Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

זרימת עבודה משולבת לחקר ארכיטקטורת הגנום המרחבי-זמני הממוקדת במקדם באוכלוסיות תאים נדירות

Published: April 21, 2023 doi: 10.3791/65316
Automatic Translation
*1, *1,2, 1, 2,3, 1,4
1Josep Carreras Leukaemia Research Institute, 2Barcelona Supercomputing Center, 3Catalan Institution for Research and Advanced Studies (ICREA), 4Institute for Health Science Research Germans Trias i Pujol
* These authors contributed equally

Summary

ביטוי גנים מוסדר על ידי אינטראקציות של מקדמי גנים עם אלמנטים רגולטוריים דיסטליים. כאן, אנו מסבירים עד כמה קלט נמוך Capture Hi-C (liCHi-C) מאפשר לזהות אינטראקציות אלה בסוגי תאים נדירים, שבעבר לא היו ניתנים למדידה.

Abstract

שעתוק גנים מרחבי-זמני מוסדר באופן הדוק על ידי אלמנטים רגולטוריים דיסטליים, כגון משפרים ומשתיקי קול, המסתמכים על קרבה פיזית עם מקדמי גני המטרה שלהם כדי לשלוט בשעתוק. למרות שקל לזהות אלמנטים רגולטוריים אלה, קשה לחזות את גני המטרה שלהם, שכן רובם ספציפיים לסוג התא וניתן להפריד אותם על ידי מאות קילו-בסיסים ברצף הגנום הליניארי, תוך דילוג על גנים אחרים שאינם מטרה. במשך מספר שנים, Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) היה תקן הזהב לשיוך של אלמנטים רגולטוריים דיסטליים לגני המטרה שלהם. עם זאת, PCHi-C מסתמך על זמינותם של מיליוני תאים, ואוסר על מחקר של אוכלוסיות תאים נדירות כגון אלה המתקבלות בדרך כלל מרקמות ראשוניות. כדי להתגבר על מגבלה זו, פותחה Capture Hi-C (liCHi-C), שיטה חסכונית וניתנת להתאמה אישית לזיהוי רפרטואר של אלמנטים רגולטוריים דיסטליים השולטים בכל גן בגנום. liCHi-C מסתמך על מסגרת ניסויית וחישובית דומה לזו של PCHi-C, אך על ידי שימוש בשינויים מינימליים בצינור, שינוי ריכוז המגיב ונפחי הריאגנטים, והחלפה או ביטול שלבים, הוא אחראי לאובדן חומרים מינימלי במהלך בניית הספרייה. באופן קולקטיבי, liCHi-C מאפשר לחקור את בקרת הגנים ואת ארגון הגנום המרחבי-זמני בהקשר של ביולוגיה התפתחותית ותפקוד תאי.

Introduction

ביטוי גנים זמני מניע התמיינות תאים, ובסופו של דבר, התפתחות אורגניזם, והשינוי שלו קשור קשר הדוק למגוון רחב של מחלות 1,2,3,4,5. שעתוק גנים מוסדר היטב על ידי פעולתם של אלמנטים רגולטוריים, אשר יכולים להיות מסווגים כפרוקסימליים (כלומר, מקדמי גנים) ודיסטליים (למשל, משפרים או משתיקי קול), אשר האחרונים ממוקמים לעתים קרובות הרחק מגני המטרה שלהם ומתקשרים איתם פיזית באמצעות לולאת כרומטין כדי לווסת ביטוי גנים 6,7,8.

זיהוי אזורי הבקרה הדיסטליים בגנום הוא עניין המוסכם על כולם, שכן אזורים אלה מכילים שינויים ספציפיים בהיסטון 9,10,11 ומכילים מוטיבים ספציפיים של זיהוי גורמי שעתוק, המשמשים כפלטפורמות גיוס עבורם12,13,14. חוץ מזה, במקרה של משפרים ומשפרי על 15,16, יש להם גם תפוסה נמוכה של נוקלאוזומים 17,18 והם משועתקים ל-eRNA לא מקודד 19,20.

עם זאת, קשה יותר לחזות את גני המטרה של כל אלמנט ויסטלי דיסטלי. לעתים קרובות יותר, אינטראקציות בין אלמנטים רגולטוריים דיסטליים לבין המטרות שלהם הן סוג תא וגירוי ספציפיים 21,22, משתרעים על פני מאות קילו-בסיסים, מגשרים על גנים אחרים לכל כיוון 23,24,25, ואפילו יכולים להיות ממוקמים בתוך אזורים אינטרוניים של גן המטרה שלהם או גנים אחרים שאינם מתערבים 26,27. יתר על כן, אלמנטים רגולטוריים דיסטליים יכולים גם לשלוט ביותר מגן אחד בו זמנית, ולהיפך28,29. מורכבות מיקום זו מעכבת איתור קשרים רגולטוריים ביניהם, ולכן רוב המטרות של כל אלמנט רגולטורי בכל סוג תא נותרות בלתי ידועות.

בשנים האחרונות חלה פריחה משמעותית בפיתוח טכניקות לכידת קונפורמציה של כרומוזומים (3C) לחקר אינטראקציות כרומטין. השימוש הנפוץ ביותר בהם, Hi-C, מאפשר ליצור מפה של כל האינטראקציות בין כל קטע של גנוםהתא 30. עם זאת, כדי לזהות אינטראקציות משמעותיות ברמת מקטע ההגבלה, Hi-C מסתמך על ריצוף עמוק במיוחד, ואוסר על השימוש בו כדי לחקור באופן שגרתי את הנוף הרגולטורי של גנים בודדים. כדי להתגבר על מגבלה כלכלית זו, התפתחו מספר טכניקות 3C מבוססות העשרה, כגון ChIA-PET31, HiChIP 32, ומקבילו בעל הקלט הנמוך HiCuT33. טכניקות אלה תלויות בשימוש בנוגדנים להעשרה לאינטראקציות כלל-גנומיות המתווכות על ידי חלבון מסוים. עם זאת, התכונה הייחודית של טכניקות 3C אלה היא גם הנזק של היישום שלהם; המשתמשים סומכים על זמינותם של נוגדנים איכותיים לחלבון המעניין ואינם יכולים להשוות בין מצבים בהם קשירת החלבון היא דינמית.

Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) היא טכניקת 3C מבוססת העשרה נוספת העוקפת מגבלות אלה34,35. על ידי שימוש במערכת העשרת גשושיות RNA ביוטינילציה, PCHi-C מסוגל ליצור ספריות ברזולוציה גבוהה של אזורים גנומיים ברחבי הגנום המקיימות אינטראקציה עם 28,650 מקדמי גנים מבוארים לבני אדם או 27,595 עכברים, הידועים גם בשם אינטראקטום מקדם. גישה זו מאפשרת לזהות אינטראקציות ארוכות טווח משמעותיות ברזולוציית מקטע ההגבלה של מקדמים פעילים ולא פעילים כאחד, ולהשוות באופן יציב אינטראקטומים של מקדמים בין כל תנאי שאינו תלוי בדינמיקה של שינויים בהיסטון או קשירת חלבונים. PCHi-C נמצא בשימוש נרחב בשנים האחרונות כדי לזהות ארגון מחדש של אינטראקטומים במהלך התמיינות תאים 36,37, לזהות את מנגנון הפעולה של גורמי שעתוק38,39, ולגלות גנים ומסלולים פוטנציאליים חדשים שעברו דה-רגולציה במחלה על ידי וריאנטים לא מקודדים 40,41,42,43,44,45,46,47,48, לצד מוטציות לא מקודדות של נהגים חדשים49,50. חוץ מזה, רק על ידי שינוי מערכת לכידה, טכניקה זו יכולה להיות מותאמת אישית על פי השאלה הביולוגית לחקור כל interactome (למשל, interactome משפר 51 או interactome של אוסף של שינויים שאינם קידוד41,52).

עם זאת, PCHi-C מסתמך על מינימום של 20 מיליון תאים כדי לבצע את הטכניקה, אשר מונעת מחקר של אוכלוסיות תאים נדירות כגון אלה המשמשים לעתים קרובות ביולוגיה התפתחותית ויישומים קליניים. מסיבה זו, פיתחנו קלט נמוך Capture Hi-C (liCHi-C), שיטה חדשה חסכונית וניתנת להתאמה אישית המבוססת על מסגרת הניסוי של PCHi-C ליצירת אינטראקטומים מקדמים ברזולוציה גבוהה עם קלט תאים נמוך. על ידי ביצוע הניסוי עם שינויים מינימליים בצינור, החלפה או ביטול של צעדים מפרוטוקול PCHi-C המקורי, הפחתה דרסטית של נפחי התגובה ושינוי ריכוזי ריאגנטים, מורכבות הספרייה היא מקסימלית וניתן ליצור ספריות באיכות גבוהה עם מעט כמו 50,000 תאים53.

לכידת קלט נמוך Hi-C (liCHi-C) נבדקה כנגד PCHi-C ושימשה להבהרת חיווט מחדש של אינטראקטום מקדם במהלך התמיינות תאים המטופויטיים אנושיים, גילוי גנים ומסלולים פוטנציאליים חדשים הקשורים למחלות שאינם מוסדרים על ידי שינויים שאינם מקודדים, וזיהוי הפרעות כרומוזומליות53. פרוטוקול שלב אחר שלב ובקרות האיכות השונות באמצעות הטכניקה מפורטים כאן עד לדור הסופי של הספריות והניתוח החישובי שלהן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כדי להבטיח אובדן חומרים מינימלי, (1) עבוד עם צינורות וקצוות DNA בעלי קישור נמוך (ראה טבלת חומרים), (2) מקם ריאגנטים על דופן הצינור במקום להכניס את הקצה לתוך הדגימה, ו-(3) אם אפשר, ערבב את הדגימה על ידי היפוך במקום להציף את הדגימה למעלה ולמטה, והסתובב למטה לאחר מכן כדי לשחזר את הדגימה.

