Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

سير عمل متكامل لدراسة بنية الجينوم المكاني والزماني المتمحورة حول المروج في مجموعات الخلايا النادرة

Published: April 21, 2023 doi: 10.3791/65316
Automatic Translation
*1, *1,2, 1, 2,3, 1,4
1Josep Carreras Leukaemia Research Institute, 2Barcelona Supercomputing Center, 3Catalan Institution for Research and Advanced Studies (ICREA), 4Institute for Health Science Research Germans Trias i Pujol
* These authors contributed equally

Summary

يتم تنظيم التعبير الجيني من خلال تفاعلات محفزات الجينات مع العناصر التنظيمية البعيدة. هنا ، نحدد كيف يسمح انخفاض الإدخال Capture Hi-C (liCHi-C) بتحديد هذه التفاعلات في أنواع الخلايا النادرة ، والتي كانت غير قابلة للقياس في السابق.

Abstract

يتم تنظيم النسخ الجيني الزماني المكاني بإحكام من خلال العناصر التنظيمية البعيدة ، مثل المعززات وكاتمات الصوت ، والتي تعتمد على القرب المادي مع مروجي الجينات المستهدفة للتحكم في النسخ. على الرغم من سهولة تحديد هذه العناصر التنظيمية ، إلا أنه من الصعب التنبؤ بجيناتها المستهدفة ، نظرا لأن معظمها خاص بنوع الخلية ويمكن فصلها بمئات الكيلوقواعد في تسلسل الجينوم الخطي ، متخطية الجينات الأخرى غير المستهدفة. لعدة سنوات ، كان Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) هو المعيار الذهبي لربط العناصر التنظيمية البعيدة بجيناتها المستهدفة. ومع ذلك ، يعتمد PCHi-C على توافر ملايين الخلايا ، مما يحظر دراسة مجموعات الخلايا النادرة مثل تلك التي يتم الحصول عليها عادة من الأنسجة الأولية. للتغلب على هذا القيد ، تم تطوير Capture Hi-C (liCHi-C) منخفض المدخلات ، وهي طريقة فعالة من حيث التكلفة وقابلة للتخصيص لتحديد ذخيرة العناصر التنظيمية البعيدة التي تتحكم في كل جين من جينوم. يعتمد liCHi-C على إطار تجريبي وحسابي مماثل ل PCHi-C ، ولكن من خلال استخدام الحد الأدنى من التغييرات في الأنبوب ، وتعديل تركيز الكاشف وأحجامه ، وتبديل الخطوات أو إزالتها ، فإنه يمثل الحد الأدنى من فقدان المواد أثناء بناء المكتبة. بشكل جماعي ، يتيح liCHi-C دراسة تنظيم الجينات وتنظيم الجينوم الزماني المكاني في سياق علم الأحياء التنموي والوظيفة الخلوية.

Introduction

يدفع التعبير الجيني الزمني تمايز الخلايا ، وفي النهاية ، تطور الكائن الحي ، ويرتبط تغييره ارتباطا وثيقا بعدد كبير من الأمراض1،2،3،4،5. يتم تنظيم النسخ الجيني بدقة من خلال عمل العناصر التنظيمية ، والتي يمكن تصنيفها على أنها قريبة (أي محفزات الجينات) وبعيدة (على سبيل المثال ، معززات أو كاتمات الصوت) ، وغالبا ما توجد الأخيرة بعيدا عن جيناتها المستهدفة وتتفاعل معها جسديا من خلال حلقات الكروماتين لتعديل التعبير الجيني6،7،8.

يعد تحديد المناطق التنظيمية البعيدة في الجينوم أمرا متفقا عليه على نطاق واسع ، نظرا لأن هذه المناطق تحتوي على تعديلات هيستون محددة9،10،11 وتحتوي على زخارف محددة للتعرف على عامل النسخ ، وتعمل كمنصات تجنيد لهم12،13،14. إلى جانب ذلك ، في حالة المعززات والمعززات الفائقة 15,16 ، لديهم أيضا إشغال منخفض للنيوكليوسوم 17,18 ويتم نسخها إلى eRNAs غير المشفرة 19,20.

ومع ذلك، فإن التنبؤ بالجينات المستهدفة لكل عنصر تنظيمي بعيد أكثر صعوبة. في أكثر الأحيان ، تكون التفاعلات بين العناصر التنظيمية البعيدة وأهدافها من نوع الخلية والتحفيزالمحدد 21,22 ، وتمتد على مئات الكيلوبيسات ، وتسد الجينات الأخرى في أي اتجاه 23,24,25 ، ويمكن حتى أن تكون موجودة داخل المناطق الداخلية للجين المستهدف أو الجينات الأخرى غير المتداخلة 26,27. علاوة على ذلك ، يمكن للعناصر التنظيمية البعيدة أيضا التحكم في أكثر من جين واحد في نفس الوقت ، والعكس صحيح28,29. يعيق هذا التعقيد الموضعي تحديد الارتباطات التنظيمية بينهما ، وبالتالي ، تظل معظم أهداف كل عنصر تنظيمي في كل نوع من أنواع الخلايا غير معروفة.

خلال السنوات الأخيرة ، كان هناك ازدهار كبير في تطوير تقنيات التقاط تشكل الكروموسوم (3C) لدراسة تفاعلات الكروماتين. أكثرها استخداما ، Hi-C ، يسمح بإنشاء خريطة لجميع التفاعلات بين كل جزء من جينوم الخلية30. ومع ذلك ، للكشف عن التفاعلات المهمة على مستوى جزء التقييد ، يعتمد Hi-C على التسلسل العميق للغاية ، مما يحظر استخدامه لدراسة المشهد التنظيمي للجينات الفردية بشكل روتيني. للتغلب على هذا القيد الاقتصادي ، ظهرت العديد من تقنيات 3C القائمة على التخصيب ، مثل ChIA-PET31 و HiChIP 32 ونظيرتها منخفضة المدخلات HiCuT33. تعتمد هذه التقنيات على استخدام الأجسام المضادة لإثراء التفاعلات على مستوى الجينوم بوساطة بروتين معين. ومع ذلك ، فإن الميزة الفريدة لتقنيات 3C هذه هي أيضا لعنة تطبيقها. يعتمد المستخدمون على توافر الأجسام المضادة عالية الجودة للبروتين محل الاهتمام ولا يمكنهم مقارنة الظروف التي يكون فيها ارتباط البروتين ديناميكيا.

التقاط المروج Hi-C (PCHi-C) هي تقنية 3C أخرى قائمة على التخصيب تتحايل على هذه القيود34,35. من خلال استخدام نظام إثراء مسبار الحمض النووي الريبي الحيوي ، فإن PCHi-C قادر على إنشاء مكتبات عالية الدقة على مستوى الجينوم للمناطق الجينومية التي تتفاعل مع 28,650 بشريا أو 27,595 من مروجي الجينات المشروحة بالماوس ، والمعروف أيضا باسم تفاعل المروج. يسمح هذا النهج للمرء باكتشاف تفاعلات طويلة المدى كبيرة عند دقة مستوى جزء التقييد لكل من المروجين النشطين وغير النشطين ، ومقارنة تفاعلات المروج بقوة بين أي حالة بشكل مستقل عن ديناميكيات تعديلات الهستون أو ارتباط البروتين. تم استخدام PCHi-C على نطاق واسع خلال السنوات الأخيرة لتحديد عمليات إعادة تنظيم التفاعل المروج أثناء تمايز الخلايا 36,37 ، وتحديد آلية عمل عوامل النسخ 38,39 ، واكتشاف جينات ومسارات محتملة جديدة تم تحريرها في المرض بواسطة المتغيرات غير المشفرة40،41،42،43،44،45 ،46،47،48 ، جنبا إلى جنب مع طفرات السائق الجديدةغير المشفرة 49,50. إلى جانب ذلك ، بمجرد تعديل نظام الالتقاط ، يمكن تخصيص هذه التقنية وفقا للسؤال البيولوجي لاستجواب أي تفاعل (على سبيل المثال ، تفاعل المحسن 51 أو تفاعل مجموعة من التعديلات غير المشفرة41,52).

ومع ذلك ، يعتمد PCHi-C على ما لا يقل عن 20 مليون خلية لأداء هذه التقنية ، مما يمنع دراسة مجموعات الخلايا النادرة مثل تلك المستخدمة غالبا في علم الأحياء التنموي والتطبيقات السريرية. لهذا السبب ، قمنا بتطوير Capture Hi-C (liCHi-C) منخفض المدخلات ، وهي طريقة جديدة فعالة من حيث التكلفة وقابلة للتخصيص تعتمد على الإطار التجريبي ل PCHi-C لتوليد تفاعلات محفزة عالية الدقة مع مدخلات منخفضة الخلية. من خلال إجراء التجربة مع الحد الأدنى من التغييرات في الأنبوب ، أو تبديل أو إزالة الخطوات من بروتوكول PCHi-C الأصلي ، وتقليل أحجام التفاعل بشكل كبير ، وتعديل تركيزات الكاشف ، يتم تعظيم تعقيد المكتبة ومن الممكن إنشاء مكتبات عالية الجودة بأقل من 50000 خلية53.

تم قياس التقاط Hi-C منخفض المدخلات (liCHi-C) مقابل PCHi-C واستخدم لتوضيح إعادة توصيل تفاعل المروج أثناء تمايز الخلايا المكونة للدم البشري ، واكتشاف جينات ومسارات جديدة محتملة مرتبطة بالمرض تم تحريرها بواسطة تعديلات غير مشفرة ، واكتشاف تشوهات الكروموسومات53. يتم تفصيل البروتوكول خطوة بخطوة وضوابط الجودة المختلفة من خلال التقنية هنا حتى الجيل النهائي للمكتبات وتحليلها الحسابي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

لضمان الحد الأدنى من فقدان المواد ، (1) العمل مع أنابيب ونصائح منخفضة الارتباط بالحمض النووي (انظر جدول المواد) ، (2) ضع الكواشف على جدار الأنبوب بدلا من إدخال الطرف داخل العينة ، و (3) إذا أمكن ، امزج العينة عن طريق الانعكاس بدلا من سحب العينة لأعلى ولأسفل ، وقم بتدويرها لأسفل بعد ذلك لاستعادة العينة.

