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JoVE Journal Genetics
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Genetics

Ein integrierter Workflow zur Untersuchung der Promotor-zentrierten raum-zeitlichen Genomarchitektur in seltenen Zellpopulationen

Published: April 21, 2023 doi: 10.3791/65316
Automatic Translation
*1, *1,2, 1, 2,3, 1,4
1Josep Carreras Leukaemia Research Institute, 2Barcelona Supercomputing Center, 3Catalan Institution for Research and Advanced Studies (ICREA), 4Institute for Health Science Research Germans Trias i Pujol
* These authors contributed equally

Summary

Die Genexpression wird durch Wechselwirkungen von Genpromotoren mit distalen regulatorischen Elementen reguliert. In dieser Arbeit beschreiben wir, wie Low Input Capture Hi-C (liCHi-C) die Identifizierung dieser Interaktionen in seltenen Zelltypen ermöglicht, die bisher nicht messbar waren.

Abstract

Die räumlich-zeitliche Gentranskription wird durch distale regulatorische Elemente wie Enhancer und Silencer streng reguliert, die auf die physische Nähe zu ihren Zielgenpromotoren angewiesen sind, um die Transkription zu kontrollieren. Obwohl diese regulatorischen Elemente leicht zu identifizieren sind, sind ihre Zielgene schwer vorherzusagen, da die meisten von ihnen zelltypspezifisch sind und in der linearen Genomsequenz durch Hunderte von Kilobasen getrennt sein können, wodurch andere Nicht-Zielgene übersprungen werden. Seit einigen Jahren ist Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) der Goldstandard für die Assoziation von distalen regulatorischen Elementen mit ihren Zielgenen. PCHi-C ist jedoch auf die Verfügbarkeit von Millionen von Zellen angewiesen, was die Untersuchung seltener Zellpopulationen, wie sie üblicherweise aus primären Geweben gewonnen werden, verbietet. Um diese Einschränkung zu überwinden, wurde Low Input Capture Hi-C (liCHi-C) entwickelt, eine kostengünstige und anpassbare Methode zur Identifizierung des Repertoires an distalen regulatorischen Elementen, die jedes Gen des Genoms steuern. liCHi-C basiert auf einem ähnlichen experimentellen und rechnerischen Rahmen wie PCHi-C, aber durch minimale Röhrchenwechsel, Modifikation der Reagenzienkonzentration und -volumina sowie Austausch oder Eliminierung von Schritten wird ein minimaler Materialverlust während des Bibliotheksaufbaus verursacht. Insgesamt ermöglicht liCHi-C die Untersuchung der Genregulation und der raumzeitlichen Genomorganisation im Kontext der Entwicklungsbiologie und der zellulären Funktion.

Introduction

Die zeitliche Genexpression treibt die Zelldifferenzierung und letztendlich die Entwicklung von Organismen voran, und ihre Veränderung steht in engem Zusammenhang mit einer Vielzahl von Krankheiten 1,2,3,4,5. Die Gentranskription wird durch die Wirkung von regulatorischen Elementen fein reguliert, die als proximal (d. h. Genpromotoren) und distale (z. B. Enhancer oder Silencer) klassifiziert werden können, von denen letztere häufig weit von ihren Zielgenen entfernt sind und physisch mit ihnen durch Chromatinschleifen interagieren, um die Genexpression zu modulieren 6,7,8.

Die Identifizierung distaler regulatorischer Regionen im Genom ist eine Angelegenheit, über die man sich weitgehend einig ist, da diese Regionen spezifische Histonmodifikationenaufweisen 9,10,11 und spezifische Transkriptionsfaktor-Erkennungsmotive enthalten, die als Rekrutierungsplattformen für sie fungieren12,13,14. Außerdem haben sie im Fall von Enhancern und Super-Enhancern 15,16 auch eine geringe Nukleosomenbelegung 17,18 und werden in nicht-kodierende eRNAs transkribiert 19,20.

Nichtsdestotrotz sind die Zielgene der einzelnen distalen regulatorischen Elemente schwieriger vorherzusagen. In den meisten Fällen sind Interaktionen zwischen distalen regulatorischen Elementen und ihren Zielen zelltyp- und stimulusspezifisch 21,22, erstrecken sich über Hunderte von Kilobasen, überbrücken andere Gene in jede Richtung 23,24,25 und können sogar innerhalb von intronischen Regionen ihres Zielgens oder anderer nicht dazwischenliegender Gene lokalisiert werden 26,27. Darüber hinaus können distale regulatorische Elemente auch mehr als ein Gen gleichzeitig steuern und umgekehrt28,29. Diese Positionskomplexität erschwert es, regulatorische Zusammenhänge zwischen ihnen zu lokalisieren, und daher bleiben die meisten Ziele der einzelnen regulatorischen Elemente in jedem Zelltyp unbekannt.

In den letzten Jahren gab es einen bedeutenden Boom bei der Entwicklung von Techniken zur Erfassung der Chromosomenkonformation (3C) zur Untersuchung von Chromatin-Interaktionen. Die am weitesten verbreitete von ihnen, Hi-C, ermöglicht es, eine Karte aller Interaktionen zwischen jedem Fragment des Genoms einer Zelle zu erstellen30. Um jedoch signifikante Wechselwirkungen auf der Ebene der Restriktionsfragmente zu erkennen, verlässt sich Hi-C auf eine ultratiefe Sequenzierung, die seine Verwendung zur routinemäßigen Untersuchung der regulatorischen Landschaft einzelner Gene verbietet. Um diese wirtschaftlichen Einschränkungen zu überwinden, haben sich mehrere anreicherungsbasierte 3C-Techniken herausgebildet, wie z. B. ChIA-PET31, HiChIP 32 und sein Gegenstück HiCuT33 mit geringem Input. Diese Techniken beruhen auf der Verwendung von Antikörpern zur Anreicherung für genomweite Interaktionen, die durch ein bestimmtes Protein vermittelt werden. Nichtsdestotrotz ist das Alleinstellungsmerkmal dieser 3C-Techniken auch der Fluch ihrer Anwendung; Anwender verlassen sich auf die Verfügbarkeit von qualitativ hochwertigen Antikörpern für das interessierende Protein und können Bedingungen nicht vergleichen, unter denen die Bindung des Proteins dynamisch ist.

Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) ist eine weitere anreicherungsbasierte 3C-Technik, die diese Einschränkungen umgeht34,35. Durch den Einsatz eines biotinylierten RNA-Sondenanreicherungssystems ist PCHi-C in der Lage, genomweite hochauflösende Bibliotheken von Genomregionen zu erstellen, die mit 28.650 humanen oder 27.595 mausannotierten Genpromotoren interagieren, die auch als Promotor-Interaktom bekannt sind. Dieser Ansatz ermöglicht es, signifikante langreichweitige Wechselwirkungen bei der Auflösung von Restriktionsfragmenten sowohl von aktiven als auch von inaktiven Promotoren zu detektieren und Promotor-Interaktome zwischen allen Bedingungen unabhängig von der Dynamik von Histonmodifikationen oder Proteinbindungen robust zu vergleichen. PCHi-C wurde in den letzten Jahren häufig eingesetzt, um Promotor-Interaktom-Reorganisationen während der Zelldifferenzierung zu identifizieren 36,37, den Wirkmechanismus von Transkriptionsfaktoren zu identifizieren38,39 und neue potenzielle Gene und Signalwege zu entdecken, die bei Krankheiten durch nicht-kodierende Varianten dereguliert werden 40,41,42,43,44,45,46,47,48, daneben neue nicht-kodierende Treibermutationen49,50. Außerdem kann diese Technik durch einfaches Modifizieren des Erfassungssystems entsprechend der biologischen Fragestellung angepasst werden, um jedes Interaktom (z. B. das Enhancer-Interaktom 51 oder das Interaktom einer Sammlung von nicht-kodierenden Veränderungen41, 52) abzufragen.

PCHi-C ist jedoch auf mindestens 20 Millionen Zellen angewiesen, um die Technik durchzuführen, was die Untersuchung knapper Zellpopulationen, wie sie häufig in der Entwicklungsbiologie und in klinischen Anwendungen verwendet werden, verhindert. Aus diesem Grund haben wir Low Input Capture Hi-C (liCHi-C) entwickelt, eine neue kostengünstige und anpassbare Methode, die auf dem experimentellen Rahmen von PCHi-C basiert, um hochauflösende Promotor-Interaktome mit geringem Zellinput zu erzeugen. Durch die Durchführung des Experiments mit minimalen Röhrchenänderungen, dem Austausch oder der Eliminierung von Schritten aus dem ursprünglichen PCHi-C-Protokoll, der drastischen Reduzierung des Reaktionsvolumens und der Änderung der Reagenzienkonzentrationen wird die Komplexität der Bibliothek maximiert und es ist möglich, qualitativ hochwertige Bibliotheken mit nur 50.000 Zellen zu generieren53.

Low Input Capture Hi-C (liCHi-C) wurde mit PCHi-C verglichen und verwendet, um die Neuverdrahtung des Promotor-Interaktoms während der Differenzierung menschlicher hämatopoetischer Zellen aufzuklären, potenzielle neue krankheitsassoziierte Gene und Signalwege zu entdecken, die durch nicht-kodierende Veränderungen dereguliert werden, und Chromosomenanomalien zu erkennen53. Das Schritt-für-Schritt-Protokoll und die verschiedenen Qualitätskontrollen durch die Technik werden hier bis zur endgültigen Generierung der Bibliotheken und ihrer rechnerischen Analyse detailliert beschrieben.

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Protocol

Um einen minimalen Materialverlust zu gewährleisten, (1) arbeiten Sie mit DNA-Röhrchen und -Spitzen mit geringer Bindung (siehe Materialtabelle), (2) platzieren Sie Reagenzien an der Röhrchenwand, anstatt die Spitze in die Probe einzuführen, und (3) mischen Sie die Probe nach Möglichkeit durch Inversion, anstatt die Probe auf und ab zu pipettieren, und schleudern Sie sie anschließend nach unten, um die Probe zu gewinnen.

1. Fixierung der Zellen

  1. Zellen, die in Suspension wachsen
    1. Ernten Sie 50.000 bis eine Million Zellen und legen Sie sie in ein 1,5-ml-Röhrchen mit geringer DNA-Bindung.
      HINWEIS: Die für die vorliegende Studie verwendeten Zelltypen sind im Abschnitt "Repräsentative Ergebnisse" aufgeführt.
    2. Zentrifugieren Sie die Zellen 5 min lang bei 600 x g (bei 4 °C) mit einer Festwinkelrotorzentrifuge und entfernen Sie den Überstand durch Pipettieren.
    3. Resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml RPMI 1640, ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum (FBS) bei Raumtemperatur.
    4. Fügen Sie 143 μl methanolfreies 16%iges Formaldehyd hinzu, um eine Konzentration von 2% zu erreichen, und mischen Sie.
    5. Inkubieren Sie die Zellen 10 Minuten lang, während Sie sie bei Raumtemperatur drehen, um die Zellen zu fixieren.
      Anmerkungen: Versuchen Sie, mit der 10-minütigen Inkubationszeit so genau wie möglich zu sein. Eine Über- oder Unterfixierung der Zellen kann zu einer Verschlechterung der Qualität der Bibliothek führen.
    6. Die Reaktion durch Zugabe von 164 μl eiskaltem 1 M Glycin abschrecken und mischen. Inkubieren Sie die Zellen 5 Minuten lang und drehen Sie sie bei Raumtemperatur.
    7. Inkubieren Sie die Zellen 15 Minuten lang auf Eis und mischen Sie sie alle ~5 Minuten durch Inversion.
    8. Zentrifugieren Sie die Zellen 10 min lang bei 1.000 x g (bei 4 °C) mit einer Festwinkelrotorzentrifuge und entfernen Sie den Überstand.
    9. Waschen Sie die Zellen, indem Sie das Pellet in 1 ml eiskalter 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) resuspendieren.
    10. Zentrifugieren Sie die Zellen 10 min lang bei 1.000 x g (bei 4 °C) und entfernen Sie den Überstand.
      HINWEIS: Die pelletierten Zellen können in flüssigem Stickstoff oder Trockeneis schockgefroren und bei -80 °C gelagert werden.
  2. Adhärente Zellen
    1. Waschen Sie die Zellen in der Kulturschale mit 1x PBS.
    2. Bereiten Sie bei Raumtemperatur genügend RPMI 1640 zu, ergänzt mit 10 % FBS und methanolfreiem 2 % Formaldehyd, um die Kulturschale zu bedecken.
    3. Geben Sie das zugesetzte Medium mit den Zellen in die Kulturschale und inkubieren Sie es 10 Minuten lang, wobei Sie es bei Raumtemperatur schaukeln, um die Zellen zu fixieren.
      Anmerkungen: Versuchen Sie, mit der 10-minütigen Inkubationszeit so genau wie möglich zu sein. Eine Über- oder Unterfixierung der Zellen kann zu einer Verschlechterung der Qualität der Bibliothek führen.
    4. Die Reaktion durch Zugabe von 1 M Glycin bis 0,125 M abschrecken und durch Schaukeln mischen.
    5. Inkubieren Sie die Zellen 5 Minuten lang und schaukeln Sie sie bei Raumtemperatur.
    6. Die Zellen werden 15 min bei 4 °C weiter inkubiert, dabei alle 3-4 min geschaukelt.
    7. Entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen mit kaltem 1x PBS.
    8. Kratzen Sie die Zellen ab und übertragen Sie sie in ein 1,5-ml-DNA-Röhrchen mit geringer Bindung. Wischen Sie die Kulturschale mit 0,5-1 ml kaltem 1x PBS sauber.
    9. Zentrifugieren Sie die Zellen 10 min lang bei 1.000 x g (bei 4 °C) mit einer Festwinkelrotorzentrifuge und entfernen Sie den Überstand. Die pelletierten Zellen können in flüssigem Stickstoff oder Trockeneis schockgefroren und bei -80 °C gelagert werden.

2. Lyse und Verdauung

  1. Resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml kaltem Lysepuffer (Tabelle 1), um die Zellmembran aufzubrechen. Die Zugabe des Puffers allein sollte ausreichen, um die Zellen zu resuspendieren, aber sie können bei Bedarf durch Lichtwirbel weiter resuspendiert werden.
  2. 30 Minuten auf Eis inkubieren lassen, alle ~5 Minuten durch Inversion mischen. Zentrifugieren Sie die Kerne 10 min lang bei 1.000 x g (bei 4 °C) und entfernen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie die Zellkerne mit 500 μl kaltem 1,25-fachem Restriktionspuffer 2 (siehe Materialtabelle).
  3. Zentrifugieren Sie die Kerne 10 min lang bei 1.000 x g (bei 4 °C) und entfernen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie die Zellkerne in 179 μl 1,25-fachem Restriktionspuffer 2.
  4. 5,5 μl 10%iges Natriumdodecylsulfat (SDB; siehe Materialtabelle) zugeben und mischen. Die Zellen können Klumpen bilden; Dies ist normal und muss durch Vortexing so weit wie möglich disaggregiert werden. Inkubieren Sie die Probe 1 h lang bei 37 °C in einem Thermoblock unter Schütteln bei 950 U/min.
  5. Schrecken Sie das SDB ab, indem Sie 37,5 μl 10% Triton X-100 hinzufügen und mischen. Inkubieren Sie die Probe 1 h lang bei 37 °C in einem Thermoblock unter Schütteln bei 950 U/min.
  6. Verdauen Sie das Chromatin, indem Sie 7,5 μl HindIII (100 U/μl; siehe Materialtabelle) hinzufügen und mischen. Inkubieren Sie die Probe über Nacht bei 37 °C in einem Thermoblock und schütteln Sie sie bei 950 U/min.
  7. Fügen Sie am nächsten Morgen weitere 2,5 μl HindIII (100 U/μL) hinzu und inkubieren Sie die Probe 1 h lang bei 37 °C in einem Thermoblock, wobei Sie sie bei 950 U/min schütteln, um einen ordnungsgemäßen Chromatinaufschluss zu gewährleisten.
    HINWEIS: Übertragen Sie im Rahmen der Aufschlusseffizienzkontrollen (siehe Schritt 5.1) das Äquivalent von 20.000 bis 40.000 Kernen in ein anderes Röhrchen, um die unverdaute Kontrolle darzustellen. Übertragen Sie nach der Verdauung die gleiche Anzahl von Zellen erneut in ein anderes Röhrchen, um die verdaute Kontrolle darzustellen. Es wird empfohlen, die Aufschlusseffizienz als separates Experiment zu testen, wenn die Verfügbarkeit des Ausgangsmaterials knapp ist.

3. Ligatur und Entkreuzung

  1. Kühlen Sie die Probe auf Eis. Bereiten Sie einen Mastermix vor und fügen Sie die folgenden Reagenzien hinzu, um die Überhänge des Restriktionsfragments zu füllen und zu biotinylieren: 3 μl 10x Restriktionspuffer 2, 1 μl nukleasefreies Wasser, 0,75 μl 10 mM dCTP, 0,75 μl 10 mM dTTP, 0,75 μl 10 mM dGTP, 18,75 μl 0,4 mM Biotin-14-dATP und 5 μl 5 U/μL Klenow (siehe Materialtabelle). Inkubieren Sie die Probe 75 min lang bei 37 °C und mischen Sie sie alle ~15 min durch Inversion.
  2. Kühlen Sie die Probe auf Eis. Bereiten Sie einen Mastermix vor und fügen Sie die folgenden Reagenzien hinzu, um die ausgefüllten DNA-Enden zu ligieren: 50 μl 10x Ligationspuffer, 2,5 μl 20 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA), 12,5 μl 1 U/μl T4-DNA-Ligase und 173 μl nukleasefreies Wasser (siehe Materialtabelle).
  3. Inkubieren Sie die Probe für 4-6 h bei 16 °C und mischen Sie alle ~1 h durch Inversion. Des Weiteren wird die Probe 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Entkreuzen Sie das Chromatin, indem Sie 30 μl 10 mg/ml Proteinase K hinzufügen und mischen. Inkubieren Sie die Probe über Nacht bei 65 °C.
  4. Fügen Sie am nächsten Morgen weitere 15 μl 10 mg/ml Proteinase K hinzu und inkubieren Sie die Probe 2 h lang bei 65 °C, um eine ordnungsgemäße Chromatin-Entkreuzung zu gewährleisten.

4. DNA-Reinigung

  1. Kühlen Sie die Probe auf Raumtemperatur ab und geben Sie sie zur Phenol-Chloroform-Reinigung in ein geeignetes Röhrchen.
  2. Fügen Sie 1 Volumen (545 μl) Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1) hinzu, um die DNA zu reinigen, und mischen Sie sie durch kräftiges Schütteln.
  3. Zentrifugieren Sie die Probe 5 Minuten lang bei 12.000 x g bei Raumtemperatur und überführen Sie die obere wässrige Phase (545 μl) in ein 2-ml-DNA-Röhrchen mit geringer Bindung.
  4. Fügen Sie die folgenden Reagenzien hinzu, um die DNA auszufällen: 1.362,5 μl 100 % Ethanol, gekühlt auf -20 °C, 54,5 μl 3 M Natriumacetat (pH 5,2) und 2 μl 15 mg/ml Glykogen als Kopiermittel.
  5. 1 h bei -80 °C oder über Nacht bei -20 °C inkubieren.
  6. Zentrifugieren Sie die Probe 30 min lang bei 16.000-21.000 x g bei 4 °C und entfernen Sie den Überstand. Das DNA-Pellet muss sichtbar sein.
  7. Waschen Sie das Pellet, indem Sie 1 ml 70%iges Ethanol hinzufügen, wirbeln und 10 Minuten lang bei 16.000-21.000 x g bei Raumtemperatur zentrifugieren.
  8. Entfernen Sie den Überstand und lassen Sie das Pellet an der Luft trocknen. Resuspendieren Sie das DNA-Pellet in 130 μl nukleasefreiem Wasser.
  9. Beurteilen Sie die Konzentration durch fluorometrische Quantifizierung (siehe Materialtabelle). Lagern Sie das gereinigte 3C-Material mehrere Monate lang bei -20 °C, bevor Sie mit dem Protokoll fortfahren.

5. Optionale Qualitätskontrollen

  1. Beurteilen Sie die Verdauungseffizienz. Die in Schritt 2.13 erhaltene unverdaute und verdaute Kontrollen werden wie zuvor beschrieben entkreuzen und Phenol:Chloroform-DNA-Aufreinigung durchführen. Resuspendieren Sie das DNA-Pellet in 10 μl nukleasefreiem Wasser. Quantifizieren Sie die Konzentration und verdünnen Sie die erhaltene DNA bei Bedarf auf 4 ng/μl.
  2. Führen Sie eine quantitative PCR mit 4 ng DNA sowohl der unverdauten als auch der verdauten Kontrollgruppe durch, wobei die Primer einen offenen Chromatin-Locus mit und ohne HindIII-Target umfassen (siehe Tabelle 2 für das Primerdesign). Berechnen Sie die Effizienz der Verdauung nach einem zuvor veröffentlichten Bericht35.
    ANMERKUNG: Die Effizienz der Ligatur wird in Prozent nach folgender Formel berechnet: Verdauung (%) = 100 -100/(2^[(Ct verdaut mit HindIII - Ctverdaut ohne HindIII) - (Ct unverdaut mit HindIII - Ct unverdaut ohne HindIII)]) (siehe Tabelle 3), wobei die Differenz der verschiedenen Cts berücksichtigt wird, die für jedes Primerpaar in der unverdauten und der verdauten Kontrolle erhalten wurden.
  3. Bewerten Sie die Sensitivität der Interaktionsdetektion durch die Durchführung einer konventionellen Polymerase-Kettenreaktion (PCR) (0,2 mM dNTP, 0,4 μm beide F + R-Primer, 0,1 und U/μL Hot-Start-Polymerase), wobei Primer sowohl lang- als auch kurzreichweitige zellinvariante Wechselwirkungen abdecken (siehe Tabelle 2 für das Primerdesign). Verwenden Sie 50-100 ng 3C-Material (für kurz- bzw. langreichweitige Wechselwirkungen) und amplifizieren Sie unter den folgenden Bedingungen: 98 °C für 15 min, gefolgt von 37 Zyklen von 98 °C für 30 s, 60 °C für 1 min, 72 °C für 1 min und beenden bei 72 °C für 10 min. Bei 4 °C halten.
    HINWEIS: Wenn die erhaltene DNA-Menge weniger als 2 μg beträgt, überprüfen Sie nur eine lang- und eine kurzreichweitige Wechselwirkung und nicht das gesamte Interaktionspanel.
  4. Lassen Sie das Produkt auf 1x Tris-Borat-EDTA (TBE) mit 1,6%igem Agarosegel laufen und suchen Sie nach dem Vorhandensein des entsprechenden PCR-Amplikons54.
    HINWEIS: Aufgrund des unvorhersehbaren "Ausschneidens und Einfügens" des Genoms können unspezifische Banden auftreten. Solange die richtige Bandgröße eingehalten wird, wird sie als korrekt gewertet.
  5. Beurteilen Sie die Effizienz des Biotin-Fill-Ins und der Ligatur, indem Sie ein Kurzstrecken-PCR-Produkt mit HindIII, NheI (siehe Materialtabelle), beiden Enzymen oder keinem Enzym (Wasser) differentiell verdauen und das Produkt auf einem 1x TBE 1,6%igen Agarosegel laufen lassen. Ein korrektes Fill-In und eine korrekte Ligatur eliminieren das vorherige HindIII-Target und erzeugen ein neues NheI-Target, so dass das Amplikon nur in Gegenwart von NheI geschnitten werden sollte.
    HINWEIS: Um den Materialverlust zu minimieren, entnehmen Sie 2,5 μl eines PCR-Produkts mit kurzer Reichweite aus den Interaktionskontrollen und reamplifizieren Sie es fünfmal, um die Fill-in- und Ligationskontrollen durchzuführen.

6. Beschallung

  1. Übertragen Sie die 130 μl der Probe (füllen Sie sie mit nukleasefreiem Wasser auf, falls etwas für die Kontrollen verwendet wurde) in eine Küvette, die für die Beschallung geeignet ist.
  2. Richten Sie einen Wasserbad-Beschallungsgerät ein und beschallen Sie ihn mit den folgenden Parametern (optimiert für das in der Materialtabelle beschriebene Modell und die Küvetten): Einschaltdauer: 20%; Spitzenleistung: 50; Zyklen pro Burst: 200; Dauer: 65 s; und Temperaturbereich: 6-10 °C (8 °C optimal).
  3. Übertragen Sie die Probe in ein neues 1,5-ml-DNA-Röhrchen mit geringer Bindung.

7. End-Reparatur

  1. Bereiten Sie einen Mastermix vor und fügen Sie die folgenden Reagenzien hinzu, um die ungleichmäßigen Enden der DNA-Fragmente zu reparieren, die während der Beschallung entstanden sind: 18 μl 10x Ligationspuffer, je 18 μl 2,5 mM dNTP-Mix, 6,5 μl 3 U/μL T4-DNA-Polymerase, 6,5 μl 10 U/μL T4 PNK und 1,3 μL 5 U/μL Klenow (siehe Materialtabelle).
  2. Die Probe wird 30 min bei 20 °C inkubiert und mit Tris-low EDTA (TLE)-Puffer (siehe Tabelle 1) auf 300 μl aufgefüllt.

8. Biotin-Pulldown

  1. Übertragen Sie 150 μl C1-Streptavidin-Kügelchen (siehe Materialtabelle) pro Probe in ein 1,5-ml-Röhrchen, legen Sie sie auf einen 1,5-ml-Röhrchenmagneten und warten Sie 2-3 Minuten oder bis alle Kügelchen an der Wand haften. Entfernen Sie den Überstand und lassen Sie die Perlen zurück.
  2. Waschen Sie die Perlen mit 400 μl 1x Tween-Puffer (TB; siehe Tabelle 1). Um die Perlen zu waschen, fügen Sie den Puffer hinzu und resuspendieren Sie sie durch sanftes Wirbeln. Setzen Sie das Röhrchen wieder in den Magneten ein und warten Sie 2-3 Minuten oder bis alle Perlen an der Wand haften. Entfernen Sie den Überstand und lassen Sie die Perlen zurück.
  3. Waschen Sie die Perlen mit 300 μL 1x no Tween Buffer (NTB; siehe Tabelle 1). Resuspendieren Sie die Beads in 300 μl 2x NTB (siehe Tabelle 1).
    Anmerkungen: Die Perlen können beim Waschen mit Puffern ohne Waschmittel eine staubige Schicht um die Tubenwand bilden. Dies ist normal und hat keinen Einfluss auf das Ergebnis des Protokolls.
  4. Kombinieren Sie diese 300 μl Kügelchen in 2x NTB mit den 300 μl der Probe. 15 Minuten inkubieren und bei Raumtemperatur drehen, um die informativen DNA-Fragmente mit Biotin nach unten zu ziehen. Die Bibliothek klebt nun an den C1-Streptavidin-Kügelchen.
  5. Waschen Sie die Perlen mit 400 μL 1x NTB. Waschen Sie die Kügelchen mit 100 μl TLE-Puffer und resuspendieren Sie sie anschließend in 35,7 μl TLE-Puffer.

9. dATP-Tailing, Adapterligation und PCR-Amplifikation

  1. Bereiten Sie einen Mastermix vor und fügen Sie der Probe die folgenden Reagenzien hinzu, um die Enden der reparierten DNA-Fragmente zu dATP-Schwanz zu ziehen: 5 μl 10x Restriktionspuffer 2, 2,3 μl 10 mM dATP und 7 μl 5 U/μL Klenow exo-. Die Probe wird 30 min bei 37 °C inkubiert.
  2. Deaktivieren Sie Klenow exo- durch weitere Inkubation der Probe für 10 min bei 65 °C. Kühlen Sie die Probe auf Eis ab. Waschen Sie die Perlen mit 300 μl 1x TB. Waschen Sie die Perlen mit 300 μL 1x NTB.
  3. Waschen Sie die Kügelchen mit 100 μl 1x Ligationspuffer und resuspendieren Sie sie anschließend in 50 μl 1x Ligationspuffer. Der Probe werden 4 μl 15 μM vorgeglühte Adaptermischung (siehe Tabelle 2) und 1 μl 2.000 U/μL T4-DNA-Ligase (siehe Materialtabelle) zugegeben.
  4. 2 h bei Raumtemperatur inkubieren. Waschen Sie die Perlen mit 400 μl 1x TB. Waschen Sie die Perlen mit 200 μL 1x NTB. Waschen Sie die Perlen mit 100 μl 1x Restriktionspuffer 2.
  5. Waschen Sie die Kügelchen mit 50 μl 1x Restriktionspuffer 2 und resuspendieren Sie sie anschließend in 50 μl 1x Restriktionspuffer 2.
  6. Mischen Sie die folgenden Reagenzien, um die PCR-Reaktion zur Amplifikation der Bibliothek vorzubereiten: 50 μl Beads mit der Bibliothek, 250 μl 2x PCR-Mastermix mit Enzym, 12 μl F + R-Primer (je 25 μM; siehe Tabelle 2) und 188 μl nukleasefreies Wasser.
  7. Führen Sie die PCR unter den folgenden Bedingungen durch (teilen Sie die PCR-Reagenzienmischung in 50-μl-Reaktionen auf): 98 °C für 40 s, gefolgt von X-Zyklen von 98 °C für 10 s, 65 °C für 30 s, 72 °C für 30 s und Ende bei 72 °C für 10 min. Bei 4 °C halten.
    HINWEIS: Verwenden Sie die folgende Anzahl von Zyklen als Ausgangspunkt für die Optimierung des Protokolls in diploiden Zellen, die eine Ausgabe von 500-1.000 ng vor der Bibliothekserfassung anstreben: eine Million Zellen für acht Zyklen; 250.000 Zellen für 10 Zyklen; 50.000 Zellen für 12 Zyklen.
  8. Fassen Sie alle 50-μl-Reaktionen aus derselben Probe in einem 1,5-ml-DNA-Röhrchen mit geringer Bindung zusammen, legen Sie es auf einen 1,5-ml-Röhrchenmagneten und warten Sie 2-3 Minuten oder bis alle Kügelchen an der Wand kleben.
  9. Übertragen Sie den Überstand, der die Bibliothek enthält (500 μl), in ein neues 1,5-ml-DNA-Röhrchen mit geringer Bindung. Mit TLE-Puffer auf 500 μl auffüllen, wenn ein Teil des Überstands verloren gegangen ist. Die C1-Streptavidin-Kügelchen werden nicht mehr benötigt.
  10. Führen Sie eine doppelseitige Auswahl55 mit paramagnetischer Perlenreinigung (0,4-1 Volumen) durch. Dies ermöglicht die selektive Eliminierung von zu großen (>1.000 bp) und zu kleinen Fragmenten oder PCR-Primern (<200 bp), abhängig von der Konzentration von Polyethylenglykol und Salz der zugesetzten paramagnetischen Beads.
  11. Geben Sie 200 μl (0,4 Volumen) Stammperlen in die Bibliothek und mischen Sie sie durch Vortexen. 10 Minuten inkubieren lassen, dabei bei Raumtemperatur drehen.
  12. Legen Sie es auf einen Magneten, warten Sie 2-3 Minuten oder bis alle Perlen an der Wand kleben, und übertragen Sie den Überstand mit der Bibliothek (ohne die größeren Fragmente) in ein neues 1,5-ml-DNA-Röhrchen mit geringer Bindung.
  13. Konzentrieren Sie die Perlen, indem Sie 750 μl Brühperlen nehmen, sie in ein 1,5-ml-Röhrchen auf einen Magneten legen, 2-3 Minuten warten oder bis alle Perlen an der Wand kleben, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Perlen, indem Sie 300 μl neue Brühperlen einwerfen.
  14. Geben Sie diese 300 μl konzentrierte Kügelchen in die Probe (1 Volumen) und mischen Sie sie durch Wirbeln. 10 Minuten inkubieren lassen, dabei bei Raumtemperatur drehen. Auf einen Magneten legen, 2-3 Minuten warten oder bis alle Perlen an der Wand kleben, und den Überstand (mit den kleineren Fragmenten und PCR-Primern) entfernen.
  15. Waschen Sie die Perlen dreimal mit 1 ml 70%igem Ethanol. Fügen Sie dazu das Ethanol hinzu, während sich das Röhrchen mit den Perlen noch auf dem Magneten befindet, versuchen Sie, die Perlen nicht zu stören, und warten Sie 30-60 s. Entfernen Sie anschließend den Überstand, ohne die Perlen zu stören.
  16. Lassen Sie die Perlen an der Luft trocknen und resuspendieren Sie sie in 21 μl TLE-Puffer durch Vortexen.
    HINWEIS: Eine übermäßige Trocknung der Kügelchen kann die Ausbeute bei der Elution der DNA verringern. Versuchen Sie, sie sofort in TLE-Puffer zu resuspendieren, nachdem sie vom Ethanol nicht mehr "glänzend" sind.
  17. Inkubieren Sie die Probe 10 min lang bei 37 °C in einem Thermoblock, um die Bibliothek aus den Beads zu eluieren. Legen Sie das Röhrchen in einen Magneten und übertragen Sie den Überstand mit der Bibliothek in ein neues 1,5-ml-DNA-Röhrchen mit geringer Bindung.
  18. Quantifizieren Sie die Größe und Konzentration durch automatisierte Elektrophorese (siehe Materialtabelle). Gereinigtes Hi-C-Material kann mehrere Monate lang bei -20 °C gelagert werden, bevor mit dem Protokoll fortgefahren wird.

10. Erfassung der Bibliothek

  1. Arbeiten Sie mit 500-1.000 ng der Bibliothek. Konzentrieren Sie die Bibliothek, indem Sie die DNA mit einem Vakuumkonzentrator trocknen und das Material in 3,4 μl nukleasefreiem Wasser resuspendieren.
  2. Fügen Sie der Probe die folgenden Blocker aus dem Target-Anreicherungskit (siehe Materialtabelle) hinzu: 2,5 μl Blocker 1, 2,5 μl Blocker 2 und 0,6 μl benutzerdefinierter Oligoblocker für die Adapter.
  3. Gründlich resuspendieren, die Lösung in einen 0,2-ml-PCR-Streifen überführen und 5 min bei 95 °C in einem Thermocycler inkubieren, gefolgt von 5 min bei 65 °C mit erhitztem Deckel. Lassen Sie das Röhrchen bei 65 °C inkubieren.
  4. Bereiten Sie die Hybridisierungslösung vor, indem Sie die folgenden Reagenzien aus dem Target-Anreicherungskit (siehe Materialtabelle) pro Probe (13 μl) kombinieren. Bei Raumtemperatur auf dem Tisch aufbewahren: 6,63 μl Hyb 1, 0,27 μl Hyb 2, 2,65 μl Hyb 3 und 3,45 μl Hyb 4.
  5. Verdünnen Sie 0,5 μl RNase-Block aus dem Target-Anreicherungskit mit 1,5 μl nukleasefreiem Wasser pro Probe. Tauen Sie 5 μl der biotinylierten RNA pro Probe auf Eis auf und fügen Sie die 2 μl des verdünnten RNase-Blocks hinzu. Bei Raumtemperatur auf der Bank aufbewahren.
  6. Die 13 μl der Hybridisierungslösung zu den 7 μl der biotinylierten RNA mit RNase geben und gut vermischen.
  7. Auf dem Thermocycler bei 65 °C wird die Hybridisierungslösung mit der biotinylierten RNA (20 μL) in die blockierte Bibliothek überführt. Den Röhrchendeckel fest verschließen und über Nacht bei 65 °C im Thermocycler inkubieren.
    HINWEIS: Um die Probenverdampfung (die zu einer suboptimalen RNA-DNA-Hybridisierung führen kann) zu minimieren, wenn mehrere Proben gleichzeitig durchgeführt werden, verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um die biotinylierte RNA gleichzeitig in jede Bibliothek zu übertragen.

11. Biotin-Pulldown und PCR-Amplifikation

  1. Übertragen Sie 50 μl T1-Streptavidin-Kügelchen pro Probe in ein 1,5-ml-DNA-Röhrchen mit geringer Bindung, legen Sie sie auf einen 1,5-ml-Röhrchenmagneten und warten Sie 2-3 Minuten oder bis alle Kügelchen an der Wand haften. Entfernen Sie den Überstand und lassen Sie die Perlen zurück. Waschen Sie die Kügelchen dreimal mit 200 μl des Bindungspuffers aus dem Target Enrichment Kit.
  2. Resuspendieren Sie die Beads in 200 μl Bindungspuffer. Auf dem Thermocycler bei 65 °C wird die Probe in die resuspendierten T1-Streptavidin-Beads überführt und 30 Minuten lang inkubiert, wobei sie sich bei Raumtemperatur dreht.
  3. Waschen Sie die Kügelchen mit 200 μl Waschpuffer 1 aus dem Target Enrichment Kit. 15 Minuten inkubieren lassen, dabei bei Raumtemperatur rotieren. Waschen Sie die Kügelchen dreimal mit 200 μl Waschpuffer 2 aus dem auf 65 °C erhitzten Zielanreicherungskit. 10 min bei 65 °C in einem Thermoblock inkubieren, zwischen den Wäschen bei 300 U/min schütteln.
  4. Waschen Sie die Kügelchen mit 200 μl 1x Restriktionspuffer 2 und resuspendieren Sie sie anschließend in 30 μl 1x Restriktionspuffer 2.
  5. Mischen Sie die folgenden Reagenzien, um die PCR-Reaktion zur Amplifikation der Bibliothek vorzubereiten: 30 μL Beads mit der Bibliothek, 150 μL 2x PCR Mastermix mit Enzym, 7,2 μL F + R Primer (je 25 μM; siehe Tabelle 2) und 112,8 μL Nuklease-freies Wasser.
  6. Führen Sie die PCR unter den folgenden Bedingungen durch (teilen Sie die PCR-Reagenzienmischung in 50-μl-Reaktionen auf): 98 °C für 40 s, gefolgt von vier Zyklen von 98 °C für 10 s, 65 °C für 30 s, 72 °C für 30 s und beenden Sie mit 72 °C für 10 min. Bei 4 °C halten.
  7. Fassen Sie alle 50-μl-Reaktionen aus derselben Probe in einem 1,5-ml-DNA-Röhrchen mit geringer Bindung zusammen, legen Sie es auf einen 1,5-ml-Röhrchenmagneten und warten Sie 2-3 Minuten oder bis alle Kügelchen an der Wand kleben.
  8. Übertragen Sie den Überstand mit der Bibliothek (300 μl) in ein neues 1,5-ml-DNA-Röhrchen mit geringer Bindung. Mit TLE-Puffer auf 300 μl auffüllen, wenn ein Teil des Überstands verloren gegangen ist. Die T1-Streptavidin-Kügelchen werden nicht mehr benötigt.
  9. Führen Sie eine DNA-Aufreinigung mit paramagnetischen Beads (0,9 Volumen; siehe Materialtabelle) durch. Geben Sie 270 μl Brühperlen in die Probe und mischen Sie sie durch Wirbeln.
  10. 10 Minuten inkubieren lassen, dabei bei Raumtemperatur drehen.
  11. Auf einen Magneten legen, 2-3 Minuten warten oder bis alle Perlen an der Wand kleben, und den Überstand entfernen.
  12. Waschen Sie die Perlen dreimal mit 1 ml 70%igem Ethanol. Fügen Sie dazu das Ethanol hinzu, während sich das Röhrchen mit den Perlen noch auf dem Magneten befindet, und versuchen Sie, die Perlen nicht zu stören, und warten Sie 30-60 s. Entfernen Sie anschließend den Überstand, ohne die Perlen zu stören.
  13. Lassen Sie die Perlen an der Luft trocknen und resuspendieren Sie sie in 21 μl TLE-Puffer durch Vortexen.
    HINWEIS: Eine übermäßige Trocknung der Kügelchen kann die Ausbeute bei der Elution der DNA verringern. Versuchen Sie, sie sofort in TLE-Puffer zu resuspendieren, nachdem sie vom Ethanol nicht mehr "glänzend" sind.
  14. Inkubieren Sie die Probe 10 min lang bei 37 °C in einem Thermoblock, um die Bibliothek aus den Beads zu eluieren.
  15. Legen Sie das Röhrchen in einen Magneten und übertragen Sie den Überstand mit der Bibliothek in ein neues 1,5-ml-DNA-Röhrchen mit geringer Bindung.
  16. Quantifizieren Sie die Größe und Konzentration durch automatisierte Elektrophorese.

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Representative Results

liCHi-C bietet die Möglichkeit, mit nur 50.000 Zellen qualitativ hochwertige und hochauflösende genomweite Promotor-Interaktombibliotheken zu generieren53. Dies wird erreicht, indem – neben der drastischen Reduzierung des Reaktionsvolumens und der Verwendung von DNA-Plasticware mit geringer Bindung im gesamten Protokoll – unnötige Schritte aus dem ursprünglichen Protokoll entfernt werden, bei denen erhebliche Materialverluste auftreten. Dazu gehören die Phenolreinigung nach der Entkreuzung, die Biotinentfernung und die anschließende Phenol-Chloroform-Reinigung und Ethanolfällung. Darüber hinaus können wir durch die Neuorganisation der Schritte der Herstellung der Hi-C-Bibliothek (Biotin-Pulldown, A-Tailing, Adapterligation, PCR-Amplifikation und doppelseitige paramagnetische Bead-Selektion - auch als PCR-Produktaufreinigung) einen weiteren unnötigen DNA-Aufreinigungsschritt entfernen. Eine Übersicht über den experimentellen Arbeitsablauf finden Sie in Abbildung 1A.

Um die Qualität der Bibliothek zu bewerten, werden während des gesamten Protokolls mehrere Kontrollen durchgeführt, von denen die erste die Berechnung der Effizienz der Genomverdauung ist. Werte über 80 % gelten als akzeptabel (Tabelle 3). Es wird empfohlen, die Verdauungseffizienz des Zelltyps in einem separaten Experiment zu überprüfen, um nicht eine signifikante Menge an Material aus einem einzigen liCHi-C-Experiment zu verlieren. Zweitens wird empfohlen, vor der Beschallung und Endreparatur die Sensitivität des Interaktionsnachweises durch Amplifikation von invarianten Chromatin-Wechselwirkungen des Zelltyps mittels konventioneller PCR zu überprüfen (Abbildung 1B). Wenn das spezifische Produkt nachgewiesen wird, sollte eine dritte Kontrolle durchgeführt werden, die sich auf die Effizienz der Biotinylierung und Ligation konzentriert, indem eines der zuvor erhaltenen PCR-Produkte mit HindIII und NheI differentiell verdaut wird (Abbildung 1C, D). Wenn eine verdaute HindIII-Restriktionsstelle gefüllt und mit einer anderen stumpf ligiert wird, wird eine neue NheI-Restriktionsstelle erzeugt, anstatt die ursprüngliche HindIII-Restriktionsstelle zu regenerieren. Daher sollte der Aufschluss des PCR-Amplikons nur bei Anwesenheit von NheI beobachtet werden. Schließlich, kurz vor und nach dem gesamten Fang, sollten die Konzentration und Größenverteilung mittels automatisierter Elektrophorese überprüft werden. Die Amplifikation der Bibliothek vor der Erfassung muss darauf abzielen, 500-1.000 ng Hi-C-Material zu erhalten, genau die Menge, die für die RNA-Sondenerfassung benötigt wird, da eine übermäßige Amplifikation sowohl der prä- als auch der post-capturenten Bibliothek zu einem hohen Prozentsatz an PCR-Duplikaten und dem daraus resultierenden Verlust von Sequenzierungslesevorgängen während der Analyse führt. Bibliotheken können unter den gleichen Bedingungen erneut reamplifiziert werden, wenn bei der ersten konservativen PCR-Amplifikation nicht genügend Material gewonnen wird. Die Menge an nacherfasstem Bibliotheksmaterial kann variieren, aber als Faustregel gilt, dass sie etwa zehn- bis 20-mal geringer sein sollte als vor der Erfassung. Die Größenverteilung der Bibliothek sollte um 450-550 bp liegen (Abbildung 2A,B), unveränderlich zwischen prä- und post-erfassten Bibliotheken. Insgesamt gewährleisten korrekte Ergebnisse dieser Kontrollen die Generierung exzellenter liCHi-C-Bibliotheken.

Fertige liCHi-C-Bibliotheken werden dann (mindestens) 100 bp gepaart sequenziert und analysiert. Rohe Sequenzierungsdaten53 werden unter Verwendung der HiCUP-Pipeline56 zum Zuordnen und Herausfiltern von Artefakten verarbeitet. Der ideale HiCUP-Bericht zeigt eine fünf- bis zehnfache Zunahme der Verteilung von cis (innerhalb desselben Chromosoms) im Vergleich zu trans (zwischen verschiedenen Chromosomen) Paired-End-Reads, wie zuvor gemäß der In-Nucleus-Ligation Hi-C57 beschrieben (Abbildung 3B). Die Erzielung von mehr als 100 Millionen eindeutigen, validen Lesevorgängen nach der Entfernung von PCR-Duplikaten reicht aus, um mit dem nächsten Schritt in der Analyse fortzufahren (Abbildung 3B), nämlich der Bewertung der Erfassungseffizienz. Paired-End-Reads, bei denen keines ihrer Enden in ein vom RNA-Sonden-Anreicherungssystem erfasstes Restriktionsfragment abgebildet wird, werden verworfen, wobei nur diejenigen beibehalten werden, die das Promotor-Interaktom der Zelle repräsentieren (d. h. solche Reads, bei denen mindestens eines ihrer Enden in Restriktionsfragmente abgebildet wird, die einen oder mehrere Genpromotoren enthalten [Abbildung 3C], idealerweise mehr als 60%).

Schließlich werden signifikante Wechselwirkungen mit der CHiCAGO-Pipeline genannt, wie in58,59 beschrieben. Zwei oder mehr biologische Replikate werden für den endgültigen Satz signifikanter Promotorinteraktionen benötigt. Die Datenqualität kann auch mit Hilfe der Hauptkomponentenanalyse (PCA) validiert werden, da biologische Replikate gruppiert und Zelltypen getrennt werden müssen. Durch die Analyse von liCHi-C-Datensätzen von vier verschiedenen primären Zelltypen aus dem menschlichen hämatopoetischen Baum (gemeinsame myeloische Vorläuferzellen, Monozyten, Megakaryozyten und Erythroblasten) können wir beispielsweise in einer PCA beobachten, dass sich liCHi-C-Bibliotheken in einer entwicklungspfadreflektierenden Weise anhäufen (Abbildung 3D). Eine genauere Untersuchung der signifikanten Wechselwirkungen, die für die vier Zelltypen nachgewiesen wurden, zeigt, dass Promotor-Interaktome zelltypspezifisch und dynamisch während der Zellentwicklung sind. Zum Beispiel zeigt das AHSP-Gen, ein Schlüssel-Chaperon, das in erythroiden Vorläufern synthetisiert wird und die korrekte Faltung von Hämoglobin60,61,62 überwacht, einen Gewinn an Interaktionen mit potenziell aktiven regulatorischen Elementen (d. h. H3K27ac- und H3K4me1-angereicherten Regionen) in Erythroblasten, aber nicht in anderen Zelltypen (Abbildung 4). Dies zeigt, dass die liCHi-C-Methode mögliche regulatorische Wechselwirkungen in seltenen Zelltypen aufdecken kann.

Figure 1
Abbildung 1: Protokollübersicht und Qualitätskontrollen der Probe vor der Beschallung . (A) Schematische Übersicht des liCHi-C-Protokolls geteilt nach Tagen. Die Zeiger B und die blauen Zeiger stehen für Biotinmoleküle bzw. -schritte, in denen man das Protokoll für einen längeren Zeitraum sicher stoppen kann. (B) Repräsentative Ergebnisse der 3C-Interaktionskontrollen. Gezeigt werden beide Interaktionssets für Mensch (links) und Maus (rechts). Die zu erwartenden Bänder sind dunkelblau markiert, während ein unspezifisches Band hellblau markiert ist. (C) Repräsentative Fill-in- und Ligationskontrollen unter Verwendung des "Dekker"-Primerpaars für die menschliche Interaktion. Das Band wird nur in den Bahnen 2 und 3 geschnitten, wo NheI hinzugefügt wird. (D) Schematische Darstellung der Generierung einer neuen NheI-Restriktionsstelle während des Fill-Ins und der Ligatur einer HindIII-Restriktionsstelle. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Repräsentative automatisierte Elektrophoreseprofile aus Bibliotheken vor und nach der Erfassung . (A) Automatisiertes Elektrophoreseprofil aus einer Bibliothek kurz vor der Erfassung. Die Gesamtmenge der erhaltenen DNA beträgt 994 ng (49,7 ng/μl in 20 μl). (B) Hochempfindliches automatisiertes Elektrophoreseprofil aus einer fertigen liCHi-C-Bibliothek. Die Probe wird halbverdünnt geladen, um so viel Material wie möglich zu erhalten. Die Gesamtmenge der erhaltenen DNA beträgt 61,2 ng (1,53 ng/μl in 20 μl x2, um die Verdünnung zu berücksichtigen). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Repräsentative Ausgabe der HiCUP-Pipeline und Clustering von Beispielreplikaten nach PCA . (A) Klassifizierung der Gültigkeit von Lesepaaren nach Prozentsätzen und Gesamtanzahl. Ungültige Lesepaare werden nach dem experimentellen Artefakttyp klassifiziert. (B) Deduplizierungsprozentsätze und Klassifizierung der Interaktionstypen. Cis-Wechselwirkungen werden weiter unterteilt in cis-nah (weniger als 10 kb) und cis-weit (mehr als 10 kb). (C) Prozentsatz der Erfassungseffizienz. Erfasste Read-Paare werden weiter unterteilt, unabhängig davon, ob ein Ende, das andere oder beide einen oder mehrere Promotoren enthalten. (D) Hauptkomponentenanalyse der signifikanten CHiCAGO-Interaktionsscores aus beiden Replikaten von liCHi-C-Bibliotheken aus gemeinsamen myeloischen Vorläuferzellen (CMP), Erythroblasten, Megakaryozyten und Monozyten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: AHSP-Interaktionslandschaft in humanen primären hämatopoetischen Zellen. Repräsentatives Beispiel für die AHSP-Promotor-zentrierte Interaktionslandschaft in gemeinsamen myeloischen Vorläuferzellen (CMP), Erythroblasten (Ery), Megakaryozyten (MK) und Monozyten (Mon), wie sie im WashU Epigenome Browser63 zu sehen ist. Bögen stellen signifikante Wechselwirkungen dar. Der dunkelblaue Farbton zeigt den AHSP-Genpromotor, während die hellblauen Farbtöne potentielle regulatorische Wirkstoffe überlappen, die spezifisch mit dem AHSP-Promotor in Erythroblasten interagieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Tabelle 1: Zusammensetzung und Zubereitung des Puffers. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: PCR-Primer und Adaptersequenzen. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 3: Beispiel für die Berechnung der Aufschlusseffizienz. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

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Discussion

liCHi-C bietet die Möglichkeit, hochauflösende Promotor-Interaktom-Bibliotheken zu generieren, indem ein ähnlicher experimenteller Rahmen wie PCHi-Cs verwendet wird, jedoch mit einer stark reduzierten Zellzahl. Dies wird in hohem Maße durch den Wegfall unnötiger Schritte wie Phenolreinigung und Biotinentfernung erreicht. Beim klassischen Hi-C-Protokoll57 für die Ligatur im Zellkern und seiner nachfolgenden Derivatetechnik PCHi-C wird Biotin aus nicht-ligierten Restriktionsfragmenten entfernt, um zu vermeiden, dass DNA-Fragmente heruntergezogen werden, die anschließend nicht mehr aussagekräftig sind. Das Überspringen dieses Teils und seiner anschließenden DNA-Aufreinigung führt nicht zu einer signifikanten Verringerung des Prozentsatzes der gültigen Reads (Abbildung 3A), während potenzielle DNA-verschwendende Schritte, d. h. DNA-Aufreinigungen, vermieden werden. Die Reorganisation der Hi-C-Bibliothekspräparation nach der Beschallung ermöglicht es, eine weitere unnötige Reinigung zu überspringen, indem die doppelseitige Auswahl als Reinigungsschritt selbst verwendet wird. All dies verbessert die Leistung des gesamten Protokolls durch minimale Röhrchenänderungen und ermöglicht zusammen mit der Reduzierung des Reaktionsvolumens, Änderungen der Reagenzienkonzentration und der Verwendung von DNA-Kunststoffen mit geringer Bindung die Erstellung hochwertiger Bibliotheken mit nur 50.000 Zellen. Es ist wichtig zu bedenken, dass die Anzahl der Startzellen aufgrund der Komplexität der Bibliothek zum Teil die Anzahl der signifikanten Interaktionen bestimmt. Obwohl Bibliotheken, die mit 50.000 Zellen generiert wurden, die zelltypspezifischen und invarianten topologischen Merkmale komplexerer Bibliothekenbeibehalten 53, empfehlen wir, wenn möglich mehr als 100.000 Zellen pro biologischem Replikat zu verwenden, um eine höhere Anzahl signifikanter Promotorinteraktionen zu erfassen.

Die Auflösung der in 3C-Techniken detektierten Wechselwirkungen wird im Wesentlichen durch das verwendete Restriktionsenzym gegeben. Hier wird die Anwendung von liCHi-C anhand von HindIII beschrieben, einem 6 bp-schneidenden Enzym, das eine theoretische mittlere Auflösung von 4.096 bp ergibt. liCHi-C ermöglicht es, das Restriktionsenzym beispielsweise durch ein 4 bp-schneidendes Enzym oder sogar eine Mikrokokken-Nuklease zu ersetzen, wodurch die Auflösung der nachgewiesenen signifikanten Wechselwirkungen erhöht wird. Es wurde berichtet, dass die Generierung von liCHi-C-Bibliotheken, bei denen das HindIII-Restriktionsenzym gegen das 4 bp-schneidende MboI-Enzym ausgetauscht wird, hervorragende Ergebnisse liefert, die fast doppelt so viele Wechselwirkungen detektieren, wenn auch mit der Verschiebung der mittleren linearen Distanz der detektierten Wechselwirkungen auf die Hälfte der Entfernung53.

In Bezug auf das eigentliche RNA-Sonden-Anreicherungssystem besteht einer der Hauptvorteile dieser Art der Erfassung gegenüber einem Antikörper-basierten System wie HiChIP32 oder HiCuT33 darin, dass die Bedingungen unabhängig von der Bindung des Proteins verglichen werden können und dass man sich nicht auf die Verfügbarkeit eines funktionierenden Antikörpers für das interessierende Protein verlassen muss. Darüber hinaus kann das RNA-Anreicherungssystem so angepasst werden, dass es jede spezifische Region genomweit erfasst, um den Bedürfnissen jedes Forschers gerecht zu werden (das Design wird in35,64 diskutiert).

Neben Antikörper-basierten Erfassungsmethoden wurden in den letzten Jahren mehrere herausragende Einzelzell- (wie z.B. scHi-C 65, Dip-C 66 oder Sci-Hi-C 67) oder Low-Input-Methoden (wie z.B. Low-C 68 oder Easy Hi-C 69) zur Untersuchung der 3D-Genomarchitektur entwickelt. Diese erzeugen jedoch spärliche Kontaktkarten mit geringer Auflösung, die die Identifizierung von Kontakten zwischen distalen regulatorischen Elementen und Zielgenen nicht erlauben. liCHi-C ist eine Methode, die in der Lage ist, diese Einschränkung zu überwinden, indem sie die Möglichkeit eröffnet, die promotorzentrierte Genomarchitektur in seltenen Zelltypen zu untersuchen und unser Verständnis der Zell- und Entwicklungsbiologie sowie der Krankheitsentwicklung zu erweitern.

Trotz all seiner Eigenschaften ist liCHi-C nicht frei von Einschränkungen. Erstens ist die Verarbeitung der Rohsequenzierungsdaten nicht trivial, und es sind faire Rechenfähigkeiten erforderlich, um die Daten zu analysieren und ihre Ergebnisse zu interpretieren. Darüber hinaus unterscheidet liCHi-C nicht zwischen funktionellen und strukturellen Interaktionen; Es ist erforderlich, dass die liCHi-C-Daten mit epigenetischen Daten und/oder funktionellen Analysen integriert werden, um die potenziellen funktionellen Interaktionen von Genpromotoren mit ihren regulatorischen Zielelementen zu validieren. Schließlich wird die Komplexität der Bibliothek geopfert, wenn am unteren Ende der Zellzahlen gearbeitet wird. Dies spiegelt sich in der Anzahl der nachgewiesenen einzigartigen Interaktionen im Vergleich zu liCHi-C-Bibliotheken mit höherer Zellzahl und deren Deduplizierungsrate wider, die bis zu 80 % erreichen kann. LiCHi-C-Bibliotheken mit niedriger Zellzahl behalten jedoch die topologischen Merkmale von Bibliotheken mit höherer Zellzahl in einer fokaleren Weisebei 53, was zeigt, dass es möglich ist, liCHi-C-Bibliotheken durchzuführen, die das Promotorinteraktom der Zelle mit nur 50.000 Zellen rekapitulieren.

Insgesamt ist liCHi-C eine kostengünstige und anpassbare Methode, um qualitativ hochwertige und hochauflösende Promotor-Interaktom-Bibliotheken in seltenen Zelltypen zu erzeugen. Es ist die erste Low-Input-Methode, um das Promotor-Interaktom abzubilden und signifikante Schleifen bei der Auflösung des Restriktionsfragments zu fordern. Wir gehen davon aus, dass dieses neue Werkzeug, wie sein Vorgänger PCHi-C, neue Einblicke in die Zelldifferenzierung und die Entwicklung von Organismen liefern wird, sowohl in Bezug auf Gesundheit als auch auf Krankheit.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Wir danken den anderen Mitgliedern des Javierre-Labors für ihr Feedback zum Manuskript. Wir danken dem CERCA-Programm, der Generalitat de Catalunya und der Josep-Carreras-Stiftung für die institutionelle Unterstützung. Diese Arbeit wurde von der FEDER/dem spanischen Ministerium für Wissenschaft und Innovation (RTI2018-094788-A-I00), der European Hematology Association (4823998) und der Spanish Association against Cancer (AECC) LABAE21981JAVI finanziert. BMJ wird durch das Junior Leader-Projekt der La Caixa Banking Foundation (LCF/BQ/PI19/11690001) finanziert, LR wird durch ein AGAUR FI-Stipendium (2019FI-B00017) und LT-D durch ein FPI-Stipendium (PRE2019-088005) finanziert. Wir danken dem Doktorandenprogramm Biochemie und Molekularbiologie der Universitat Autònoma de Barcelona für seine Unterstützung. Keiner der Geldgeber war zu irgendeinem Zeitpunkt an der Versuchsplanung oder dem Schreiben des Manuskripts beteiligt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.4 mM Biotin-14-dATP Invitrogen 19524-016
0.5 M EDTA pH 8.0 Invitrogen AM9260G
1 M Tris pH 8.0 Invitrogen AM9855G
10x NEBuffer 2 New England Biolabs B7002S Referenced as restriction buffer 2 in the manuscript
10x PBS Fisher Scientific BP3994
10x T4 DNA ligase reaction buffer New England Biolabs B0202S
16% formaldehyde solution (w/v), methanol-free Thermo Scientific 28908
20 mg/mL Bovine Serum Albumin New England Biolabs B9000S
5 M NaCl Invitrogen AM9760G
5PRIME Phase Lock Gel Light tubes Qiuantabio 2302820 For phenol-chloroform purification in section 4 (DNA purification). Phase Lock Gel tubes are a commercial type of tubes specially designed to maximize DNA recovery after phenol-chloroform purifications while avoiding carryover of contaminants in the organic phase by containing a resin of intermediate density which settles between the organic and aqueous phase and isolates them. PLG tubes should be spun at 12,000 x g for 30 s before use to ensure that the resin is well-placed at the bottom of the tube
Adapters and PCR primers for library amplification Integrated DNA Technologies - Bought as individual primers with PAGE purification for NGS
Cell scrappers Nunc 179693 Or any other brand
Centrifuge (fixed-angle rotor for 1.5 mL tubes) Any brand
CHiCAGO R package 1.14.0
CleanNGS beads CleanNA CNGS-0050
dATP, dCTP, dGTP, dTTP Promega U120A, U121A, U122A, U123A Or any other brand
DNA LoBind tube, 1.5 mL Eppendorf 30108051
DNA LoBind tube, 2 mL Eppendorf 30108078
DNA polymerase I large (Klenow) fragment 5000 units/mL New England Biolabs M0210L
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 beads Invitrogen 65002 For biotin pull-down of the pre-captured library in section 8 (biotin pull-down)
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 beads Invitrogen 65602 For biotin pull-down of the post-captured library in section 11 (biotin pull-down and PCR amplification)
DynaMag-2 Invitrogen 12321D Or any other magnet suitable for 1.5 ml tubeL
Ethanol absolute VWR 20821.321
FBS, qualified Gibco 10270-106 Or any other brand
Glycine Fisher BioReagents BP381-1
GlycoBlue Coprecipitant Invitrogen AM9515 Used for DNA coprecipitation in section 4 (DNA purification)
HiCUP 0.8.2
HindIII, 100 U/µL New England Biolabs R0104T
IGEPAL CA-630 Sigma-Aldrich I8896-50ML
Klenow EXO- 5000 units/mL New England Biolabs M0212L
Low-retention filter tips (10 µL, 20 µL, 200 µL and 1000 µL) ZeroTip PMT233010, PMT252020, PMT231200, PMT252000
M220 Focused-ultrasonicator Covaris 500295
Micro TUBE AFA Fiber Pre-slit snap cap 6 x 16 mm vials Covaris 520045 For sonication in section 6 (sonication)
NheI-HF, 100 U/µL New England Biolabs R3131M
Nuclease-free molecular biology grade water Sigma-Aldrich W4502
PCR primers for quality controls Integrated DNA Technologies -
PCR strips and caps Agilent Technologies 410022, 401425
Phenol: Chloroform: Isoamyl Alcohol 25:24:1, Saturated with 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA Sigma-Aldrich P3803
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer New England Biolabs M0531L For amplification of the library in sections 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification)
and 11 (biotin pull-down and PCR amplification)
Protease inhibitor cocktail (EDTA-free) Roche 11873580001
Proteinase K, recombinant, PCR grade Roche 3115836001
Qubit 1x dsDNA High Sensitivity kit Invitrogen Q33230 For DNA quantification after precipitation in section 4 (DNA purification)
Qubit assay tubes Invitrogen Q32856
rCutsmart buffer New England Biolabs B6004S
RPMI Medium 1640 1x + GlutaMAX Gibco 61870-010 Or any other brand
SDS - Solution 10% for molecular biology PanReac AppliChem A0676
Sodium acetate pH 5.2 Sigma-Aldrich S7899-100ML
SureSelect custom 3-5.9 Mb library Agilent Technologies 5190-4831 Custom designed mouse or human capture system, used for the capture
SureSelect Target Enrichment Box 1 Agilent Technologies 5190-8645 Used for the capture
SureSelect Target Enrichment Kit ILM PE Full Adapter Agilent Technologies 931107 Used for the capture
T4 DNA ligase 1 U/µL Invitrogen 15224025 For ligation in section 3 (ligation and decrosslink)
T4 DNA ligase 2000000/mL New England Biolabs M0202T For ligation in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification)
T4 DNA polymerase 3000 units/mL New England Biolabs M0203L
T4 PNK 10000 units/mL New England Biolabs M0201L
Tapestation 4200 instrument Agilent Technologies For automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and
section 11 (Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid
Tapestation reagents Agilent Technologies 5067-5582, 5067-5583, 5067-5584, 5067-5585, For automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and
section 11 (Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid
Triton X-100 for molecular biology PanReac AppliChem A4975
Tween 20 Sigma-Aldrich P9416-50ML

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References

  1. Hatton, C. S., et al. α-thalassemia caused by a large (62 kb) deletion upstream of the human α globin gene cluster. Blood. 76 (1), 221-227 (1990).
  2. Toikkanen, S., Helin, H., Isola, J., Joensuu, H. Prognostic significance of HER-2 oncoprotein expression in breast cancer: A 30-year follow-up. Journal of Clinical Oncology. 10 (7), 1044-1048 (1992).
  3. Church, C., et al. Overexpression of Fto leads to increased food intake and results in obesity. Nature Genetics. 42 (12), 1086-1092 (2010).
  4. Bhatia, S., et al. Disruption of autoregulatory feedback by a mutation in a remote, ultraconserved PAX6 enhancer causes aniridia. American Journal of Human Genetics. 93 (6), 1126-1134 (2013).
  5. Herranz, D., et al. A NOTCH1-driven MYC enhancer promotes T cell development, transformation and acute lymphoblastic leukemia. Nature Medicine. 20 (10), 1130-1137 (2014).
  6. Carter, D., Chakalova, L., Osborne, C. S., Dai, Y. F., Fraser, P. Long-range chromatin regulatory interactions in vivo. Nature Genetics. 32 (4), 623-626 (2002).
  7. Rao, S. S. P., et al. A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).
  8. Schoenfelder, S., Fraser, P. Long-range enhancer-promoter contacts in gene expression control. Nature Reviews Genetics. 20 (8), 437-455 (2019).
  9. Heintzman, N. D., et al. Distinct and predictive chromatin signatures of transcriptional promoters and enhancers in the human genome. Nature Genetics. 39 (3), 311-318 (2007).
  10. Zentner, G. E., Tesar, P. J., Scacheri, P. C. Epigenetic signatures distinguish multiple classes of enhancers with distinct cellular functions. Genome Research. 21 (8), 1273-1283 (2011).
  11. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  12. McPherson, C. E., Shim, E. Y., Friedman, D. S., Zaret, K. S. An active tissue-specific enhancer and bound transcription factors existing in a precisely positioned nucleosomal array. Cell. 75 (2), 387-398 (1993).
  13. He, A., Kong, S. W., Ma, Q., Pu, W. T. Co-occupancy by multiple cardiac transcription factors identifies transcriptional enhancers active in heart. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (14), 5632-5637 (2011).
  14. Dogan, N., et al. Occupancy by key transcription factors is a more accurate predictor of enhancer activity than histone modifications or chromatin accessibility. Epigenetics and Chromatin. 8, 16 (2015).
  15. Whyte, W. A., et al. transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes. Cell. 153 (2), 307-319 (2013).
  16. Hnisz, D., et al. Super-enhancers in the control of cell identity and disease. Cell. 155 (4), 934-947 (2013).
  17. He, H. H., et al. Nucleosome dynamics define transcriptional enhancers. Nature Genetics. 42 (4), 343-347 (2010).
  18. Song, L., et al. Open chromatin defined by DNaseI and FAIRE identifies regulatory elements that shape cell-type identity. Genome Research. 21 (10), 1757-1767 (2011).
  19. De Santa, F., et al. A large fraction of extragenic RNA Pol II transcription sites overlap enhancers. PLoS Biology. 8 (5), e1000384 (2010).
  20. Kim, T. K., et al. Widespread transcription at neuronal activity-regulated enhancers. Nature. 465 (7295), 182-187 (2010).
  21. ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  22. Wu, H., et al. Tissue-specific RNA expression marks distant-acting developmental enhancers. PLoS Genetics. 10 (9), e1004610 (2014).
  23. Banerji, J., Rusconi, S., Schaffner, W. Expression of a β-globin gene is enhanced by remote SV40 DNA sequences. Cell. 27 (2), 299-308 (1981).
  24. Amano, T., et al. Chromosomal dynamics at the Shh locus: limb bud-specific differential regulation of competence and active transcription. Developmental Cell. 16 (1), 47-57 (2009).
  25. Shi, J., et al. Role of SWI/SNF in acute leukemia maintenance and enhancer-mediated Myc regulation. Genes and Development. 27 (24), 2648-2662 (2013).
  26. Lettice, L. A., et al. A long-range Shh enhancer regulates expression in the developing limb and fin and is associated with preaxial polydactyly. Human Molecular Genetics. 12 (14), 1725-1735 (2003).
  27. Tuvikene, J., et al. Intronic enhancer region governs transcript-specific Bdnf expression in rodent neurons. eLife. 10, e65161 (2021).
  28. Tasic, B., et al. Promoter choice determines splice site selection in protocadherin α and γ pre-mRNA splicing. Molecular Cell. 10 (1), 21-33 (2002).
  29. Perry, M. W., Boettiger, A. N., Levine, M. Multiple enhancers ensure precision of gap gene-expression patterns in the Drosophila embryo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (33), 13570-13575 (2011).
  30. Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326 (5950), 289-293 (2009).
  31. Fullwood, M. J., et al. An oestrogen-receptor-α-bound human chromatin interactome. Nature. 462 (7269), 58-64 (2009).
  32. Mumbach, M. R., et al. HiChIP: Efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture. Nature Methods. 13 (11), 919-922 (2016).
  33. Sati, S., et al. HiCuT: An efficient and low input method to identify protein-directed chromatin interactions. PLoS Genetics. 18 (3), e1010121 (2022).
  34. Schoenfelder, S., et al. The pluripotent regulatory circuitry connecting promoters to their long-range interacting elements. Genome Research. 25 (4), 582-597 (2015).
  35. Schoenfelder, S., Javierre, B. M., Furlan-Magaril, M., Wingett, S. W., Fraser, P. Promoter capture Hi-C: High-resolution, genome-wide profiling of promoter interactions. Journal of Visualized Experiments. (136), e57320 (2018).
  36. Rubin, A. J., et al. Lineage-specific dynamic and pre-established enhancer-promoter contacts cooperate in terminal differentiation. Nature Genetics. 49 (10), 1522-1528 (2017).
  37. Siersbæk, R., et al. Dynamic rewiring of promoter-anchored chromatin loops during adipocyte differentiation. Molecular Cell. 66 (3), 420-435 (2017).
  38. Schoenfelder, S., et al. Polycomb repressive complex PRC1 spatially constrains the mouse embryonic stem cell genome. Nature Genetics. 47 (10), 1179-1186 (2015).
  39. Zhang, N., et al. Muscle progenitor specification and myogenic differentiation are associated with changes in chromatin topology. Nature Communications. 11 (1), 6222 (2020).
  40. Javierre, B. M., et al. Lineage-specific genome architecture links enhancers and non-coding disease variants to target gene promoters. Cell. 167 (5), 1369-1384 (2016).
  41. Jäger, R., et al. Capture Hi-C identifies the chromatin interactome of colorectal cancer risk loci. Nature Communications. 6, 6178 (2015).
  42. Martin, P., et al. Identifying causal genes at the multiple sclerosis associated region 6q23 using capture Hi-C. PLoS One. 11 (11), e0166923 (2016).
  43. Burren, O. S., et al. Chromosome contacts in activated T cells identify autoimmune disease candidate genes. Genome Biology. 18 (1), 165 (2017).
  44. Choy, M. K., et al. Promoter interactome of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes connects GWAS regions to cardiac gene networks. Nature Communications. 9 (1), 2526 (2018).
  45. Miguel-Escalada, I., et al. Human pancreatic islet three-dimensional chromatin architecture provides insights into the genetics of type 2 diabetes. Nature Genetics. 51 (7), 1137-1148 (2019).
  46. Law, P. J., et al. Association analyses identify 31 new risk loci for colorectal cancer susceptibility. Nature Communications. 10 (1), 2154 (2019).
  47. Speedy, H. E., et al. Insight into genetic predisposition to chronic lymphocytic leukemia from integrative epigenomics. Nature Communications. 10 (1), 3615 (2019).
  48. Li, T., et al. Epigenomics and transcriptomics of systemic sclerosis CD4+ T cells reveal long-range dysregulation of key inflammatory pathways mediated by disease-associated susceptibility loci. Genome Medicine. 12 (1), 81 (2020).
  49. Orlando, G., et al. Promoter capture Hi-C-based identification of recurrent noncoding mutations in colorectal cancer. Nature Genetics. 50 (10), 1375-1380 (2018).
  50. Cornish, A. J., et al. Identification of recurrent noncoding mutations in B-cell lymphoma using capture Hi-C. Blood Advances. 3 (1), 21-32 (2019).
  51. Madsen, J. G. S., et al. Highly interconnected enhancer communities control lineage-determining genes in human mesenchymal stem cells. Nature Genetics. 52 (11), 1227-1238 (2020).
  52. Dryden, N. H., et al. Unbiased analysis of potential targets of breast cancer susceptibility loci by Capture Hi-C. Genome Research. 24 (11), 1854-1868 (2014).
  53. Tomás-Daza, L., et al. Low input capture Hi-C (liCHi-C) identifies promoter-enhancer interactions at high-resolution. Nature Communications. 14 (1), 268 (2023).
  54. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. 62 (62), e3923 (2012).
  55. Bronner, I. F., Quail, M. A. Best practices for Illumina library preparation. Current Protocols in Human Genetics. 102 (1), 86 (2019).
  56. Wingett, S., et al. HiCUP: pipeline for mapping and processing Hi-C data. F1000Research. 4, 1310 (2015).
  57. Nagano, T., et al. Comparison of Hi-C results using in-solution versus in-nucleus ligation. Genome Biology. 16 (1), 175 (2015).
  58. Cairns, J., et al. CHiCAGO: Robust detection of DNA looping interactions in Capture Hi-C data. Genome Biology. 17 (1), 127 (2016).
  59. Freire-Pritchett, P., et al. Detecting chromosomal interactions in Capture Hi-C data with CHiCAGO and companion tools. Nature Protocols. 16 (9), 4144-4176 (2021).
  60. Kihm, A. J., et al. An abundant erythroid protein that stabilizes free α-haemoglobin. Nature. 417 (6890), 758-763 (2002).
  61. Feng, L., et al. Molecular mechanism of AHSP-mediated stabilization of α-hemoglobin. Cell. 119 (5), 629-640 (2004).
  62. Favero, M. E., Costa, F. F. Alpha-hemoglobin-stabilizing protein: An erythroid molecular chaperone. Biochemistry Research International. 2011, 373859 (2011).
  63. Li, D., et al. WashU Epigenome Browser update 2022. Nucleic Acids Research. 50 (W1), W774-W781 (2022).
  64. Mifsud, B., et al. Mapping long-range promoter contacts in human cells with high-resolution capture Hi-C. Nature Genetics. 47 (6), 598-606 (2015).
  65. Nagano, T., et al. Single-cell Hi-C reveals cell-to-cell variability in chromosome structure. Nature. 502 (7469), 59-64 (2013).
  66. Tan, L., Xing, D., Chang, C. H., Li, H., Xie, X. S. 3D genome structures of single diploid human cells. Science. 361 (6405), 924 (2018).
  67. Ramani, V., et al. Massively multiplex single-cell Hi-C. Nature Methods. 14 (3), 263-266 (2017).
  68. Díaz, N., et al. Chromatin conformation analysis of primary patient tissue using a low input Hi-C method. Nature Communications. 9 (1), 4938 (2018).
  69. Lu, L., Jin, F. Easy Hi-C: A low-input method for capturing genome organization. Methods in Molecular Biology. 2599, 113-125 (2023).

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Genetik Heft 194
Ein integrierter Workflow zur Untersuchung der Promotor-zentrierten raum-zeitlichen Genomarchitektur in seltenen Zellpopulationen
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Rovirosa, L., Tomás-Daza, L., Urmeneta, B., Valencia, A., Javierre, B. M. An Integrated Workflow to Study the Promoter-Centric Spatio-Temporal Genome Architecture in Scarce Cell Populations. J. Vis. Exp. (194), e65316, doi:10.3791/65316 (2023).

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