1. קיבוע תאים

  1. תאים הגדלים בתרחיף
    1. קצרו 50,000 עד מיליון תאים והכניסו אותם לצינור DNA בעל קישור נמוך של 1.5 מ"ל.
      הערה: סוגי התאים המשמשים למחקר הנוכחי מפורטים בסעיף התוצאות המייצגות.
    2. צנטריפוגה את התאים למשך 5 דקות ב 600 x גרם (ב 4 ° C) באמצעות צנטריפוגת רוטור זווית קבועה ולהסיר את supernatant על ידי pipetting.
    3. יש להשהות מחדש את התאים ב-1 מ"ל של RPMI 1640 בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי (FBS) בטמפרטורת החדר.
    4. מוסיפים 143 μL של פורמלדהיד 16% ללא מתנול כדי להגיע לריכוז של 2% ומערבבים.
    5. דוגרים על התאים במשך 10 דקות תוך כדי סיבוב בטמפרטורת החדר כדי לתקן את התאים.
      הערה: נסה להיות מדויק ככל האפשר עם הדגירה של 10 דקות. קיבוע יתר או חסר של התאים עלול להוביל לירידה באיכות הספרייה.
    6. להרוות את התגובה על ידי הוספת 164 μL של גליצין 1M קר כקרח ולערבב. דוגרים על התאים במשך 5 דקות, מסתובבים בטמפרטורת החדר.
    7. עוד לדגור את התאים במשך 15 דקות על קרח, ערבוב על ידי היפוך כל ~ 5 דקות.
    8. צנטריפוגה את התאים למשך 10 דקות ב 1,000 x גרם (ב 4 ° C) באמצעות צנטריפוגת רוטור זווית קבועה ולהסיר את supernatant.
    9. שטפו את התאים על ידי השעיית הגלולה ב-1 מ"ל של מלח חוצץ פוספט 1x קר כקרח (PBS).
    10. צנטריפוגו את התאים למשך 10 דקות במהירות של 1,000 x גרם (ב-4°C) והוציאו את הסופרנטנט.
      הערה: ניתן להקפיא את התאים הכדוריים בחנקן נוזלי או בקרח יבש ולאחסן אותם בטמפרטורה של -80°C.
  2. תאים דבקים
    1. לשטוף את התאים בצלחת תרבית עם 1x PBS.
    2. הכינו מספיק RPMI 1640 בתוספת 10% FBS ופורמלדהיד 2% ללא מתנול בטמפרטורת החדר כדי לכסות את צלחת התרבית.
    3. מוסיפים את תוספת המדיה לצלחת התרבית עם התאים ודגרים במשך 10 דקות, מתנדנדים בטמפרטורת החדר כדי לתקן את התאים.
      הערה: נסה להיות מדויק ככל האפשר עם הדגירה של 10 דקות. קיבוע יתר או חסר של התאים עלול להוביל לירידה באיכות הספרייה.
    4. להרוות את התגובה על ידי הוספת 1 M גליצין עד 0.125 M ולערבב על ידי נדנדה.
    5. דוגרים על התאים במשך 5 דקות, מתנדנדים בטמפרטורת החדר.
    6. עוד לדגור את התאים במשך 15 דקות ב 4 ° C, ערבוב על ידי נדנוד כל 3-4 דקות.
    7. הסר את המדיה ושטוף את התאים עם קר 1x PBS.
    8. מגרדים את התאים ומעבירים אותם לצינור DNA בעל קישור נמוך של 1.5 מ"ל. נגבו את צלחת התרבית עם 0.5-1 מ"ל של PBS 1x קר.
    9. צנטריפוגה את התאים למשך 10 דקות ב 1,000 x גרם (ב 4 ° C) באמצעות צנטריפוגת רוטור זווית קבועה ולהסיר את supernatant. התאים הכדוריים יכולים להיות מוקפאים במהירות הבזק בחנקן נוזלי או קרח יבש ומאוחסנים ב -80 מעלות צלזיוס.

2. ליזה ועיכול

  1. השהה מחדש את התאים ב-1 מ"ל של חיץ ליזה קר (טבלה 1) כדי לשבש את קרום התא. תוספת המאגר לבדה אמורה להספיק כדי להשעות מחדש את התאים, אך ניתן להשהות אותם מחדש במידת הצורך על ידי מערבולות אור.
  2. דוגרים על קרח במשך 30 דקות, מערבבים על ידי היפוך כל ~ 5 דקות. צנטריפוגו את הגרעינים למשך 10 דקות במהירות של 1,000 x גרם (ב-4°C) והוציאו את הסופר-נטנט. השהה מחדש את הגרעינים עם 500 μL של חיץ הגבלה קר 1.25x 2 (ראה טבלת חומרים).
  3. צנטריפוגו את הגרעינים למשך 10 דקות במהירות של 1,000 x גרם (ב-4°C) והוציאו את הסופר-נטנט. השהה מחדש את הגרעינים ב 179 μL של 1.25x חיץ הגבלה 2.
  4. הוסיפו 5.5 מיקרוליטר של 10% נתרן דודציל סולפט (SDS; ראו טבלת חומרים) וערבבו. התאים עשויים ליצור גושים; זה נורמלי וצריך לפרק אותו ככל האפשר על ידי מערבולת. לדגור על הדגימה במשך שעה אחת ב 37 ° C thermoblock, עם רעד ב 950 סל"ד.
  5. להרוות את SDS על ידי הוספת 37.5 μL של 10% Triton X-100 ולערבב. לדגור על הדגימה במשך שעה אחת ב 37 ° C thermoblock, עם רעד ב 950 סל"ד.
  6. לעכל את הכרומטין על ידי הוספת 7.5 μL של HindIII (100 U/μL; ראה טבלה של חומרים) ולערבב. יש לדגור על הדגימה למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בתרמו-בלוק, עם רעידות ב-950 סל"ד.
  7. למחרת בבוקר, הוסיפו עוד 2.5 μL של HindIII (100 U/μL) והמשיכו לדגור על הדגימה במשך שעה אחת ב-37°C בתרמו-בלוק, עם רעידות ב-950 סל"ד כדי להבטיח עיכול כרומטין תקין.
    הערה: כחלק מבקרות יעילות העיכול (ראה שלב 5.1), העבר את המקבילה של 20,000 עד 40,000 גרעינים לצינור אחר כדי לייצג את הבקרה הלא מעוכלת. לאחר העיכול, להעביר את אותו מספר של תאים לצינור אחר שוב כדי לייצג את הבקרה מעוכל. מומלץ לבדוק את יעילות העיכול כניסוי נפרד אם זמינות חומר המוצא מועטה.

3. קשירה ו decrosslinking

  1. מצננים את הדגימה על קרח. הכינו מאסטרמיקס והוסיפו את הריאגנטים הבאים כדי למלא ולבצע ביוטינילציה של מקטע ההגבלה: 3 μL של 10x restriction buffer 2, 1 μL של מים נטולי נוקלאז, 0.75 μL של 10 mM dCTP, 0.75 μL של 10 mM dTTP, 0.75 μL של 10 mM dGTP, 18.75 μL של 0.4 mM biotin-14-dATP, ו-5 μL של 5 U/μL Klenow (ראה טבלת חומרים). לדגור על הדגימה במשך 75 דקות ב 37 ° C, ערבוב על ידי היפוך כל ~ 15 דקות.
  2. מצננים את הדגימה על קרח. הכינו מאסטרמיקס והוסיפו את הריאגנטים הבאים כדי לקשור את קצוות הדנ"א שמולאו: 50 μL של 10x חיץ קשירה, 2.5 μL של אלבומין בסרום בקר (BSA) של 20 מ"ג/מ"ל, 12.5 μL של 1 U/μL T4 DNA ligase, ו-173 μL של מים נטולי נוקלאז (ראו טבלת חומרים).
  3. לדגור על הדגימה במשך 4-6 שעות ב 16 ° C, ערבוב על ידי היפוך כל ~ 1 שעות. יתר על כן, לדגור את הדגימה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. צלבו את הכרומטין על ידי הוספת 30 μL של 10 מ"ג/מ"ל פרוטאינאז K וערבבו. לדגור את הדגימה לילה ב 65 ° C.
  4. למחרת בבוקר, הוסף 15 μL נוסף של 10 מ"ג / מ"ל פרוטאינאז K ולדגור עוד יותר את הדגימה במשך 2 שעות ב 65 ° C כדי להבטיח decrosslinking כרומטין תקין.