1. تثبيت الخلية

  1. الخلايا التي تنمو في تعليق
    1. احصد 50000 إلى مليون خلية وضعها في أنبوب منخفض الارتباط للحمض النووي سعة 1.5 مل.
      ملاحظة: أنواع الخلايا المستخدمة في هذه الدراسة مفصلة في قسم النتائج التمثيلية.
    2. قم بطرد الخلايا لمدة 5 دقائق عند 600 × جم (عند 4 درجات مئوية) باستخدام جهاز طرد مركزي دوار ثابت الزاوية وإزالة المادة الطافية عن طريق الماصة.
    3. أعد تعليق الخلايا في 1 مل من RPMI 1640 المكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ (FBS) في درجة حرارة الغرفة.
    4. أضف 143 ميكرولتر من الفورمالديهايد الخالي من الميثانول بنسبة 16٪ للوصول إلى تركيز 2٪ واخلطه.
    5. احتضان الخلايا لمدة 10 دقائق أثناء الدوران في درجة حرارة الغرفة لإصلاح الخلايا.
      ملاحظة: حاول أن تكون دقيقا قدر الإمكان مع الحضانة لمدة 10 دقائق. يمكن أن يؤدي التثبيت الزائد أو الناقص للخلايا إلى انخفاض جودة المكتبة.
    6. إخماد التفاعل عن طريق إضافة 164 ميكرولتر من الجليد البارد 1 M الجلايسين والمزيج. احتضان الخلايا لمدة 5 دقائق ، بالتناوب في درجة حرارة الغرفة.
    7. مزيد من احتضان الخلايا لمدة 15 دقيقة على الجليد ، والخلط عن طريق الانقلاب كل ~ 5 دقيقة.
    8. قم بطرد الخلايا لمدة 10 دقائق عند 1000 × جم (عند 4 درجات مئوية) باستخدام جهاز طرد مركزي دوار ثابت الزاوية وإزالة المادة الطافية.
    9. اغسل الخلايا عن طريق تعليق الحبيبات في 1 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) بارد 1x.
    10. قم بطرد الخلايا لمدة 10 دقائق عند 1000 × جم (عند 4 درجات مئوية) وإزالة المادة الطافية.
      ملاحظة: يمكن تجميد الخلايا المحببة في النيتروجين السائل أو الثلج الجاف وتخزينها في -80 درجة مئوية.
  2. الخلايا الملتصقة
    1. اغسل الخلايا في طبق الثقافة باستخدام 1x PBS.
    2. قم بإعداد ما يكفي من RPMI 1640 المكمل ب 10٪ FBS والفورمالديهايد الخالي من الميثانول 2٪ في درجة حرارة الغرفة لتغطية طبق الاستزراع.
    3. أضف الوسائط المكملة إلى طبق الثقافة مع الخلايا واحتضانها لمدة 10 دقائق ، وهزاز في درجة حرارة الغرفة لإصلاح الخلايا.
      ملاحظة: حاول أن تكون دقيقا قدر الإمكان مع الحضانة لمدة 10 دقائق. يمكن أن يؤدي التثبيت الزائد أو الناقص للخلايا إلى انخفاض جودة المكتبة.
    4. إخماد التفاعل عن طريق إضافة 1 M الجلايسين حتى 0.125 M وتخلط عن طريق هزاز.
    5. احتضان الخلايا لمدة 5 دقائق ، هزاز في درجة حرارة الغرفة.
    6. مزيد من احتضان الخلايا لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية ، والخلط عن طريق هز كل 3-4 دقائق.
    7. قم بإزالة الوسائط وغسل الخلايا باستخدام 1x PBS بارد.
    8. اكشط الخلايا وانقلها إلى أنبوب منخفض الارتباط بالحمض النووي سعة 1.5 مل. امسح طبق الاستزراع نظيفا باستخدام 0.5-1 مل من البرد 1x PBS.
    9. قم بطرد الخلايا لمدة 10 دقائق عند 1000 × جم (عند 4 درجات مئوية) باستخدام جهاز طرد مركزي دوار ثابت الزاوية وإزالة المادة الطافية. يمكن تجميد الخلايا المحببة في النيتروجين السائل أو الثلج الجاف وتخزينها في -80 درجة مئوية.

2. التحلل والهضم

  1. أعد تعليق الخلايا في 1 مل من محلول التحلل البارد (الجدول 1) لتعطيل غشاء الخلية. يجب أن تكون إضافة المخزن المؤقت وحده كافيا لإعادة تعليق الخلايا ، ولكن يمكن إعادة تعليقها إذا لزم الأمر عن طريق الدوامة الخفيفة.
  2. احتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة ، والخلط عن طريق الانقلاب كل ~ 5 دقائق. قم بطرد النوى لمدة 10 دقائق عند 1000 × جم (عند 4 درجات مئوية) وإزالة المادة الطافية. أعد تعليق النوى ب 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتقييد البارد 1.25x 2 (انظر جدول المواد).
  3. قم بطرد النوى لمدة 10 دقائق عند 1000 × جم (عند 4 درجات مئوية) وإزالة المادة الطافية. أعد تعليق النوى في 179 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتقييد 1.25x 2.
  4. أضف 5.5 ميكرولتر من 10٪ كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS ؛ انظر جدول المواد) واخلطها. قد تشكل الخلايا كتل. هذا أمر طبيعي ويحتاج إلى تصنيفه قدر الإمكان عن طريق الدوامة. احتضان العينة لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية في كتلة حرارية ، مع الاهتزاز عند 950 دورة في الدقيقة.
  5. قم بإخماد SDS بإضافة 37.5 ميكرولتر من 10٪ Triton X-100 واخلطها. احتضان العينة لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية في كتلة حرارية ، مع الاهتزاز عند 950 دورة في الدقيقة.
  6. هضم الكروماتين عن طريق إضافة 7.5 ميكرولتر من HindIII (100 وحدة / ميكرولتر ؛ انظر جدول المواد) واخلطها. احتضان العينة طوال الليل عند 37 درجة مئوية في كتلة حرارية ، مع الاهتزاز عند 950 دورة في الدقيقة.
  7. في صباح اليوم التالي ، أضف 2.5 ميكرولتر إضافية من HindIII (100 وحدة / ميكرولتر) واحتضان العينة لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية في كتلة حرارية ، مع الاهتزاز عند 950 دورة في الدقيقة لضمان الهضم السليم للكروماتين.
    ملاحظة: كجزء من ضوابط كفاءة الهضم (انظر الخطوة 5.1) ، قم بنقل ما يعادل 20000 إلى 40000 نواة إلى أنبوب آخر لتمثيل التحكم غير المهضوم. بعد الهضم ، انقل نفس العدد من الخلايا إلى أنبوب آخر مرة أخرى لتمثيل عنصر التحكم المهضوم. يوصى باختبار كفاءة الهضم كتجربة منفصلة إذا كان توافر المواد الأولية نادرا.

3. الربط وفك الارتباط

  1. برد العينة على الجليد. قم بإعداد مزيج رئيسي وأضف الكواشف التالية لملء الأجزاء المتدلية من التقييد والبيوتينيلات: 3 ميكرولتر من محلول تقييد 10x 2 ، 1 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز ، 0.75 ميكرولتر من 10 mM dCTP ، 0.75 ميكرولتر من 10 mM dTTP ، 0.75 ميكرولتر من 10 mM dGTP ، 18.75 ميكرولتر من 0.4 mM البيوتين -14-dATP ، و 5 ميكرولتر من 5 وحدة / ميكرولتر Klenow (انظر جدول المواد). احتضان العينة لمدة 75 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، مع الخلط عن طريق الانعكاس كل ~ 15 دقيقة.
  2. برد العينة على الجليد. قم بإعداد مزيج رئيسي وإضافة الكواشف التالية لربط نهايات الحمض النووي المملوءة: 50 ميكرولتر من محلول ربط 10x ، 2.5 ميكرولتر من 20 مجم / مل من ألبومين مصل الأبقار (BSA) ، 12.5 ميكرولتر من 1 وحدة / ميكرولتر T4 DNA ligase ، و 173 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز (انظر جدول المواد).
  3. احتضان العينة لمدة 4-6 ساعات عند 16 درجة مئوية ، والخلط عن طريق الانعكاس كل ~ 1 ساعة. علاوة على ذلك ، احتضان العينة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. افصل الكروماتين عن طريق إضافة 30 ميكرولتر من 10 مجم / مل بروتيناز K واخلطه. احتضان العينة طوال الليل عند 65 درجة مئوية.
  4. في صباح اليوم التالي ، أضف 15 ميكرولتر إضافية من 10 مجم / مل من Proteinase K واحتضان العينة لمدة 2 ساعة عند 65 درجة مئوية لضمان فك ارتباط الكروماتين بشكل صحيح.

