Summary
Questo protocollo presenta un sistema ottimizzato di biodosaggio a foglia staccata per valutare l'efficacia dei funghi entomopatogeni (EPF) contro l'afide della senape (Lipaphis erysimi (Kalt.)), un insetto partenogenetico. Il metodo delinea il processo di raccolta dei dati durante gli esperimenti con piastre di Petri, consentendo ai ricercatori di misurare costantemente la virulenza dell'EPF contro gli afidi della senape e altri insetti partenogenetici.
Abstract
L'afide della senape (L. erysimi) è un parassita che infesta varie colture crocifere e trasmette virus vegetali. Per ottenere una gestione ecologica dei parassiti, i funghi entomopatogeni (EPF) sono potenziali agenti di controllo microbico per il controllo di questo parassita. Pertanto, lo screening della virulenza degli isolati di EPF in condizioni di piastra di Petri è necessario prima dell'applicazione sul campo. Tuttavia, l'afide della senape è un insetto partenogenetico, il che rende difficile registrare i dati durante gli esperimenti con piastre di Petri. Per affrontare questo problema è stato sviluppato un sistema modificato per i saggi biologici delle foglie distaccate, utilizzando un microspruzzatore per inoculare i conidi sugli afidi e prevenire l'annegamento facilitando l'essiccazione all'aria dopo la sospensione delle spore. Il sistema ha mantenuto un'elevata umidità relativa per tutto il periodo di osservazione e il disco fogliare è rimasto fresco per oltre dieci giorni, consentendo la riproduzione partenogenetica degli afidi. Per prevenire l'accumulo di prole, è stato implementato un processo di rimozione quotidiana utilizzando un pennello da pittura. Questo protocollo dimostra un sistema stabile per valutare la virulenza degli isolati di EPF contro gli afidi della senape o altri afidi, consentendo la selezione di potenziali isolati per il controllo degli afidi.
Introduction
L'afide della senape (L. erysimi) è un noto parassita che infesta una varietà di colture crocifere, causando notevoli perdite economiche1. Sebbene siano stati raccomandati diversi insetticidi sistematici per combattere le infestazioni di afidi, l'uso frequente di questi insetticidi solleva preoccupazioni sulla resistenza ai pesticidi 2,3. Pertanto, in termini di gestione ecologica dei parassiti, i funghi entomopatogeni (EPF) potrebbero fungere da adeguata strategia di controllo alternativa. L'EPF è un insetto patogeno con la capacità di infettare gli ospiti penetrando nelle loro cuticole, il che lo rende un potente agente per il controllo degli afidi e di altri insetti succhiatori delle piante4. Inoltre, l'EPF ha dimostrato di essere una tecnica di gestione dei parassiti fattibile e sostenibile, offrendo vantaggi come l'antagonismo dei patogeni delle piante e la promozione della crescita delle piante5.
L'EPF può essere ottenuto attraverso l'adescamento del suolo degli insetti o isolato dai cadaveri degli insetti nel campo 6,7. Tuttavia, prima di un ulteriore utilizzo di isolati fungini, è necessario uno screening della patogenicità. Sono stati condotti diversi studi sull'efficacia dell'EPF contro gli afidi, che sono importanti parassiti delle colture che possono causare gravi danni 8,9. Gli afidi della senape, tra le varie specie di afidi, sono stati testati per la suscettibilità a diversi ceppi di Beauveria spp., Metarhizium spp., Lecanicillium spp., Paecilomyces spp. e persino Alternaria, che è principalmente noto come fungo saprofita e patogeno delle piante, ma ha mostrato alcuni effetti letali contro gli afidi della senape10,11,12.
Per valutare l'efficacia dell'EPF contro gli afidi in condizioni di laboratorio, i saggi biologici possono essere suddivisi in due parti principali: la camera di inoculazione e l'inoculazione fungina. L'attuale protocollo descrive la costruzione di una camera di inoculazione, in cui gli afidi possono essere mantenuti utilizzando vari metodi, come una foglia asportata con un picciolo avvolto in cotone umido, un disco fogliare asportato con una capsula di Petri rivestita con carta da filtro inumidita, la manutenzione diretta sulle piante in vaso o un disco fogliare asportato incorporato in agar acquoso all'interno di una capsula di Petri o di un contenitore10, 11,13. I metodi comuni per l'inoculazione fungina includono l'irrorazione dei conidi, l'immersione degli afidi in una sospensione dei conidi, l'immersione delle foglie in una sospensione dei conidi e l'inoculazione degli endofitidelle piante 11,14,15,16. Sebbene esistano vari metodi di inoculazione, i saggi biologici dovrebbero simulare le condizioni di applicazione sul campo. Ad esempio, nel caso del metodo12,17 a immersione fogliare, è possibile valutare l'efficienza dell'EPF, ma poiché gli afidi infestano le foglie cariche di funghi, il lato dorsale dell'afide, che è un sito di penetrazione preferenziale, di solito non viene esposto al fungo.
Per valutare l'effetto afididida dell'EPF in condizioni di laboratorio, questo protocollo suggerisce di utilizzare il metodo della foglia staccata descritto da Yokomi e Gottwald18 con alcune modifiche, seguito dall'inoculazione dei conidi utilizzando un micro-spruzzatore. Questo metodo mantiene circa il 100% di umidità nella camera del biosaggio per almeno sette giorni senza richiedere un ulteriore reintegro di acqua18,19. Inoltre, confinare gli afidi su una superficie garantisce la loro esposizione all'irrorazione dei conidi e facilita le osservazioni20. Tuttavia, gli afidi possono rimanere bloccati nella superficie esposta dell'agar mentre si muovono all'interno della camera di inoculazione. Inoltre, la registrazione dei dati nell'esperimento della piastra di Petri con gli afidi della senape, che sono insetti partenogenetici, può essere difficile a causa del loro rapido sviluppo e riproduzione. È difficile distinguere tra gli adulti inoculati e la loro progenie senza rimozione. I dettagli su come procedere con questo passaggio sono raramente menzionati e alcuni fattori incoerenti, come l'area di consumo delle foglie, devono essere ottimizzati.
