2557-2567 (2021).
- Ortiz-Urquiza, A., Keyhani, N. O. Action on the Surface: entomopathogenic fungi versus the insect cuticle. Insects. 4, 357-374 (2013).
- Knodel, J. J., Beauzay, P., Boetel, M., Prochaska, T., Chirumamilla, A. 2022 North Dakota Field Crop Insect Management Guide. , 23 North Dakota State University Extension Publication: North Dakota, USA. (2021).
- Yeo, H., Pell, J. K., Alderson, P. G., Clark, S. J., Pye, B. J. Laboratory evaluation of temperature effects on the germination and growth of entomopathogenic fungi and on their pathogenicity to two aphid species. Pest Management Science. 59 (2), 156-165 (2003).
- Erdos, Z., Chandler, D., Bass, C., Raymond, B. Controlling insecticide resistant clones of the aphid, Myzus persicae, using the entomopathogenic fungus Akanthomyces muscarius: fitness cost of resistance under pathogen challenge. Pest Management Science. 77 (11), 5286-5293 (2021).
