Summary
Dit protocol presenteert een geoptimaliseerd vrijstaand bioassaysysteem voor het evalueren van de effectiviteit van entomopathogene schimmels (EPF) tegen de mosterdluis (Lipaphis erysimi (Kalt.)), een parthenogenetisch insect. De methode schetst het gegevensverzamelingsproces tijdens experimenten met petrischaaltjes, waardoor onderzoekers consequent de virulentie van EPF kunnen meten tegen mosterdbladluizen en andere parthenogenetische insecten.
Abstract
De mosterdluis (L. erysimi) is een plaag die verschillende kruisbloemige gewassen aantast en plantenvirussen overbrengt. Om milieuvriendelijke plaagbestrijding te bereiken, zijn entomopathogene schimmels (EPF) potentiële microbiële bestrijdingsmiddelen voor het bestrijden van deze plaag. Daarom is virulentiescreening van EPF-isolaten onder petrischaalcondities noodzakelijk vóór toepassing in het veld. De mosterdluis is echter een parthenogenetisch insect, waardoor het moeilijk is om gegevens vast te leggen tijdens experimenten met petrischaaltjes. Om dit probleem aan te pakken, werd een aangepast systeem voor bioassays met losse bladeren ontwikkeld, waarbij een microsproeier werd gebruikt om conidia op bladluizen te inoculeren en verdrinking te voorkomen door het drogen aan de lucht na sporensuspensie te vergemakkelijken. Het systeem handhaafde gedurende de hele observatieperiode een hoge relatieve vochtigheid en de bladschijf bleef meer dan tien dagen vers, waardoor parthenogenetische reproductie van de bladluizen mogelijk was. Om de opbouw van nakomelingen te voorkomen, werd een proces van dagelijkse verwijdering met behulp van een verfborstel geïmplementeerd. Dit protocol demonstreert een stabiel systeem voor het evalueren van de virulentie van EPF-isolaten tegen mosterdluis of andere bladluizen, waardoor de selectie van potentiële isolaten voor bladluisbestrijding mogelijk wordt.
Introduction
De mosterdluis (L. erysimi) is een beruchte plaag die een verscheidenheid aan kruisbloemige gewassen aantast en aanzienlijke economische verliezen veroorzaakt. Hoewel verschillende systematische insecticiden zijn aanbevolen om bladluisplagen te bestrijden, geeft het frequente gebruik van deze insecticiden aanleiding tot bezorgdheid over resistentie tegen pesticiden 2,3. Daarom zouden entomopathogene schimmels (EPF) in termen van milieuvriendelijke plaagbestrijding kunnen dienen als een geschikte alternatieve bestrijdingsstrategie. EPF is een ziekteverwekker van insecten met het vermogen om gastheren te infecteren door hun nagelriemen binnen te dringen, waardoor het een krachtig middel is voor het bestrijden van bladluizen en andere plantenzuigende insecten4. Bovendien heeft EPF bewezen een haalbare en duurzame plaagbestrijdingstechniek te zijn, die voordelen biedt zoals antagonisme van plantpathogenen en bevordering van de plantengroei5.
EPF kan worden verkregen door middel van aas in de grond van insecten of geïsoleerd uit insectenkadavers in het veld 6,7. Alvorens verder gebruik van schimmelisolaten is echter screening op pathogeniteit noodzakelijk. Er zijn verschillende onderzoeken uitgevoerd naar de effectiviteit van EPF tegen bladluizen, dit zijn belangrijke gewasplagen die ernstige schade kunnen aanrichten 8,9. Mosterdbladluizen, naast verschillende soorten bladluizen, zijn getest op gevoeligheid voor verschillende stammen van Beauveria spp., Metarhizium spp., Lecanicillium spp., Paecilomyces spp. en zelfs Alternaria, dat vooral bekend staat als een saprofytische en plantpathogene schimmel, maar enkele dodelijke effecten heeft vertoond tegen mosterdbladluizen10,11,12.
Om de effectiviteit van EPF tegen bladluizen onder laboratoriumomstandigheden te evalueren, kunnen bioassays worden onderverdeeld in twee hoofddelen: de inoculatiekamer en schimmelinoculatie. Het huidige protocol beschrijft de bouw van een inoculatiekamer, waar bladluizen op verschillende manieren kunnen worden onderhouden, zoals een uitgesneden blad met een bladsteel gewikkeld in vochtig katoen, een uitgesneden bladschijf met een petrischaal bekleed met vochtig filtreerpapier, direct onderhoud aan potplanten, of een uitgesneden bladschijf ingebed in wateragar in een petrischaal of -container10, 11,13. Veelgebruikte methoden voor schimmelinoculatie zijn onder meer conidia sproeien, bladluisonderdompeling in een conidia-suspensie, bladonderdompeling in een conidia-suspensie en endofyteninoculatie van planten11,14,15,16. Hoewel er verschillende inoculatiemethoden bestaan, moeten de bioassays de toepassingsomstandigheden in het veld simuleren. In het geval van de bladgedompelde methode12,17 kan bijvoorbeeld de efficiëntie van EPF worden geëvalueerd, maar aangezien de bladluizen de met schimmel beladen bladeren besmetten, wordt de dorsale zijde van de bladluis, die een preferentiële penetratieplaats is, meestal niet blootgesteld aan de schimmel.
Om het bladluiseffect van EPF onder laboratoriumomstandigheden te evalueren, stelt dit protocol voor om de losbladmethode te gebruiken die is beschreven door Yokomi en Gottwald18 met enkele aanpassingen, gevolgd door conidia-inoculatie met behulp van een microsproeier. Deze methode handhaaft de luchtvochtigheid in de bioassaykamer gedurende ten minste zeven dagen met ongeveer 100% zonder dat er extra water hoeft te worden bijgevuld18,19. Bovendien zorgt het beperken van bladluizen tot één oppervlak ervoor dat ze worden blootgesteld aan conidia-sproeien en vergemakkelijkt het observaties20. Bladluizen kunnen echter vast komen te zitten in het blootgestelde agaroppervlak terwijl ze zich binnen de inoculatiekamer bewegen. Bovendien kan het opnemen van gegevens in het petrischaalexperiment met mosterdbladluizen, parthenogenetische insecten, een uitdaging zijn vanwege hun snelle ontwikkeling en voortplanting. Het is moeilijk om onderscheid te maken tussen ingeënte volwassenen en hun nakomelingen zonder verwijdering. De details over hoe u verder moet gaan met deze stap worden zelden genoemd en sommige inconsistente factoren, zoals het bladverbruiksgebied, moeten worden geoptimaliseerd.
Dit protocol demonstreert een stabiel systeem voor het screenen van de virulentie van EPF-isolaten tegen mosterdbladluizen, waardoor potentiële isolaten tegen verschillende bladluissoorten uit een uitgebreide EPF-bibliotheek kunnen worden geselecteerd. In het veld verzamelde bladluizen kunnen worden geïdentificeerd en er kan een voldoende laboratoriumpopulatie van mosterdbladluizen worden vastgesteld om het bladluiseffect van verschillende schimmelisolaten te evalueren met behulp van een eenvoudige en haalbare methodologie met consistente resultaten. Bladluizen hebben meerdere evolutionaire mechanismen ontwikkeld als reactie op intense en herhaalde antropogene druk in agro-ecosystemen, wat een uitdaging vormt voor de voedselzekerheid9. Daarom zou deze beschreven methode kunnen worden uitgebreid om potentiële EPF-isolaten tegen verschillende bladluissoorten te evalueren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Het volledige stroomschema wordt weergegeven in afbeelding 1.
1. Mosterdbladluis verzamelen en onderhouden
- Inzameling van mosterdbladluizen
- Draai de bladeren om en controleer visueel op aantasting van mosterdbladluizen op kruisbloemige gewassen in het veld.
- Registreer de informatie over de bemonsteringslocatie (d.w.z. GPS) en waardplant(en) en bevestig de geschiedenis van insecticidentoepassingen met de boeren.
- Gebruik een insectenzuiger of een fijn schilderspenseel (zie Materiaaltabel) om ongeveer 50 mosterdbladluizen te verzamelen in een centrifugebuis van 50 ml van kruisbloemige gewassen in het veld en breng het monster binnen 3 uur naar het laboratorium.
- Maak een petrischaaltje voor tijdelijk onderhoud met weggesneden kruisbloemige bladeren en met water geïnfiltreerd filtreerpapier op de bodem.
- Plaats de vijf bladluizen op de tijdelijke petrischaal bij kamertemperatuur (25 ± 2 °C) met een relatieve luchtvochtigheid van 70% en 12:12 uur (licht:donker) fotoperiode gedurende 14 dagen om te bevestigen dat bladluizen natuurlijke vijandvrij sparen voordat ze verder worden gekweekt.
OPMERKING: Om ervoor te zorgen dat in het veld verzamelde bladluizen vrij zijn van natuurlijke vijanden zoals sluipwespen of entomopathogene schimmels, is het van cruciaal belang om de afwezigheid van deze organismen te bevestigen voordat u verder gaat met de kweek.
- Instandhouding van mosterdbladluizen
NOTITIE: Gebruik kruisbloemige bladeren zonder pesticiden (inclusief biopesticide) om mosterdbladluizen te behouden.- Zorg voor een stabiele en voldoende aanvoer van kruisbloemige bladeren (ongeveer 25cm2).
OPMERKING: Haal de kruisbloemige bladeren van de markt of kweek de planten. Voorafgaand aan de langdurige, massale kweek van mosterdbladluizen, kunnen verschillende soorten kruisbloemigen worden getest om een geschikte kruisbloemige te vinden. Als de soort van het kruisbloemige blad eenmaal is gefixeerd, verander het dan niet. In dit onderzoek is Komatsuna (Brassica rapa var. perviridis) in het 6-7-bladstadium gebruikt (zie Tabel met materialen). Gooi bovendien de 2-3 oudste bladeren weg. - Voeg water toe voordat het filtreerpapier aan de onderkant helemaal droog is.
- Observeer dagelijks de populatiedichtheid van de mosterdbladluizen. De populatie zou na 7 dagen 2-3-voudig moeten groeien.
- Wanneer het aantal bladluizen toeneemt, snijdt u de oorspronkelijk weggesneden bladeren met mosterdbladluizen in 4-6 kleinere stukken en doet u elk klein bladstukje met mosterdbladluizen in een petrischaal met vers uitgesneden blad en met water geïnfiltreerd filtreerpapier.
- Plaats de petrischaal in een incubator bij 25 °C met een fotoperiode van 12:12 uur (licht:donker) en observeer dagelijks de populatiedichtheid van mosterdbladluizen.
- Verwijder de originele uitgesneden bladeren nadat de meeste bladluizen zijn gemigreerd naar verse weggesneden bladeren voordat de oorspronkelijke bladeren rotten.
- Zorg voor een stabiele en voldoende aanvoer van kruisbloemige bladeren (ongeveer 25cm2).
2. Moleculaire identificatie van mosterdluis
OPMERKING: Om de soort in het veld verzamelde mosterdluis te bevestigen, werd moleculaire identificatie uitgevoerd met behulp van twee moleculaire markers: de sequentie gekarakteriseerd geamplificeerd gebied (SCAR) op basis van A05Le, ontworpen door Lu et al.21, en mosterdbladluis cytochroomoxidase subeenheid 1 (COI) gebied van de mosterdluis.
- Extractie van genoom-DNA van mosterdluis
- Verzamel ongeveer 50 bladluizen in een centrifugebuisje van 1,5 ml.
OPMERKING: Bladluizen die voor moleculaire identificatie worden gebruikt, moeten afstammelingen zijn van één enkele bladluis, en verschillende stadia kunnen ook in dezelfde buis worden samengevoegd voor DNA-extractie. - Homogeniseer de bladluizen met een pelletstamper en extraheer het DNA met behulp van Gene-Spin Genomic DNA Isolation Kit volgens de instructies van de fabrikant (zie Tabel met materialen).
- Elueer het genomische DNA met 50 μL voorverwarmd nucleasevrij water.
- Verzamel ongeveer 50 bladluizen in een centrifugebuisje van 1,5 ml.
- PCR-amplificatie en DNA-sequencing
- Amplificeer de doel-DNA-sequenties van genoom-DNA van bladluis met behulp van PCR Master Mix (2x) met primerparen A05LeF/A05LeR en LeCO1F/LeCO1R (tabel 1) met verschillende PCR-programma's21.
OPMERKING: De PCR-reactie met een totaal volume van 20 μL bestaat uit 2 μL bladluis genomische DNA-sjabloon, 1 μL voorwaartse en 1 μL omgekeerde primers, 10 μL PCR Master Mix (zie Materiaaltabel) en 6 μL ddH2O. - Voer de PCR uit in een thermische cycler (zie materiaaltabel) met het volgende programma: 94 °C gedurende 5 min, 25 cycli van 94 °C gedurende 45 s, 61 °C (voor A05LeF/A05LeR) en 58 °C (voor LeCO1F/LeCO1R) gedurende 45 s, 72 °C gedurende 1 min, gevolgd door een laatste verlenging van 72 °C gedurende 5 min.
- Analyseer het PCR-product door middel van 1% agarosegelelektroforese om de identiteit van de mosterdluis te bevestigen (Figuur 2).
OPMERKING: Als primerpaar A05LeF/A05LeR met succes de juiste grootte van het DNA-fragment ampliseert, heeft het de in het veld verzamelde bladluis overtuigend geïdentificeerd als mosterdluis21. De primerparen staan vermeld in tabel 2. - Zuiver het PCR-product van het COI-amplicon van mosterdluis met behulp van een in de handel verkrijgbare gel/PCR-kit volgens de instructies van de fabrikant (zie Materiaaltabel) en sequentie van het PCR-product met behulp van een commerciële sequencingservice.
- Amplificeer de doel-DNA-sequenties van genoom-DNA van bladluis met behulp van PCR Master Mix (2x) met primerparen A05LeF/A05LeR en LeCO1F/LeCO1R (tabel 1) met verschillende PCR-programma's21.
- Sequentie analyse
OPMERKING: Volgens Lu et al.21 is de DNA-buiging van A05Le een mosterdbladluisspecifiek DNA-fragment; daarom hoeft het A05Le PCR-product niet verder te worden gesequenced.- Controleer de leeskwaliteit door Chromas-software (zie Materiaaltabel) na het verkrijgen van de LeCO1-sequentie.
- Trim upstream en downstream leesbewerkingen van lage kwaliteit door een fasta- (of txt)-bestand te openen en de leesbewerkingen van lage kwaliteit direct te verwijderen.
- Dien de bijgesneden reeks in bij NCBI web BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) met behulp van standaardparameters.
OPMERKING: Als de amplicongroottes van A05Le- en LeCO1-primersets correct zijn, moet theoretisch de sequentiestraalzoekopdracht in NCBI-standaarddatabases overeenkomen met mosterdluis.
3. Bereiding van entomopathogene schimmels
OPMERKING: De EPF die in dit onderzoek is gebruikt, staat vermeld in tabel 1.
- Terugwinning van EPF uit schimmelbibliotheek
- Ontdooi de geconserveerde schimmelvoorraad (conidia gesuspendeerd in 30% glycerine) uit de vriezer van -80 °C.
- Breng een kleine hoeveelheid (ongeveer 10 μl) van de conidia suspensie over op een plaat van 6 cm 1/4 Sabouraud dextrose-agar (SDA) (0,75 g Sabouraud-dextrosebouillon met 1,5 g agar per 100 ml ddH2O) en verdeel deze gelijkmatig met behulp van een celverdeler in een laminaire stroomkap.
- Sluit de petrischaal af met paraffinefolie en broed deze 10-14 dagen in het donker bij 25 °C uit.
- Herkweek de schimmelisolaten door schimmelmassa op een 1/4 SDA-plaat te strepen en schimmels gedurende 10-14 dagen in het donker bij 25 °C te incuberen voordat de conidia22 worden geoogst.
OPMERKING: De schimmelcultuur moet ongeveer 10 dagen voor het inoculeren van de bladluizen worden gebruikt. EPF-kweek die meer dan 14 dagen oud is, wordt niet aanbevolen voor gebruik in de virulentietest.
- Bereiding van conidia-suspensie
- Schraap de conidia van de 10-14 dagen oude schimmelcultuur op 1/4 SDA-plaat door een lus te inoculeren na toevoeging van 2-3 ml 0,03% Tween 80 (zie Tabel met materialen).
- Vang de schimmelsuspensie op in een centrifugebuisje.
- Draai de oplossing met de hoogste snelheid vortex, tel het aantal conidia met behulp van een hemocytometer onder een lichtmicroscoop en pas de concentratie van de conidia suspensie aan tot 108 conidiën/ml.
- Breng de conidia-suspensie over in een UV-gesteriliseerde microsproeier.
OPMERKING: Draai de conidia-suspensie opnieuw voordat u deze overbrengt, omdat de conidia vatbaar zijn voor neerslaan. De microsproeier moet voor gebruik gedurende 30 minuten worden blootgesteld aan ultraviolette straling in een laminaire stroomkap.
4. Virulentiescreening tegen mosterdluis
- Voorbereiding van nieuw opgekomen volwassenen
- Verplaats aptereuze (zonder vleugel) en alate (gevleugelde) volwassenen van de opgroeiende petrischaal naar vers uitgesneden bladeren om nieuwe nakomelingen van dezelfde leeftijd te reproduceren. Verwijder de volwassen dieren na 24 uur om overbevolking te voorkomen en de productie van gelaagde nakomelingen te minimaliseren23,24. Alleen geschikte volwassenen zullen in verdere experimenten worden gebruikt.
- Voed de nakomelingen op naar het volwassen stadium en verwijder de nakomelingen die zich na 48 uur niet ontwikkelen tot het volwassen stadium (figuur 3) om leeftijdsvariatie tussen bladluizen voor het experiment te voorkomen. Verwijder bovendien gealiseerde volwassenen.
- Voorbereiding van de inentkamer
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om eerst kruisbloemige bladeren met een diameter van 9 cm te bereiden, zodat de bladschijf vóór het stollen in de wateragar kan worden ingebed.- Reinig de kruisbloemige bladeren met kraanwater, verwijder vuil en resten en eventuele andere geleedpotigen.
- Veeg overtollig water weg met keukenpapier en controleer met een stereomicroscoop op andere geleedpotigen op het oppervlak van de kruisbloemige bladeren. Verwijder eventuele geleedpotigen, indien aanwezig.
- Knip een bladschijf met een diameter van 9 cm af door de onderste petrischaal als mal direct op het blad te drukken of door een schaar te gebruiken.
OPMERKING: Als de bladeren kleiner zijn dan 9 cm in diameter, combineer dan een paar weggesneden bladeren. - Bereid 1,5% wateragar voor elke petrischaal door 450 mg agar (zie materiaaltabel) te verwarmen en op te lossen in 30 ml ddH2O met behulp van de magnetron.
OPMERKING: De hoeveelheid 1,5% wateragar kan worden aangepast afhankelijk van de schaal van het experiment. - Giet 30 ml 1,5% wateragar in de petrischaal van 9 cm voordat u stolt in de laminaire stroomkap en wacht tot de agar is afgekoeld tot ~40 °C totdat het oppervlak van de agar half gestold is.
NOTITIE: Controleer of het oppervlak half gestold is door de petrischaal voorzichtig horizontaal te schudden. - Plaats de bladschijf, met het abaxiale oppervlak naar boven, bovenop de wateragar en plaats de bladschijf in de agar.
NOTITIE: Minimaliseer de blootstelling van het agar-oppervlak. - Nadat de wateragar volledig is gestold, sluit u het deksel van de petrischaal.
NOTITIE: Open het deksel voor waterverdamping als er onmiddellijk veel druppels op het deksel condenseren. - Plaats 20 volwassen dieren op de bladschijf.
NOTITIE: Het wordt aanbevolen om onder een stereomicroscoop te werken om schade aan hun monddelen te voorkomen.
- EPF-inoculatie en observatie
- Open het deksel van de inoculatiekamer en spuit 0,3 ml conidia suspensie (uit stap 3.2) rechtstreeks op de bladluizen en de bladschijf vanaf ongeveer 15 cm boven de bladschijf.
OPMERKING: Draai de conidia-suspensie opnieuw voor het spuiten. De spuitgebieden moeten vóór het experiment worden getest, omdat ze kunnen variëren tussen verschillende sproeiers. In dit geval wordt 0,3 ml met 15 cm afstand aanbevolen. Het spuitgebied moet de hele bladschijf bedekken en een dunne laag conidia-suspensie moet de bladschijf bedekken. Als druppeltjes samenkomen in stilstaand water op het blad, moet het inoculatievolume worden verminderd. Reinig de tafel met 70% ethanol voor inoculatie en tussen het gebruik van verschillende isolaten. - Wacht tot de conidia-suspensie droog is en sluit dan het deksel om te voorkomen dat mosterdbladluizen verdrinken.
OPMERKING: Bladluizen zwerven zelden rond tijdens het experiment; Het is echter nog steeds nodig om ervoor te zorgen dat de bladluizen niet ontsnappen. - Sluit de inoculatiekamer af met paraffinefolie om een hoge relatieve luchtvochtigheid te behouden en plaats de inoculatiekamer in een incubator bij 25 °C met 12:12 h (licht:donker) fotoperiode.
- Open het deksel van de inoculatiekamer om de sterfte onder een stereomicroscoop om de 12 uur gedurende 5 dagen.
- Veeg de honingdauw die aan het deksel kleeft weg met keukenpapier en verwijder de nieuw opgekomen bladluizen met een fijne verfkwast. Reinig het deksel elke 24 uur met kraanwater.
OPMERKING: De observatieperiode kan variëren voor verschillende soorten bladluizen op basis van de volwassen levensduur. - Houd het kadaver op de bladschijf voor mycose om een succesvolle inoculatie te bevestigen.
- Open het deksel van de inoculatiekamer en spuit 0,3 ml conidia suspensie (uit stap 3.2) rechtstreeks op de bladluizen en de bladschijf vanaf ongeveer 15 cm boven de bladschijf.
- Bevestiging van de kiemkracht van conidia
OPMERKING: Deze stap is optioneel. Om de kiemsnelheid van conidia paarsgewijs te bevestigen bij het uitvoeren van de virulentiescreening om de activiteit van conidia te garanderen.- Laat één druppel 5 μL conidia suspensie vallen op 1/4 SDA voor drie replicaten.
- Bereken na 18 uur de kiemkracht met de lichtmicroscoop. Tel ten minste 100 sporen willekeurig in een enkele druppel om de kiemkracht van de schimmel te bevestigen.
OPMERKING: Normaal gesproken zou de kiemkracht van de isolaten die in het experiment worden gebruikt hoger moeten zijn dan 90%.
5. Bioassay van geselecteerde EPF-isolaten
OPMERKING: EPF-isolaten die een hoge virulentie vertoonden, die uit stap 4 werden geselecteerd, werden onderworpen aan een bioassay tegen mosterdbladluizen met behulp van vier concentraties conidia-suspensies (variërend van 104 tot 107 conidiën/ml).
- Bereiding van conidia-suspensie
- Herhaal stap 3.1 om de geselecteerde EPF-isolaten te herstellen.
- Herhaal stap 3.2 om vier concentraties conidia suspensie te bereiden, waaronder 104, 105,10 6 en 107 conidiën/ml.
- Voorbereiding van nieuw opgekomen volwassenen
- Herhaal stap 4.1 om pas opgekomen volwassenen voor te bereiden.
- Voorbereiding van de inentkamer
- Herhaal stap 4.1. om de inoculatiekamer voor te bereiden.
- EPF-inoculatie en observatie
- Herhaal stap 4.3. om de EPF-inoculatie en observatie uit te voeren met respectievelijk de vier concentraties conidia-suspensie.
6. Statistische analyse
- Berekening van de gecorrigeerde sterfte
- Bereken de gecorrigeerde mortaliteit met behulp van de formule25 van Abbott, zoals hieronder weergegeven:
Gecorrigeerde mortaliteit (%) = [(MT− M C) × 100%] / (100− MC)
MT staat voor de mortaliteit van de behandelde groep en MC staat voor de mortaliteit van de controlegroep.
OPMERKING: De mortaliteit van de controlegroep mag niet hoger zijn dan 20%. - Open het SPSS-softwareplatform (zie Materiaaltabel), maak variabelen aan, waaronder "behandeling" en "cor_mor" (die gecorrigeerde mortaliteit vertegenwoordigen) en voer de berekende resultaten in voor de inoculatie van verschillende isolaten op hetzelfde tijdstip met dezelfde geïnoculeerde concentratie.
- Selecteer Analyseren, Vergelijk Gemiddelden en Verhoudingen, Onafhankelijke Steekproeven T-Test in SPSS voor onafhankelijke t-toetsanalyse .
- Voer in SPSS de behandeling in het vak "Groeperingsvariabele" in en cor_mor in de "Testvariabele(n)". Definieer groepen aan de hand van verschillende schimmelisolaten. Druk op OK om te analyseren.
- Bereken de gecorrigeerde mortaliteit met behulp van de formule25 van Abbott, zoals hieronder weergegeven:
- Berekening van de mediane letale tijd (LT 50) en de mediane letale concentratie (LC50)
- Open de SPSS, maak variabelen "totaal", "respons" en "duur"/"concentratie" en voer het geregistreerde resultaat in de spreadsheet in.
- Selecteer Analyze, Regression, Probit in SPSS om LT 50 en/of LC50 te berekenen.
OPMERKING: Als de cumulatieve mortaliteit uiteindelijk niet hoger is dan 50%, kan LT 50 en/of LC50 niet worden geschat. - Voer het totaal in het vak "Totaal waargenomen" in, de respons in het vak "Responsfrequentie", de duur/concentratie in het vak "Covariabele(n)". Druk op OK om te analyseren.
OPMERKING: Druk in het algemeen op Opties en stel het "Significantieniveau voor gebruik van heterogeniteitsfactor" in op 0.05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het gepresenteerde stroomschema illustreert de stabiele toestand van de mosterdbladluizen van veldverzameling tot virulentiescreening. Het in stand houden van bladluizen uit veldverzameling zorgde voor een stabiele toename van bladluiskolonies met voldoende voedselaanbod. De in het veld verzamelde bladluizen werden bevestigd als mosterdluizen door het gebruik van moleculaire markers, waaronder PCR-amplicongrootte en LeCO1-sequencing. De virulentiescreening, uitgevoerd met behulp van de losbladmethode, onthulde een consistent overlevingspercentage voor mosterdbladluizen, waarbij de controlegroep een overlevingspercentage van 85% vertoonde (figuur 4).
Tijdens de virulentiescreening vertoonde Cc-NCHU-213 het snelste bladluisdodende vermogen, resulterend in 50% en 90% sterfte op respectievelijk 3 dagen en 4,5 dagen na inoculatie (d.p.i.) (Figuur 4). Er werden echter verschillende bladluisdodende vermogens waargenomen bij de vijf B. bassiana-isolaten. Bb-NCHU-141, -143 en -153 vertoonden langzame bladluisdodende eigenschappen, met slechts 5% sterfte bij 3 d.p.i., zelfs wanneer de effecten van 0,03% Tween 80 sproeien of andere dodelijke factoren buiten beschouwing werden gelaten (Figuur 4). Daarom werd de gecorrigeerde sterfteformule gebruikt om de controlesterfte te normaliseren. De meeste EPF-isolaten tegen mosterdbladluizen vertoonden gecorrigeerde sterftecijfers van meer dan 70% binnen 5 d.p.i., behalve Pl-NCHU-152 (tabel 3). Van deze EPF-isolaten vertoonde Bb-NCHU-286 het hoogste sterftecijfer van 100% (tabel 3). Daarnaast werd EPF-mycose waargenomen op kadavers van mosterdbladluizen die besmet waren met Metarhizium spp., Beauveria spp., Purpureocillium lilacinum en Cordyceps cateniannulata tijdens de virulentiescreening, wat de effectiviteit van dit systeem aangeeft (Figuur 5).
Op basis van de resultaten van de virulentiescreening werden twee EPF-isolaten, namelijk Mb-NCHU-197 en Cc-NCHU-213, die een snelle insectendodende activiteit vertonen (respectievelijk 40% en 50% sterfte bij 3 d.p.i.), geselecteerd voor bioassay tegen mosterdbladluizen. De resultaten toonden significant verschillende gecorrigeerde mortaliteiten voor Mb-NCHU-197 en Cc-NCHU-213 bij 3 en 4 d.p.i. met een inoculatie van 107 conidiën/ml (Figuur 6). In de LT50-test vertoonde de behandeling met 107 conidiën/ml Cc-NCHU-213 een significant kortere duur in vergelijking met andere behandelingen (tabel 4). Bovendien was de LC50-waarde van Cc-NCHU-213 (9,32 × 104) lager dan die van Mb-NCHU-213 (2,30 × 10 5), wat aangeeft dat Cc-NCHU-213 een grotere virulentie heeft tegen mosterdbladluizen (tabel 5).
Figuur 1: Experimenteel stroomschema voor het screenen van EPF-virulentie tegen mosterdbladluizen . (A) Opzetten van een systeem voor het kweken van mosterdbladluizen. b) Voorbereiding van de EPF. (C) Schimmelinoculatie. (D) Statistische analyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Elektroforese van genoom-DNA van mosterdluis geamplificeerd met A05Le en Le CO1 primersets. Elektroforese werd uitgevoerd op een 1% agarosegel. M = 100 bp DNA-ladder; bp = basenparen. Het rode sterretje geeft de doelbuiging van PCR-amplificatie aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Verschillen tussen aptereuze vierde-instar nimf en volwassen mosterdluizen. (A) Vierde-instar nimf. (b) Volwassene. De tibiae van de achterpoten van de vierde-instar nimf zijn witachtig (gemarkeerd met rode pijl). Nieuw opgekomen bladluizen werden tijdens virulentietests verwijderd door fijne kamelenborstels. Schaalbalk = 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: Sterfte hittekaart van 13 EPF isolaten tegen mosterdluis door middel van de losbladmethode. Klik hier voor een grotere versie van deze figuur.
Figuur 5: Waarneming van schimmelmycose van 13 EPF-isolaten. Mepe-NCHU-2 = Metarhizium pemphigi; Mp-NCHU-11 = Metarhizium pinghaense; Mb = Metarhizium baoshanense; Cc = Cordyceps cateniannulata; Ba = Beauveria australis; Bb = Beauveriabassiana; Pl = Purpureocillium lilacinum. Schaalbalk = 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 6: Gecorrigeerde sterfte van schimmelisolaten Mb-NCHU-197 en Cc-NCHU-213 tegen mosterdluis. De foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie (SD). De mortaliteiten van Mb-NCHU-197 en Cc-NCHU-213 op hetzelfde tijdstip met dezelfde geïnoculeerde concentratie werden vergeleken met behulp van een onafhankelijke t-test, en de mortaliteiten gemarkeerd met een asterisk bleken significant verschillend te zijn (p < 0,05). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Isoleren | Soort | Host of bron* | Plaats |
| Mp-NCHU-2 | Pemphigi van Metarhizium | grond | Yilan |
| Ml-NCHU-9 | Lepidiotae van Metarhizium | grond | Yilan |
| Mp-NCHU-11 | Metarhizium pinghaense | grond | Yilan |
| Ba-NCHU-113 | Beauveria australis | grond | Taichung |
| Bb-NCHU-141 | Beauveria bassiana | Hampei van Hypothenemus | Chiayi |
| Bb-NCHU-143 | Beauveria bassiana | Hampei van Hypothenemus | Chiayi |
| Pl-NCHU-152 | Lilacinum van Purpureocillium | Papillosa van Tessaratoom | Chiayi |
| Bb-NCHU-153 | Beauveria bassiana | Ferruïsche Rhynchophorus | Chunghua |
| Bb-NCHU-157 | Beauveria bassiana | Ferruïsche Rhynchophorus | Chunghua |
| MB-NCHU-196 | Baoshanense van Metarhizium | grond | Taichung |
| MB-NCHU-197 | Baoshanense van Metarhizium | grond | Taichung |
| Cc-NCHU-213 | Cordyceps cateniannulata | grond | Taichung |
| Bb-NCHU-286 | Beauveria bassiana | Cerambycidae (Cerambycidae) | Taichung |
Tabel 1: EPF-isolaten die in dit onderzoek zijn gebruikt.
| Naam van de primer | Sequentie (5' - 3') | Grootte van het product (bp) | Referentie | |
| A05Le | F-GGGTCTTGGATGGTGTGGTG | 953 | Lu et al. [21] | |
| R-AGGGGTCTTGTCGCCATTTT | ||||
| LeCO1 | F-CTTTTCCCATGATCAATTTT | 593 | Deze studie | |
| R-ACGTAGTGGAAATGAGCAAC | ||||
Tabel 2: Primerparen die worden gebruikt voor de moleculaire identificatie van mosterdluizen.
| Isoleren | Soort | Gecorrigeerde sterfte (%) |
| Mp-NCHU-2 | Pemphigi van Metarhizium | 76.47 |
| Ml-NCHU-9 | Lepidiotae van Metarhizium | 82.35 |
| Mp-NCHU-11 | Metarhizium pinghaense | 76.47 |
| Ba-NCHU-113 | Beauveria australis | 82.35 |
| Bb-NCHU-141 | Beauveria bassiana | 88.24 |
| Bb-NCHU-143 | Beauveria bassiana | 88.24 |
| Pl-NCHU-152 | Lilacinum van Purpureocillium | 35.29 |
| Bb-NCHU-153 | Beauveria bassiana | 82.35 |
| Bb-NCHU-157 | Beauveria bassiana | 88.24 |
| MB-NCHU-196 | Baoshanense van Metarhizium | 76.47 |
| MB-NCHU-197 | Baoshanense van Metarhizium | 88.24 |
| Cc-NCHU-213 | Cordyceps cateniannulata | 94.12 |
| Bb-NCHU-286 | Beauveria bassiana | 100.00 |
Tabel 3: Gecorrigeerde sterftecijfers van 13 EPF-isolaten tegen mosterdbladluis 5 dagen na inoculatie (d.p.i.).
| Isoleren | Soort | Conc.(conidiën/ml) | N* | LT50 (dagen)† | 95% betrouwbaarheidslimieten | Helling (ZO) | X2 (df)‡ |
| MB-NCHU-197 | Baoshanense van Metarhizium | 104 Zoekertjes | 60 | 3.816 A | 3.61–4.05 | 0.60 (0.05) | 15.64 (28) |
| 105 Zoekertjes | 60 | 3.112 bd | 2.95–3.28 | 0.72 (0.05) | 14.61 (28) | ||
| 106 | 60 | 2.908 b | 2.76–3.06 | 0.85 (0.06) | 15.04 (28) | ||
| 107 | 60 | 2.549 c | 2.40–2.69 | 0.90 (0.06) | 24.31 (28) | ||
| Cc-NCHU-213 | Cordyceps cateniannulata | 104 Zoekertjes | 60 | 3.948 a | 3.71–4.23 | 0.53 (0.05) | 8.81 (28) |
| 105 Zoekertjes | 60 | 3.237 dagen | 3.07–3.41 | 0.72 (0.05) | 22.86 (28) | ||
| 106 | 60 | 2.414 c | 2.28–2.54 | 1.08 (0.07) | 28.30 (28) | ||
| 107 | 60 | 2.132 e | 2.02–2.25 | 1.41 (0.10) | 28.96 (28) | ||
| *Aantal waargenomen insecten. | |||||||
| †LT50-waarden gemarkeerd met verschillende letters werden als significant verschillend beschouwd omdat hun 95%-betrouwbaarheidslimieten elkaar niet overlapten. | |||||||
| ‡X2, Chi-kwadraatwaarde in Pearson's goodness-of-fit-test; DF, vrijheidsgraden | |||||||
Tabel 4: LT50-waarden van schimmelisolaten Mb-NCHU-197 en Cc-NCHU-213 tegen mosterdluis onder verschillende conidiaconcentraties. *Aantal waargenomen insecten. †LT50-waarden gemarkeerd met verschillende letters werden als significant verschillend beschouwd omdat hun 95%-betrouwbaarheidslimieten elkaar niet overlapten. ‡X2, Chi-kwadraatwaarde in Pearson's goodness-of-fit-test; DF, vrijheidsgraden.
| Isoleren | Soort | N* | LC50 (conidiën/ml)† | 95% betrouwbaarheidslimieten | Slpoe (SE) | X2 (df)‡ |
| MB-NCHU-197 | Baoshanense van Metarhizium | 240 | 2.30 × 105 A | 8,63 × 104–5,70 × 105 | 0.43 (0.08) | 10.14 (10) |
| Cc-NCHU-213 | Cordyceps cateniannulata | 240 | 9,32 × 104 a | 4,97 × 104–1,62 × 105 | 0.76 (0.09) | 4.33 (10) |
| *Aantal waargenomen insecten. | ||||||
| †LC50-waarden gemarkeerd met verschillende letters werden als significant verschillend beschouwd omdat hun 95%-betrouwbaarheidslimieten elkaar niet overlapten. | ||||||
| ‡X2, Chi-kwadraatwaarde in Pearson's goodness-of-fit-test; DF, vrijheidsgraden | ||||||
Tabel 5: LC50-waarden van schimmelisolaten Mb-NCHU-197 en Cc-NCHU-213 tegen mosterdluizen. *Aantal waargenomen insecten. †LC50-waarden gemarkeerd met verschillende letters werden als significant verschillend beschouwd omdat hun 95%-betrouwbaarheidslimieten elkaar niet overlapten. ‡X2, Chi-kwadraatwaarde in Pearson's goodness-of-fit-test; DF, vrijheidsgraden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kruisbloemigen, een groep groenten, worden vaak aangetast door meerdere soorten bladluis, waaronder mosterdluis (L. erysimi) en koolluis (Brevicoryne brassicae)26. Beide soorten zijn gemeld in Taiwan27, en het is mogelijk dat ze naast elkaar bestaan op de verzamelplaats. Om nauw verwante bladluissoorten te onderscheiden, werd in dit onderzoek gebruik gemaakt van een moleculaire identificatietechniek met behulp van een multiplex primerset21. Door een moleculaire merker te ontwerpen op basis van het COI-genfragment van de mosterdbladluis, hebben we met succes de mosterdluis geïdentificeerd, waarmee we de betrouwbaarheid van de moleculaire merker A05Le voor dit doel hebben bevestigd.
Uit de waarnemingen bleek dat het zonder ervaring een uitdaging is om onderscheid te maken tussen aptereuze nimfen van de vierde ster en volwassen mosterdbladluizen, uitsluitend op basis van hun grootte of morfologie. Een cruciaal onderscheidend kenmerk is echter het scheenbeen van de achterpoten, dat wit lijkt bij nimfen van de vierde instar, maar niet bij volwassenen (Figuur 3). Eerdere studies over L. attenuatum, B. bassiana tegen katoenluis en M. brunneum tegen groene perzikluis hebben aangetoond dat rui een strategie kan zijn om infectie te voorkomen28,29,30. Daarom kan het verkeerd identificeren van bladluisstadia leiden tot fouten bij de beoordeling van de virulentie, aangezien rui de effectiviteit van EPF28,29,31 kan beïnvloeden. Om dit probleem aan te pakken en een grotere nauwkeurigheid en precisie bij de evaluatie van de virulentie te garanderen, moet u bladluizen met witachtige delen op hun scheenbeen van de achterpoten uitsluiten die het volwassen stadium nog niet hebben bereikt, tenzij ze opzettelijk bladluisnimfen gebruiken. Deze bladluizen zijn nog niet volledig volwassen en kunnen vervellen, waardoor ze kunnen ontsnappen aan het infectieproces van EPF. Bovendien wordt aanbevolen om elke 12 uur een tijdsverloop van observatie en gegevensregistratie te volgen. Het interval van 12 uur heeft de voorkeur om verschillen aan te tonen tussen meerdere veelbelovende isolaten met vergelijkbare bladluisdodende eigenschappen en vergemakkelijkt de nauwkeurige berekening van LT50. Het tijdsinterval kan echter worden aangepast op basis van de verschillende levenscycli van andere insectensoorten of worden bepaald door middel van een kleinschalige pretest.
Hoewel de losbladmethode minimale honingdauw op de bladschijf kan achterlaten, hecht het grootste deel van de honingdauw zich aan het deksel van de petrischaal omdat de bladschijf zich in de buurt bevindt. Het kan tijdens de observatieperiode worden afgeveegd of weggespoeld. Honingdauw is echter ongetwijfeld aanwezig in de praktische omgeving van de gewasteelt wanneer bladluizenbinnendringen 32. De honingdauw die in de inoculatiekamer aanwezig is, kan enigszins de situatie simuleren wanneer EPF in het veld in bladluizen wordt geïnoculeerd. Nagelriemen bevatten meestal honingdauw, die dient als voedingsbron voor de schimmel en de kieming van EPF16 kan stimuleren. De combinatie van EPF-toepassing en honingdauwproductie door bladluizen kan dus voordelig zijn.
Om te bevestigen dat bladluissterfte het gevolg is van een infectie, worden kadavers meestal overgebracht van de EPF-inoculatiekamer naar vochtig filtreerpapier of een kweekmedium voor het observeren van schimmeluitgroei 11,14,33,34. In deze studie werd echter wateragar gebruikt in de inoculatiekamer om een hoge luchtvochtigheid te behouden, waardoor de bladluiskadavers op de bladeren konden blijven zonder te hoeven worden verplaatst voor observatie van schimmeluitgroei. Hoewel de losbladige methode informatie geeft over het bladluwe effect van EPF-isolaten, heeft het nog steeds beperkingen. De wateragar die wordt gebruikt om de conditie van de bladschijf op peil te houden, kan ervoor zorgen dat bladluizen vast komen te zitten tijdens het bewegen in de inoculatiekamer. Om dit probleem aan te pakken, werd het percentage wateragar verhoogd tot 3%, waardoor een oppervlak ontstaat dat stevig genoeg is voor Russische tarweluizen (Diuraphis noxia) om op20 te lopen. In dit experiment konden mosterdbladluizen zich comfortabel verplaatsen op wateragaroppervlakken met concentraties variërend van 1,5% tot 3%. Naarmate de observatieperiode vorderde, kwamen er echter een paar bladluizen ondersteboven vast te zitten met hun poten naar boven en moesten ze terug naar de bladschijf worden gered. Dit kan te wijten zijn aan de verschillen in bladluisgrootte of mobiliteit, wat aangeeft dat het verhogen van de agarconcentratie alleen het probleem mogelijk niet oplost. Zorg er daarom voor dat de bladschijf het agaroppervlak volledig bedekt door een blad te gebruiken dat beter aansluit op de grootte van de petrischaal, wat dit probleem kan helpen verlichten. In vergelijking met de methode met losse bladeren beschreven door Yokomi en Gottwald18, heeft deze studie één aspect verbeterd door een bladgrootte te gebruiken die ongeveer goed past bij de petrischaal. Dit maakt een relatieve kwantificering van de voedselconsumptie mogelijk en minimaliseert het blootgestelde agaroppervlak. Bovendien moet het blad worden "ingebed" in de halfgestolde wateragar, terwijl het in de oorspronkelijke referentie werd beschreven als "geplaatst" op de wateragar18. Door de bladschijf in de wateragar in te bedden, wordt de kans verkleind dat bladluizen aan het agaroppervlak blijven plakken en wordt de observatie vergemakkelijkt, omdat de bladluizen aan één kant worden beperkt.
Dit protocol geeft gedetailleerde instructies over hoe verder te gaan met de losbladmethode en EPF-inoculatie, samen met enkele wijzigingen die operaties, observaties en consistente resultaten hebben vergemakkelijkt. Het stelt ook een gestandaardiseerde methode vast voor het selecteren van EPF-isolaten tegen plantenzuigend ongedierte onder laboratoriumomstandigheden. Bovendien kan een standaardcontrole worden uitgevoerd met bekende effectieve of in de handel verkrijgbare producten voor de toekomstige commercialisering van EPF-isolaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling bij dit werk.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd ondersteund door 109-2313-B-005 -048 -MY3 van het Ministerie van Wetenschap en Technologie (MOST).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 μL Inoculating Loop | NEST Scientific | 718201 | |
| 100 bp DNA Ladder III | Geneaid | DL007 | |
| 2x SuperRed PCR Master Mix | Biotools | TE-SR01 | |
| 50 mL centrifuge tube | Bioman Scientific | ET5050-12 | |
| 6 cm Petri dish | Alpha Plus Scientific | 16021 | |
| 6 mm insect aspirator | MegaView Science | BA6001 | |
| 70 mm filter paper NO.1 | Toyo Roshi Kaisha | ||
| 70% ethanol | |||
| 9 cm Petri dish | Alpha Plus Scientific | 16001 | |
| Agar | Bioman Scientific | AGR001.1 | Microbiology grade |
| Agarose | Bioman Scientific | PB1200 | |
| BioGreen Safe DNA Gel Buffer | Bioman Scientific | SDB001T | |
| Chromas | Technelysium | ||
| GeneDoc | |||
| GenepHlow Gel/PCR Kit | Geneaid | DFH300 | https://www.geneaid.com/data/files/1605861013102532959.pdf |
| Gene-Spin Genomic DNA Isolation Kit | Protech Technology | PT-GD112-V3 | http://www.protech-bio.com/UserFiles/file/Gene-Spin%20Genomic%20DNA%20Kit.pdf |
| Hemocytometer | Paul Marienfeld | 640030 | |
| Komatsuna leaves (Brassica rapa var. perviridis) | Tai Cheng Farm | 1-010-300410 | |
| Microsprayer | |||
| MiniAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A37834 | |
| Mustard aphid (Lipaphis erysimi) | |||
| Painting brush | Tian Cheng brush company | 4716608400352 | |
| Parafilm M | Bemis | PM-996 | |
| Pellet pestle | Bioman Scientific | GT100R | |
| Sabouraud Dextrose Broth | HiMedia | MH033-500G | |
| SPSS Statistics | IBM | ||
| TAE buffer 50x | Bioman Scientific | TAE501000 | |
| Tween 80 | PanReac AppliChem | 142050.1661 |
References
- Ghosh, S., Roy, A., Chatterjee, A., Sikdar, S. R. Effect of regional wind circulation and meteorological factors on long-range migration of mustard aphids over indo-gangetic plain. Scientific Reports. 9, 5626 (2019).
- Dhillon, M. K., Singh, N., Yadava, D. K. Preventable yield losses and management of mustard aphid, Lipaphis erysimi (Kaltenbach) in different cultivars of Brassica juncea(L.) Czern & Coss. Crop Protection. 161, 106070 (2022).
- Huang, F., Hao, Z., Yan, F. Influence of oilseed rape seed treatment with imidacloprid on survival, feeding behavior, and detoxifying enzymes of mustard aphid, lipaphis erysimi. Insects. 10 (5), 144 (2019).
- Mannino, M. C., Huarte-Bonnet, C., Davyt-Colo, B., Pedrini, N. Is the insect cuticle the only entry gate for fungal infection? insights into alternative modes of action of entomopathogenic fungi. Journal of Fungi. 5 (2), 33 (2019).
- Bamisile, B. S., Akutse, K. S., Siddiqui, J. A., Xu, Y. Model application of entomopathogenic fungi as alternatives to chemical pesticides: prospects, challenges, and insights for next-generation sustainable agriculture. Frontiers in Plant Science. 12, 741804 (2021).
- Scorsetti, A. C., Humber, R. A., Garcia, J. J., Lopez Lastra, C. C. Natural occurrence of entomopathogenic fungi (Zygomycetes: Entomophthorales) of aphid (Hemiptera: Aphididae) pests of horticultural crops in Argentina. Biocontrol. 52, 641-655 (2007).
- Liu, Y. C., Ni, N. T., Chang, J. C., Li, Y. H., Lee, M. R., Kim, J. S., et al. Isolation and selection of entomopathogenic fungi from soil samples and evaluation of fungal virulence against insect pests. Journal of Visualized Experiments. 175, e62882 (2021).
- Francis, F., Fingu-Mabola, J. C., Fekih, I. B. Direct and endophytic effects of fungal entomopathogens for sustainable aphid control: a review. Agriculture. 12 (12), 2081 (2022).
- Simon, J., Peccoud, J. Rapid evolution of aphid pests in agricultural environments. Current Opinion in Insect Science. 26, 17-24 (2018).
- Ujjan, A. A., Shahzad, S. Use of Entomopathogenic Fungi for the Control of Mustard Aphid (Lipaphis erysimi) on canola (Brassica napus L). Pakistan Journal of Botany. 44 (6), 2081-2086 (2012).
- Sajid, M., Bashir, N. H., Batool, Q., Munir, I., Bilal, M., Jamal, M. A., et al. In-vitro evaluation of biopesticides (Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae, Bacillus thuringiensis) against mustard aphid Lipaphis erysimi kalt. (Hemiptera: Aphididae). Journal of Entomology and Zoology Studies. 5 (6), 331-335 (2017).
- Paschapur, A. U., Subbanna, A. R. N. S., Singh, A. K., Jeevan, B., Stanley, J., Rajashekara, H., Mishra, K. K., Koti, P. S., Kant, L., Pattanayak, A. Alternaria alternata strain VLH1: a potential entomopathogenic fungus native to North Western Indian Himalayas. Egyptian Journal of Biological Pest Control. 32, 138 (2022).
- Miohammed, A. A. Lecanicillium muscarium and Adalia bipunctata combination for the control of black bean aphid, Aphis fabae. Biocontrol. 63, 277-287 (2018).
- Thaochan, N., Ngampongsai, A., Prabhakar, C. S., Hu, Q. Beauveria bassiana PSUB01 simultaneously displays biocontrol activity against Lipaphis erysimi (Kalt.) (Hemiptera: Aphididae) and promotes plant growth in Chinese kale under hydroponic growing conditions. Biocontrol Science and Technology. 31 (10), 997-1015 (2021).
- Mseddi, J., Farhat-Touzri, D. B., Azzouz, H. Selection and characterization of thermotolerant Beauveria bassiana isolates and with insecticidal activity against the cotton-melon aphid Aphis gossypii (Glover) (Hemiptera: Aphididae). Pest Management Science. 78 (6), 2183-2195 (2022).
- Butt, T. M., Ibrahim, L., Clark, S. J., Beckett, A. The germination behaviour of Metarhizium anisopliae on the surface of aphid and flea beetle cuticles. Mycological Research. 99 (8), 945-950 (1995).
- Ullah, S., Raza, A. B. M., Alkafafy, M., Sayed, S., Hamid, M. I., Majeed, M. Z., Riaz, M. A., Gaber, N. M., Asim, M. Isolation, identification and virulence of indigenous entomopathogenic fungal strains against the peach-potato aphid, Myzus persicae Sulzer (Hemiptera: Aphididae), and the fall armyworm, Spodoptera frugiperda (J.E. Smith) (Lepidoptera: Noctuidae). Egyptian Journal of Biological Pest Control. 32, 2 (2022).
- Yokomi, R. K., Gottwald, T. R. Virulence of Verticillium lecanii Isolates in Aphids Determined by Detached-leaf Bioassay. Journal of Inbertebrate Pathology. 51, 250-258 (1988).
- Vu, V. H., Hong, S. I., Kim, K. Selection of entomopathogenic fungi for aphid control. Journal of Bioscience and Bioengineering. 104 (6), 498-505 (2007).
- Vandenberg, J. D. Standardized bioassay and screening of beauveria bassiana and paecilomyces fumosoroseus against the russian wheat aphid (homoptera: aphididae). Journal of Economic Entomology. 89 (6), 1418-1423 (1996).
- Lu, W. N., Wu, Y. T., Kuo, M. H. Development of species-specific primers for the identification of aphids in Taiwan. Applied Entomology and Zoology. 43 (1), 91-96 (2008).
- Liu, Y. C., et al. Isolation and selection of entomopathogenic fungi from soil samples and evaluation of fungal virulence against insect pests. Journal of Visualized Experiments. 175, e62882 (2021).
- Menger, J., Beauzay, P., Chirumamilla, A., Dierks, C., Gavloski, J., Glogoza, P., et al. Implementation of a diagnostic-concentration bioassay for detection of susceptibility to pyrethroids in soybean aphid (hemiptera: aphididae). Journal of Economic Entomology. 113 (2), 932-939 (2020).
- Zhang, R., Chen, J., Jiang, L., Qiao, G. The genes expression difference between winged and wingless bird cherry-oat aphid Rhopalosiphum padi based on transcriptomic data. Scientific Reports. 9, 4754 (2019).
- Abbott, W. S. A method of computing the effectiveness of an insecticide. Journal of Economic Entomology. 18, 265-267 (1925).
- Liu, T. X., Sparks, A. N. Jr Aphids on Cruciferous Crops: Identification and Management. , Texas A&M AgriLife Extension Service. 9-11 (2001).
- Kuo, M., Chianglin, H. Temperature dependent life table of brevicoryne brassicae (l.)(hemiptera: aphididae) on radish. Formosan Entomologist. 27, 293-302 (2007).
- Im, Y., Park, S., Lee, S. Y., Kim, J., Kim, J. J. Early-Stage defense mechanism of the cotton aphid aphis gossypii against infection with the insect-killing fungus beauveria bassiana JEF-544. Frontiers in Immunology. 13, 907088 (2022).
- Kim, J. J., Roberts, D. W. The relationship between conidial dose, moulting and insect developmental stage on the susceptibility of cotton aphid, Aphis gossypii, to conidia of Lecanicillium attenuatum, an entomopathogenic fungus. Biocontrol Science and Technology. 22 (3), 319-331 (2012).
- Reingold, V., Kottakota, C., Birnbaum, N., Goldenberg, M., Lebedev, G., Ghanim, M., et al. Intraspecies variation ofMetarhiziumbrunneumagainst the green peach aphid,Myzus persicae, provides insight into thecomplexity of disease progression. Pest Management Science. 77, 2557-2567 (2021).
- Ortiz-Urquiza, A., Keyhani, N. O. Action on the Surface: entomopathogenic fungi versus the insect cuticle. Insects. 4, 357-374 (2013).
- Knodel, J. J., Beauzay, P., Boetel, M., Prochaska, T., Chirumamilla, A. 2022 North Dakota Field Crop Insect Management Guide. , 23 North Dakota State University Extension Publication: North Dakota, USA. (2021).
- Yeo, H., Pell, J. K., Alderson, P. G., Clark, S. J., Pye, B. J. Laboratory evaluation of temperature effects on the germination and growth of entomopathogenic fungi and on their pathogenicity to two aphid species. Pest Management Science. 59 (2), 156-165 (2003).
- Erdos, Z., Chandler, D., Bass, C., Raymond, B. Controlling insecticide resistant clones of the aphid, Myzus persicae, using the entomopathogenic fungus Akanthomyces muscarius: fitness cost of resistance under pathogen challenge. Pest Management Science. 77 (11), 5286-5293 (2021).