Questo protocollo dimostra un sistema stabile per lo screening della virulenza degli isolati di EPF contro gli afidi della senape, consentendo la selezione di potenziali isolati contro varie specie di afidi da un'ampia libreria di EPF. È possibile identificare gli afidi raccolti sul campo e stabilire una popolazione di laboratorio sufficiente di afidi della senape per valutare l'effetto afididida di vari isolati fungini utilizzando una metodologia semplice e fattibile con risultati coerenti. Gli afidi hanno sviluppato molteplici meccanismi evolutivi in risposta alle intense e ripetute pressioni antropogeniche negli agroecosistemi, ponendo sfide alla sicurezza alimentare9. Pertanto, questo metodo descritto potrebbe essere esteso per valutare potenziali isolati di EPF contro varie specie di afidi.
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Protocol
NOTA: Il diagramma di flusso completo è mostrato nella Figura 1.
1. Raccolta e manutenzione dell'afide della senape
- Collezione di afidi della senape
- Capovolgi le foglie e controlla visivamente l'infestazione di afidi della senape sulle colture crocifere nel campo.
- Registrare le informazioni sul sito di campionamento (ad es. GPS) e sulle piante ospiti e confermare la cronologia delle applicazioni di insetticidi con gli agricoltori.
- Utilizzare un aspiratore per insetti o un pennello da pittura fine (vedere Tabella dei materiali) per raccogliere circa 50 afidi di senape in una provetta da centrifuga da 50 ml da colture crocifere in campo e portare il campione in laboratorio entro 3 ore.
- Preparare una capsula di Petri di manutenzione temporanea con foglie crocifere asportate e carta da filtro infiltrata d'acqua sul fondo.
- Posizionare i cinque afidi sulla capsula di Petri di mantenimento temporanea a temperatura ambiente (25 ± 2 °C) con un'umidità relativa del 70% e un fotoperiodo di 12:12 h (chiaro:scuro) per 14 giorni per confermare che gli afidi risparmiano il nemico naturale prima di un ulteriore allevamento.
NOTA: Per garantire che gli afidi raccolti in campo siano esenti da nemici naturali come vespe parassitoidi o funghi entomopatogeni, è fondamentale confermare l'assenza di questi organismi prima di procedere con ulteriori allevamenti.
- Mantenimento degli afidi della senape
NOTA: Per mantenere gli afidi della senape, utilizzare foglie crocifere prive di pesticidi (compresi i biopesticidi).- Fornire un apporto stabile e sufficiente di foglie crocifere (circa 25 cm2).
NOTA: Procurarsi le foglie di crucifere dal mercato o coltivare le piante. Prima dell'allevamento massiccio e a lungo termine di afidi della senape, è stato possibile testare diversi tipi di crucifere per trovare una crucifera adatta. Una volta fissata la specie della foglia crocifera, non cambiarla. In questo studio è stata utilizzata la Komatsuna (Brassica rapa var. perviridis) allo stadio di 6-7 foglie (vedi Tabella dei materiali). Inoltre, smaltisci le 2-3 foglie più vecchie. - Aggiungere acqua prima che la carta da filtro sul fondo sia completamente asciutta.
- Osserva quotidianamente la densità di popolazione degli afidi della senape. La popolazione dovrebbe crescere fino a 2-3 volte dopo 7 giorni.
- Quando il numero di afidi aumenta, tagliare le foglie originariamente asportate con gli afidi della senape in 4-6 pezzi più piccoli e mettere ogni piccolo pezzo di foglia con gli afidi della senape in una capsula di Petri con foglie fresche asportate e carta da filtro infiltrata d'acqua.
- Porre la capsula di Petri in un'incubatrice a 25 °C con un fotoperiodo di 12:12 h (chiaro:scuro) e osservare quotidianamente la densità di popolazione degli afidi della senape.
- Rimuovere le foglie asportate originali dopo che la maggior parte degli afidi è migrata verso le foglie fresche asportate prima che le foglie originali marciscano.
- Fornire un apporto stabile e sufficiente di foglie crocifere (circa 25 cm2).
2. Identificazione molecolare dell'afide della senape
NOTA: Per confermare la specie di afide della senape raccolto sul campo, l'identificazione molecolare è stata eseguita utilizzando due marcatori molecolari: la sequenza caratterizzata dalla regione amplificata (SCAR) basata su A05Le progettata da Lu et al.21 e la regione della subunità 1 della citocromo ossidasi dell'afide della senape (COI) dell'afide della senape.
- Estrazione del DNA genomico dell'afide della senape
- Raccogliere circa 50 afidi in una provetta da centrifuga da 1,5 mL.
NOTA: Gli afidi utilizzati per l'identificazione molecolare dovrebbero essere discendenti di un singolo afide e vari stadi potrebbero anche essere raggruppati nella stessa provetta per l'estrazione del DNA. - Omogeneizzare gli afidi con un pestello a pellet ed estrarre il DNA utilizzando il kit di isolamento del DNA genomico Gene-Spin seguendo le istruzioni del produttore (vedere la tabella dei materiali).
- Eluire il DNA genomico con 50 μL di acqua preriscaldata priva di nucleasi.
- Raccogliere circa 50 afidi in una provetta da centrifuga da 1,5 mL.
- Amplificazione PCR e sequenziamento del DNA
- Amplificare le sequenze di DNA bersaglio dal DNA genomico degli afidi utilizzando PCR Master Mix (2x) con le coppie di primer A05LeF/A05LeR e LeCO1F/LeCO1R (Tabella 1) con diversi programmi di PCR21.
NOTA: La reazione PCR con un volume totale di 20 μL è composta da 2 μL di stampo di DNA genomico di afidi, 1 μL di primer diretti e 1 μL invertito, 10 μL di PCR Master Mix (vedere la tabella dei materiali) e 6 μL di ddH2O. - Eseguire la PCR in un termociclatore (vedi Tabella dei materiali) con il seguente programma: 94 °C per 5 min, 25 cicli di 94 °C per 45 s, 61 °C (per A05LeF/A05LeR) e 58 °C (per LeCO1F/LeCO1R) per 45 s, 72 °C per 1 min, seguiti da un'estensione finale di 72 °C per 5 min.
- Analizzare il prodotto PCR mediante elettroforesi su gel di agarosio all'1% per confermare l'identità dell'afide della senape (Figura 2).
NOTA: Se la coppia di primer A05LeF/A05LeR amplifica con successo la dimensione corretta del frammento di DNA, ha identificato in modo convincente l'afide raccolto sul campo come afide della senape21. Le coppie di primer sono elencate nella Tabella 2. - Purificare il prodotto PCR dall'amplicone COI dell'afide della senape utilizzando un kit gel/PCR disponibile in commercio seguendo le istruzioni del produttore (vedere la Tabella dei materiali) e sequenziare il prodotto PCR utilizzando un servizio di sequenziamento commerciale.
- Amplificare le sequenze di DNA bersaglio dal DNA genomico degli afidi utilizzando PCR Master Mix (2x) con le coppie di primer A05LeF/A05LeR e LeCO1F/LeCO1R (Tabella 1) con diversi programmi di PCR21.
- Analisi della sequenza
NOTA: Secondo Lu et al.21, la piegatura del DNA di A05Le è un frammento di DNA specifico dell'afide della senape; pertanto, il prodotto A05Le PCR non deve essere ulteriormente sequenziato.- Controllare la qualità di lettura con il software Chromas (vedere la tabella dei materiali) dopo aver ottenuto la sequenza LeCO1.
- Taglia le letture di bassa qualità a monte e a valle aprendo un file fasta (o txt) e rimuovendo direttamente le letture di bassa qualità.
- Inviare la sequenza tagliata a NCBI web BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) utilizzando i parametri predefiniti.
NOTA: Se le dimensioni dell'amplicone dei set di primer A05Le e LeCO1 sono corrette, in teoria, la ricerca di esplosioni in sequenza rispetto ai database standard NCBI deve corrispondere all'afide della senape.
3. Preparazione di funghi entomopatogeni
NOTA: L'EPF utilizzato in questo studio è elencato nella Tabella 1.
- Recupero di EPF da libreria fungina
- Scongelare i funghi conservati (conidi sospesi in glicerina al 30%) dal congelatore a -80 °C.
- Trasferire una piccola quantità (circa 10 μL) della sospensione di conidi in una piastra di agar destrosio Sabouraud da 6 cm 1/4 (0,75 g di brodo di destrosio Sabouraud con 1,5 g di agar per 100 mL ddH2O) e distribuirla uniformemente utilizzando uno spandiconcime cellulare in una cappa a flusso laminare.
- Sigillare la capsula di Petri con pellicola di paraffina e incubarla al buio a 25 °C per 10-14 giorni.
- Ricoltura degli isolati fungini striando la massa fungina su una piastra da 1/4 di SDA e incubando i funghi al buio a 25 °C per 10-14 giorni prima di raccogliere i conidi22.
NOTA: La coltura fungina deve essere utilizzata circa 10 giorni prima di inoculare gli afidi. La coltura EPF che ha più di 14 giorni non è raccomandata per l'uso nel test di virulenza.
- Preparazione della sospensione di conidi
- Raschiare i conidi dalla coltura fungina di 10-14 giorni su piastra SDA da 1/4 inoculando un'ansa dopo aver aggiunto 2-3 ml di Tween 80 allo 0,03% (vedere la tabella dei materiali).
- Raccogliere la sospensione fungina in una provetta da centrifuga.
- Vorticare la soluzione alla massima velocità, contare il numero di conidi utilizzando un emocitometro al microscopio ottico e regolare la concentrazione della sospensione dei conidi a 108 conidi/mL.
- Trasferire la sospensione dei conidi in un microspruzzatore sterilizzato ai raggi UV.
NOTA: Vorticare nuovamente la sospensione dei conidi prima di trasferirla, poiché i conidi sono inclini a precipitare. Il microspruzzatore deve essere esposto alle radiazioni ultraviolette in una cappa a flusso laminare per 30 minuti prima dell'uso.
4. Screening della virulenza contro l'afide della senape
- Preparazione degli adulti appena emersi
- Spostare gli adulti atteri (senza ala) e alati (alati) dalla capsula di Petri che si sta rialzando alle foglie appena asportate per riprodurre nuove progenie della stessa età. Rimuovere gli adulti dopo 24 ore per evitare il sovraffollamento e ridurre al minimo la produzione di progenie alata23,24. Solo gli adulti atteri saranno utilizzati in ulteriori esperimenti.
- Allevare le progenie allo stadio adulto e rimuovere le progenie che non si sviluppano nello stadio adulto dopo 48 ore (Figura 3) per prevenire la variazione di età tra gli afidi per l'esperimento. Inoltre, rimuovere gli adulti alati.
- Preparazione della camera di inoculo
NOTA: Si consiglia di preparare prima le foglie di crucifere di 9 cm di diametro, in modo che il disco fogliare possa essere incorporato nell'agar acquoso prima della solidificazione.- Pulisci le foglie crocifere con acqua di rubinetto, rimuovi sporco e residui e qualsiasi altro artropode se presente.
- Asciugare l'acqua in eccesso con un tovagliolo di carta e verificare la presenza di altri artropodi sulla superficie delle foglie crocifere utilizzando uno stereomicroscopio. Rimuovere eventuali artropodi, se presenti.
- Tagliare un disco di foglie di 9 cm di diametro premendo direttamente la capsula di Petri inferiore sulla foglia come stampo o usando le forbici.
NOTA: Se le foglie hanno un diametro inferiore a 9 cm, unire un paio di foglie asportate. - Preparare l'agar acquoso all'1,5% per ogni capsula di Petri riscaldando e sciogliendo 450 mg di agar (vedere Tabella dei materiali) in 30 mL ddH2O utilizzando il microonde.
NOTA: La quantità di agar acquoso all'1,5% può essere regolata a seconda della scala dell'esperimento. - Versare 30 mL di agar acquoso all'1,5% nella capsula di Petri da 9 cm prima della solidificazione nella cappa a flusso laminare, quindi attendere che l'agar si raffreddi a ~40 °C fino a quando la superficie dell'agar non è semisolidificata.
NOTA: Controllare se la superficie è semisolidificata scuotendo delicatamente orizzontalmente la capsula di Petri. - Posizionare il disco fogliare, con la superficie abassiale rivolta verso l'alto, sopra l'agar acquoso, incorporando il disco fogliare nell'agar.
NOTA: Ridurre al minimo l'esposizione della superficie dell'agar. - Dopo che l'agar acquoso si è solidificato completamente, chiudere il coperchio della capsula di Petri.
NOTA: Aprire il coperchio per la vaporizzazione dell'acqua se molte goccioline si condensano immediatamente sul coperchio. - Posiziona 20 adulti atteri sul disco fogliare.
NOTA: Si consiglia di operare sotto uno stereomicroscopio per evitare danni all'apparato boccale.
- Inoculazione e osservazione dell'EPF
- Aprire il coperchio della camera di inoculo e spruzzare 0,3 mL di sospensione di conidi (dal punto 3.2) direttamente sugli afidi e sul disco fogliare da circa 15 cm sopra il disco fogliare.
NOTA: Vorticare nuovamente la sospensione dei conidi prima di spruzzare. Le aree di spruzzatura devono essere testate prima dell'esperimento, in quanto possono variare tra i diversi spruzzatori. In questo caso, si consiglia 0,3 mL con una distanza di 15 cm. L'area di spruzzatura dovrebbe coprire l'intero disco fogliare e un sottile strato di sospensione di conidi dovrebbe coprire il disco fogliare. Se le goccioline convergono nell'acqua stagnante sulla foglia, il volume di inoculazione deve essere ridotto. Pulire il tavolo con etanolo al 70% prima dell'inoculazione e tra l'uso di diversi isolati. - Attendere che la sospensione dei conidi si asciughi, quindi chiudere il coperchio per evitare che gli afidi della senape anneghino.
NOTA: Gli afidi vagano raramente durante l'esperimento; Tuttavia, è comunque necessario assicurarsi che gli afidi non fuoriescano. - Sigillare la camera di inoculo con una pellicola di paraffina per mantenere un'elevata umidità relativa e posizionare la camera di inoculo in un incubatore a 25 °C con fotoperiodo 12:12 h (chiaro:scuro).
- Aprire il coperchio della camera di inoculazione per contare la mortalità al microscopio stereoscopico ogni 12 ore per 5 giorni.
- Pulisci la melata aderente al coperchio con un tovagliolo di carta e rimuovi gli afidi appena emersi con un pennello da pittura fine. Pulire il coperchio con acqua di rubinetto ogni 24 ore.
NOTA: Il periodo di osservazione può variare per le diverse specie di afidi in base alla longevità dell'adulto. - Tenere il cadavere sul disco fogliare per la micosi per confermare l'avvenuta inoculazione.
- Aprire il coperchio della camera di inoculo e spruzzare 0,3 mL di sospensione di conidi (dal punto 3.2) direttamente sugli afidi e sul disco fogliare da circa 15 cm sopra il disco fogliare.
- Conferma del tasso di germinazione dei conidi
NOTA: questo passaggio è facoltativo. Per confermare il tasso di germinazione dei conidi a coppie durante l'esecuzione dello screening della virulenza per garantire l'attività dei conidi.- Far cadere una gocciolina di sospensione di conidi da 5 μL su 1/4 di SDA per tre repliche.
- Dopo 18 ore, calcolare il tasso di germinazione con il microscopio ottico. Conta almeno 100 spore in modo casuale in una singola gocciolina per confermare il tasso di germinazione del fungo.
NOTA: Normalmente, il tasso di germinazione degli isolati utilizzati nell'esperimento dovrebbe essere superiore al 90%.
5. Biodosaggio di isolati EPF selezionati
NOTA: Gli isolati di EPF che hanno mostrato un'elevata virulenza, che è stata selezionata dalla fase 4, sono stati sottoposti a un test biologico contro gli afidi della senape utilizzando quattro concentrazioni di sospensioni di conidi (comprese tra 104 e 107 conidi/mL).
- Preparazione della sospensione di conidi
- Ripetere il passaggio 3.1 per recuperare gli isolati EPF selezionati.
- Ripetere il passaggio 3.2 per preparare quattro concentrazioni di sospensione di conidi, di cui 104, 105,10 6 e 107 conidi/mL.
- Preparazione degli adulti appena emersi
- Ripetere il passaggio 4.1 per preparare gli adulti appena emersi.
- Preparazione della camera di inoculo
- Ripetere il passaggio 4.1. per preparare la camera di inoculazione.
- Inoculazione e osservazione dell'EPF
- Ripetere il passaggio 4.3. per eseguire l'inoculazione e l'osservazione dell'EPF con le quattro concentrazioni di sospensione dei conidi, rispettivamente.
6. Analisi statistica
- Calcolo della mortalità corretta
- Calcolare la mortalità corretta utilizzando la formula25 di Abbott, come mostrato di seguito:
Mortalità corretta (%) = [(MT− M C) × 100%] / (100− MC)
MT rappresenta la mortalità del gruppo di trattamento e MC rappresenta la mortalità del gruppo di controllo.
NOTA: La mortalità del gruppo di controllo non deve essere superiore al 20%. - Aprire la piattaforma software SPSS (vedere la tabella dei materiali), creare variabili tra cui "trattamento" e "cor_mor" (che rappresentano la mortalità corretta) e inserire i risultati calcolati per l'inoculazione di diversi isolati nello stesso punto temporale con la stessa concentrazione inoculata.
- Selezionare Analizza, Confronta medie e proporzioni, Test T a campioni indipendenti in SPSS per l'analisi del test t indipendente.
- In SPSS, immettere il trattamento nella casella "Variabile di raggruppamento" e cor_mor in "Variabile/i di prova". Definisci i gruppi in base a diversi isolati fungini. Premere OK per analizzare.
- Calcolare la mortalità corretta utilizzando la formula25 di Abbott, come mostrato di seguito:
- Calcolo del tempo letale mediano (LT 50) e della concentrazione letale mediana (LC50)
- Aprire l'SPSS, creare le variabili "totale", "risposta" e "durata"/"concentrazione" e inserire il risultato registrato nel foglio di calcolo.
- Selezionare Analizza, Regressione, Probit in SPSS per calcolare LT 50 e/o LC50.
NOTA: Se la mortalità cumulativa non supera il 50% alla fine, LT 50 e/o LC50 non possono essere stimati. - Inserire il totale nella casella "Totale osservato", la risposta nella casella "Frequenza di risposta ", la durata/concentrazione nella casella "Covariate". Premere OK per analizzare.
NOTA: In genere, premere Opzioni e impostare il "Livello di significatività per l'uso del fattore di eterogeneità" su 0,05.
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Representative Results
Il diagramma di flusso presentato illustra le condizioni stabili degli afidi della senape dalla raccolta sul campo allo screening della virulenza. Il mantenimento degli afidi provenienti dalla raccolta in campo ha garantito un aumento stabile delle colonie di afidi con un adeguato approvvigionamento alimentare. Gli afidi raccolti sul campo sono stati confermati come afidi della senape attraverso l'uso di marcatori molecolari, tra cui la dimensione dell'amplicone della PCR e il sequenziamento di LeCO1. Lo screening della virulenza, condotto utilizzando il metodo della foglia staccata, ha rivelato un tasso di sopravvivenza costante per gli afidi della senape, con il gruppo di controllo che ha mostrato un tasso di sopravvivenza dell'85% (Figura 4).
Durante lo screening di virulenza, Cc-NCHU-213 ha dimostrato la più rapida capacità di uccidere gli afidi, con conseguente mortalità del 50% e del 90% rispettivamente a 3 giorni e 4,5 giorni dopo l'inoculazione (d.p.i.) (Figura 4). Tuttavia, sono state osservate diverse capacità di uccidere gli afidi tra i cinque isolati di B. bassiana. Bb-NCHU-141, -143 e -153 hanno mostrato capacità di uccidere lentamente gli afidi, con solo il 5% di mortalità a 3 d.p.i., anche escludendo gli effetti dell'irrorazione dello 0,03% di Tween 80 o di altri fattori letali (Figura 4). Quindi, la formula di mortalità corretta è stata impiegata per normalizzare la mortalità di controllo. La maggior parte degli isolati di EPF contro gli afidi della senape ha mostrato tassi di mortalità corretti superiori al 70% entro 5 d.p.i., ad eccezione di Pl-NCHU-152 (Tabella 3). Tra questi isolati EPF, Bb-NCHU-286 ha dimostrato il più alto tasso di mortalità del 100% (Tabella 3). Inoltre, la micosi EPF è stata osservata su cadaveri di afidi della senape infettati da Metarhizium spp., Beauveria spp., Purpureocillium lilacinum e Cordyceps cateniannulata durante lo screening della virulenza, indicando l'efficacia di questo sistema (Figura 5).
Sulla base dei risultati dello screening di virulenza, due isolati di EPF, vale a dire Mb-NCHU-197 e Cc-NCHU-213, che mostrano una rapida attività di uccisione degli insetti (40% e 50% di mortalità a 3 d.p.i., rispettivamente), sono stati selezionati per il test biologico contro gli afidi della senape. I risultati hanno dimostrato mortalità corrette significativamente diverse per Mb-NCHU-197 e Cc-NCHU-213 a 3 e 4 d.p.i. con un'inoculazione di 107 conidi/mL (Figura 6). Nel test LT50, il trattamento con 107 conidi/mL di Cc-NCHU-213 ha mostrato una durata significativamente più breve rispetto ad altri trattamenti (Tabella 4). Inoltre, il valore di LC50 di Cc-NCHU-213 (9,32 × 104) era inferiore a quello di Mb-NCHU-213 (2,30 × 10 5), indicando che Cc-NCHU-213 possiede una maggiore virulenza contro gli afidi della senape (Tabella 5).
Figura 1: Diagramma di flusso sperimentale per lo screening della virulenza dell'EPF contro gli afidi della senape. (A) Istituzione di un sistema di allevamento di afidi della senape. (b) Preparazione dell'EPF. (C) Inoculazione fungina. (D) Analisi statistica. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Elettroforesi del DNA genomico dell'afide della senape amplificato con i set di primer A05Le e Le CO1. L'elettroforesi è stata eseguita su un gel di agarosio all'1%. M = scala del DNA di 100 bp; bp = coppie di basi. L'asterisco rosso indica la curvatura target dell'amplificazione PCR. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Differenze tra la ninfa del quarto stadio e gli afidi adulti della senape. (A) Ninfa del quarto stadio. (b) Adulto. Le tibie delle zampe posteriori della ninfa del quarto stadio sono biancastre (contrassegnate da una freccia rossa). Gli afidi appena emersi sono stati rimossi con una spazzola fine di cammello durante i test di virulenza. Barra della scala = 1 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Mappa termica di mortalità di 13 isolati EPF contro gli afidi della senape attraverso il metodo della foglia staccata. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Osservazione della micosi fungina di 13 isolati di EPF. Mepe-NCHU-2 = Metarhizium pemphigi; Mp-NCHU-11 = Metarhizium pinghaense; Mb = Metarhizium baoshanense; Cc = Cordyceps cateniannulata; Ba = Beauveria australis; Bb = Beauveriabassiana; Pl = Purpureocillium lilacinum. Barra della scala = 1 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Mortalità corretta degli isolati fungini Mb-NCHU-197 e Cc-NCHU-213 contro l'afide della senape. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard (SD). I decessi di Mb-NCHU-197 e Cc-NCHU-213 nello stesso momento con la stessa concentrazione inoculata sono stati confrontati utilizzando un t-test indipendente e i decessi contrassegnati con un asterisco sono risultati significativamente diversi (p < 0,05). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Isolare | Specie | Host o sorgente* | Ubicazione |
| Mp-NCHU-2 | Pemphigi di Metarhizium | suolo | Yilan |
| Visualizzazione del materiale ML-NCHU-9 | Metarhizium lepidiotae | suolo | Yilan |
| Mp-NCHU-11 | Metarhizium pinghaense | suolo | Yilan |
| BA-NCHU-113 | Beauveria australis | suolo | Taichung |
| Bb-NCHU-141 | Bassiana di Beauveria | Hypothenemus hampei | Chiayi |
| Bb-NCHU-143 | Bassiana di Beauveria | Hypothenemus hampei | Chiayi |
| PL-NCHU-152 | Purpureocillium lilacinum | Papillosa di Tessaratoma | Chiayi |
| Bb-NCHU-153 | Bassiana di Beauveria | Ferrugineus di Rhynchophorus | cantone di Chunghua |
| Bb-NCHU-157 | Bassiana di Beauveria | Ferrugineus di Rhynchophorus | cantone di Chunghua |
| Mb-NCHU-196 | Metarhizium baoshanense | suolo | Taichung |
| Mb-NCHU-197 | Metarhizium baoshanense | suolo | Taichung |
| CC-NCHU-213 | Cordyceps cateniannulata | suolo | Taichung |
| Bb-NCHU-286 | Bassiana di Beauveria | Cerambycidae | Taichung |
Tabella 1: Isolati di EPF utilizzati in questo studio.
| Nome primer | Sequenza (5' - 3') | Dimensioni del prodotto (bp) | Riferimento | |
| A05LE | F-GGGTCTTGGATGGTGTGGTG | 953 | Lu et al. [21] | |
| R-AGGGGTCTTGTCGCCATTTT | ||||
| LeCO1 | F-CTTTTCCCATGATCAATTTT | 593 | Questo studio | |
| R-ACGTAGTGGAAATGAGCAAC | ||||
Tabella 2: Coppie di primer utilizzati per l'identificazione molecolare degli afidi della senape.
| Isolare | Specie | Mortalità corretta (%) |
| Mp-NCHU-2 | Pemphigi di Metarhizium | 76.47 |
| Visualizzazione del materiale ML-NCHU-9 | Metarhizium lepidiotae | 82.35 |
| Mp-NCHU-11 | Metarhizium pinghaense | 76.47 |
| BA-NCHU-113 | Beauveria australis | 82.35 |
| Bb-NCHU-141 | Bassiana di Beauveria | 88.24 |
| Bb-NCHU-143 | Bassiana di Beauveria | 88.24 |
| PL-NCHU-152 | Purpureocillium lilacinum | 35.29 |
| Bb-NCHU-153 | Bassiana di Beauveria | 82.35 |
| Bb-NCHU-157 | Bassiana di Beauveria | 88.24 |
| Mb-NCHU-196 | Metarhizium baoshanense | 76.47 |
| Mb-NCHU-197 | Metarhizium baoshanense | 88.24 |
| CC-NCHU-213 | Cordyceps cateniannulata | 94.12 |
| Bb-NCHU-286 | Bassiana di Beauveria | 100.00 |
Tabella 3: Tassi di mortalità corretti di 13 isolati EPF contro gli afidi della senape a 5 giorni dall'inoculazione (d.p.i.).
| Isolare | Specie | Conc. (conidi/mL) | N* | LT50 (giorni)† | Limiti di confidenza del 95% | Pendenza (SE) | X2 (df)‡ |
| Mb-NCHU-197 | Metarhizium baoshanense | 104 | 60 | Il 3.816 | 3.61–4.05 | 0.60 (0.05) | 15.64 (28) |
| Visualizzazione del materiale 105 | 60 | 3.112 miliardi di dollari | 2.95–3.28 | 0.72 (0.05) | 14.61 (28) | ||
| Visualizzazione 106 | 60 | 2.908 miliardi | 2.76–3.06 | 0.85 (0.06) | 15.04 (28) | ||
| 107 | 60 | 2.549 c | 2.40–2.69 | 0.90 (0.06) | 24.31 (28) | ||
| CC-NCHU-213 | Cordyceps cateniannulata | 104 | 60 | Il 3.948 | 3.71–4.23 | 0.53 (0.05) | 8.81 (28) |
| Visualizzazione del materiale 105 | 60 | 3.237 d | 3.07–3.41 | 0.72 (0.05) | 22.86 (28) | ||
| Visualizzazione 106 | 60 | 2.414 c | 2.28–2.54 | 1.08 (0.07) | 28.30 (28) | ||
| 107 | 60 | 2.132 e | 2.02–2.25 | 1.41 (0.10) | 28.96 (28) | ||
| *Numero di insetti osservati. | |||||||
| †I valori LT50 contrassegnati con lettere diverse sono stati considerati significativamente diversi in quanto i loro limiti di confidenza al 95% non si sovrapponevano. | |||||||
| ‡X2, valore del chi-quadrato nel test di bontà dell'adattamento di Pearson; DF, gradi di libertà | |||||||
Tabella 4: Valori LT50 degli isolati fungini Mb-NCHU-197 e Cc-NCHU-213 contro gli afidi della senape sotto diverse concentrazioni di conidi. *Numero di insetti osservati. †I valori LT50 contrassegnati con lettere diverse sono stati considerati significativamente diversi in quanto i loro limiti di confidenza al 95% non si sovrapponevano. ‡X2, valore del chi-quadrato nel test di bontà dell'adattamento di Pearson; DF, gradi di libertà.
| Isolare | Specie | N* | LC50 (conidi/mL)† | Limiti di confidenza del 95% | Slpoe (SE) | X2 (df)‡ |
| Mb-NCHU-197 | Metarhizium baoshanense | 240 | 2,30 × 105 A | 8,63 × 104–5,70 × 105 | 0.43 (0.08) | 10.14 (10) |
| CC-NCHU-213 | Cordyceps cateniannulata | 240 | 9,32 × 104 A | 4,97 × 104–1,62 × 105 | 0.76 (0.09) | 4.33 (10) |
| *Numero di insetti osservati. | ||||||
| †I valori LC50 contrassegnati con lettere diverse sono stati considerati significativamente diversi in quanto i loro limiti di confidenza al 95% non si sovrapponevano. | ||||||
| ‡X2, valore del chi-quadrato nel test di bontà dell'adattamento di Pearson; DF, gradi di libertà | ||||||
Tabella 5: Valori LC50 degli isolati fungini Mb-NCHU-197 e Cc-NCHU-213 contro gli afidi della senape. *Numero di insetti osservati. †I valori LC50 contrassegnati con lettere diverse sono stati considerati significativamente diversi in quanto i loro limiti di confidenza al 95% non si sovrapponevano. ‡X2, valore del chi-quadrato nel test di bontà dell'adattamento di Pearson; DF, gradi di libertà.
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Discussion
Le crucifere, un gruppo di ortaggi, sono spesso infestate da diverse specie di afidi, tra cui l'afide della senape (L. erysimi) e l'afide del cavolo (Brevicoryne brassicae)26. Entrambe le specie sono state segnalate a Taiwan27 ed è possibile che coesistano nel sito di raccolta. Per distinguere le specie di afidi strettamente correlate, questo studio ha impiegato una tecnica di identificazione molecolare utilizzando un set di primer multiplex21. Progettando un marcatore molecolare dal frammento del gene COI dell'afide della senape, abbiamo identificato con successo l'afide della senape, confermando così l'affidabilità del marcatore molecolare A05Le per questo scopo21.
Le osservazioni hanno rivelato che distinguere tra ninfe di quarto stadio e afidi adulti di senape in base esclusivamente alle loro dimensioni o morfologia è difficile senza esperienza. Tuttavia, una caratteristica distintiva cruciale è la tibia delle zampe posteriori, che appare bianca nelle ninfe del quarto stadio ma non negli adulti (Figura 3). Precedenti studi su L. attenuatum, B. bassiana contro gli afidi del cotone e M. brunneum contro gli afidi verdi del pesco hanno dimostrato che la muta può essere una strategia per evitare l'infezione28,29,30. Pertanto, l'errata identificazione degli stadi degli afidi può portare a errori nella valutazione della virulenza, poiché la muta può influire sull'efficacia dell'EPF28,29,31. Per affrontare questo problema e garantire una maggiore accuratezza e precisione nella valutazione della virulenza, escludere gli afidi con porzioni biancastre sulle tibie delle zampe posteriori che non hanno raggiunto lo stadio adulto, a meno che non si utilizzino intenzionalmente ninfe afidi. Questi afidi non maturano completamente e possono subire la muta, che potrebbe consentire loro di sfuggire al processo di infezione dell'EPF. Inoltre, si raccomanda un corso temporale di osservazione e registrazione dei dati ogni 12 ore. L'intervallo di 12 ore è preferibile per dimostrare le differenze tra più isolati promettenti con capacità simili di uccidere gli afidi e facilita il calcolo preciso di LT50. Tuttavia, l'intervallo di tempo può essere regolato in base ai diversi cicli di vita di altre specie di insetti o determinato attraverso un pretest su piccola scala.
Sebbene il metodo della foglia staccata possa lasciare una quantità minima di melata sul disco fogliare, la maggior parte della melata aderisce alla copertura della piastra di Petri poiché il disco fogliare è nelle immediate vicinanze. Può essere asciugato o lavato via durante il periodo di osservazione. Tuttavia, la melata è senza dubbio presente nell'ambiente pratico della coltivazione delle colture quando gli afidi invadono32. La melata presente nella camera di inoculazione può in qualche modo simulare la situazione in cui l'EPF viene inoculato negli afidi sul campo. Le cuticole degli afidi contengono principalmente melata, che funge da fonte di nutrienti per il fungo e può stimolare la germinazione di EPF16. Pertanto, la combinazione dell'applicazione di EPF e della produzione di melata da parte degli afidi può essere vantaggiosa.
Per confermare che la morte degli afidi è dovuta a un'infezione, i cadaveri vengono in genere trasferiti dalla camera di inoculazione dell'EPF a carta da filtro umida o a un terreno di coltura per osservare la crescita fungina 11,14,33,34. Tuttavia, in questo studio, l'agar d'acqua è stato utilizzato nella camera di inoculazione per mantenere un'elevata umidità, consentendo ai cadaveri degli afidi di rimanere sulle foglie senza bisogno di essere spostati per l'osservazione della crescita fungina. Sebbene il metodo della foglia staccata fornisca informazioni sull'effetto afididida degli isolati di EPF, presenta ancora dei limiti. L'agar d'acqua utilizzato per mantenere le condizioni del disco fogliare può causare il blocco degli afidi durante il movimento nella camera di inoculazione. Per risolvere questo problema, la percentuale di agar d'acqua è stata aumentata al 3%, fornendo una superficie abbastanza solida da consentire agli afidi del grano russi (Diuraphis noxia) di camminarci sopra20. In questo esperimento, gli afidi della senape sono stati in grado di muoversi comodamente sulle superfici di agar d'acqua con concentrazioni comprese tra l'1,5% e il 3%. Tuttavia, con il progredire del periodo di osservazione, alcuni afidi sono rimasti bloccati a testa in giù con le zampe rivolte verso l'alto e hanno dovuto essere salvati nel disco fogliare. Ciò può essere dovuto alle differenze nelle dimensioni o nella mobilità degli afidi, indicando che l'aumento della concentrazione di agar da solo potrebbe non risolvere il problema. Pertanto, assicurarsi che il disco fogliare copra completamente la superficie dell'agar utilizzando una foglia che si adatti meglio alle dimensioni della piastra di Petri, il che può aiutare ad alleviare questo problema. Rispetto al metodo della foglia staccata descritto da Yokomi e Gottwald18, questo studio ha migliorato un aspetto utilizzando una dimensione della foglia che si adatta approssimativamente bene alla capsula di Petri. Ciò consente di quantificare il consumo di cibo in modo relativo e di ridurre al minimo la superficie esposta dell'agar. Inoltre, la foglia deve essere "incorporata" nell'agar d'acqua semi-solidificato, mentre nel riferimento originale era descritta come "posizionata" sull'agar d'acqua18. L'incorporazione del disco fogliare nell'agar acquoso riduce la probabilità che gli afidi rimangano attaccati alla superficie dell'agar e facilita l'osservazione, poiché gli afidi sono confinati su un lato.
Questo protocollo fornisce istruzioni dettagliate su come procedere con il metodo della foglia staccata e l'inoculazione con EPF, insieme ad alcune modifiche che hanno facilitato le operazioni, le osservazioni e i risultati coerenti. Stabilisce inoltre un metodo standardizzato per la selezione di isolati di EPF contro i parassiti succhiatori di piante in condizioni di laboratorio. Inoltre, è possibile eseguire un controllo standard con prodotti noti efficaci o disponibili in commercio per la futura commercializzazione di isolati EPF.
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Disclosures
Gli autori dichiarano che non c'è alcun conflitto di interessi coinvolto in questo lavoro.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata supportata dal numero 109-2313-B-005 -048 -MY3 del Ministero della Scienza e della Tecnologia (MOST).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 μL Inoculating Loop | NEST Scientific | 718201 | |
| 100 bp DNA Ladder III | Geneaid | DL007 | |
| 2x SuperRed PCR Master Mix | Biotools | TE-SR01 | |
| 50 mL centrifuge tube | Bioman Scientific | ET5050-12 | |
| 6 cm Petri dish | Alpha Plus Scientific | 16021 | |
| 6 mm insect aspirator | MegaView Science | BA6001 | |
| 70 mm filter paper NO.1 | Toyo Roshi Kaisha | ||
| 70% ethanol | |||
| 9 cm Petri dish | Alpha Plus Scientific | 16001 | |
| Agar | Bioman Scientific | AGR001.1 | Microbiology grade |
| Agarose | Bioman Scientific | PB1200 | |
| BioGreen Safe DNA Gel Buffer | Bioman Scientific | SDB001T | |
| Chromas | Technelysium | ||
| GeneDoc | |||
| GenepHlow Gel/PCR Kit | Geneaid | DFH300 | https://www.geneaid.com/data/files/1605861013102532959.pdf |
| Gene-Spin Genomic DNA Isolation Kit | Protech Technology | PT-GD112-V3 | http://www.protech-bio.com/UserFiles/file/Gene-Spin%20Genomic%20DNA%20Kit.pdf |
| Hemocytometer | Paul Marienfeld | 640030 | |
| Komatsuna leaves (Brassica rapa var. perviridis) | Tai Cheng Farm | 1-010-300410 | |
| Microsprayer | |||
| MiniAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A37834 | |
| Mustard aphid (Lipaphis erysimi) | |||
| Painting brush | Tian Cheng brush company | 4716608400352 | |
| Parafilm M | Bemis | PM-996 | |
| Pellet pestle | Bioman Scientific | GT100R | |
| Sabouraud Dextrose Broth | HiMedia | MH033-500G | |
| SPSS Statistics | IBM | ||
| TAE buffer 50x | Bioman Scientific | TAE501000 | |
| Tween 80 | PanReac AppliChem | 142050.1661 |
References
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