4. تنقية الحمض النووي

  1. قم بتبريد العينة إلى درجة حرارة الغرفة ونقلها إلى أنبوب مناسب لتنقية الفينول كلوروفورم.
  2. أضف حجما واحدا (545 ميكرولتر) من الفينول: الكلوروفورم: كحول الأيزو أميل (25:24:1) لتنقية الحمض النووي واخلطه عن طريق الهز بقوة.
  3. قم بطرد العينة لمدة 5 دقائق عند 12000 × جم في درجة حرارة الغرفة ونقل المرحلة المائية العليا (545 ميكرولتر) إلى أنبوب منخفض الارتباط للحمض النووي سعة 2 مل.
  4. أضف الكواشف التالية لترسيب الحمض النووي: 1,362.5 ميكرولتر من الإيثانول 100٪ مبرد إلى -20 درجة مئوية ، 54.5 ميكرولتر من 3 M أسيتات الصوديوم (درجة الحموضة 5.2) ، و 2 ميكرولتر من 15 مجم / مل من الجليكوجين كمادة قابلة للتكرار.
  5. احتضان لمدة 1 ساعة عند -80 درجة مئوية أو بين عشية وضحاها في -20 درجة مئوية.
  6. قم بطرد العينة لمدة 30 دقيقة عند 16000-21000 × جم عند 4 درجات مئوية وإزالة المادة الطافية. يجب أن تكون حبيبات الحمض النووي مرئية.
  7. اغسل الحبيبات بإضافة 1 مل من الإيثانول بنسبة 70٪ ، والدوامات ، والطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 16,000-21,000 × جم في درجة حرارة الغرفة.
  8. قم بإزالة المادة الطافية واترك الحبيبات تجف في الهواء. أعد تعليق حبيبات الحمض النووي في 130 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز.
  9. تقييم التركيز عن طريق القياس الكمي الفلوري (انظر جدول المواد). قم بتخزين مادة 3C المنقاة في -20 درجة مئوية لعدة أشهر قبل متابعة البروتوكول.

5. ضوابط الجودة الاختيارية

  1. تقييم كفاءة الهضم. قم بإجراء فك الارتباط والفينول: تنقية الحمض النووي الكلوروفورم ، كما هو موضح سابقا ، إلى عناصر التحكم غير المهضومة والمهضومة التي تم الحصول عليها في الخطوة 2.13. أعد تعليق حبيبات الحمض النووي في 10 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز. تحديد التركيز وتخفيف الحمض النووي الذي تم الحصول عليه ، إذا لزم الأمر ، إلى 4 نانوغرام / ميكرولتر.
  2. إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي مع 4 نانوغرام من الحمض النووي لكل من عناصر التحكم غير المهضومة والمهضومة ، مع البادئات التي تمتد على موضع كروماتين مفتوح مع وبدون هدف HindIII (انظر الجدول 2 لتصميم التمهيدي). احسب كفاءة الهضم بعد تقرير منشور مسبقا35.
    ملاحظة: يتم حساب كفاءة الربط كنسبة مئوية باستخدام الصيغة: الهضم (٪) = 100 -100 / (2 ^ [(هضم Ct مع HindIII - Ctdigested بدون HindIII) - (Ct غير مهضوم مع HindIII - Ct غير مهضوم بدون HindIII)]) (انظر الجدول 3) ، والذي يأخذ في الاعتبار الفرق بين Cts المختلفة التي تم الحصول عليها لكل زوج تمهيدي في عناصر التحكم غير المهضومة والمهضومة.
  3. تقييم حساسية الكشف عن التفاعل عن طريق إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدي (PCR) (0.2 mM dNTP ، 0.4 ميكرومتر على حد سواء F + R البادئات ، 0.1 و U / μL بوليميراز البدء الساخن) ، مع الاشعال التي تغطي كل من التفاعلات الثابتة للخلايا طويلة وقصيرة المدى (انظر الجدول 2 لتصميم التمهيدي). استخدم 50-100 نانوغرام من مادة 3C (للتفاعلات قصيرة وطويلة المدى ، على التوالي) وقم بالتضخيم باستخدام الشروط التالية: 98 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، تليها 37 دورة من 98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، 60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة ، 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة ، والانتهاء بمقدار 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. يمسك عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: إذا كانت كمية الحمض النووي التي تم الحصول عليها أقل من 2 ميكروغرام ، فتحقق فقط من التفاعل طويل المدى وقصير المدى بدلا من لوحة التفاعل بأكملها.
  4. قم بتشغيل المنتج على 1x tris-borate-EDTA (TBE) باستخدام جل أغاروز 1.6٪ وابحث عن وجود PCR amplicon54 المقابل.
    ملاحظة: بسبب "القص واللصق" غير المتوقع للجينوم ، قد تظهر نطاقات غير محددة. طالما لوحظ حجم النطاق الصحيح ، يتم احتسابه على أنه صحيح.
  5. قم بتقييم كفاءة تعبئة البيوتين وربطه عن طريق الهضم التفاضلي لمنتج تفاعل البوليميراز المتسلسل قصير المدى باستخدام HindIII و NheI (انظر جدول المواد) ، سواء الإنزيمات أو لا شيء (الماء) ، وتشغيل المنتج على 1x TBE 1.6٪ هلام الأغاروز. يؤدي الملء والربط الصحيحان إلى القضاء على هدف HindIII السابق وإنشاء هدف NheI جديد ، لذلك يجب قطع amplicon فقط في وجود NheI.
    ملاحظة: لتقليل فقد المواد ، استرجع 2.5 ميكرولتر من منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل قصير المدى من عناصر التحكم في التفاعل وأعد تضخيمه خمس مرات لإجراء ضوابط التعبئة والربط.

6. سونيكيشن

  1. انقل 130 ميكرولتر من العينة (قم بتعبئة الماء الخالي من النيوكلياز إذا تم استخدام بعضها لعناصر التحكم) إلى كوفيت مناسب للصوتنة.
  2. قم بإعداد سونيكاتور حمام مائي وصوتيكات باستخدام المعلمات التالية (محسنة للنموذج و cuvettes الموصوفة في جدول المواد): عامل العمل: 20٪ ؛ قوة الحدوث القصوى: 50; دورات لكل انفجار: 200 ؛ الوقت: 65 ثانية ؛ ونطاق درجة الحرارة: 6-10 درجة مئوية (8 درجة مئوية الأمثل).
  3. انقل العينة إلى أنبوب جديد منخفض الارتباط للحمض النووي (DNA) حجمه 1.5 mL.

7. نهاية الإصلاح

  1. قم بإعداد مزيج رئيسي وإضافة الكواشف التالية لإصلاح النهايات غير المستوية لشظايا الحمض النووي التي تم إنشاؤها أثناء الصوتنة: 18 ميكرولتر من محلول ربط 10x ، 18 ميكرولتر من مزيج dNTP 2.5 mM لكل منهما ، 6.5 ميكرولتر من 3 U / μL T4 DNA polymerase ، 6.5 ميكرولتر من 10 U / μL T4 PNK ، و 1.3 ميكرولتر من 5 U / μL Klenow (انظر جدول المواد).
  2. احتضان العينة لمدة 30 دقيقة عند 20 درجة مئوية وقم بتعبئتها بمحلول ثلاثي منخفض EDTA (TLE) (انظر الجدول 1) إلى 300 ميكرولتر.

8. البيوتين المنسدلة لأسفل

  1. انقل 150 ميكرولتر من حبات الستربتافيدين C1 (انظر جدول المواد) لكل عينة إلى أنبوب سعة 1.5 مل ، وضعها على مغناطيس أنبوب سعة 1.5 مل ، وانتظر 2-3 دقائق أو حتى تلتصق جميع الخرزات بالحائط. إزالة طاف ، وترك الخرز وراءها.
  2. اغسل الخرزات ب 400 ميكرولتر من 1x Tween buffer (TB ؛ انظر الجدول 1). لغسل الخرز ، أضف المخزن المؤقت وأعد تعليقها عن طريق الدوامة الناعمة. ضع الأنبوب مرة أخرى في المغناطيس وانتظر 2-3 دقائق أو حتى تلتصق جميع الخرزات بالحائط. إزالة طاف ، وترك الخرز وراءها.
  3. اغسل الخرزات ب 300 ميكرولتر من 1x بدون مخزن مؤقت توين (NTB ؛ انظر الجدول 1). إعادة تعليق الخرز في 300 ميكرولتر من 2x NTB (انظر الجدول 1).
    ملاحظة: قد تشكل الخرزات طبقة مغبرة حول جدار الأنبوب عند الغسيل بمخازن بدون منظف. هذا أمر طبيعي ولا يؤثر على نتيجة البروتوكول.
  4. اجمع بين 300 ميكرولتر من الخرز في 2x NTB مع 300 ميكرولتر من العينة. احتضان لمدة 15 دقيقة ، بالتناوب في درجة حرارة الغرفة لسحب شظايا الحمض النووي المفيدة مع البيوتين. المكتبة عالقة الآن في حبات الستربتافيدين C1.
  5. اغسل الخرز ب 400 ميكرولتر من 1x NTB. اغسل الخرزات ب 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت TLE ثم أعد تعليقها بعد ذلك في 35.7 ميكرولتر من المخزن المؤقت TLE.

9. dATP- المخلفات ، ربط المحول ، وتضخيم PCR

  1. قم بإعداد مزيج رئيسي وإضافة الكواشف التالية إلى العينة لذيل dATP نهايات شظايا الحمض النووي التي تم إصلاحها: 5 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتقييد 10x 2 ، 2.3 ميكرولتر من 10 mM dATP ، و 7 ميكرولتر من 5 وحدة / ميكرولتر Klenow exo-. احتضان العينة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  2. قم بتعطيل Klenow exo- عن طريق احتضان العينة لمدة 10 دقائق عند 65 درجة مئوية. تبريد العينة على الجليد. اغسل الخرز ب 300 ميكرولتر من 1x TB. اغسل الخرز ب 300 ميكرولتر من 1x NTB.
  3. اغسل الخرزات ب 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للربط 1x ثم أعد تعليقها بعد ذلك في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للربط 1x. أضف 4 ميكرولتر من مزيج محول 15 ميكرومتر الملدن مسبقا (انظر الجدول 2) و 1 ميكرولتر من 2000 وحدة / ميكرولتر T4 DNA ligase (انظر جدول المواد) إلى العينة.
  4. احتضان لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة. اغسل الخرزات ب 400 ميكرولتر من 1x TB. اغسل الخرز ب 200 ميكرولتر من 1x NTB. اغسل الخرز ب 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتقييد 1x 2.
  5. اغسل الخرزات ب 50 ميكرولتر من 1x المخزن المؤقت للتقييد 2 وبعد ذلك أعد تعليقها في 50 ميكرولتر من 1x المخزن المؤقت للتقييد 2.
  6. امزج الكواشف التالية لإعداد تفاعل تفاعل PCR لتضخيم المكتبة: 50 ميكرولتر من الخرز مع المكتبة ، 250 ميكرولتر من 2x PCR mastermix مع الإنزيم ، 12 ميكرولتر من الأوائل F + R (25 ميكرومتر لكل منهما ؛ انظر الجدول 2) ، و 188 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز.
  7. قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل بالشروط التالية (قسم مزيج كاشف تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى تفاعلات 50 ميكرولتر): 98 درجة مئوية لمدة 40 ثانية ، تليها دورات X 98 درجة مئوية لمدة 10 ثوان ، 65 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، وتنتهي بمقدار 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. يمسك عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: استخدم العدد التالي من الدورات كنقطة انطلاق لتحسين البروتوكول في الخلايا ثنائية الصيغة الصبغية بهدف إخراج 500-1000 نانوغرام قبل التقاط المكتبة: مليون خلية لمدة ثماني دورات ؛ 250000 خلية لمدة 10 دورات ؛ 50000 خلية لمدة 12 دورة.
  8. اجمع كل تفاعلات 50 ميكرولتر من نفس العينة في أنبوب منخفض الارتباط للحمض النووي 1.5 مل ، وضعه على مغناطيس أنبوب 1.5 مل ، وانتظر 2-3 دقائق أو حتى تلتصق جميع الخرزات بالحائط.
  9. انقل المادة الطافية التي تحتوي على المكتبة (500 ميكرولتر) إلى أنبوب جديد منخفض الارتباط للحمض النووي سعة 1.5 مل. قم بتعبئة المخزن المؤقت TLE إلى 500 ميكرولتر في حالة فقد بعض المواد الطافية. لم تعد هناك حاجة إلى حبات الستربتافيدين C1.
  10. قم بإجراء تحديد على الوجهين55 باستخدام تنقية حبة البارامغناطيسية (حجم 0.4-1). وهذا يسمح بالتخلص الانتقائي من الشظايا الكبيرة جدا (>1000 نقطة أساس) والصغيرة جدا أو بادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل (<200 نقطة أساس) ، اعتمادا على تركيز البولي إيثيلين جلايكول وملح حبات البارامغناطيسية المضافة.
  11. أضف 200 ميكرولتر (0.4 مجلد) من حبات المخزون إلى المكتبة واخلطها بالدوامة. احتضان لمدة 10 دقائق ، بالتناوب في درجة حرارة الغرفة.
  12. ضعه على مغناطيس ، وانتظر 2-3 دقائق أو حتى تلتصق جميع الخرزات بالحائط ، وانقل المادة الطافية التي تحتوي على المكتبة (بدون الأجزاء الكبيرة) إلى أنبوب جديد منخفض الارتباط بالحمض النووي سعة 1.5 مل.
  13. ركز الخرز عن طريق أخذ 750 ميكرولتر من حبات المخزون ، وضعها في أنبوب سعة 1.5 مل على مغناطيس ، انتظر لمدة 2-3 دقائق أو حتى تلتصق جميع الخرزات بالحائط ، وقم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق الخرز عن طريق الدوامة في 300 ميكرولتر من حبات المخزون الجديدة.
  14. أضف 300 ميكرولتر من الخرز المركز إلى العينة (حجم 1) واخلطها بالدوامة. احتضان لمدة 10 دقائق ، بالتناوب في درجة حرارة الغرفة. ضعه على مغناطيس ، وانتظر 2-3 دقائق أو حتى تلتصق جميع الخرزات بالحائط ، وقم بإزالة المادة الطافية (التي تحتوي على الأجزاء الأصغر وبادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل).
  15. اغسل الخرزات ثلاث مرات مع 1 مل من الإيثانول بنسبة 70٪. للقيام بذلك ، أضف الإيثانول بينما لا يزال الأنبوب مع الخرز على المغناطيس ، محاولا عدم إزعاج الخرز ، وانتظر 30-60 ثانية. بعد ذلك ، قم بإزالة المادة الطافية دون إزعاج الخرز.
  16. اترك الخرزات تجف في الهواء وأعد تعليقها في 21 ميكرولتر من المخزن المؤقت TLE عن طريق الدوامة.
    ملاحظة: يمكن أن يؤدي التجفيف المفرط للخرزات إلى تقليل المحصول عند استخلاص الحمض النووي. تهدف إلى إعادة تعليقها في المخزن المؤقت TLE فورا بعد أن لم تعد "لامعة" من الإيثانول.
  17. احتضان العينة لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية في كتلة حرارية لإزالة المكتبة من الخرز. ضع الأنبوب في مغناطيس وانقل المادة الطافية التي تحتوي على المكتبة إلى أنبوب جديد منخفض الارتباط من الحمض النووي (DNA) سعة 1.5 mL.
  18. تحديد الحجم والتركيز عن طريق الرحلان الكهربائي الآلي (انظر جدول المواد). يمكن تخزين مواد Hi-C النقية عند -20 درجة مئوية لعدة أشهر قبل متابعة البروتوكول.

10. التقاط المكتبة

  1. العمل مع 500-1000 نانوغرام من المكتبة. ركز المكتبة عن طريق تجفيف الحمض النووي باستخدام مكثف فراغ وتعليق المادة في 3.4 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز.
  2. أضف حاصرات التخصيب التالية من مجموعة التخصيب المستهدفة (انظر جدول المواد) إلى العينة: 2.5 ميكرولتر من المانع 1 ، 2.5 ميكرولتر من المانع 2 ، و 0.6 ميكرولتر من مانع oligo المخصص للمحولات.
  3. أعد التعليق جيدا ، وانقل المحلول إلى شريط PCR سعة 0.2 مل ، واحتضنه في جهاز تدوير حراري لمدة 5 دقائق عند 95 درجة مئوية ، متبوعا ب 5 دقائق عند 65 درجة مئوية بغطاء ساخن. اترك الأنبوب يحضن عند 65 درجة مئوية.
  4. تحضير محلول التهجين عن طريق الجمع بين الكواشف التالية من مجموعة التخصيب المستهدفة (انظر جدول المواد) لكل عينة (13 ميكرولتر). ابق على المقعد في درجة حرارة الغرفة: 6.63 ميكرولتر من Hyb 1 ، 0.27 ميكرولتر من Hyb 2 ، 2.65 ميكرولتر من Hyb 3 ، و 3.45 ميكرولتر من Hyb 4.
  5. قم بتخفيف 0.5 ميكرولتر من كتلة RNase من مجموعة التخصيب المستهدفة مع 1.5 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز لكل عينة. قم بإذابة 5 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي البيوتينيل لكل عينة على الجليد وأضف إليه 2 ميكرولتر من كتلة RNase المخففة. يحفظ على مقاعد البدلاء في درجة حرارة الغرفة.
  6. أضف 13 ميكرولتر من محلول التهجين إلى 7 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي البيوتينيل مع RNase واخلطه جيدا.
  7. أثناء استخدام جهاز التدوير الحراري عند 65 درجة مئوية ، انقل محلول التهجين باستخدام الحمض النووي الريبي البيوتينيل (20 ميكرولتر) إلى المكتبة المحظورة. أغلق غطاء الأنبوب بإحكام واحتضانه في جهاز التدوير الحراري طوال الليل عند 65 درجة مئوية.
    ملاحظة: لتقليل تبخر العينة (الذي قد يؤدي إلى تهجين الحمض النووي الريبي دون المستوى الأمثل) عند إجراء عينات متعددة في نفس الوقت ، استخدم ماصة متعددة القنوات لنقل الحمض النووي الريبي البيوتينيل إلى كل مكتبة في نفس الوقت.

11. البيوتين المنسدلة وتضخيم PCR

  1. انقل 50 ميكرولتر من حبات الستربتافيدين T1 لكل عينة إلى أنبوب منخفض الارتباط للحمض النووي سعة 1.5 مل ، وضعها على مغناطيس أنبوب سعة 1.5 مل ، وانتظر 2-3 دقائق أو حتى تلتصق جميع الخرزات بالحائط. إزالة طاف ، وترك الخرز وراءها. اغسل الخرزات ثلاث مرات باستخدام 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للربط من مجموعة التخصيب المستهدفة.
  2. أعد تعليق الخرزات في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للربط. أثناء استخدام جهاز التدوير الحراري عند 65 درجة مئوية ، انقل العينة إلى حبات الستربتافيدين T1 المعاد تعليقها واحتضانها لمدة 30 دقيقة ، بالتناوب في درجة حرارة الغرفة.
  3. اغسل الخرز ب 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل 1 من مجموعة التخصيب المستهدفة. احتضان لمدة 15 دقيقة ، بالتناوب في درجة حرارة الغرفة. اغسل الخرزات ثلاث مرات باستخدام 200 ميكرولتر من محلول الغسيل 2 من مجموعة التخصيب المستهدفة المسخنة إلى 65 درجة مئوية. احتضان لمدة 10 دقائق عند 65 درجة مئوية في كتلة حرارية ، ويهز عند 300 دورة في الدقيقة بين الغسيلات.
  4. اغسل الخرزات ب 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتقييد 1x 2 وبعد ذلك أعد تعليقها في 30 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتقييد 1x 2.
  5. امزج الكواشف التالية لإعداد تفاعل تفاعل تفاعل PCR لتضخيم المكتبة: 30 حبة ميكرولتر مع المكتبة ، 150 ميكرولتر من 2x PCR mastermix مع الإنزيم ، 7.2 ميكرولتر من الاشعال F + R (25 ميكرومتر لكل منهما ؛ انظر الجدول 2) ، و 112.8 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز.
  6. قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل بالشروط التالية (قسم مزيج كاشف تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى تفاعلات 50 ميكرولتر): 98 درجة مئوية لمدة 40 ثانية ، تليها أربع دورات من 98 درجة مئوية لمدة 10 ثوان ، 65 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، وتنتهي ب 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. يمسك عند 4 درجات مئوية.
  7. اجمع كل تفاعلات 50 ميكرولتر من نفس العينة في أنبوب منخفض الارتباط للحمض النووي 1.5 مل ، وضعه على مغناطيس أنبوب 1.5 مل ، وانتظر 2-3 دقائق أو حتى تلتصق جميع الخرزات بالحائط.
  8. انقل المادة الطافية التي تحتوي على المكتبة (300 ميكرولتر) إلى أنبوب جديد منخفض الارتباط للحمض النووي سعة 1.5 مل. قم بتعبئة المخزن المؤقت TLE إلى 300 ميكرولتر في حالة فقد بعض المواد الطافية. لم تعد هناك حاجة إلى حبات الستربتافيدين T1.
  9. قم بإجراء تنقية الحمض النووي باستخدام حبات مغناطيسية (0.9 مجلد ؛ انظر جدول المواد). أضف 270 ميكرولتر من حبات المخزون إلى العينة واخلطها بالدوامة.
  10. احتضان لمدة 10 دقائق ، بالتناوب في درجة حرارة الغرفة.
  11. ضعه على مغناطيس ، وانتظر 2-3 دقائق أو حتى تلتصق جميع الخرزات بالحائط ، وقم بإزالة المادة الطافية.
  12. اغسل الخرزات ثلاث مرات مع 1 مل من الإيثانول بنسبة 70٪. للقيام بذلك ، أضف الإيثانول بينما لا يزال الأنبوب مع الخرز على المغناطيس ، محاولا عدم إزعاج الخرز ، وانتظر 30-60 ثانية. بعد ذلك ، قم بإزالة المادة الطافية دون إزعاج الخرز.
  13. اترك الخرزات تجف في الهواء وأعد تعليقها في 21 ميكرولتر من المخزن المؤقت TLE عن طريق الدوامة.
    ملاحظة: يمكن أن يؤدي التجفيف المفرط للخرزات إلى تقليل المحصول عند استخلاص الحمض النووي. تهدف إلى إعادة تعليقها في المخزن المؤقت TLE فورا بعد أن لم تعد "لامعة" من الإيثانول.
  14. احتضان العينة لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية في كتلة حرارية لإزالة المكتبة من الخرز.
  15. ضع الأنبوب في مغناطيس وانقل المادة الطافية التي تحتوي على المكتبة إلى أنبوب جديد منخفض الارتباط من الحمض النووي (DNA) سعة 1.5 mL.
  16. تحديد الحجم والتركيز عن طريق الكهربائي الآلي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يوفر liCHi-C إمكانية إنشاء مكتبات تفاعلية عالية الجودة وعالية الدقة على مستوى الجينوم مع أقل من 50000 خلية53. يتم تحقيق ذلك عن طريق - إلى جانب التخفيض الحاد في أحجام التفاعل واستخدام الأواني البلاستيكية منخفضة الارتباط بالحمض النووي في جميع أنحاء البروتوكول - إزالة الخطوات غير الضرورية من البروتوكول الأصلي ، حيث تحدث خسائر كبيرة في المواد. وتشمل هذه تنقية الفينول بعد فك الارتباط ، وإزالة البيوتين ، وتنقية الفينول كلوروفورم اللاحقة وترسيب الإيثانول. إلى جانب ذلك ، فإن إعادة تنظيم خطوات إعداد مكتبة Hi-C (سحب البيوتين ، والذيل A ، وربط المحول ، وتضخيم PCR ، واختيار حبة البارامغناطيسية على الوجهين - أيضا كتنقية منتج PCR) يسمح لنا بإزالة خطوة أخرى غير ضرورية لتنقية الحمض النووي. يمكن العثور على نظرة عامة على سير العمل التجريبي في الشكل 1 أ.

لتقييم جودة المكتبة ، يتم تنفيذ العديد من الضوابط في جميع أنحاء البروتوكول ، أولها حساب كفاءة هضم الجينوم. تعتبر القيم التي تزيد عن 80٪ مقبولة (الجدول 3). يقترح التحقق من كفاءة الهضم لنوع الخلية في تجربة منفصلة حتى لا تفقد كمية كبيرة من المواد من تجربة liCHi-C واحدة. ثانيا ، قبل الصوتنة والإصلاح النهائي ، يوصى بالتحقق من حساسية اكتشاف التفاعل عن طريق تضخيم تفاعلات الكروماتين الثابتة من نوع الخلية بواسطة PCR التقليدي (الشكل 1 ب). إذا تم الكشف عن منتج معين ، يجب إجراء تحكم ثالث ، مع التركيز على كفاءة البيوتينيل والربط عن طريق الهضم التفاضلي لأحد منتجات PCR التي تم الحصول عليها مسبقا باستخدام HindIII و NheI (الشكل 1C ، D). عند ملء موقع تقييد HindIII المهضوم وربطه بآخر ، يتم إنشاء موقع تقييد NheI جديد بدلا من إعادة إنشاء موقع HindIII الأصلي. لذلك ، يجب ملاحظة هضم amplicon PCR فقط عند وجود NheI. أخيرا ، قبل وبعد الالتقاط بالكامل ، يجب التحقق من توزيع التركيز والحجم باستخدام الرحلان الكهربائي الآلي. يجب أن يهدف تضخيم مكتبة ما قبل الالتقاط إلى الحصول على 500-1000 نانوغرام من مادة Hi-C ، وهي الكمية الدقيقة اللازمة لإجراء التقاط مسبار الحمض النووي الريبي ، نظرا لأن التضخيم المفرط لكل من المكتبة التي تم التقاطها مسبقا وبعدها يؤدي إلى نسبة عالية من تكرارات تفاعل البوليميراز المتسلسل وما يترتب على ذلك من فقدان قراءات التسلسل أثناء التحليل. يمكن إعادة تضخيم المكتبات مرة أخرى في ظل نفس الظروف إذا لم يتم الحصول على مواد كافية أثناء تضخيم PCR المحافظ الأول. يمكن أن تختلف كمية مواد المكتبة التي تم التقاطها بعد التقاطها ، ولكن كقاعدة عامة ، يجب أن تكون أقل بعشرة أضعاف إلى 20 ضعفا تقريبا مما كانت عليه قبل الالتقاط. يجب أن ينخفض توزيع حجم المكتبة حوالي 450-550 نقطة أساس (الشكل 2 أ ، ب) ، ثابتا بين المكتبات التي تم التقاطها قبل وبعد التقاطها. بشكل جماعي ، تضمن النتائج الصحيحة لعناصر التحكم هذه إنشاء مكتبات liCHi-C ممتازة.

يتم بعد ذلك (على الأقل) تسلسل وتحليل مكتبات liCHi-C النهائية (على الأقل) 100 bp. تتم معالجة بيانات التسلسل الخام53 باستخدام خط أنابيب HiCUP56 لتعيين القطع الأثرية وتصفيتها. يظهر تقرير HiCUP المثالي زيادة بمقدار خمسة أضعاف إلى عشرة أضعاف في توزيع رابطة الدول المستقلة (داخل نفس الكروموسوم) مقارنة بقراءات النهاية المزدوجة العابرة (بين الكروموسومات المختلفة) ، كما هو موضح سابقا وفقا لربط النواة Hi-C57 (الشكل 3B). إن ملاحظة أكثر من 100 مليون قراءة فريدة وصالحة بعد إزالة نسخ PCR المكررة كافية للانتقال إلى الخطوة التالية في التحليل (الشكل 3B) ، وهي تقييم كفاءة الالتقاط. يتم تجاهل القراءات ذات النهايات المزدوجة التي لا يتم فيها تعيين أي من نهاياتها إلى جزء تقييد تم التقاطه بواسطة نظام إثراء مسبار الحمض النووي الريبي ، مع الاحتفاظ فقط بتلك التي تمثل تفاعل المروج للخلية (أي تلك القراءات التي يتم فيها تعيين واحد على الأقل من نهاياتها في شظايا تقييد تحتوي على واحد أو أكثر من محفزات الجينات [الشكل 3C] ، من الناحية المثالية أكثر من 60 ٪).

أخيرا ، يتم استدعاء التفاعلات المهمة مع خط أنابيب CHiCAGO ، كما هو موضح في58,59. هناك حاجة إلى اثنين أو أكثر من النسخ البيولوجية للمجموعة النهائية من تفاعلات المروج الهامة. يمكن أيضا التحقق من جودة البيانات باستخدام تحليل المكونات الرئيسية (PCA) ، حيث يجب أن تتجمع النسخ المتماثلة البيولوجية معا ويجب فصل أنواع الخلايا. على سبيل المثال ، من خلال تحليل مجموعات بيانات liCHi-C من أربعة أنواع مختلفة من الخلايا الأولية من شجرة المكونة للدم البشرية (السلف النخاعي الشائع ، وحيدات الخلايا ، خلايا النواة ، وأرومات الدم الحمراء) ، يمكننا أن نلاحظ في PCA أن مكتبات liCHi-C تتجمع بطريقة تعكس المسار التنموي (الشكل 3D). يكشف الفحص الدقيق للتفاعلات المهمة المكتشفة لأنواع الخلايا الأربعة أن تفاعلات المروج محددة وديناميكية من نوع الخلية أثناء نمو الخلية. على سبيل المثال ، يظهر جين AHSP ، وهو مرافق رئيسي تم تصنيعه في سلائف الكريات الحمر التي تشرف على الطي الصحيح للهيموجلوبين60،61،62 ، زيادة في التفاعلات مع العناصر التنظيمية النشطة المحتملة (أي المناطق المخصبة H3K27ac و H3K4me1) في أرومات الدم الحمراء ، ولكن ليس في أنواع الخلايا الأخرى (الشكل 4). يوضح هذا أن طريقة liCHi-C يمكن أن تكشف عن التفاعلات التنظيمية المحتملة في أنواع الخلايا النادرة.

Figure 1
الشكل 1: نظرة عامة على البروتوكول وضوابط الجودة للعينة قبل الصوتنة . (أ) نظرة عامة تخطيطية على بروتوكول liCHi-C مقسومة على الأيام. تمثل الأيدي B والزرقاء ، على التوالي ، جزيئات البيوتين والخطوات التي يمكن للمرء من خلالها إيقاف البروتوكول بأمان لفترة طويلة من الزمن. (ب) النتائج التمثيلية لضوابط التفاعل 3C. يتم عرض كل من مجموعات التفاعل للإنسان (يسار) والماوس (يمين). يتم تمييز النطاقات المتوقعة باللون الأزرق الداكن ، بينما يتم تمييز النطاق غير المحدد باللون الأزرق الفاتح. (ج) عناصر التحكم في التعبئة والربط التمثيلي باستخدام زوج التمهيدي للتفاعل البشري "Dekker". يتم قطع الشريط فقط في الممرات 2 و 3 ، حيث تتم إضافة NheI. (د) تمثيل تخطيطي لتوليد موقع تقييد NheI جديد أثناء ملء وربط موقع تقييد HindIII. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: ملفات تعريف الرحلان الكهربائي الآلي التمثيلي من المكتبات قبل وبعد الالتقاط. (أ) ملف تعريف الرحلان الكهربائي الآلي من مكتبة قبل التقاطها مباشرة. إجمالي كمية الحمض النووي التي تم الحصول عليها هي 994 نانوغرام (49.7 نانوغرام / ميكرولتر في 20 ميكرولتر). (ب) ملف تعريف كهربائي آلي عالي الحساسية من مكتبة liCHi-C النهائية. يتم تحميل العينة نصف مخففة للحفاظ على أكبر قدر ممكن من المواد. الكمية الإجمالية للحمض النووي التي تم الحصول عليها هي 61.2 نانوغرام (1.53 نانوغرام / ميكرولتر في 20 ميكرولتر × 2 لحساب التخفيف). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: إخراج خط أنابيب HiCUP التمثيلي وتجميع نسخ العينة بواسطة PCA . (أ) تصنيف صلاحية أزواج القراءة حسب النسب المئوية والأعداد الإجمالية. يتم تصنيف أزواج القراءة غير الصالحة حسب نوع الأداة التجريبية. (ب) نسب إلغاء البيانات المكررة وتصنيف أنواع التفاعلات. يتم تصنيف تفاعلات رابطة الدول المستقلة أيضا على أنها قريبة من رابطة الدول المستقلة (أقل من 10 كيلوبايت) ورابطة الدول المستقلة (أكثر من 10 كيلوبايت). (ج) النسبة المئوية لكفاءة الالتقاط. يتم تصنيف أزواج القراءة التي تم التقاطها بشكل فرعي سواء كان أحد الطرفين أو الآخر أو كلاهما يحتوي على واحد أو أكثر من المروجين. (د) تحليل المكون الرئيسي لدرجات التفاعل المعنوية ل CHiCAGO من كل من النسخ المتماثلة لمكتبات liCHi-C من السلف النخاعي المشترك (CMP) ، وأرومات الدم الحمراء ، وخلايا النواة الضخمة ، والوحيدات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: مشهد تفاعل AHSP في الخلايا المكونة للدم الأولية البشرية. مثال تمثيلي لمشهد التفاعل المتمحور حول مروج AHSP في الأسلاف النخاعية الشائعة (CMP) ، والأرومات الحمراء (Ery) ، والخلايا الضخمة (MK) ، والوحيدات (Mon) كما هو موضح في متصفح WashU Epigenome63. تمثل الأقواس تفاعلات مهمة. يظهر الظل الأزرق الداكن مروج جين AHSP ، بينما تتداخل الظلال الزرقاء الفاتحة مع العناصر التنظيمية النشطة المحتملة التي تتفاعل بشكل خاص مع مروج AHSP في أرومات الدم الحمراء. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: تكوين المخزن المؤقت وإعداده. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 2: بادئات PCR وتسلسل المحول. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 3: مثال على حساب كفاءة الهضم. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يوفر liCHi-C القدرة على إنشاء مكتبات تفاعلية عالية الدقة باستخدام إطار تجريبي مماثل من PCHi-C ولكن مع عدد خلايا مخفض بشكل كبير. يتم تحقيق ذلك بشكل كبير من خلال القضاء على الخطوات غير الضرورية ، مثل تنقية الفينول وإزالة البيوتين. في بروتوكول Hi-C الكلاسيكي للربط داخل النواة57 وتقنيته المشتقة اللاحقة PCHi-C ، تتم إزالة البيوتين من شظايا التقييد غير المربوطة لتجنب سحب شظايا الحمض النووي التي تكون غير معلوماتية بعد ذلك. لا يترجم تخطي هذا الجزء وتنقية الحمض النووي اللاحقة إلى انخفاض كبير في النسبة المئوية للقراءات الصحيحة (الشكل 3 أ) مع استبعاد خطوات إهدار الحمض النووي المحتملة ، وهي تنقية الحمض النووي. تسمح إعادة تنظيم إعداد مكتبة Hi-C بعد الصوتنة بتخطي تنقية أخرى غير ضرورية باستخدام التحديد على الوجهين كخطوة تنقية نفسها. كل هذا يعزز أداء البروتوكول بأكمله من خلال استخدام الحد الأدنى من التغييرات في الأنبوب ، وجنبا إلى جنب مع تقليل حجم التفاعل ، والتغيرات في تركيز الكاشف ، واستخدام الأدوات البلاستيكية منخفضة الارتباط للحمض النووي ، هو ما يسمح بإنشاء مكتبات عالية الجودة باستخدام أقل من 50000 خلية. من المهم أن تضع في اعتبارك أن رقم خلية البداية يحدد ، جزئيا ، عدد التفاعلات المهمة بسبب تعقيد المكتبة. على الرغم من أن المكتبات التي تم إنشاؤها باستخدام 50000 خلية تحتفظ بالسمات الطوبولوجية الخاصة بنوع الخلية والثابتة للمكتباتالأكثر تعقيدا 53 ، فإن توصيتنا هي استخدام ، إن أمكن ، أكثر من 100000 خلية لكل نسخة بيولوجية متماثلة من أجل التقاط عدد أكبر من تفاعلات المروج المهمة.

يتم تحديد دقة التفاعلات المكتشفة في تقنيات 3C بشكل أساسي بواسطة إنزيم التقييد المستخدم. هنا ، يتم وصف تطبيق liCHi-C باستخدام HindIII ، وهو إنزيم قطع 6 bp يعطي دقة متوسطة نظرية تبلغ 4096 bp. يسمح liCHi-C باستبدال إنزيم التقييد ، على سبيل المثال ، نحو إنزيم قطع 4 bp أو حتى نيوكلياز micrococcal ، وبالتالي زيادة دقة التفاعلات المهمة المكتشفة. تم الإبلاغ عن توليد مكتبات liCHi-C ، وتبديل إنزيم تقييد HindIII لإنزيم MboI الذي يقطع 4 bp ، لتحقيق نتائج ممتازة للكشف عن ما يقرب من ضعف إجمالي التفاعلات ، وإن كان ذلك مع تحول متوسط المسافة الخطية للتفاعلات المكتشفة إلى نصف المسافة53.

فيما يتعلق بنظام تخصيب مسبار الحمض النووي الريبي الفعلي ، فإن إحدى المزايا الرئيسية لاستخدام هذا النوع من الالتقاط على نظام قائم على الأجسام المضادة ، مثل HiChIP32 أو HiCuT33 ، من بين أمور أخرى ، هي القدرة على مقارنة الظروف بشكل مستقل عن ارتباط البروتين ، وكذلك عدم الاضطرار إلى الاعتماد على توفر جسم مضاد عامل للبروتين محل الاهتمام. علاوة على ذلك ، يمكن تصميم نظام تخصيب الحمض النووي الريبي لالتقاط أي مناطق محددة على مستوى الجينوم لتناسب احتياجات كل باحث (تمت مناقشة التصميم في35,64).

بالإضافة إلى طرق الالتقاط القائمة على الأجسام المضادة ، تم تطوير العديد من الخلايا المفردة المتميزة (مثل scHi-C 65 أو Dip-C 66 أو Sci-Hi-C 67 وغيرها) أو طرق الإدخال المنخفض (مثل Low-C 68 أو Easy Hi-C 69) للتحقيق في بنية الجينوم ثلاثية الأبعاد في السنوات الأخيرة. ومع ذلك ، فإن هذه تولد خرائط اتصال متفرقة ذات دقة منخفضة لا تسمح بتحديد جهات الاتصال بين العناصر التنظيمية البعيدة والجينات المستهدفة. liCHi-C هي طريقة قادرة على التغلب على هذا القيد ، وفتح إمكانية دراسة بنية الجينوم المتمركزة على المروج في أنواع الخلايا النادرة وتوفير الفرصة لتعزيز فهمنا للبيولوجيا الخلوية والتنموية وتطور المرض.

على الرغم من كل ميزاته ، فإن liCHi-C ليس معفيا من القيود. أولا ، معالجة بيانات التسلسل الخام ليست تافهة ، وهناك حاجة إلى مهارات حسابية عادلة لتحليل البيانات وتفسير نتائجها. علاوة على ذلك ، لا يميز liCHi-C بين التفاعلات الوظيفية والهيكلية. مطلوب لدمج بيانات liCHi-C مع البيانات اللاجينية و / أو التحليل الوظيفي للتحقق من صحة التفاعلات الوظيفية المحتملة لمروجي الجينات مع عناصرهم التنظيمية المستهدفة. أخيرا ، يتم التضحية بتعقيد المكتبة عند العمل على الطرف السفلي من أرقام الخلايا. ينعكس هذا على مقدار التفاعلات الفريدة المكتشفة مقارنة بمكتبات liCHi-C ذات رقم الخلية الأعلى ومعدل إلغاء البيانات المكررة ، والذي يمكن أن يصل إلى 80٪. ومع ذلك ، تحتفظ مكتبات liCHi-C ذات رقم الخلية المنخفض بالسمات الطوبولوجية لمكتبات أرقام الخلايا الأعلى بطريقة أكثر تركيزا53 ، مما يدل على أنه من الممكن إجراء مكتبات liCHi-C التي تلخص تفاعل مروج الخلية مع أقل من 50000 خلية.

بشكل عام ، تعد liCHi-C طريقة فعالة من حيث التكلفة وقابلة للتخصيص لإنشاء مكتبات تفاعلية عالية الجودة وعالية الدقة في أنواع الخلايا النادرة. إنها أول طريقة منخفضة الإدخال لتعيين تفاعل المروج والدعوة إلى حلقات كبيرة في دقة جزء التقييد. نتوقع أن توفر هذه الأداة الجديدة ، مثل سابقتها PCHi-C ، رؤى جديدة في تمايز الخلايا وتطور الكائنات الحية ، سواء في الصحة أو المرض.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

نشكر بقية الأعضاء من مختبر خافيير على ملاحظاتهم على المخطوطة. نشكر برنامج CERCA و Generalitat de Catalunya ومؤسسة Josep Carreras على الدعم المؤسسي. تم تمويل هذا العمل من قبل FEDER / وزارة العلوم والابتكار الإسبانية (RTI2018-094788-A-I00) ، والجمعية الأوروبية لأمراض الدم (4823998) ، والجمعية الإسبانية لمكافحة السرطان (AECC) LABAE21981JAVI. يتم تمويل BMJ من قبل مشروع القائد الصغير لمؤسسة La Caixa المصرفية (LCF / BQ / PI19 / 11690001) ، ويتم تمويل LR من خلال زمالة AGAUR FI (2019FI-B00017) ، ويتم تمويل LT-D من خلال زمالة FPI (PRE2019-088005). نشكر برنامج الدكتوراه في الكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية من جامعة برشلونة المستقلة على دعمها. لم يشارك أي من الممولين في أي وقت في التصميم التجريبي أو كتابة المخطوطة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.4 mM Biotin-14-dATP Invitrogen 19524-016
0.5 M EDTA pH 8.0 Invitrogen AM9260G
1 M Tris pH 8.0 Invitrogen AM9855G
10x NEBuffer 2 New England Biolabs B7002S Referenced as restriction buffer 2 in the manuscript
10x PBS Fisher Scientific BP3994
10x T4 DNA ligase reaction buffer New England Biolabs B0202S
16% formaldehyde solution (w/v), methanol-free Thermo Scientific 28908
20 mg/mL Bovine Serum Albumin New England Biolabs B9000S
5 M NaCl Invitrogen AM9760G
5PRIME Phase Lock Gel Light tubes Qiuantabio 2302820 For phenol-chloroform purification in section 4 (DNA purification). Phase Lock Gel tubes are a commercial type of tubes specially designed to maximize DNA recovery after phenol-chloroform purifications while avoiding carryover of contaminants in the organic phase by containing a resin of intermediate density which settles between the organic and aqueous phase and isolates them. PLG tubes should be spun at 12,000 x g for 30 s before use to ensure that the resin is well-placed at the bottom of the tube
Adapters and PCR primers for library amplification Integrated DNA Technologies - Bought as individual primers with PAGE purification for NGS
Cell scrappers Nunc 179693 Or any other brand
Centrifuge (fixed-angle rotor for 1.5 mL tubes) Any brand
CHiCAGO R package 1.14.0
CleanNGS beads CleanNA CNGS-0050
dATP, dCTP, dGTP, dTTP Promega U120A, U121A, U122A, U123A Or any other brand
DNA LoBind tube, 1.5 mL Eppendorf 30108051
DNA LoBind tube, 2 mL Eppendorf 30108078
DNA polymerase I large (Klenow) fragment 5000 units/mL New England Biolabs M0210L
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 beads Invitrogen 65002 For biotin pull-down of the pre-captured library in section 8 (biotin pull-down)
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 beads Invitrogen 65602 For biotin pull-down of the post-captured library in section 11 (biotin pull-down and PCR amplification)
DynaMag-2 Invitrogen 12321D Or any other magnet suitable for 1.5 ml tubeL
Ethanol absolute VWR 20821.321
FBS, qualified Gibco 10270-106 Or any other brand
Glycine Fisher BioReagents BP381-1
GlycoBlue Coprecipitant Invitrogen AM9515 Used for DNA coprecipitation in section 4 (DNA purification)
HiCUP 0.8.2
HindIII, 100 U/µL New England Biolabs R0104T
IGEPAL CA-630 Sigma-Aldrich I8896-50ML
Klenow EXO- 5000 units/mL New England Biolabs M0212L
Low-retention filter tips (10 µL, 20 µL, 200 µL and 1000 µL) ZeroTip PMT233010, PMT252020, PMT231200, PMT252000
M220 Focused-ultrasonicator Covaris 500295
Micro TUBE AFA Fiber Pre-slit snap cap 6 x 16 mm vials Covaris 520045 For sonication in section 6 (sonication)
NheI-HF, 100 U/µL New England Biolabs R3131M
Nuclease-free molecular biology grade water Sigma-Aldrich W4502
PCR primers for quality controls Integrated DNA Technologies -
PCR strips and caps Agilent Technologies 410022, 401425
Phenol: Chloroform: Isoamyl Alcohol 25:24:1, Saturated with 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA Sigma-Aldrich P3803
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer New England Biolabs M0531L For amplification of the library in sections 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification)
and 11 (biotin pull-down and PCR amplification)
Protease inhibitor cocktail (EDTA-free) Roche 11873580001
Proteinase K, recombinant, PCR grade Roche 3115836001
Qubit 1x dsDNA High Sensitivity kit Invitrogen Q33230 For DNA quantification after precipitation in section 4 (DNA purification)
Qubit assay tubes Invitrogen Q32856
rCutsmart buffer New England Biolabs B6004S
RPMI Medium 1640 1x + GlutaMAX Gibco 61870-010 Or any other brand
SDS - Solution 10% for molecular biology PanReac AppliChem A0676
Sodium acetate pH 5.2 Sigma-Aldrich S7899-100ML
SureSelect custom 3-5.9 Mb library Agilent Technologies 5190-4831 Custom designed mouse or human capture system, used for the capture
SureSelect Target Enrichment Box 1 Agilent Technologies 5190-8645 Used for the capture
SureSelect Target Enrichment Kit ILM PE Full Adapter Agilent Technologies 931107 Used for the capture
T4 DNA ligase 1 U/µL Invitrogen 15224025 For ligation in section 3 (ligation and decrosslink)
T4 DNA ligase 2000000/mL New England Biolabs M0202T For ligation in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification)
T4 DNA polymerase 3000 units/mL New England Biolabs M0203L
T4 PNK 10000 units/mL New England Biolabs M0201L
Tapestation 4200 instrument Agilent Technologies For automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and
section 11 (Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid
Tapestation reagents Agilent Technologies 5067-5582, 5067-5583, 5067-5584, 5067-5585, For automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and
section 11 (Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid
Triton X-100 for molecular biology PanReac AppliChem A4975
Tween 20 Sigma-Aldrich P9416-50ML

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hatton, C. S., et al. α-thalassemia caused by a large (62 kb) deletion upstream of the human α globin gene cluster. Blood. 76 (1), 221-227 (1990).
  2. Toikkanen, S., Helin, H., Isola, J., Joensuu, H. Prognostic significance of HER-2 oncoprotein expression in breast cancer: A 30-year follow-up. Journal of Clinical Oncology. 10 (7), 1044-1048 (1992).
  3. Church, C., et al. Overexpression of Fto leads to increased food intake and results in obesity. Nature Genetics. 42 (12), 1086-1092 (2010).
  4. Bhatia, S., et al. Disruption of autoregulatory feedback by a mutation in a remote, ultraconserved PAX6 enhancer causes aniridia. American Journal of Human Genetics. 93 (6), 1126-1134 (2013).
  5. Herranz, D., et al. A NOTCH1-driven MYC enhancer promotes T cell development, transformation and acute lymphoblastic leukemia. Nature Medicine. 20 (10), 1130-1137 (2014).
  6. Carter, D., Chakalova, L., Osborne, C. S., Dai, Y. F., Fraser, P. Long-range chromatin regulatory interactions in vivo. Nature Genetics. 32 (4), 623-626 (2002).
  7. Rao, S. S. P., et al. A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).
  8. Schoenfelder, S., Fraser, P. Long-range enhancer-promoter contacts in gene expression control. Nature Reviews Genetics. 20 (8), 437-455 (2019).
  9. Heintzman, N. D., et al. Distinct and predictive chromatin signatures of transcriptional promoters and enhancers in the human genome. Nature Genetics. 39 (3), 311-318 (2007).
  10. Zentner, G. E., Tesar, P. J., Scacheri, P. C. Epigenetic signatures distinguish multiple classes of enhancers with distinct cellular functions. Genome Research. 21 (8), 1273-1283 (2011).
  11. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  12. McPherson, C. E., Shim, E. Y., Friedman, D. S., Zaret, K. S. An active tissue-specific enhancer and bound transcription factors existing in a precisely positioned nucleosomal array. Cell. 75 (2), 387-398 (1993).
  13. He, A., Kong, S. W., Ma, Q., Pu, W. T. Co-occupancy by multiple cardiac transcription factors identifies transcriptional enhancers active in heart. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (14), 5632-5637 (2011).
  14. Dogan, N., et al. Occupancy by key transcription factors is a more accurate predictor of enhancer activity than histone modifications or chromatin accessibility. Epigenetics and Chromatin. 8, 16 (2015).
  15. Whyte, W. A., et al. transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes. Cell. 153 (2), 307-319 (2013).
  16. Hnisz, D., et al. Super-enhancers in the control of cell identity and disease. Cell. 155 (4), 934-947 (2013).
  17. He, H. H., et al. Nucleosome dynamics define transcriptional enhancers. Nature Genetics. 42 (4), 343-347 (2010).
  18. Song, L., et al. Open chromatin defined by DNaseI and FAIRE identifies regulatory elements that shape cell-type identity. Genome Research. 21 (10), 1757-1767 (2011).
  19. De Santa, F., et al. A large fraction of extragenic RNA Pol II transcription sites overlap enhancers. PLoS Biology. 8 (5), e1000384 (2010).
  20. Kim, T. K., et al. Widespread transcription at neuronal activity-regulated enhancers. Nature. 465 (7295), 182-187 (2010).
  21. ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  22. Wu, H., et al. Tissue-specific RNA expression marks distant-acting developmental enhancers. PLoS Genetics. 10 (9), e1004610 (2014).
  23. Banerji, J., Rusconi, S., Schaffner, W. Expression of a β-globin gene is enhanced by remote SV40 DNA sequences. Cell. 27 (2), 299-308 (1981).
  24. Amano, T., et al. Chromosomal dynamics at the Shh locus: limb bud-specific differential regulation of competence and active transcription. Developmental Cell. 16 (1), 47-57 (2009).
  25. Shi, J., et al. Role of SWI/SNF in acute leukemia maintenance and enhancer-mediated Myc regulation. Genes and Development. 27 (24), 2648-2662 (2013).
  26. Lettice, L. A., et al. A long-range Shh enhancer regulates expression in the developing limb and fin and is associated with preaxial polydactyly. Human Molecular Genetics. 12 (14), 1725-1735 (2003).
  27. Tuvikene, J., et al. Intronic enhancer region governs transcript-specific Bdnf expression in rodent neurons. eLife. 10, e65161 (2021).
  28. Tasic, B., et al. Promoter choice determines splice site selection in protocadherin α and γ pre-mRNA splicing. Molecular Cell. 10 (1), 21-33 (2002).
  29. Perry, M. W., Boettiger, A. N., Levine, M. Multiple enhancers ensure precision of gap gene-expression patterns in the Drosophila embryo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (33), 13570-13575 (2011).
  30. Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326 (5950), 289-293 (2009).
  31. Fullwood, M. J., et al. An oestrogen-receptor-α-bound human chromatin interactome. Nature. 462 (7269), 58-64 (2009).
  32. Mumbach, M. R., et al. HiChIP: Efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture. Nature Methods. 13 (11), 919-922 (2016).
  33. Sati, S., et al. HiCuT: An efficient and low input method to identify protein-directed chromatin interactions. PLoS Genetics. 18 (3), e1010121 (2022).
  34. Schoenfelder, S., et al. The pluripotent regulatory circuitry connecting promoters to their long-range interacting elements. Genome Research. 25 (4), 582-597 (2015).
  35. Schoenfelder, S., Javierre, B. M., Furlan-Magaril, M., Wingett, S. W., Fraser, P. Promoter capture Hi-C: High-resolution, genome-wide profiling of promoter interactions. Journal of Visualized Experiments. (136), e57320 (2018).
  36. Rubin, A. J., et al. Lineage-specific dynamic and pre-established enhancer-promoter contacts cooperate in terminal differentiation. Nature Genetics. 49 (10), 1522-1528 (2017).
  37. Siersbæk, R., et al. Dynamic rewiring of promoter-anchored chromatin loops during adipocyte differentiation. Molecular Cell. 66 (3), 420-435 (2017).
  38. Schoenfelder, S., et al. Polycomb repressive complex PRC1 spatially constrains the mouse embryonic stem cell genome. Nature Genetics. 47 (10), 1179-1186 (2015).
  39. Zhang, N., et al. Muscle progenitor specification and myogenic differentiation are associated with changes in chromatin topology. Nature Communications. 11 (1), 6222 (2020).
  40. Javierre, B. M., et al. Lineage-specific genome architecture links enhancers and non-coding disease variants to target gene promoters. Cell. 167 (5), 1369-1384 (2016).
  41. Jäger, R., et al. Capture Hi-C identifies the chromatin interactome of colorectal cancer risk loci. Nature Communications. 6, 6178 (2015).
  42. Martin, P., et al. Identifying causal genes at the multiple sclerosis associated region 6q23 using capture Hi-C. PLoS One. 11 (11), e0166923 (2016).
  43. Burren, O. S., et al. Chromosome contacts in activated T cells identify autoimmune disease candidate genes. Genome Biology. 18 (1), 165 (2017).
  44. Choy, M. K., et al. Promoter interactome of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes connects GWAS regions to cardiac gene networks. Nature Communications. 9 (1), 2526 (2018).
  45. Miguel-Escalada, I., et al. Human pancreatic islet three-dimensional chromatin architecture provides insights into the genetics of type 2 diabetes. Nature Genetics. 51 (7), 1137-1148 (2019).
  46. Law, P. J., et al. Association analyses identify 31 new risk loci for colorectal cancer susceptibility. Nature Communications. 10 (1), 2154 (2019).
  47. Speedy, H. E., et al. Insight into genetic predisposition to chronic lymphocytic leukemia from integrative epigenomics. Nature Communications. 10 (1), 3615 (2019).
  48. Li, T., et al. Epigenomics and transcriptomics of systemic sclerosis CD4+ T cells reveal long-range dysregulation of key inflammatory pathways mediated by disease-associated susceptibility loci. Genome Medicine. 12 (1), 81 (2020).
  49. Orlando, G., et al. Promoter capture Hi-C-based identification of recurrent noncoding mutations in colorectal cancer. Nature Genetics. 50 (10), 1375-1380 (2018).
  50. Cornish, A. J., et al. Identification of recurrent noncoding mutations in B-cell lymphoma using capture Hi-C. Blood Advances. 3 (1), 21-32 (2019).
  51. Madsen, J. G. S., et al. Highly interconnected enhancer communities control lineage-determining genes in human mesenchymal stem cells. Nature Genetics. 52 (11), 1227-1238 (2020).
  52. Dryden, N. H., et al. Unbiased analysis of potential targets of breast cancer susceptibility loci by Capture Hi-C. Genome Research. 24 (11), 1854-1868 (2014).
  53. Tomás-Daza, L., et al. Low input capture Hi-C (liCHi-C) identifies promoter-enhancer interactions at high-resolution. Nature Communications. 14 (1), 268 (2023).
  54. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. 62 (62), e3923 (2012).
  55. Bronner, I. F., Quail, M. A. Best practices for Illumina library preparation. Current Protocols in Human Genetics. 102 (1), 86 (2019).
  56. Wingett, S., et al. HiCUP: pipeline for mapping and processing Hi-C data. F1000Research. 4, 1310 (2015).
  57. Nagano, T., et al. Comparison of Hi-C results using in-solution versus in-nucleus ligation. Genome Biology. 16 (1), 175 (2015).
  58. Cairns, J., et al. CHiCAGO: Robust detection of DNA looping interactions in Capture Hi-C data. Genome Biology. 17 (1), 127 (2016).
  59. Freire-Pritchett, P., et al. Detecting chromosomal interactions in Capture Hi-C data with CHiCAGO and companion tools. Nature Protocols. 16 (9), 4144-4176 (2021).
  60. Kihm, A. J., et al. An abundant erythroid protein that stabilizes free α-haemoglobin. Nature. 417 (6890), 758-763 (2002).
  61. Feng, L., et al. Molecular mechanism of AHSP-mediated stabilization of α-hemoglobin. Cell. 119 (5), 629-640 (2004).
  62. Favero, M. E., Costa, F. F. Alpha-hemoglobin-stabilizing protein: An erythroid molecular chaperone. Biochemistry Research International. 2011, 373859 (2011).
  63. Li, D., et al. WashU Epigenome Browser update 2022. Nucleic Acids Research. 50 (W1), W774-W781 (2022).
  64. Mifsud, B., et al. Mapping long-range promoter contacts in human cells with high-resolution capture Hi-C. Nature Genetics. 47 (6), 598-606 (2015).
  65. Nagano, T., et al. Single-cell Hi-C reveals cell-to-cell variability in chromosome structure. Nature. 502 (7469), 59-64 (2013).
  66. Tan, L., Xing, D., Chang, C. H., Li, H., Xie, X. S. 3D genome structures of single diploid human cells. Science. 361 (6405), 924 (2018).
  67. Ramani, V., et al. Massively multiplex single-cell Hi-C. Nature Methods. 14 (3), 263-266 (2017).
  68. Díaz, N., et al. Chromatin conformation analysis of primary patient tissue using a low input Hi-C method. Nature Communications. 9 (1), 4938 (2018).
  69. Lu, L., Jin, F. Easy Hi-C: A low-input method for capturing genome organization. Methods in Molecular Biology. 2599, 113-125 (2023).

Tags

علم الوراثة ، العدد 194 ،
سير عمل متكامل لدراسة بنية الجينوم المكاني والزماني المتمحورة حول المروج في مجموعات الخلايا النادرة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rovirosa, L., Tomás-Daza, L.,… More

Rovirosa, L., Tomás-Daza, L., Urmeneta, B., Valencia, A., Javierre, B. M. An Integrated Workflow to Study the Promoter-Centric Spatio-Temporal Genome Architecture in Scarce Cell Populations. J. Vis. Exp. (194), e65316, doi:10.3791/65316 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter