Summary
遺伝子発現は、遺伝子プロモーターと遠位調節要素との相互作用によって調節される。ここでは、低入力のCapture Hi-C(liCHi-C)により、以前は測定できなかった希少細胞型におけるこれらの相互作用の同定がどのように可能になるかを説明します。
Abstract
時空間的な遺伝子転写は、転写を制御するために標的遺伝子プロモーターとの物理的な近接に依存するエンハンサーやサイレンサーなどの遠位調節要素によって厳密に制御されています。これらの調節要素は同定が容易ですが、それらのほとんどは細胞型特異的であり、線形ゲノム配列において数百キロ塩基離れている可能性があり、他の非標的遺伝子をスキップするため、それらの標的遺伝子を予測することは困難です。数年前から、プロモーターキャプチャーHi-C(PCHi-C)は、遠位調節エレメントを標的遺伝子に関連付けるためのゴールドスタンダードでした。しかし、PCHi-Cは数百万の細胞の入手可能性に依存しており、初代組織から一般的に得られるような希少細胞集団の研究を禁止しています。この制限を克服するために、ゲノムの各遺伝子を制御する遠位調節要素のレパートリーを同定するための費用効果が高くカスタマイズ可能な方法である低入力Capture Hi-C(liCHi-C)が開発されました。liCHi-Cは、PCHi-Cと同様の実験および計算フレームワークに依存していますが、チューブの変更を最小限に抑え、試薬の濃度と量を変更し、ステップを交換または排除することにより、ライブラリ構築中の材料損失を最小限に抑えます。liCHi-Cは、発生生物学と細胞機能の文脈における遺伝子制御と時空間ゲノム構成の研究を可能にします。
Introduction
時間的な遺伝子発現は細胞の分化を促進し、最終的には生物の発生を促進し、その変化は幅広い疾患と密接に関連しています1,2,3,4,5。遺伝子転写は、近位(すなわち、遺伝子プロモーター)および遠位(例えば、エンハンサーまたはサイレンサー)に分類され得る調節要素の作用によって細かく制御され、後者はしばしば標的遺伝子から遠くに位置し、クロマチンループを介してそれらと物理的に相互作用して遺伝子発現を調節する6,7,8。
ゲノム中の遠位調節領域の同定は、これらの領域が特異的なヒストン修飾9,10,11を有し、特異的な転写因子認識モチーフを含み、それらの募集プラットフォームとして機能するため、広く合意されている問題である12,13,14。その上、エンハンサーおよびスーパーエンハンサー15,16の場合、それらはまた低ヌクレオソーム占有率17,18を有し、ノンコーディングeRNA19,20に転写される。
それにもかかわらず、各遠位調節要素の標的遺伝子を予測することはより困難です。多くの場合、遠位調節要素とその標的との間の相互作用は、細胞型および刺激特異的であり21,22、数百キロベースに及び、任意の方向に他の遺伝子を橋渡しし23,24,25、標的遺伝子または他の非介在遺伝子のイントロン領域内に位置し得る26,27.さらに、遠位調節要素は同時に複数の遺伝子を制御することもでき、逆もまた同様である28,29。この位置の複雑さは、それらの間の調節関連を特定することを妨げ、したがって、すべての細胞型における各調節要素の標的のほとんどは未知のままです。
近年、クロマチン相互作用を研究するための染色体立体構造捕捉(3C)技術の開発に大きなブームがありました。それらの中で最も広く使用されているHi-Cは、細胞のゲノム30のすべての断片間のすべての相互作用のマップを生成することを可能にする。しかし、制限断片レベルで有意な相互作用を検出するために、Hi-Cは超深部シーケンシングに依存しており、個々の遺伝子の調節状況を日常的に研究するためにそれを使用することを禁止しています。この経済的限界を克服するために、ChIA-PET 31、HiChIP32、およびその低入力対応物HiCuT33など、いくつかの濃縮ベースの3C技術が登場しました。これらの技術は、特定のタンパク質によって媒介されるゲノム全体の相互作用を濃縮するための抗体の使用に依存しています。それにもかかわらず、これらの3C技術のユニークな特徴は、それらのアプリケーションの悩みの種でもあります。ユーザーは、目的のタンパク質に対する高品質の抗体の入手可能性を頼りにしており、タンパク質の結合が動的である条件を比較することはできません。
プロモーター捕捉Hi−C(PCHi−C)は、これらの制限を回避する別の濃縮ベースの3C技術である34、35。PCHi-Cは、ビオチン化RNAプローブ濃縮システムを採用することにより、28,650個のヒトまたは27,595個のマウスアノテーション付き遺伝子プロモーター(プロモーターインタラクトームとも呼ばれる)と相互作用するゲノム領域のゲノムワイドな高解像度ライブラリを生成することができます。このアプローチにより、活性プロモーターと非活性プロモーターの両方の制限フラグメントレベルの分解能で有意な長距離相互作用を検出し、ヒストン修飾やタンパク質結合のダイナミクスとは無関係に、任意の条件間でプロモーター相互作用を堅牢に比較することができます。PCHi-Cは、細胞分化中のプロモーターの相互作用体再編成を同定するために近年広く使用されており36,37、転写因子の作用機序を同定し38,39、非コード変異体40,41,42,43,44,45によって疾患において調節解除される新しい潜在的な遺伝子および経路を発見する。46、47、48、新しいドライバ非コード変異49、50と並んで。さらに、捕捉システムを変更するだけで、この手法を生物学的問題に従ってカスタマイズして、任意のインタラクトーム(例えば、エンハンサーインタラクトーム51または非コード改変のコレクションのインタラクトーム41、52)を尋問することができる。
しかし、PCHi-Cは最低2,000万個の細胞に依存してこの技術を実行するため、発生生物学や臨床応用でよく使用されるような希少な細胞集団の研究が妨げられています。このため、PCHi-Cの実験フレームワークに基づいて、低細胞入力で高分解能プロモーター相互作用を形成するための費用効果が高くカスタマイズ可能な新しい方法である低入力キャプチャHi-C(liCHi-C)を開発しました。最小限のチューブ交換、元のPCHi-Cプロトコルからのステップの交換または排除、反応量の大幅な削減、試薬濃度の変更で実験を行うことで、ライブラリの複雑さが最大化され、わずか50,000細胞で高品質のライブラリを生成することができます53。
低入力キャプチャHi-C(liCHi-C)は、PCHi-Cに対してベンチマークされており、ヒト造血細胞分化中のプロモーター相互作用体再配線の解明、非コード変化によって制御解除される可能性のある新しい疾患関連遺伝子および経路の発見、および染色体異常の検出に使用されています53。ステップバイステップのプロトコルと技術によるさまざまな品質管理は、ライブラリの最終生成とその計算分析までここで詳しく説明します。
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Protocol
材料の損失を最小限に抑えるには、(1)DNA低結合チューブとチップ( 材料表を参照)を使用し、(2)チップをサンプル内に導入する代わりにチューブ壁に試薬を配置し、(3)可能であれば、サンプルを上下にピペッティングする代わりに反転によってサンプルを混合し、その後スピンダウンしてサンプルを回収します。
1.細胞固定
- 浮遊状態で増殖する細胞
- 50,000〜100万個の細胞を採取し、DNA低結合1.5 mLチューブに入れます。
注:本研究に用いた細胞型は、代表的な結果のセクションで詳述されています。 - 固定角度ローター遠心分離機を使用して細胞を600 x g (4°C)で5分間遠心分離し、ピペッティングで上清を除去します。
- 室温で10%ウシ胎児血清(FBS)を添加した1 mLのRPMI 1640に細胞を再懸濁します。
- メタノールを含まない16%ホルムアルデヒド143μLを加えて濃度2%にし、混合します。
- 室温で回転させながら細胞を10分間インキュベートし、細胞を固定します。
注:10分間のインキュベーションでできるだけ正確になるようにしてください。細胞の過剰または過小固定は、ライブラリの品質の低下につながる可能性があります。 - 氷冷した1 Mグリシン164 μLを加えて反応を停止し、混合します。細胞を室温で回転させながら5分間インキュベートする。
- さらに細胞を氷上で15分間インキュベートし、~5分ごとに転倒させて混合します。
- 固定角度ローター遠心分離機を使用して細胞を1,000 x g (4°C)で10分間遠心分離し、上清を除去します。
- ペレットを氷冷した1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)1 mLに再懸濁して細胞を洗浄します。
- 細胞を1,000 x g (4°C)で10分間遠心分離し、上清を除去します。
注:ペレット化された細胞は、液体窒素またはドライアイスで瞬間凍結し、-80°Cで保存できます。
- 50,000〜100万個の細胞を採取し、DNA低結合1.5 mLチューブに入れます。
- 接着細胞
- 培養皿内の細胞を1x PBSで洗浄します。
- 培養皿を覆うのに十分なRPMI 1640を室温で10%FBSおよびメタノールフリーの2%ホルムアルデヒドを添加したものを準備します。
- 添加した培地を細胞と一緒に培養皿に加え、室温で揺動させて細胞を固定しながら10分間インキュベートします。
注:10分間のインキュベーションでできるだけ正確になるようにしてください。細胞の過剰または過小固定は、ライブラリの品質の低下につながる可能性があります。 - 1 Mのグリシンを0.125 Mまで添加して反応を停止し、揺動させて混合します。
- 細胞を室温で揺らしながら5分間インキュベートします。
- さらに細胞を4°Cで15分間インキュベートし、3〜4分ごとに揺動させて混合する。
- 培地を取り出し、冷たい1x PBSで細胞を洗浄します。
- 細胞をスクレイピングし、1.5 mL DNA低結合チューブに移します。培養皿を0.5〜1 mLの冷たい1 x PBSできれいに拭きます。
- 固定角度ローター遠心分離機を使用して細胞を1,000 x g (4°C)で10分間遠心分離し、上清を除去します。ペレット化された細胞は、液体窒素またはドライアイス中で瞬間凍結し、-80°Cで保存することができる。
2.溶解と消化
- 細胞を1 mLの低温溶解バッファー(表1)に再懸濁して、細胞膜を破壊します。緩衝液の添加だけで細胞を再懸濁するのに十分であるべきであるが、必要に応じて光ボルテックスによってさらに再懸濁することができる。
- 氷上で30分間インキュベートし、~5分ごとに反転させて混合します。核を1,000 x g (4°C)で10分間遠心分離し、上清を除去します。核を500 μLの冷たい1.25倍制限バッファー2で再懸濁します( 材料表を参照)。
- 核を1,000 x g (4°C)で10分間遠心分離し、上清を除去します。核を179 μLの1.25x制限バッファー2に再懸濁します。
- 5.5 μLの10%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS; 材料表を参照)を加えて混合します。細胞は塊を形成することがあります。これは正常であり、ボルテックスによって可能な限り分解する必要があります。サンプルをサーモブロック中で37°Cで1時間インキュベートし、950 rpmで振とうします。
- 37.5 μLの10%トリトンX-100を加えてSDSをクエンチし、混合します。サンプルをサーモブロック中で37°Cで1時間インキュベートし、950 rpmで振とうします。
- 7.5 μLのHindIII(100 U / μL; 材料表を参照)を加えてクロマチンを消化し、混合します。サンプルをサーモブロック内で37°Cで一晩インキュベートし、950 rpmで振とうします。
- 翌朝、さらに2.5 μLのHindIII(100 U/μL)を加え、適切なクロマチン消化を確保するために、950 rpmで振とうしながら、サーモブロック中で37°Cで1時間サンプルをさらにインキュベートします。
注意: 消化効率制御(ステップ5.1を参照)の一部として、20,000〜40,000核に相当するものを別のチューブに移して、未消化のコントロールを表します。消化後、同じ数の細胞を再び別のチューブに移して、消化されたコントロールを表します。出発物質の入手可能性が不足している場合は、別の実験として消化効率をテストすることをお勧めします。
3. ライゲーションと脱架橋
- サンプルを氷の上で冷やします。マスターミックスを調製し、制限フラグメントオーバーハングを充填してビオチン化するための試薬を添加します:3 μLの10x制限バッファー2、1 μLのヌクレアーゼフリー水、0.75 μLの10 mM dCTP、0.75 μLの10 mM dTTP、0.75 μLの10 mM dGTP、18.75 μLの0.4 mMビオチン-14-dATP、および5 μLの5 U/μL Klenow( 材料表を参照)。サンプルを37°Cで75分間インキュベートし、~15分ごとに転倒混合します。
- サンプルを氷の上で冷やします。マスターミックスを調製し、充填されたDNA末端をライゲーションするための試薬50 μL、20 mg/mLウシ血清アルブミン(BSA)2.5 μL、1 U/μL T4 DNAリガーゼ12.5 μL、およびヌクレアーゼフリー水173 μLを添加します( 材料表参照)。
- サンプルを16°Cで4〜6時間インキュベートし、~1時間ごとに反転混合します。さらに、サンプルを室温で30分間インキュベートします。30 μLの10 mg/mLプロテイナーゼKを加えてクロマチンを脱架橋し、混合します。サンプルを65°Cで一晩インキュベートします。
- 翌朝、さらに15 μLの10 mg/mLプロテイナーゼKを添加し、さらにサンプルを65°Cで2時間インキュベートして、適切なクロマチン脱架橋を確保します。
4. DNA精製
- サンプルを室温まで冷却し、フェノール-クロロホルム精製に適したチューブに移します。
- フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(25:24:1)を1容量(545 μL)加えてDNAを精製し、激しく振とうして混合します。
- サンプルを室温で12,000 x g で5分間遠心分離し、上水相(545 μL)を2 mL DNA低結合チューブに移します。
- 以下の試薬を加えてDNAを沈殿させます:-20°Cに冷却した100%エタノール1,362.5 μL、3 M酢酸ナトリウム(pH 5.2)54.5 μL、共沈剤として15 mg/mLグリコーゲン2 μL。
- -80°Cで1時間、または-20°Cで一晩インキュベートします。
- サンプルを4°Cで16,000-21,000 x g で30分間遠心分離し、上清を除去します。DNAペレットは見えなければなりません。
- 1 mLの70%エタノールを加えてペレットを洗浄し、ボルテックスし、室温で16,000〜21,000 x g で10分間遠心分離します。
- 上清を取り除き、ペレットを風乾させます。DNAペレットを130 μLのヌクレアーゼフリー水に再懸濁します。
- 蛍光定量によって濃度を評価します( 材料の表を参照)。精製した3C材料を-20°Cで数ヶ月間保管してから、プロトコルを進めてください。
5.オプションの品質管理
- 消化効率を評価します。前述のように、ステップ2.13で得られた未消化および消化されたコントロールに対して、脱架橋およびフェノール:クロロホルムDNA精製を実行します。DNAペレットをヌクレアーゼフリー水10 μLに再懸濁します。濃度を定量し、必要に応じて得られたDNAを4 ng/μLに希釈します。
- HindIIIターゲットの有無にかかわらず、オープンクロマチン遺伝子座にまたがるプライマーを用いて、未消化コントロールと消化コントロールの両方の4 ngのDNAを用いて定量PCRを実行します(プライマー設計については 表2 を参照)。以前に公開されたレポート35に従って消化の効率を計算します。
注:ライゲーションの効率は、消化(%)= 100 -100/(2^[(HindIIIで消化されたCt-HindIIIなしで消化されたCt)-(HindIIIで消化されていないCt-HindIIIなしで消化されていないCt)])(表3を参照)を使用してパーセンテージとして計算され、これは未消化および消化されたコントロールの各プライマーペアについて得られた異なるCtsの差を考慮に入れています。 - 従来のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)(0.2 mM dNTP、0.4 μmの両方のF+Rプライマー、0.1およびU/μLホットスタートポリメラーゼ)を実行して、長距離および短距離の細胞不変相互作用の両方にまたがるプライマーを使用して、相互作用検出の感度を評価します(プライマー設計については 表2 を参照)。50〜100 ngの3C材料(それぞれ短距離および長距離相互作用用)を使用し、次の条件を使用して増幅します:98°Cで15分間、続いて98°Cで30秒間、60°Cで1分間、72°Cで1分間、72°Cで10分間仕上げます。4°Cで保持する。
注:得られたDNAの量が2 μg未満の場合は、相互作用パネル全体ではなく、長距離および短距離の相互作用のみを確認してください。 - 1.6%アガロースゲルを用いて1x トリス-ホウ酸-EDTA(TBE)上で産物を実行し、対応するPCRアンプリコン54の存在を探します。
注:ゲノムの予測不可能な「カットアンドペースト」により、不特異的なバンドが現れることがあります。正しいバンド サイズが観察されている限り、正しいものとしてカウントされます。 - 短距離PCR産物をHindIII、NheI( 材料表を参照)、酵素の両方またはなし(水)で差動的に消化し、1x TBE 1.6%アガロースゲル上で産物を流すことにより、ビオチン充填およびライゲーションの効率を評価します。正しいフィルインとライゲーションにより、以前のHindIIIターゲットが排除され、新しいNheIターゲットが作成されるため、アンプリコンはNheIの存在下でのみ切断する必要があります。
注:材料の損失を最小限に抑えるために、相互作用コントロールから2.5 μLの短距離PCR産物を取り出し、5回再増幅してフィルインおよびライゲーションコントロールを実行します。
6.超音波処理
- サンプルの130μL(一部がコントロールに使用された場合はヌクレアーゼフリー水で補充)を超音波処理に適したキュベットに移します。
- ウォーターバス超音波処理器をセットアップし、次のパラメータを使用して超音波処理します( 材料表に記載されているモデルとキュベット用に最適化されています):デューティファクター:20%;ピーク入射電力:50;バーストあたりのサイクル数:200;時間:65秒;温度範囲:6-10°C(8°C最適)。
- サンプルを新しい1.5 mL DNA低結合チューブに移します。
7.エンドリペア
- マスターミックスを調製し、超音波処理中に作成されたDNA断片の不均一な末端を修復するために次の試薬を追加します:18μLの10xライゲーションバッファー、18μLの2.5mM dNTPミックス、6.5μLの3U /μL T4 DNAポリメラーゼ、6.5μLの10U/μL T4 PNK、および1.3μLの5U/μLクレノウ( 材料の表を参照)。
- サンプルを20°Cで30分間インキュベートし、トリス低EDTA(TLE)バッファー( 表1を参照)を300 μLに補充します。
8.ビオチンプルダウン
- サンプルあたり150 μLのC1ストレプトアビジンビーズ( 材料表を参照)を1.5 mLチューブに移し、1.5 mLチューブマグネットの上に置き、2〜3分またはすべてのビーズが壁にくっつくまで待ちます。ビーズを残して上清を取り除きます。
- ビーズを400 μLの1xトゥイーンバッファー(TB; 表1を参照)で洗浄します。ビーズを洗浄するには、バッファーを追加し、ソフトボルテックスで再懸濁します。チューブを磁石に戻し、2〜3分、またはすべてのビーズが壁にくっつくまで待ちます。ビーズを残して上清を取り除きます。
- ビーズを300 μLの1xトゥイーンなしバッファー(NTB; 表1を参照)で洗浄します。ビーズを300 μLの2x NTBに再懸濁します( 表1を参照)。
注意: 洗剤なしでバッファーで洗浄すると、ビーズがチューブ壁の周りにほこりの多い層を形成する可能性があります。これは正常であり、プロトコルの結果には影響しません。 - この300 μLのビーズを2x NTBで300 μLのサンプルと組み合わせます。室温で回転させながら15分間インキュベートし、ビオチンで有益なDNA断片を引き下げます。ライブラリはC1ストレプトアビジンビーズに貼り付けられています。
- ビーズを400 μLの1x NTBで洗浄します。ビーズを100 μLのTLEバッファーで洗浄し、その後35.7 μLのTLEバッファーに再懸濁します。
9. dATPテーリング、アダプターライゲーション、PCR増幅
- マスターミックスを調製し、修復されたDNA断片の末端をdATPテールするためにサンプルに次の試薬を追加します:5 μLの10x制限バッファー2、2.3 μLの10 mM dATP、および7 μLの5 U/μLクレノウエキソ-。サンプルを37°Cで30分間インキュベートします。
- サンプルをさらに65°Cで10分間インキュベートすることにより、Klenowexo-を不活性化します。 サンプルを氷の上で冷却します。ビーズを300 μLの1x TBで洗浄します。ビーズを300 μLの1x NTBで洗浄します。
- ビーズを100 μLの1xライゲーションバッファーで洗浄し、その後50 μLの1xライゲーションバッファーに再懸濁します。4 μLの15 μMプレアニールアダプターミックス( 表2を参照)と1 μLの2,000 U/μL T4 DNAリガーゼ( 材料表を参照)をサンプルに追加します。
- 室温で2時間インキュベートします。ビーズを400 μLの1x TBで洗浄します。ビーズを200 μLの1x NTBで洗浄します。ビーズを100 μlの1x制限バッファー2で洗浄します。
- ビーズを50 μLの1x制限バッファー2で洗浄し、その後、50 μLの1x制限バッファー2に再懸濁します。
- 以下の試薬を混合してPCR反応を調製し、ライブラリーを増幅します:ライブラリーを含む50 μLのビーズ、酵素を含む250 μLの2x PCRマスターミックス、12 μLのF+Rプライマー(各25 μM、 表2を参照)、および188 μLのヌクレアーゼフリー水。
- 98°Cで40秒、続いて98°Cで10秒、65°Cで30秒、72°Cで30秒、72°Cで10分間のXサイクルの条件でPCRを行います(PCR試薬ミックスを50 μLの反応に分割し、72°Cで10分間終了します)。4°Cで保持する。
注:ライブラリキャプチャの前に500〜1,000 ngの出力を目指す二倍体細胞のプロトコルを最適化するための出発点として、次のサイクル数を使用します:8サイクルで100万個の細胞。10サイクルで250,000セル。12サイクルで50,000セル。 - 同じサンプルからのすべての50 μL反応液を1.5 mL DNA低結合チューブにプールし、1.5 mLチューブマグネットに置き、2〜3分またはすべてのビーズが壁に付着するまで待ちます。
- ライブラリーを含む上清(500 μL)を新しい1.5 mL DNA低結合チューブに移します。上清の一部が失われた場合は、TLEバッファーを500 μLまで補充します。C1ストレプトアビジンビーズはもう必要ありません。
- 常磁性ビーズ精製(0.4-1容量)を用いて両面選択55 を行う。これにより、添加する常磁性ビーズのポリエチレングリコールと塩の濃度に応じて、大きすぎる(>1,000 bp)および小さすぎるフラグメントまたはPCRプライマー(<200 bp)を選択的に除去できます。
- 200 μL(0.4容量)のストックビーズをライブラリに加え、ボルテックスで混合します。室温で回転させながら10分間インキュベートする。
- 磁石の上に置き、2〜3分、またはすべてのビーズが壁にくっつくまで待ってから、ライブラリを含む上清(大きな断片なし)を新しい1.5 mL DNA低結合チューブに移します。
- 750 μLのストックビーズを採取してビーズを濃縮し、磁石上の1.5 mLチューブに入れ、2〜3分またはすべてのビーズが壁に付着するまで待ち、上清を取り除き、300 μLの新しいストックビーズにボルテックスしてビーズを再懸濁します。
- この300μLの濃縮ビーズをサンプル(1容量)に加え、ボルテックスで混合します。室温で回転させながら10分間インキュベートする。磁石の上に置き、2〜3分、またはすべてのビーズが壁にくっつくまで待ってから、上清(小さなフラグメントとPCRプライマーを含む)を取り除きます。
- ビーズを1 mLの70%エタノールで3回洗浄します。これを行うには、ビーズ付きのチューブがまだ磁石上にある間にエタノールを追加し、ビーズを乱さないようにし、30〜60秒待ちます。その後、ビーズを乱さずに上清を除去します。
- ビーズを風乾させ、ボルテックスによって21 μLのTLEバッファーに再懸濁します。
注:ビーズを過度に乾燥させると、DNAを溶出する際の収量が低下する可能性があります。エタノールから「光沢」がなくなった直後にTLEバッファーに再懸濁することを目指します。 - サンプルをサーモブロック中で37°Cで10分間インキュベートし、ビーズからライブラリを溶出します。チューブを磁石に入れ、ライブラリを含む上清を新しい1.5 mL DNA低結合チューブに移します。
- 自動電気泳動によりサイズと濃度を定量化します( 材料表を参照)。精製されたHi-C材料は、プロトコルを進める前に-20°Cで数ヶ月間保存できます。
10.ライブラリキャプチャ
- 500〜1,000 ngのライブラリで作業します。真空濃縮器を使用してDNAを乾燥させ、3.4 μLのヌクレアーゼフリー水に材料を再懸濁することにより、ライブラリを濃縮します。
- ターゲット濃縮キット( 材料表を参照)から次のブロッカーをサンプルに追加します:2.5 μLのブロッカー1、2.5 μLのブロッカー2、およびアダプター用の0.6 μLのカスタムオリゴブロッカー。
- 完全に再懸濁し、溶液を0.2 mLのPCRストリップに移し、サーモサイクラーで95°Cで5分間インキュベートした後、加熱した蓋で65°Cで5分間インキュベートします。チューブを65°Cでインキュベートしたままにします。
- サンプルあたりターゲット濃縮キット( 材料の表を参照)から以下の試薬を組み合わせてハイブリダイゼーション溶液を調製します(13 μL)。室温でベンチに保管してください:6.63 μLのHyb 1、0.27 μLのHyb 2、2.65 μLのHyb 3、および3.45 μLのHyb 4。
- ターゲット濃縮キットのRNaseブロック0.5 μLを、サンプルあたり1.5 μLのヌクレアーゼフリー水で希釈します。サンプルあたり5 μLのビオチン化RNAを氷上で解凍し、2 μLの希釈RNaseブロックを加えます。室温でベンチに保管してください。
- 13 μLのハイブリダイゼーション溶液をRNaseを含む7 μLのビオチン化RNAに加え、よく混合します。
- 65°Cのサーモサイクラーで、ハイブリダイゼーション溶液とビオチン化RNA(20 μL)をブロックライブラリーに移します。チューブの蓋をしっかりと閉め、サーモサイクラーで65°Cで一晩インキュベートします。
注:複数のサンプルを同時に実施する場合、サンプルの蒸発(RNA-DNAハイブリダイゼーションが最適ではない可能性があります)を最小限に抑えるには、マルチチャンネルピペットを使用してビオチン化RNAを各ライブラリに同時に移します。
11. ビオチンプルダウンとPCR増幅
- サンプルあたり50 μLのT1ストレプトアビジンビーズを1.5 mL DNA低結合チューブに移し、1.5 mLチューブマグネットに置き、2〜3分またはすべてのビーズが壁にくっつくまで待ちます。ビーズを残して上清を取り除きます。ターゲット濃縮キットからの200 μLの結合バッファーでビーズを3回洗浄します。
- ビーズを200 μLの結合バッファーに再懸濁します。65°Cのサーモサイクラーで、サンプルを再懸濁したT1ストレプトアビジンビーズに移し、室温で回転しながら30分間インキュベートします。
- ターゲット濃縮キットの洗浄バッファー1を200 μLでビーズを洗浄します。室温で回転させながら15分間インキュベートする。65°Cに加熱したターゲット濃縮キットからの200 μLの洗浄バッファー2でビーズを3回洗浄します。 サーモブロック中で65°Cで10分間インキュベートし、洗浄の合間に300 rpmで振とうします。
- ビーズを200 μLの1x制限バッファー2で洗浄し、その後、30 μLの1x制限バッファー2に再懸濁します。
- 以下の試薬を混合してPCR反応を調製し、ライブラリーを増幅します:ライブラリーを含む30 μLビーズ、酵素を含む150 μLの2x PCRマスターミックス、7.2 μLのF+Rプライマー(各25 μM、 表2を参照)、および112.8 μLのヌクレアーゼフリー水。
- 98°Cで40秒、続いて98°Cで10秒、65°Cで30秒、72°Cで30秒、72°Cで10分間の条件でPCRを行います。4°Cで保持する。
- 同じサンプルからのすべての50 μL反応液を1.5 mL DNA低結合チューブにプールし、1.5 mLチューブマグネットに置き、2〜3分またはすべてのビーズが壁に付着するまで待ちます。
- ライブラリー(300 μL)を含む上清を新しい1.5 mL DNA低結合チューブに移します。上清の一部が失われた場合は、TLEバッファーを300 μLまで補充します。T1ストレプトアビジンビーズはもう必要ありません。
- 常磁性ビーズを使用してDNA精製を実行します(0.9ボリューム; 材料表を参照)。270 μLのストックビーズをサンプルに加え、ボルテックスで混合します。
- 室温で回転させながら10分間インキュベートする。
- 磁石の上に置き、2〜3分またはすべてのビーズが壁にくっつくまで待ってから、上清を取り除きます。
- ビーズを1 mLの70%エタノールで3回洗浄します。これを行うには、ビーズの入ったチューブがまだ磁石上にある間にエタノールを加え、ビーズを邪魔しないようにし、30〜60秒待ちます。その後、ビーズを乱さずに上清を除去します。
- ビーズを風乾させ、ボルテックスによって21 μLのTLEバッファーに再懸濁します。
注:ビーズを過度に乾燥させると、DNAを溶出する際の収量が低下する可能性があります。エタノールから「光沢」がなくなった直後にTLEバッファーに再懸濁することを目指します。 - サンプルをサーモブロック中で37°Cで10分間インキュベートし、ビーズからライブラリを溶出します。
- チューブを磁石に入れ、ライブラリを含む上清を新しい1.5 mL DNA低結合チューブに移します。
- 自動電気泳動によりサイズと濃度を定量化します。
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Representative Results
liCHi-Cは、わずか50,000細胞で高品質で分解能の高いゲノムワイドプロモーターインタラクトームライブラリを生成する可能性を提供します53。これは、反応量の大幅な削減とプロトコル全体でのDNA低結合プラスチックウェアの使用に加えて、重大な材料損失が発生する元のプロトコルから不要なステップを削除することによって達成されます。これらには、脱架橋後のフェノール精製、ビオチン除去、およびその後のフェノール-クロロホルム精製およびエタノール沈殿が含まれます。それに加えて、Hi-Cライブラリ調製のステップ(ビオチンプルダウン、Aテーリング、アダプターライゲーション、PCR増幅、および両面常磁性ビーズの選択-PCR産物精製としても)を再編成することで、さらに別の不要なDNA精製ステップを取り除くことができます。実験ワークフローの概要を 図1Aに示します。
ライブラリの品質を評価するために、プロトコル全体でいくつかのコントロールが実行され、その最初のコントロールはゲノム消化効率の計算です。80%を超える値は許容できると見なされます(表3)。単一のliCHi-C実験から大量の物質を失わないようにするために、別の実験で細胞タイプの消化効率をチェックすることが提案されています。第二に、超音波処理および終了修復の前に、従来のPCRによって細胞型不変クロマチン相互作用を増幅することによって相互作用検出の感度をチェックすることが推奨される(図1B)。特定の産物が検出された場合は、以前に得られたPCR産物の1つをHindIIIおよびNheIで差動消化することにより、ビオチン化とライゲーションの効率に焦点を当てた3番目のコントロールを実行する必要があります(図1C、D)。消化されたHindIII制限部位を満たし、それを別のものと平滑末端結紮すると、元のHindIII制限部位を再生する代わりに、新しいNheI制限部位が生成されます。したがって、PCRアンプリコンの消化は、NheIが存在する場合にのみ観察する必要があります。最後に、キャプチャ全体の直前と直後に、自動電気泳動を使用して濃度とサイズ分布を確認する必要があります。キャプチャ前ライブラリの増幅は、キャプチャ前とキャプチャ後の両方のライブラリを過剰に増幅すると、PCR重複の割合が高くなり、その結果、分析中にシーケンシングリードが失われるため、RNAプローブキャプチャを実行するために必要な正確な量である500〜1,000 ngのHi-C材料を取得することを目的とする必要があります。ライブラリは、最初の保存的PCR増幅中に十分な材料が得られない場合、同じ条件下で再度再増幅することができます。キャプチャ後のライブラリ資料の量はさまざまですが、経験則として、キャプチャ前よりも約10倍から20倍少なくする必要があります。ライブラリのサイズ分布は約450〜550 bp(図2A、B)で、キャプチャ前とキャプチャ後のライブラリ間で不変です。まとめると、これらのコントロールの正しい結果は、優れたliCHi-Cライブラリの生成を保証します。
完成したliCHi-Cライブラリは、(少なくとも)100 bpのペアエンドシーケンシングと解析が行われます。生のシーケンシングデータ53 は、アーチファクトをマッピングおよびフィルタリングするためにHiCUPパイプライン56 を使用して処理される。理想的なHiCUPレポートは、核内ライゲーションHi-C57 (図3B)に従って前述のように、トランス(異なる染色体間)ペアエンドリードと比較して、シス(同じ染色体内)の分布が5倍から10倍増加することを示しています。PCR重複の除去後に1億を超えるユニークで有効なリードが保持されることは、キャプチャ効率を評価する分析の次のステップ(図3B)に進むのに十分です。RNAプローブ濃縮システムによって捕捉された制限断片にそれらの末端のいずれもマッピングされないペアエンドリードは破棄され、細胞のプロモーター相互作用を表すもののみを保持する(すなわち、それらの末端の少なくとも1つが1つ以上の遺伝子プロモーターを含む制限断片にマッピングされるリード[図3C]、 理想的には60%以上)。
最後に、58,59で説明されているように、CHiCAGOパイプラインとの有意な相互作用が呼び出されます。2つ以上の生物学的複製が、重要なプロモーター相互作用の最終セットに必要である。生物学的複製はクラスター化し、細胞の種類を分離する必要があるため、データ品質は主成分分析(PCA)を使用して検証することもできます。例えば、ヒト造血樹の4つの異なる初代細胞タイプ(一般的な骨髄系前駆細胞、単球、巨核球、赤芽球)のliCHi-Cデータセットを分析することで、PCAでliCHi-Cライブラリが発生軌道を反映してクラスター化していることを観察できます(図3D)。4つの細胞型について検出された有意な相互作用を詳しく調べると、プロモーターの相互作用は細胞型特異的であり、細胞発生中に動的であることが明らかになります。例えば、赤血球前駆体で合成され、ヘモグロビン60,61,62の正しいフォールディングを監督する重要なシャペロンであるAHSP遺伝子は、赤芽球では潜在的に活性な調節要素(すなわち、H3K27acおよびH3K4me1富化領域)との相互作用の増加を示しますが、他の細胞型ではそうではありません(図4)。これは、liCHi-C法が希少細胞型における潜在的な調節相互作用を明らかにできることを示しています。
図1:超音波処理前のサンプルのプロトコルの概要と品質管理 。 (A)liCHi-Cプロトコルの概略図を日で割ったもの。Bと青い手はそれぞれ、ビオチン分子と、プロトコルを長期間安全に停止できるステップを表しています。(B)3C相互作用コントロールの代表的な結果。人間(左)とマウス(右)の両方のインタラクションセットが示されています。予想されるバンドは濃い青でマークされ、不特定のバンドは水色でマークされます。(C)ヒトインタラクションプライマー対「Dekker」を用いた代表的なフィルインおよびライゲーションコントロール。バンドは、NheIが追加されたレーン2と3でのみカットされます。(D)HindIII制限部位の充填および結紮中の新しいNheI制限部位の生成の概略図。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:キャプチャ前およびキャプチャ後のライブラリからの代表的な自動電気泳動プロファイル。 (A)キャプチャ直前のライブラリからの自動電気泳動プロファイル。得られたDNAの総量は994 ng(20 μL中49.7 ng / μL)です。(B)完成したliCHi-Cライブラリからの高感度自動電気泳動プロファイル。サンプルは、できるだけ多くの材料を保存するために半分希釈されてロードされます。得られたDNAの総量は61.2 ng(希釈分として20 μL x2中1.53 ng/μL)です。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:PCAによる代表的なHiCUPパイプライン出力とサンプルレプリケートクラスタリング 。 (A)パーセンテージと合計カウントによる読み取りペアの有効性の分類。無効な読み取りペアは、実験的なアーティファクトの種類によって下位分類されます。(B)重複排除の割合と相互作用タイプの分類。シス相互作用はさらに、シスクローズ(10 kb未満)およびシスファー(10 kb以上)に分類されます。(C)キャプチャ効率の割合。捕捉されたリードペアは、一方の端、他方、または両方に1つ以上のプロモーターが含まれているかどうかがさらに細分されます。(D)一般的な骨髄系前駆細胞(CMP)、赤芽球、巨核球、および単球からのliCHi-Cライブラリの両方の複製からのCHiCAGO有意な相互作用スコアの主成分分析。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:ヒト初代造血細胞におけるAHSP相互作用の状況。WashUエピゲノムブラウザ63に見られるような、一般的な骨髄系前駆細胞(CMP)、赤芽球(Ery)、巨核球(MK)、および単球(Mon)におけるAHSPプロモーター中心相互作用ランドスケープの代表例。円弧は重要な相互作用を表します。濃い青色の色合いはAHSP遺伝子プロモーターを示し、水色の色合いは赤芽球のAHSPプロモーターと特異的に相互作用する潜在的な活性調節要素と重なります。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
表1:緩衝液の組成および調製。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表2:PCRプライマーおよびアダプター配列。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表3:消化効率の計算例。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
liCHi-Cは、PCHi-Cと同様の実験フレームワークを使用して、細胞数を大幅に削減した高分解能プロモーターインタラクトームライブラリを生成する機能を提供します。これは、フェノール精製やビオチン除去などの不要なステップを排除することによって大きく達成されます。古典的な核内ライゲーションHi-Cプロトコル57 およびそれに続く派生技術PCHi-Cでは、ビオチンは、後で情報が得られないDNA断片を引き下げることを避けるために、非ライゲーション制限断片から除去されます。この部分とそれに続くDNA精製をスキップしても、有効なリードの割合が大幅に減少することはありません(図3A)が、DNA精製である潜在的なDNA浪費ステップが切り取られます。超音波処理後のHi-Cライブラリ調製物の再編成は、精製ステップ自体として両面選択を使用することにより、さらに別の不要な精製をスキップすることを可能にする。これらすべてが、最小限のチューブ交換を採用することでプロトコル全体の性能を向上させ、反応量の減少、試薬濃度の変化、およびDNA低結合プラスチック器具の使用とともに、わずか50,000細胞を使用して高品質のライブラリを生成することができます。開始細胞数は、ライブラリの複雑さのために重要な相互作用の数を部分的に決定することを覚えておくことが重要です。50,000個の細胞で生成されたライブラリは、より複雑なライブラリ53の細胞型特異的で不変なトポロジカル特徴を保持していますが、可能であれば、より多くの重要なプロモーター相互作用を捕捉するために、生物学的複製ごとに100,000個を超える細胞を使用することをお勧めします。
3C技術で検出される相互作用の分解能は、基本的に使用される制限酵素によって与えられます。ここでは、理論平均分解能4,096 bpを与える6 bp切断酵素であるHindIIIを使用してliCHi-Cの適用について説明します。 liCHi-Cは、制限酵素を、例えば、4 bp切断酵素またはミクロコッカスヌクレアーゼに置換することを可能にし、したがって、検出される有意な相互作用の分離を増加させる。LiCHi-Cライブラリの生成は、HindIII制限酵素を4 bp切断MboI酵素に切り替え、検出された相互作用の平均直線距離が距離の半分にシフトしているにもかかわらず、総相互作用のほぼ2倍を検出する優れた結果をもたらすことが報告されています53。
実際のRNAプローブ濃縮システムに関して、HiChIP32やHiCuT33などの抗体ベースのものよりもこのタイプのキャプチャを使用する主な利点の1つは、タンパク質の結合とは無関係に条件を比較できること、および目的のタンパク質の有効な抗体の可用性に依存する必要がないことです。さらに、RNA濃縮システムは、各研究者のニーズに合わせてゲノム全体の任意の特定の領域を捕捉するように調整することができる(設計は35,64で議論されている)。
抗体ベースの捕捉法に加えて、3Dゲノム構造を調べるためのいくつかの優れたシングルセル法(scHi-C 65、Dip-C66、またはSci-Hi-C67など)または低入力法(Low-C 68またはEasyHi-C 69など)が近年開発されています。しかし、これらは低解像度のスパースコンタクトマップを生成するため、遠位調節要素と標的遺伝子の間の接触を同定することはできません。liCHi-Cは、この限界を克服することができる方法であり、希少な細胞種におけるプロモーター中心のゲノム構造を研究する可能性を開き、細胞および発生生物学および疾患発生の理解を深める機会を提供します。
そのすべての機能にもかかわらず、liCHi-Cは制限を免除されていません。まず、生のシーケンスデータの処理は簡単ではなく、データを分析して結果を解釈するには公正な計算スキルが必要です。さらに、liCHi-Cは機能的相互作用と構造的相互作用を区別しません。liCHi-Cデータをエピジェネティックデータおよび/または機能解析と統合して、遺伝子プロモーターとその標的調節要素との潜在的な機能的相互作用を検証する必要があります。最後に、細胞番号の下端で作業する場合、ライブラリの複雑さが犠牲になります。これは、細胞数の多いliCHi-Cライブラリと比較して検出された固有の相互作用の量と、最大80%に達する可能性のあるそれらの重複排除率に反映されています。しかし、低細胞数のliCHi-Cライブラリは、より焦点的な方法で高細胞数のライブラリのトポロジカルな特徴を保持しており53、わずか50,000個の細胞で細胞のプロモーター相互作用を再現するliCHi-Cライブラリを実行可能であることを示しています。
全体として、liCHi-Cは、希少な細胞タイプで高品質で高解像度のプロモーターインタラクトームライブラリを生成するための費用効果が高くカスタマイズ可能な方法です。これは、プロモーターの相互作用をマッピングし、制限フラグメントの分解能で有意なループを呼び出す最初の低インプットメソッドです。この新しいツールは、その前身であるPCHi-Cとして、健康と病気の両方における細胞分化と生物発生における新しい洞察を提供すると予測しています。
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Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
原稿に対するフィードバックを提供してくれたハビエールラボの他のメンバーに感謝します。我々は、CERCAプログラム、カタルーニャ州政府、及びジョセップ・カレーラス財団の制度的支援に感謝する。この研究は、FEDER/スペイン科学イノベーション省(RTI2018-094788-A-I00)、欧州血液学会(4823998)、およびスペインがん協会(AECC)LABAE21981JAVIによって資金提供されました。BMJはラカイシャ銀行財団ジュニアリーダープロジェクト(LCF/BQ/PI19/11690001)から資金提供を受け、LRはAGAUR FIフェローシップ(2019FI-B00017)から資金提供を受け、LT-DはFPIフェローシップ(PRE2019-088005)から資金提供されています。バルセロナ自治大学の生化学および分子生物学博士課程の支援に感謝します。資金提供者の誰も、実験計画や原稿の執筆には関与していませんでした。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4 mM Biotin-14-dATP | Invitrogen | 19524-016 | |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Invitrogen | AM9260G | |
| 1 M Tris pH 8.0 | Invitrogen | AM9855G | |
| 10x NEBuffer 2 | New England Biolabs | B7002S | Referenced as restriction buffer 2 in the manuscript |
| 10x PBS | Fisher Scientific | BP3994 | |
| 10x T4 DNA ligase reaction buffer | New England Biolabs | B0202S | |
| 16% formaldehyde solution (w/v), methanol-free | Thermo Scientific | 28908 | |
| 20 mg/mL Bovine Serum Albumin | New England Biolabs | B9000S | |
| 5 M NaCl | Invitrogen | AM9760G | |
| 5PRIME Phase Lock Gel Light tubes | Qiuantabio | 2302820 | For phenol-chloroform purification in section 4 (DNA purification). Phase Lock Gel tubes are a commercial type of tubes specially designed to maximize DNA recovery after phenol-chloroform purifications while avoiding carryover of contaminants in the organic phase by containing a resin of intermediate density which settles between the organic and aqueous phase and isolates them. PLG tubes should be spun at 12,000 x g for 30 s before use to ensure that the resin is well-placed at the bottom of the tube |
| Adapters and PCR primers for library amplification | Integrated DNA Technologies | - | Bought as individual primers with PAGE purification for NGS |
| Cell scrappers | Nunc | 179693 | Or any other brand |
| Centrifuge (fixed-angle rotor for 1.5 mL tubes) | Any brand | ||
| CHiCAGO R package | 1.14.0 | ||
| CleanNGS beads | CleanNA | CNGS-0050 | |
| dATP, dCTP, dGTP, dTTP | Promega | U120A, U121A, U122A, U123A | Or any other brand |
| DNA LoBind tube, 1.5 mL | Eppendorf | 30108051 | |
| DNA LoBind tube, 2 mL | Eppendorf | 30108078 | |
| DNA polymerase I large (Klenow) fragment 5000 units/mL | New England Biolabs | M0210L | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 beads | Invitrogen | 65002 | For biotin pull-down of the pre-captured library in section 8 (biotin pull-down) |
| Dynabeads MyOne Streptavidin T1 beads | Invitrogen | 65602 | For biotin pull-down of the post-captured library in section 11 (biotin pull-down and PCR amplification) |
| DynaMag-2 | Invitrogen | 12321D | Or any other magnet suitable for 1.5 ml tubeL |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.321 | |
| FBS, qualified | Gibco | 10270-106 | Or any other brand |
| Glycine | Fisher BioReagents | BP381-1 | |
| GlycoBlue Coprecipitant | Invitrogen | AM9515 | Used for DNA coprecipitation in section 4 (DNA purification) |
| HiCUP | 0.8.2 | ||
| HindIII, 100 U/µL | New England Biolabs | R0104T | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I8896-50ML | |
| Klenow EXO- 5000 units/mL | New England Biolabs | M0212L | |
| Low-retention filter tips (10 µL, 20 µL, 200 µL and 1000 µL) | ZeroTip | PMT233010, PMT252020, PMT231200, PMT252000 | |
| M220 Focused-ultrasonicator | Covaris | 500295 | |
| Micro TUBE AFA Fiber Pre-slit snap cap 6 x 16 mm vials | Covaris | 520045 | For sonication in section 6 (sonication) |
| NheI-HF, 100 U/µL | New England Biolabs | R3131M | |
| Nuclease-free molecular biology grade water | Sigma-Aldrich | W4502 | |
| PCR primers for quality controls | Integrated DNA Technologies | - | |
| PCR strips and caps | Agilent Technologies | 410022, 401425 | |
| Phenol: Chloroform: Isoamyl Alcohol 25:24:1, Saturated with 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA | Sigma-Aldrich | P3803 | |
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | New England Biolabs | M0531L | For amplification of the library in sections 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification) and 11 (biotin pull-down and PCR amplification) |
| Protease inhibitor cocktail (EDTA-free) | Roche | 11873580001 | |
| Proteinase K, recombinant, PCR grade | Roche | 3115836001 | |
| Qubit 1x dsDNA High Sensitivity kit | Invitrogen | Q33230 | For DNA quantification after precipitation in section 4 (DNA purification) |
| Qubit assay tubes | Invitrogen | Q32856 | |
| rCutsmart buffer | New England Biolabs | B6004S | |
| RPMI Medium 1640 1x + GlutaMAX | Gibco | 61870-010 | Or any other brand |
| SDS - Solution 10% for molecular biology | PanReac AppliChem | A0676 | |
| Sodium acetate pH 5.2 | Sigma-Aldrich | S7899-100ML | |
| SureSelect custom 3-5.9 Mb library | Agilent Technologies | 5190-4831 | Custom designed mouse or human capture system, used for the capture |
| SureSelect Target Enrichment Box 1 | Agilent Technologies | 5190-8645 | Used for the capture |
| SureSelect Target Enrichment Kit ILM PE Full Adapter | Agilent Technologies | 931107 | Used for the capture |
| T4 DNA ligase 1 U/µL | Invitrogen | 15224025 | For ligation in section 3 (ligation and decrosslink) |
| T4 DNA ligase 2000000/mL | New England Biolabs | M0202T | For ligation in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification) |
| T4 DNA polymerase 3000 units/mL | New England Biolabs | M0203L | |
| T4 PNK 10000 units/mL | New England Biolabs | M0201L | |
| Tapestation 4200 instrument | Agilent Technologies | For automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and section 11 (Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid |
|
| Tapestation reagents | Agilent Technologies | 5067-5582, 5067-5583, 5067-5584, 5067-5585, | For automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and section 11 (Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid |
| Triton X-100 for molecular biology | PanReac AppliChem | A4975 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML |
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