4. טיהור DNA

  1. מצננים את הדגימה לטמפרטורת החדר ומעבירים אותה לצינורית מתאימה לטיהור פנול-כלורופורם.
  2. הוסף נפח 1 (545 μL) של פנול:כלורופורם:איזואמיל אלכוהול (25:24:1) כדי לטהר את הדנ"א ולערבב על ידי ניעור נמרץ.
  3. צנטריפוגו את הדגימה למשך 5 דקות במהירות של 12,000 x גרם בטמפרטורת החדר והעבירו את הפאזה המימית העליונה (545 μL) לצינור DNA בעל קישור נמוך של 2 מ"ל.
  4. הוסף את הריאגנטים הבאים כדי לזרז את ה- DNA: 1,362.5 μL של 100% אתנול מקורר ל -20 ° C, 54.5 μL של 3 M נתרן אצטט (pH 5.2), ו 2 μL של 15 מ"ג / מ"ל גליקוגן כמו cocipitant.
  5. לדגור במשך שעה אחת ב -80 ° C או לילה ב -20 ° C.
  6. צנטריפוגו את הדגימה למשך 30 דקות בטמפרטורה של 16,000-21,000 x גרם ב-4°C והוציאו את הסופרנטנט. גלולת הדנ"א חייבת להיות גלויה.
  7. שטפו את הגלולה על ידי הוספת 1 מ"ל של 70% אתנול, מערבולות וצנטריפוגות במשך 10 דקות בטמפרטורה של 16,000-21,000 x גרם בטמפרטורת החדר.
  8. מוציאים את הסופרנאטנט ונותנים לגלולה להתייבש באוויר. השהה מחדש את גלולת הדנ"א ב 130 מיקרוליטר של מים נטולי נוקלאז.
  9. להעריך את הריכוז על ידי כימות פלואורומטרי (ראה טבלת חומרים). אחסן את חומר 3C המטוהר ב -20 ° C במשך מספר חודשים לפני שתמשיך עם הפרוטוקול.

5. בקרות איכות אופציונליות

  1. להעריך את יעילות העיכול. בצע decrosslinking ו phenol:chloroform טיהור DNA, כפי שתואר קודם לכן, לבקרות מעוכלות ומעוכלות שהתקבלו בשלב 2.13. השהה מחדש את גלולת הדנ"א ב -10 מיקרוליטר של מים נטולי נוקלאז. לכמת את הריכוז ולדלל את הדנ"א המתקבל, במידת הצורך, ל 4 ng / μL.
  2. בצע PCR כמותי עם 4 ננוגרם של דנ"א הן של הביקורת הלא מעוכלת והן של קבוצת הביקורת המעוכלת, עם פריימרים המתפרשים על פני מוקד כרומטין פתוח עם וללא מטרה הינדית (ראה טבלה 2 לתכנון פריימר). חישוב יעילות העיכול בעקבות דוח שפורסם בעבר35.
    הערה: יעילות הקשירה מחושבת כאחוז באמצעות הנוסחה: עיכול (%) = 100 -100/(2^[(Ct מעוכל עם HindIII - Ctdigested ללא HindIII) - (Ct undigested with HindIII - Ct undigested without HindIII)]) (ראה טבלה 3), אשר לוקח בחשבון את ההבדל בין Cts שונים המתקבלים עבור כל זוג פריימר בבקרות לא מעוכלות ומעוכלות.
  3. הערך את הרגישות של זיהוי האינטראקציה על ידי ביצוע תגובת שרשרת פולימראז קונבנציונלית (PCR) (0.2 mM dNTP, 0.4 מיקרומטר הן פריימרים F + R, 0.1 ו- U/μL התחלה חמה פולימראז), עם פריימרים המשתרעים על אינטראקציות ארוכות טווח וקצרות טווח של תאים אינווריאנטיים (ראה טבלה 2 לתכנון פריימר). יש להשתמש ב-50-100 ננוגרם של חומר 3C (לאינטראקציות קצרות וארוכות, בהתאמה) ולהגביר באמצעות התנאים הבאים: 98°C למשך 15 דקות, ולאחר מכן 37°C למשך 98°C למשך 30 שניות, 60°C למשך דקה אחת, 72°C למשך דקה אחת, וסיימו ב-72°C למשך 10 דקות. החזק בטמפרטורה של 4°C.
    הערה: אם כמות הדנ"א המתקבלת קטנה מ-2 מיקרוגרם, בדוק רק אינטראקציה לטווח ארוך וקצר במקום את כל לוח האינטראקציה.
  4. הפעל את המוצר על 1x tris-borate-EDTA (TBE) באמצעות 1.6% ג'ל agarose ולחפש את נוכחותו של אמפליקון PCRהמתאים 54.
    הערה: בשל "חיתוך והדבקה" בלתי צפוי של הגנום, להקות לא ספציפיות עשויות להופיע. כל עוד גודל הרצועה הנכון נצפה, הוא נחשב כנכון.
  5. להעריך את היעילות של מילוי וקשירת ביוטין על ידי עיכול דיפרנציאלי של מוצר PCR לטווח קצר עם HindIII, NheI (ראה טבלת חומרים), אנזימים או אף אחד (מים), והפעלת המוצר על ג'ל אגרוז 1x TBE 1.6%. מילוי וקשירה נכונים מבטלים את יעד HindIII הקודם ויוצרים יעד NheI חדש, ולכן יש לחתוך את האמפליקון רק בנוכחות NheI.
    הערה: כדי למזער אובדן חומרים, אחזר 2.5 μL של מוצר PCR לטווח קצר מפקדי האינטראקציה והגבר אותו מחדש חמש פעמים כדי לבצע את בקרות המילוי והקשירה.

6. סוניקציה

  1. מעבירים את 130 μL של הדגימה (ממלאים במים נטולי נוקלאז אם חלקם שימשו לבקרות) לקובט המתאים לסניקציה.
  2. הגדר סוניקטור אמבט מים וסוניק באמצעות הפרמטרים הבאים (מותאם לדגם ולקוביות המתוארים בטבלת החומרים): מקדם חובה: 20%; שיא הספק התחלואה: 50; מחזורים לפרץ: 200; זמן: 65 שניות; וטווח טמפרטורות: 6-10 °C (8 °C אופטימלי).
  3. העבירו את הדגימה לצינור DNA חדש בעל קשירה נמוכה של 1.5 מ"ל.

7. תיקון סופי

  1. הכינו מאסטרמיקס והוסיפו את הריאגנטים הבאים כדי לתקן את הקצוות הלא אחידים של מקטעי הדנ"א שנוצרו במהלך הסוניקציה: 18 μL של חיץ קשירה 10x, 18 μL של תערובת dNTP של 2.5 mM כל אחד, 6.5 μL של 3 U/μL T4 DNA פולימראז, 6.5 μL של 10 U/μL T4 PNK, ו-1.3 μL של 5 U/μL Klenow (ראו טבלת חומרים).
  2. יש לדגור על הדגימה במשך 30 דקות בטמפרטורה של 20°C ולמלא אותה במאגר Tris-low EDTA (TLE) (ראו טבלה 1) עד 300 μL.

8. הורדת ביוטין

  1. מעבירים 150 μL של חרוזי סטרפטווידין C1 (ראו טבלת חומרים) לכל דגימה לצינור של 1.5 מ"ל, מניחים אותם על מגנט צינור של 1.5 מ"ל, וממתינים 2-3 דקות או עד שכל החרוזים נדבקים לקיר. הסר את supernatant, משאיר את החרוזים מאחור.
  2. שטפו את החרוזים עם 400 μL של חיץ טווין 1x (שחפת; ראו טבלה 1). כדי לשטוף את החרוזים, להוסיף את החיץ ולהשהות אותם מחדש על ידי מערבולות רכות. מחזירים את הצינור למגנט וממתינים 2-3 דקות או עד שכל החרוזים נדבקים לקיר. הסר את supernatant, משאיר את החרוזים מאחור.
  3. שטפו את החרוזים עם 300 μL של 1x ללא חיץ Tween (NTB; ראו טבלה 1). השהה מחדש את החרוזים ב-300 μL של 2x NTB (ראה טבלה 1).
    הערה: החרוזים עלולים ליצור שכבה מאובקת סביב דופן הצינור בעת שטיפה עם חוצצים ללא חומר ניקוי. זה נורמלי ולא משפיע על התוצאה של הפרוטוקול.
  4. שלב 300 μL זה של חרוזים ב 2x NTB עם 300 μL של הדגימה. דוגרים במשך 15 דקות, מסתובבים בטמפרטורת החדר כדי למשוך למטה את מקטעי הדנ"א האינפורמטיביים עם ביוטין. הספרייה דבוקה כעת לחרוזי סטרפטווידין C1.
  5. שטפו את החרוזים עם 400 μL של 1x NTB. שטפו את החרוזים עם 100 μL של חיץ TLE ולאחר מכן השעו אותם מחדש ב-35.7 μL של חיץ TLE.

9. זנב dATP, קשירת מתאם והגברת PCR

  1. הכינו מאסטרמיקס והוסיפו את הריאגנטים הבאים לדגימה לזנב dATP בקצות מקטעי הדנ"א המתוקנים: 5 μL של 10x חיץ הגבלה 2, 2.3 μL של 10 mM dATP, ו-7 μL של 5 U/μL Klenow exo-. לדגור את הדגימה במשך 30 דקות ב 37 ° C.
  2. השבתת Klenow exo- על ידי דגירה נוספת של הדגימה למשך 10 דקות ב 65 ° C. מצננים את הדגימה על קרח. שטפו את החרוזים עם 300 μL של 1x TB. שטפו את החרוזים עם 300 μL של 1x NTB.
  3. שטפו את החרוזים עם 100 μL של 1x חיץ קשירה ולאחר מכן השהו אותם מחדש ב 50 μL של 1x חיץ קשירה. הוסף 4 μL של 15 μM תערובת מתאם מראש (ראה טבלה 2) ו- 1 μL של 2,000 U/μL T4 DNA ligase (ראה טבלת חומרים) לדגימה.
  4. יש לדגור במשך שעתיים בטמפרטורת החדר. שטפו את החרוזים עם 400 μL של 1x TB. לשטוף את החרוזים עם 200 μL של 1x NTB. לשטוף את החרוזים עם 100 μl של 1x חיץ הגבלה 2.
  5. שטפו את החרוזים עם 50 μL של 1x restriction buffer 2 ולאחר מכן השעו אותם מחדש ב-50 μL של 1x restriction buffer 2.
  6. ערבבו את הריאגנטים הבאים כדי להכין את תגובת ה-PCR להגברת הספרייה: 50 מיקרוליטר חרוזים עם הספרייה, 250 מיקרוליטר של 2x PCR מאסטרמיקס עם אנזים, 12 מיקרוליטר של פריימרים F + R (25 מיקרומטר כל אחד; ראו טבלה 2), ו-188 מיקרוליטר של מים נטולי נוקלאז.
  7. בצע את ה- PCR בתנאים הבאים (פצל את תערובת מגיב ה- PCR לתגובות של 50 μL): 98 ° C במשך 40 שניות, ואחריו X מחזורים של 98 ° C עבור 10 שניות, 65 ° C עבור 30 שניות, 72 ° C עבור 30 שניות, וסיים על ידי 72 ° C במשך 10 דקות. החזק בטמפרטורה של 4°C.
    הערה: השתמש במספר המחזורים הבא כנקודת התחלה למיטוב הפרוטוקול בתאים דיפלואידים המכוונים לפלט של 500-1,000 ננוגרם לפני לכידת הספרייה: מיליון תאים למשך שמונה מחזורים; 250,000 תאים במשך 10 מחזורים; 50,000 תאים במשך 12 מחזורים.
  8. אגרו את כל התגובות של 50 μL מאותה דגימה לתוך צינור DNA בעל קישור נמוך של 1.5 מ"ל, הניחו אותו על מגנט צינור של 1.5 מ"ל, והמתינו 2-3 דקות או עד שכל החרוזים נדבקים לקיר.
  9. מעבירים את הסופרנאטנט המכיל את הספרייה (500 μL) לצינור DNA חדש בעל קישור נמוך של 1.5 מ"ל. מלאו את מאגר TLE ל-500 מיקרוליטר אם חלק מהסופרנאטנט אבד. חרוזי סטרפטאבידין C1 אינם נחוצים עוד.
  10. בצע בחירה דו-צדדית55 באמצעות טיהור חרוזים פאראמגנטי (נפח 0.4-1). זה מאפשר חיסול סלקטיבי של שברים גדולים מדי (>1,000 bp) וקטנים מדי או פריימרים PCR (<200 bp), בהתאם לריכוז של פוליאתילן גליקול ומלח של חרוזים פאראמגנטיים הוסיף.
  11. הוסף 200 μL (0.4 כרכים) של חרוזי מלאי לספרייה וערבב על ידי מערבולת. דוגרים במשך 10 דקות, מסתובבים בטמפרטורת החדר.
  12. מניחים על מגנט, ממתינים 2-3 דקות או עד שכל החרוזים נדבקים לקיר, ומעבירים את הסופרנאטנט המכיל את הספרייה (ללא השברים הגדולים יותר) לצינור DNA חדש בעל קשירה נמוכה של 1.5 מ"ל.
  13. רכז את החרוזים על ידי לקיחת 750 מיקרוליטר של חרוזי מלאי, הנח אותם בצינור 1.5 מ"ל על מגנט, המתן 2-3 דקות או עד שכל החרוזים נדבקים לקיר, הסר את הסופרנטנט, והשהה מחדש את החרוזים על ידי ערבול 300 מיקרוליטר של חרוזי מלאי חדשים.
  14. הוסף 300 μL של חרוזים מרוכזים לדגימה (1 נפח) וערבב על ידי מערבולת. דוגרים במשך 10 דקות, מסתובבים בטמפרטורת החדר. מניחים על מגנט, ממתינים 2-3 דקות או עד שכל החרוזים נדבקים לקיר, ומסירים את הסופרנאטנט (המכיל את השברים הקטנים יותר ואת פריימר ה-PCR).
  15. לשטוף את החרוזים שלוש פעמים עם 1 מ"ל של אתנול 70%. כדי לעשות זאת, מוסיפים את האתנול בזמן שהצינור עם החרוזים עדיין על המגנט, מנסה לא להפריע לחרוזים, ולחכות 30-60 שניות. לאחר מכן, הסירו את הסופרנאטנט מבלי להפריע לחרוזים.
  16. אפשרו לחרוזים להתייבש באוויר והשהו אותם מחדש ב-21 μL של חיץ TLE על ידי מערבולת.
    הערה: ייבוש יתר של החרוזים יכול להפחית את התשואה בעת פליטת הדנ"א. המטרה היא להשעות אותם מחדש בחיץ TLE מיד לאחר שהם כבר לא "מבריקים" מהאתנול.
  17. דגרו על הדגימה במשך 10 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בתרמובלוק כדי להוציא את הספרייה מהחרוזים. מניחים את הצינור במגנט ומעבירים את הסופרנאטנט המכיל את הספרייה לצינור DNA חדש בעל קשירה נמוכה של 1.5 מ"ל.
  18. כימות הגודל והריכוז באמצעות אלקטרופורזה אוטומטית (ראה טבלת חומרים). ניתן לאחסן חומר Hi-C מטוהר ב -20 °C במשך מספר חודשים לפני שתמשיך עם הפרוטוקול.

10. לכידת ספרייה

  1. עבודה עם 500-1,000 ננוגרם של הספרייה. רכז את הספרייה על ידי ייבוש הדנ"א באמצעות רכז ואקום והשעיה מחדש של החומר ב -3.4 מיקרוליטר של מים נטולי נוקלאז.
  2. הוסף את החוסמים הבאים מערכת העשרת היעד (ראה טבלת חומרים) לדגימה: 2.5 μL של Blocker 1, 2.5 μL של Blocker 2 ו- 0.6 μL של חוסם אוליגו מותאם אישית עבור המתאמים.
  3. להשהות ביסודיות, להעביר את התמיסה לרצועת PCR 0.2 מ"ל, ולדגור thermocycler במשך 5 דקות ב 95 ° C, ואחריו 5 דקות ב 65 ° C עם מכסה מחומם. השאר את הצינור דוגר ב 65 ° C.
  4. הכינו את פתרון ההכלאה על ידי שילוב הריאגנטים הבאים מערכת העשרת המטרה (ראו טבלת חומרים) לכל דגימה (13 מיקרוליטר). יש לשמור על הספסל בטמפרטורת החדר: 6.63 μL של Hyb 1, 0.27 μL של Hyb 2, 2.65 μL של Hyb 3 ו-3.45 μL של Hyb 4.
  5. יש לדלל 0.5 מיקרוליטר של בלוק RNase מערכת העשרת המטרה ב-1.5 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז לדגימה. הפשירו 5 μL של RNA biotinylated לכל דגימה על קרח והוסיפו לו את 2 μL של בלוק RNase מדולל. יש לשמור על הספסל בטמפרטורת החדר.
  6. הוסף את 13 μL של תמיסת הכלאה ל 7 μL של RNA biotinylated עם RNase ומערבבים היטב.
  7. בעוד על thermocycler ב 65 ° C, להעביר את פתרון הכלאה עם RNA biotinylated (20 μL) לספרייה חסומה. סגור את מכסה הצינור בחוזקה ודגור בתרמוסייקלר למשך הלילה ב 65 מעלות צלזיוס.
    הערה: כדי למזער את אידוי הדגימות (שעלול להוביל להכלאה תת-אופטימלית של RNA-DNA) בעת ביצוע דגימות מרובות בו-זמנית, השתמש בפיפט רב-ערוצי כדי להעביר את ה-RNA הביוטינילי לכל ספרייה בו-זמנית.

11. משיכת ביוטין והגברת PCR

  1. מעבירים 50 μL של חרוזי סטרפטאבידין T1 לכל דגימה לצינור DNA בעל קישור נמוך של 1.5 מ"ל, מניחים אותם על מגנט צינור של 1.5 מ"ל, וממתינים 2-3 דקות או עד שכל החרוזים נדבקים לקיר. הסר את supernatant, משאיר את החרוזים מאחור. שטפו את החרוזים שלוש פעמים עם 200 מיקרוליטר של חיץ הקשירה מערכת העשרת המטרה.
  2. השהה מחדש את החרוזים ב 200 μL של חיץ קשירה. בעוד על thermocycler ב 65 ° C, להעביר את הדגימה לחרוזי סטרפטאבידין T1 resuspended ולדגור במשך 30 דקות, מסתובב בטמפרטורת החדר.
  3. שטפו את החרוזים עם 200 μL של חיץ כביסה 1 מערכת העשרת המטרה. דוגרים במשך 15 דקות, מסתובבים בטמפרטורת החדר. יש לשטוף את החרוזים שלוש פעמים עם 200 μL של חיץ כביסה 2 מערכת העשרה המטרה מחומם ל 65 ° C. יש לדגור במשך 10 דקות ב-65°C בתרמו-בלוק, תוך רעידות ב-300 סל"ד בין השטיפות.
  4. שטפו את החרוזים עם 200 μL של 1x restriction buffer 2 ולאחר מכן השעו אותם מחדש ב-30 μL של 1x restriction buffer 2.
  5. ערבבו את הריאגנטים הבאים כדי להכין את תגובת ה-PCR להגברת הספרייה: 30 μL חרוזים עם הספרייה, 150 μL של 2x PCR mastermix עם אנזים, 7.2 μL של פריימרים F + R (25 מיקרומטר כל אחד; ראו טבלה 2), ו-112.8 מיקרוליטר של מים נטולי נוקלאז.
  6. בצע את ה- PCR בתנאים הבאים (פצל את תערובת מגיב ה- PCR בתגובות של 50 μL): 98 ° C במשך 40 שניות, ואחריו ארבעה מחזורים של 98 ° C עבור 10 שניות, 65 ° C עבור 30 שניות, 72 ° C עבור 30 שניות, וסיים עם 72 ° C במשך 10 דקות. החזק בטמפרטורה של 4°C.
  7. אגרו את כל התגובות של 50 μL מאותה דגימה לתוך צינור DNA בעל קישור נמוך של 1.5 מ"ל, הניחו אותו על מגנט צינור של 1.5 מ"ל, והמתינו 2-3 דקות או עד שכל החרוזים נדבקים לקיר.
  8. מעבירים את הסופרנאטנט המכיל את הספרייה (300 μL) לצינור DNA חדש בעל קישור נמוך של 1.5 מ"ל. ממלא עם מאגר TLE ל 300 μL אם חלק supernatant אבד. חרוזי סטרפטאבידין T1 אינם נחוצים עוד.
  9. בצעו טיהור DNA באמצעות חרוזים פאראמגנטיים (0.9 נפחים; ראו טבלת חומרים). הוסף 270 μL של חרוזי מלאי למדגם וערבב על ידי מערבולת.
  10. דוגרים במשך 10 דקות, מסתובבים בטמפרטורת החדר.
  11. מניחים על מגנט, ממתינים 2-3 דקות או עד שכל החרוזים נדבקים לקיר, ומסירים את הסופרנטנט.
  12. לשטוף את החרוזים שלוש פעמים עם 1 מ"ל של אתנול 70%. כדי לעשות זאת, מוסיפים את האתנול בזמן שהצינור עם החרוזים עדיין על המגנט, מנסה לא להפריע לחרוזים, ולחכות 30-60 שניות. לאחר מכן, הסירו את הסופרנאטנט מבלי להפריע לחרוזים.
  13. אפשרו לחרוזים להתייבש באוויר והשהו אותם מחדש ב-21 μL של חיץ TLE על ידי מערבולת.
    הערה: ייבוש יתר של החרוזים יכול להפחית את התשואה בעת פליטת הדנ"א. המטרה היא להשעות אותם מחדש בחיץ TLE מיד לאחר שהם כבר לא "מבריקים" מהאתנול.
  14. דגרו על הדגימה במשך 10 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בתרמובלוק כדי להוציא את הספרייה מהחרוזים.
  15. מניחים את הצינור במגנט ומעבירים את הסופרנאטנט המכיל את הספרייה לצינור DNA חדש בעל קשירה נמוכה של 1.5 מ"ל.
  16. כמת את הגודל והריכוז באמצעות אלקטרופורזה אוטומטית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

liCHi-C מציעה את האפשרות ליצור ספריות אינטראקטום מקדמי גנום באיכות גבוהה וברזולוציה רחבה עם מעט כמו 50,000 תאים53. הדבר מושג על ידי – מלבד הפחתה דרסטית של נפחי התגובה ושימוש בכלי פלסטיק בעלי קישור נמוך לדנ"א לאורך כל הפרוטוקול – הסרת צעדים מיותרים מהפרוטוקול המקורי, שבהם מתרחשים הפסדים חומריים משמעותיים. אלה כוללים את טיהור פנול לאחר decrosslinking, הסרת ביוטין, ולאחר מכן טיהור פנול-כלורופורם משקעים אתנול. חוץ מזה, ארגון מחדש של שלבי הכנת ספריית Hi-C (משיכת ביוטין, זנב A, קשירת מתאם, הגברת PCR ובחירת חרוזים פאראמגנטיים דו-צדדיים - גם כטיהור מוצר PCR) מאפשר לנו להסיר עוד שלב טיהור DNA מיותר. סקירה כללית של זרימת העבודה הניסויית ניתן למצוא באיור 1A.

כדי להעריך את איכות הספרייה, מבוצעות מספר בקרות לאורך הפרוטוקול, הראשונה שבהן היא חישוב יעילות העיכול של הגנום; ערכים מעל 80% נחשבים קבילים (טבלה 3). בדיקת יעילות העיכול של סוג התא בניסוי נפרד מוצעת על מנת לא לאבד כמות משמעותית של חומר מניסוי liCHi-C יחיד. שנית, לפני סוניקציה ותיקון קצה, מומלץ לבדוק את הרגישות של זיהוי אינטראקציה על-ידי הגברת אינטראקציות כרומטין אינווריאנטיות מסוג תא באמצעות PCR קונבנציונלי (איור 1B). אם המוצר הספציפי מזוהה, יש לבצע בקרה שלישית, המתמקדת ביעילות של ביוטינילציה וקשירה על-ידי עיכול דיפרנציאלי של אחד ממוצרי ה-PCR שהתקבלו בעבר עם HindIII ו-NheI (איור 1C,D). כאשר ממלאים אתר הגבלה HindIII מעוכל וקשירה קהה שלו עם אתר אחר, נוצר אתר הגבלה חדש של NheI במקום ליצור מחדש את אתר ה- HindIII המקורי. לכן, העיכול של אמפליקון PCR צריך להיות רק ציין כאשר NheI קיים. לבסוף, ממש לפני ואחרי כל הלכידה, יש לבדוק את התפלגות הריכוז והגודל באמצעות אלקטרופורזה אוטומטית. הגברה של ספריית טרום לכידה חייבת לשאוף להשגת 500-1,000 ננוגרם של חומר Hi-C, הכמות המדויקת הדרושה לביצוע לכידת בדיקת RNA, שכן הגברה מוגזמת של הספרייה לפני ואחרי הלכידה מובילה לאחוז גבוה של כפילויות PCR וכתוצאה מכך לאובדן קריאות רצף במהלך הניתוח. ניתן להגביר מחדש ספריות שוב באותם תנאים אם לא מתקבל מספיק חומר במהלך הגברת ה- PCR השמרנית הראשונה. כמות חומר הספרייה לאחר הלכידה יכולה להשתנות, אך ככלל אצבע, היא צריכה להיות בערך פי עשרה עד פי 20 פחות מאשר לפני הלכידה. התפלגות הגודל של הספרייה צריכה להיות סביב 450-550 bp (איור 2A,B), בלתי משתנה בין ספריות לפני ואחרי שנלכדו. באופן קולקטיבי, תוצאות נכונות של בקרות אלה מבטיחות יצירה של ספריות liCHi-C מצוינות.

ספריות liCHi-C מוגמרות לאחר מכן (לפחות) 100 bp ברצף ומנותחות. נתוני ריצוף גולמיים53 מעובדים באמצעות צינור HiCUP56 למיפוי וסינון תוצרים. דו"ח HiCUP האידיאלי מראה עלייה של פי חמישה עד פי עשרה בפיזור של סיס (בתוך אותו כרומוזום) בהשוואה לקריאות טרנס (בין כרומוזומים שונים), כפי שתואר קודם לכן על פי קשירת גרעין Hi-C57 (איור 3B). די בהשגת יותר מ-100 מיליון קריאות ייחודיות ותקפות לאחר הסרת כפילויות PCR כדי להמשיך לשלב הבא בניתוח (איור 3B), שהוא להעריך את יעילות הלכידה. קריאות זוגיות שבהן אף אחד מהקצוות שלהן לא ממופה למקטע הגבלה שנלכד על-ידי מערכת העשרת הגשושיות של הרנ"א, מושלכות, ונשמרות רק אלה המייצגות את האינטראקטום המקדם של התא (כלומר, אותן קריאות שבהן לפחות אחד מהקצוות שלהן ממופה למקטעי הגבלה המכילים מקדם גנים אחד או יותר [איור 3C], באופן אידיאלי יותר מ -60%).

לבסוף, אינטראקציות משמעותיות נקראות עם צינור CHiCAGO, כמתואר ב-58,59. שני שכפולים ביולוגיים או יותר נחוצים לקבוצה הסופית של אינטראקציות מקדם משמעותיות. ניתן לאמת את איכות הנתונים גם באמצעות ניתוח רכיבים עיקריים (PCA), מכיוון שעותקים ביולוגיים חייבים להתקבץ יחד ויש להפריד בין סוגי תאים. לדוגמה, על-ידי ניתוח מערכי נתונים של liCHi-C מארבעה סוגי תאים ראשוניים שונים מהעץ ההמטופויטי האנושי (אבות מיאלואידים נפוצים, מונוציטים, מגה-קריוציטים ואריתרובלסטים), אנו יכולים לראות ב-PCA שספריות liCHi-C מתקבצות באופן המשקף מסלול התפתחותי (איור 3D). בחינה מדוקדקת יותר של האינטראקציות המשמעותיות שזוהו עבור ארבעת סוגי התאים מגלה כי אינטראקטומים מקדמים הם ספציפיים לסוג התא ודינמיים במהלך התפתחות התא. לדוגמה, הגן AHSP, מלווה מרכזי המסונתז במבשרי אריתרואידים אשר מפקח על הקיפול הנכון של המוגלובין60,61,62, מראה רווח של אינטראקציות עם אלמנטים רגולטוריים פעילים פוטנציאליים (כלומר, אזורים מועשרים H3K27ac ו-H3K4me1) באריתרובלסטים, אך לא בסוגי תאים אחרים (איור 4). זה מדגים כי שיטת liCHi-C יכולה לחשוף אינטראקציות רגולטוריות פוטנציאליות בסוגי תאים נדירים.

Figure 1
איור 1: סקירת פרוטוקול ובקרות איכות של הדגימה לפני סוניקציה . (A) סקירה סכמטית של פרוטוקול liCHi-C חלקי ימים. ידיים B וידיים כחולות מייצגות, בהתאמה, מולקולות ביוטין ושלבים שבהם ניתן לעצור את הפרוטוקול בבטחה לפרק זמן גדול. (B) תוצאות מייצגות של בקרות האינטראקציה של 3C. שתי ערכות האינטראקציה עבור אדם (שמאל) ועכבר (ימין) מוצגות. הפסים שיש לצפות להם מסומנים בכחול כהה, בעוד רצועה לא ספציפית מסומנת בכחול בהיר. (C) בקרות מילוי וקשירה מייצגות באמצעות זוג פריימר "Dekker" לאינטראקציה אנושית. הרצועה נחתכת רק בנתיבים 2 ו-3, שם מתווסף NheI. (D) ייצוג סכמטי של יצירת אתר הגבלת NheI חדש במהלך מילוי וקשירה של אתר הגבלה הינדי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: פרופילים מייצגים של אלקטרופורזה אוטומטית מספריות לפני ואחרי הלכידה. (A) פרופיל אלקטרופורזה אוטומטי מספרייה ממש לפני הלכידה. הכמות הכוללת של DNA המתקבל היא 994 ng (49.7 ng / μL ב 20 μL). (B) פרופיל אלקטרופורזה אוטומטי בעל רגישות גבוהה מספריית liCHi-C מוגמרת. הדגימה נטענת חצי מדוללת כדי לשמר כמה שיותר חומר. הכמות הכוללת של דנ"א המתקבלת היא 61.2 ng (1.53 ng/μL ב 20 μL x2 כדי להסביר את הדילול). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: פלט צינור HiCUP מייצג ואשכולות משוכפלים של מדגם לפי PCA . (A) סיווג תוקפם של זוגות קריאה לפי אחוזים וספירות כוללות. זוגות קריאה לא חוקיים מסווגים לפי סוג החפץ הניסיוני. (B) אחוזי מניעת כפילויות וסיווג סוגי האינטראקציה. אינטראקציות CIS מסווגות גם כ- cis-close (פחות מ- 10 kb) ו- cis-far (יותר מ- 10 kb). (C) אחוז יעילות הלכידה. זוגות קריאה שנלכדו מסווגים עוד יותר בין אם קצה אחד, השני או שניהם מכילים מקדם אחד או יותר. (D) ניתוח רכיבים עיקריים של ציוני אינטראקציה משמעותיים של CHiCAGO משני העתקים של ספריות liCHi-C מאבות מיאלואידים נפוצים (CMP), אריתרובלסטים, מגה-קריוציטים ומונוציטים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: נוף האינטראקציה של AHSP בתאים המטופויטיים ראשוניים אנושיים. דוגמה מייצגת לנוף האינטראקציה הממוקדת במקדם AHSP באבות מיאלואידים משותפים (CMP), אריתרובלסטים (Ery), מגה-קריוציטים (MK) ומונוציטים (Mon) כפי שניתן לראות בדפדפן WashU Epigenome63. קשתות מייצגות אינטראקציות משמעותיות. הגוון הכחול הכהה מראה את מקדם הגן AHSP, בעוד שגווני התכלת חופפים אלמנטים רגולטוריים פעילים פוטנציאליים המקיימים אינטראקציה ספציפית עם מקדם AHSP באריתרובלסטים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: הרכב חיץ והכנתו. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 2: פריימרים PCR ורצפי מתאמים. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 3: דוגמה לחישוב יעילות העיכול. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

liCHi-C מציעה את היכולת ליצור ספריות אינטראקטום מקדם ברזולוציה גבוהה באמצעות מסגרת ניסויית דומה מזו של PCHi-C, אך עם מספר תאים מופחת במידה ניכרת. זה מושג במידה רבה על ידי ביטול צעדים מיותרים, כגון טיהור פנול והסרת ביוטין. בפרוטוקול Hi-C הקלאסי של קשירת גרעיןHi-C 57 ובטכניקת הנגזרת שלו PCHi-C, ביוטין מוסר ממקטעי הגבלה שאינם קשורים כדי למנוע משיכת מקטעי DNA שלאחר מכן אינם אינפורמטיביים. דילוג על החלק הזה וטיהור הדנ"א שבא בעקבותיו אינו מתורגם לירידה משמעותית באחוז הקריאות החוקיות (איור 3A) בזמן שהוא חותך שלבים פוטנציאליים לבזבוז דנ"א, שהם טיהור דנ"א. הארגון מחדש של הכנת ספריית Hi-C לאחר הסוניקציה מאפשר לדלג על טיהור מיותר נוסף על ידי שימוש בבחירה הדו-צדדית כשלב הטיהור עצמו. כל זה משפר את הביצועים של הפרוטוקול כולו על ידי שימוש בשינויים מינימליים בצינור, ויחד עם הפחתת נפח התגובה, שינויים בריכוז המגיבים, ושימוש בכלי פלסטיק בעלי קישור נמוך לדנ"א, הוא המאפשר יצירת ספריות איכותיות המשתמשות ב-50,000 תאים בלבד. חשוב לזכור כי מספר התא ההתחלתי קובע, בין השאר, את מספר האינטראקציות המשמעותיות בשל מורכבות הספרייה. אף על פי שספריות שנוצרו עם 50,000 תאים שומרות על התכונות הטופולוגיות הספציפיות והאינווריאנטיות של ספריות מורכבות יותר53, המלצתנו היא להשתמש, במידת האפשר, ביותר מ-100,000 תאים לכל שכפול ביולוגי על מנת ללכוד מספר גבוה יותר של אינטראקציות מקדם משמעותיות.

הרזולוציה של האינטראקציות שזוהו בטכניקות 3C ניתנת למעשה על ידי אנזים ההגבלה המשמש. כאן, היישום של liCHi-C מתואר באמצעות HindIII, אנזים חיתוך 6 bp הנותן רזולוציה ממוצעת תיאורטית של 4,096 bp. liCHi-C מאפשר להחליף את אנזים ההגבלה, למשל, לכיוון אנזים חיתוך 4 bp או אפילו נוקלאז מיקרוקוקלי, ובכך להגדיל את הרזולוציה של אינטראקציות משמעותיות שזוהו. הדור של ספריות liCHi-C, החלפת אנזים הגבלה HindIII עבור אנזים MboI 4 bp, דווח לספק תוצאות מצוינות לזהות כמעט כפול את סך כל האינטראקציות, אם כי עם הסטת המרחק הליניארי הממוצע של האינטראקציות שזוהו עד למחצית המרחק53.

באשר למערכת העשרת בדיקות RNA בפועל, אחד היתרונות העיקריים של שימוש בלכידה מסוג זה על פני אחד מבוסס נוגדנים, כגון HiChIP32 או HiCuT33, בין היתר, הוא היכולת להשוות תנאים ללא תלות בקשירת החלבון, כמו גם לא להסתמך על זמינותו של נוגדן עובד עבור החלבון המעניין. יתר על כן, ניתן להתאים את מערכת העשרת הרנ"א כך שתלכוד אזורים ספציפיים ברחבי הגנום כך שתתאים לצורך של כל חוקר (התכנון נדון ב 35,64).

בנוסף לשיטות לכידה מבוססות נוגדנים, פותחו בשנים האחרונות מספר שיטות בולטות של תא בודד (כגון scHi-C 65, Dip-C 66 או Sci-Hi-C67) או שיטות קלט נמוך (כגון Low-C 68 או Easy Hi-C 69) לחקר ארכיטקטורת הגנום התלת-ממדי. עם זאת, אלה מייצרים מפות מגע דלילות ברזולוציה נמוכה שאינן מאפשרות זיהוי מגעים בין אלמנטים רגולטוריים דיסטליים לבין גני המטרה. liCHi-C היא שיטה המסוגלת להתגבר על מגבלה זו, ופותחת את האפשרות לחקור את ארכיטקטורת הגנום הממוקדת בסוגי תאים נדירים ומספקת הזדמנות לקדם את הבנתנו בביולוגיה תאית והתפתחותית ובהתפתחות מחלות.

למרות כל התכונות שלו, liCHi-C אינו פטור ממגבלות. ראשית, עיבוד נתוני הרצף הגולמיים אינו טריוויאלי, ויש צורך במיומנויות חישוביות הוגנות כדי לנתח את הנתונים ולפרש את תוצאותיהם. יתר על כן, liCHi-C אינו מפלה בין אינטראקציות תפקודיות ומבניות; זה נדרש עבור נתוני liCHi-C להיות משולבים עם נתונים אפיגנטיים ו / או ניתוח פונקציונלי כדי לאמת את האינטראקציות הפונקציונליות הפוטנציאליות של מקדמי גנים עם אלמנטים רגולטוריים היעד שלהם. לבסוף, מורכבות הספרייה מוקרבת כאשר עובדים על הקצה התחתון של מספרי תאים. זה בא לידי ביטוי בכמות האינטראקציות הייחודיות שזוהו בהשוואה לספריות liCHi-C בעלות מספר תאים גבוה יותר ושיעור מניעת הכפילויות שלהן, שיכול להגיע עד 80%. עם זאת, ספריות liCHi-C בעלות מספרים נמוכים שומרות על התכונות הטופולוגיות של ספריות מספרי תאים גבוהים יותר באופן ממוקד יותר53, מה שמוכיח כי ניתן לבצע ספריות liCHi-C המשחזרות את האינטראקטום מקדם התא עם 50,000 תאים בלבד.

בסך הכל, liCHi-C היא שיטה חסכונית וניתנת להתאמה אישית ליצירת ספריות אינטראקטום מקדם באיכות גבוהה וברזולוציה גבוהה בסוגי תאים נדירים. זוהי השיטה הראשונה עם קלט נמוך למיפוי אינטרקטום המקדם וקריאה ללולאות משמעותיות ברזולוציית מקטע ההגבלה. אנו צופים כי כלי חדש זה, כמו קודמו PCHi-C, יספק תובנות חדשות בהתמיינות תאים ופיתוח אורגניזמים, הן בבריאות והן במחלות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים לשאר החברים ממעבדת Javierre על המשוב שלהם על כתב היד. אנו מודים לתוכנית CERCA, Generalitat de Catalunya ולקרן Josep Carreras על התמיכה המוסדית. עבודה זו מומנה על ידי פדר / משרד המדע והחדשנות הספרדי (RTI2018-094788-A-I00), האגודה ההמטולוגית האירופית (4823998) והאגודה הספרדית נגד סרטן (AECC) LABAE21981JAVI. BMJ ממומן על ידי פרויקט Junior Leader של קרן הבנקאות La Caixa (LCF / BQ / PI19 / 11690001), LR ממומן על ידי מלגת AGAUR FI (2019FI-B00017), ו- LT-D ממומן על ידי מלגת FPI (PRE2019-088005). אנו מודים לתוכנית הדוקטורט בביוכימיה וביולוגיה מולקולרית מהאוניברסיטה האוטונומית של ברצלונה על תמיכתה. אף אחד מהמממנים לא היה מעורב בשום שלב בעיצוב הניסוי או בכתיבת כתב היד.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.4 mM Biotin-14-dATP Invitrogen 19524-016
0.5 M EDTA pH 8.0 Invitrogen AM9260G
1 M Tris pH 8.0 Invitrogen AM9855G
10x NEBuffer 2 New England Biolabs B7002S Referenced as restriction buffer 2 in the manuscript
10x PBS Fisher Scientific BP3994
10x T4 DNA ligase reaction buffer New England Biolabs B0202S
16% formaldehyde solution (w/v), methanol-free Thermo Scientific 28908
20 mg/mL Bovine Serum Albumin New England Biolabs B9000S
5 M NaCl Invitrogen AM9760G
5PRIME Phase Lock Gel Light tubes Qiuantabio 2302820 For phenol-chloroform purification in section 4 (DNA purification). Phase Lock Gel tubes are a commercial type of tubes specially designed to maximize DNA recovery after phenol-chloroform purifications while avoiding carryover of contaminants in the organic phase by containing a resin of intermediate density which settles between the organic and aqueous phase and isolates them. PLG tubes should be spun at 12,000 x g for 30 s before use to ensure that the resin is well-placed at the bottom of the tube
Adapters and PCR primers for library amplification Integrated DNA Technologies - Bought as individual primers with PAGE purification for NGS
Cell scrappers Nunc 179693 Or any other brand
Centrifuge (fixed-angle rotor for 1.5 mL tubes) Any brand
CHiCAGO R package 1.14.0
CleanNGS beads CleanNA CNGS-0050
dATP, dCTP, dGTP, dTTP Promega U120A, U121A, U122A, U123A Or any other brand
DNA LoBind tube, 1.5 mL Eppendorf 30108051
DNA LoBind tube, 2 mL Eppendorf 30108078
DNA polymerase I large (Klenow) fragment 5000 units/mL New England Biolabs M0210L
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 beads Invitrogen 65002 For biotin pull-down of the pre-captured library in section 8 (biotin pull-down)
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 beads Invitrogen 65602 For biotin pull-down of the post-captured library in section 11 (biotin pull-down and PCR amplification)
DynaMag-2 Invitrogen 12321D Or any other magnet suitable for 1.5 ml tubeL
Ethanol absolute VWR 20821.321
FBS, qualified Gibco 10270-106 Or any other brand
Glycine Fisher BioReagents BP381-1
GlycoBlue Coprecipitant Invitrogen AM9515 Used for DNA coprecipitation in section 4 (DNA purification)
HiCUP 0.8.2
HindIII, 100 U/µL New England Biolabs R0104T
IGEPAL CA-630 Sigma-Aldrich I8896-50ML
Klenow EXO- 5000 units/mL New England Biolabs M0212L
Low-retention filter tips (10 µL, 20 µL, 200 µL and 1000 µL) ZeroTip PMT233010, PMT252020, PMT231200, PMT252000
M220 Focused-ultrasonicator Covaris 500295
Micro TUBE AFA Fiber Pre-slit snap cap 6 x 16 mm vials Covaris 520045 For sonication in section 6 (sonication)
NheI-HF, 100 U/µL New England Biolabs R3131M
Nuclease-free molecular biology grade water Sigma-Aldrich W4502
PCR primers for quality controls Integrated DNA Technologies -
PCR strips and caps Agilent Technologies 410022, 401425
Phenol: Chloroform: Isoamyl Alcohol 25:24:1, Saturated with 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA Sigma-Aldrich P3803
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer New England Biolabs M0531L For amplification of the library in sections 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification)
and 11 (biotin pull-down and PCR amplification)
Protease inhibitor cocktail (EDTA-free) Roche 11873580001
Proteinase K, recombinant, PCR grade Roche 3115836001
Qubit 1x dsDNA High Sensitivity kit Invitrogen Q33230 For DNA quantification after precipitation in section 4 (DNA purification)
Qubit assay tubes Invitrogen Q32856
rCutsmart buffer New England Biolabs B6004S
RPMI Medium 1640 1x + GlutaMAX Gibco 61870-010 Or any other brand
SDS - Solution 10% for molecular biology PanReac AppliChem A0676
Sodium acetate pH 5.2 Sigma-Aldrich S7899-100ML
SureSelect custom 3-5.9 Mb library Agilent Technologies 5190-4831 Custom designed mouse or human capture system, used for the capture
SureSelect Target Enrichment Box 1 Agilent Technologies 5190-8645 Used for the capture
SureSelect Target Enrichment Kit ILM PE Full Adapter Agilent Technologies 931107 Used for the capture
T4 DNA ligase 1 U/µL Invitrogen 15224025 For ligation in section 3 (ligation and decrosslink)
T4 DNA ligase 2000000/mL New England Biolabs M0202T For ligation in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification)
T4 DNA polymerase 3000 units/mL New England Biolabs M0203L
T4 PNK 10000 units/mL New England Biolabs M0201L
Tapestation 4200 instrument Agilent Technologies For automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and
section 11 (Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid
Tapestation reagents Agilent Technologies 5067-5582, 5067-5583, 5067-5584, 5067-5585, For automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and
section 11 (Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid
Triton X-100 for molecular biology PanReac AppliChem A4975
Tween 20 Sigma-Aldrich P9416-50ML

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hatton, C. S., et al. α-thalassemia caused by a large (62 kb) deletion upstream of the human α globin gene cluster. Blood. 76 (1), 221-227 (1990).
  2. Toikkanen, S., Helin, H., Isola, J., Joensuu, H. Prognostic significance of HER-2 oncoprotein expression in breast cancer: A 30-year follow-up. Journal of Clinical Oncology. 10 (7), 1044-1048 (1992).
  3. Church, C., et al. Overexpression of Fto leads to increased food intake and results in obesity. Nature Genetics. 42 (12), 1086-1092 (2010).
  4. Bhatia, S., et al. Disruption of autoregulatory feedback by a mutation in a remote, ultraconserved PAX6 enhancer causes aniridia. American Journal of Human Genetics. 93 (6), 1126-1134 (2013).
  5. Herranz, D., et al. A NOTCH1-driven MYC enhancer promotes T cell development, transformation and acute lymphoblastic leukemia. Nature Medicine. 20 (10), 1130-1137 (2014).
  6. Carter, D., Chakalova, L., Osborne, C. S., Dai, Y. F., Fraser, P. Long-range chromatin regulatory interactions in vivo. Nature Genetics. 32 (4), 623-626 (2002).
  7. Rao, S. S. P., et al. A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).
  8. Schoenfelder, S., Fraser, P. Long-range enhancer-promoter contacts in gene expression control. Nature Reviews Genetics. 20 (8), 437-455 (2019).
  9. Heintzman, N. D., et al. Distinct and predictive chromatin signatures of transcriptional promoters and enhancers in the human genome. Nature Genetics. 39 (3), 311-318 (2007).
  10. Zentner, G. E., Tesar, P. J., Scacheri, P. C. Epigenetic signatures distinguish multiple classes of enhancers with distinct cellular functions. Genome Research. 21 (8), 1273-1283 (2011).
  11. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  12. McPherson, C. E., Shim, E. Y., Friedman, D. S., Zaret, K. S. An active tissue-specific enhancer and bound transcription factors existing in a precisely positioned nucleosomal array. Cell. 75 (2), 387-398 (1993).
  13. He, A., Kong, S. W., Ma, Q., Pu, W. T. Co-occupancy by multiple cardiac transcription factors identifies transcriptional enhancers active in heart. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (14), 5632-5637 (2011).
  14. Dogan, N., et al. Occupancy by key transcription factors is a more accurate predictor of enhancer activity than histone modifications or chromatin accessibility. Epigenetics and Chromatin. 8, 16 (2015).
  15. Whyte, W. A., et al. transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes. Cell. 153 (2), 307-319 (2013).
  16. Hnisz, D., et al. Super-enhancers in the control of cell identity and disease. Cell. 155 (4), 934-947 (2013).
  17. He, H. H., et al. Nucleosome dynamics define transcriptional enhancers. Nature Genetics. 42 (4), 343-347 (2010).
  18. Song, L., et al. Open chromatin defined by DNaseI and FAIRE identifies regulatory elements that shape cell-type identity. Genome Research. 21 (10), 1757-1767 (2011).
  19. De Santa, F., et al. A large fraction of extragenic RNA Pol II transcription sites overlap enhancers. PLoS Biology. 8 (5), e1000384 (2010).
  20. Kim, T. K., et al. Widespread transcription at neuronal activity-regulated enhancers. Nature. 465 (7295), 182-187 (2010).
  21. ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  22. Wu, H., et al. Tissue-specific RNA expression marks distant-acting developmental enhancers. PLoS Genetics. 10 (9), e1004610 (2014).
  23. Banerji, J., Rusconi, S., Schaffner, W. Expression of a β-globin gene is enhanced by remote SV40 DNA sequences. Cell. 27 (2), 299-308 (1981).
  24. Amano, T., et al. Chromosomal dynamics at the Shh locus: limb bud-specific differential regulation of competence and active transcription. Developmental Cell. 16 (1), 47-57 (2009).
  25. Shi, J., et al. Role of SWI/SNF in acute leukemia maintenance and enhancer-mediated Myc regulation. Genes and Development. 27 (24), 2648-2662 (2013).
  26. Lettice, L. A., et al. A long-range Shh enhancer regulates expression in the developing limb and fin and is associated with preaxial polydactyly. Human Molecular Genetics. 12 (14), 1725-1735 (2003).
  27. Tuvikene, J., et al. Intronic enhancer region governs transcript-specific Bdnf expression in rodent neurons. eLife. 10, e65161 (2021).
  28. Tasic, B., et al. Promoter choice determines splice site selection in protocadherin α and γ pre-mRNA splicing. Molecular Cell. 10 (1), 21-33 (2002).
  29. Perry, M. W., Boettiger, A. N., Levine, M. Multiple enhancers ensure precision of gap gene-expression patterns in the Drosophila embryo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (33), 13570-13575 (2011).
  30. Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326 (5950), 289-293 (2009).
  31. Fullwood, M. J., et al. An oestrogen-receptor-α-bound human chromatin interactome. Nature. 462 (7269), 58-64 (2009).
  32. Mumbach, M. R., et al. HiChIP: Efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture. Nature Methods. 13 (11), 919-922 (2016).
  33. Sati, S., et al. HiCuT: An efficient and low input method to identify protein-directed chromatin interactions. PLoS Genetics. 18 (3), e1010121 (2022).
  34. Schoenfelder, S., et al. The pluripotent regulatory circuitry connecting promoters to their long-range interacting elements. Genome Research. 25 (4), 582-597 (2015).
  35. Schoenfelder, S., Javierre, B. M., Furlan-Magaril, M., Wingett, S. W., Fraser, P. Promoter capture Hi-C: High-resolution, genome-wide profiling of promoter interactions. Journal of Visualized Experiments. (136), e57320 (2018).
  36. Rubin, A. J., et al. Lineage-specific dynamic and pre-established enhancer-promoter contacts cooperate in terminal differentiation. Nature Genetics. 49 (10), 1522-1528 (2017).
  37. Siersbæk, R., et al. Dynamic rewiring of promoter-anchored chromatin loops during adipocyte differentiation. Molecular Cell. 66 (3), 420-435 (2017).
  38. Schoenfelder, S., et al. Polycomb repressive complex PRC1 spatially constrains the mouse embryonic stem cell genome. Nature Genetics. 47 (10), 1179-1186 (2015).
  39. Zhang, N., et al. Muscle progenitor specification and myogenic differentiation are associated with changes in chromatin topology. Nature Communications. 11 (1), 6222 (2020).
  40. Javierre, B. M., et al. Lineage-specific genome architecture links enhancers and non-coding disease variants to target gene promoters. Cell. 167 (5), 1369-1384 (2016).
  41. Jäger, R., et al. Capture Hi-C identifies the chromatin interactome of colorectal cancer risk loci. Nature Communications. 6, 6178 (2015).
  42. Martin, P., et al. Identifying causal genes at the multiple sclerosis associated region 6q23 using capture Hi-C. PLoS One. 11 (11), e0166923 (2016).
  43. Burren, O. S., et al. Chromosome contacts in activated T cells identify autoimmune disease candidate genes. Genome Biology. 18 (1), 165 (2017).
  44. Choy, M. K., et al. Promoter interactome of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes connects GWAS regions to cardiac gene networks. Nature Communications. 9 (1), 2526 (2018).
  45. Miguel-Escalada, I., et al. Human pancreatic islet three-dimensional chromatin architecture provides insights into the genetics of type 2 diabetes. Nature Genetics. 51 (7), 1137-1148 (2019).
  46. Law, P. J., et al. Association analyses identify 31 new risk loci for colorectal cancer susceptibility. Nature Communications. 10 (1), 2154 (2019).
  47. Speedy, H. E., et al. Insight into genetic predisposition to chronic lymphocytic leukemia from integrative epigenomics. Nature Communications. 10 (1), 3615 (2019).
  48. Li, T., et al. Epigenomics and transcriptomics of systemic sclerosis CD4+ T cells reveal long-range dysregulation of key inflammatory pathways mediated by disease-associated susceptibility loci. Genome Medicine. 12 (1), 81 (2020).
  49. Orlando, G., et al. Promoter capture Hi-C-based identification of recurrent noncoding mutations in colorectal cancer. Nature Genetics. 50 (10), 1375-1380 (2018).
  50. Cornish, A. J., et al. Identification of recurrent noncoding mutations in B-cell lymphoma using capture Hi-C. Blood Advances. 3 (1), 21-32 (2019).
  51. Madsen, J. G. S., et al. Highly interconnected enhancer communities control lineage-determining genes in human mesenchymal stem cells. Nature Genetics. 52 (11), 1227-1238 (2020).
  52. Dryden, N. H., et al. Unbiased analysis of potential targets of breast cancer susceptibility loci by Capture Hi-C. Genome Research. 24 (11), 1854-1868 (2014).
  53. Tomás-Daza, L., et al. Low input capture Hi-C (liCHi-C) identifies promoter-enhancer interactions at high-resolution. Nature Communications. 14 (1), 268 (2023).
  54. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. 62 (62), e3923 (2012).
  55. Bronner, I. F., Quail, M. A. Best practices for Illumina library preparation. Current Protocols in Human Genetics. 102 (1), 86 (2019).
  56. Wingett, S., et al. HiCUP: pipeline for mapping and processing Hi-C data. F1000Research. 4, 1310 (2015).
  57. Nagano, T., et al. Comparison of Hi-C results using in-solution versus in-nucleus ligation. Genome Biology. 16 (1), 175 (2015).
  58. Cairns, J., et al. CHiCAGO: Robust detection of DNA looping interactions in Capture Hi-C data. Genome Biology. 17 (1), 127 (2016).
  59. Freire-Pritchett, P., et al. Detecting chromosomal interactions in Capture Hi-C data with CHiCAGO and companion tools. Nature Protocols. 16 (9), 4144-4176 (2021).
  60. Kihm, A. J., et al. An abundant erythroid protein that stabilizes free α-haemoglobin. Nature. 417 (6890), 758-763 (2002).
  61. Feng, L., et al. Molecular mechanism of AHSP-mediated stabilization of α-hemoglobin. Cell. 119 (5), 629-640 (2004).
  62. Favero, M. E., Costa, F. F. Alpha-hemoglobin-stabilizing protein: An erythroid molecular chaperone. Biochemistry Research International. 2011, 373859 (2011).
  63. Li, D., et al. WashU Epigenome Browser update 2022. Nucleic Acids Research. 50 (W1), W774-W781 (2022).
  64. Mifsud, B., et al. Mapping long-range promoter contacts in human cells with high-resolution capture Hi-C. Nature Genetics. 47 (6), 598-606 (2015).
  65. Nagano, T., et al. Single-cell Hi-C reveals cell-to-cell variability in chromosome structure. Nature. 502 (7469), 59-64 (2013).
  66. Tan, L., Xing, D., Chang, C. H., Li, H., Xie, X. S. 3D genome structures of single diploid human cells. Science. 361 (6405), 924 (2018).
  67. Ramani, V., et al. Massively multiplex single-cell Hi-C. Nature Methods. 14 (3), 263-266 (2017).
  68. Díaz, N., et al. Chromatin conformation analysis of primary patient tissue using a low input Hi-C method. Nature Communications. 9 (1), 4938 (2018).
  69. Lu, L., Jin, F. Easy Hi-C: A low-input method for capturing genome organization. Methods in Molecular Biology. 2599, 113-125 (2023).

Tags

גנטיקה גיליון 194
זרימת עבודה משולבת לחקר ארכיטקטורת הגנום המרחבי-זמני הממוקדת במקדם באוכלוסיות תאים נדירות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rovirosa, L., Tomás-Daza, L.,… More

Rovirosa, L., Tomás-Daza, L., Urmeneta, B., Valencia, A., Javierre, B. M. An Integrated Workflow to Study the Promoter-Centric Spatio-Temporal Genome Architecture in Scarce Cell Populations. J. Vis. Exp. (194), e65316, doi:10.3791/65316 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter