一种用于在稀有细胞群体中研究以启动子为中心的时空基因组结构的整合工作流程

摘要

基因表达受到基因启动子与远端调控元件相互作用的调控。本文介绍了低起始量的捕获染色体构象捕获技术（liCHi-C）如何实现对稀有细胞类型中这些相互作用的鉴定，而这些细胞类型在此前是无法测量的。

摘要

时空特异性的基因转录受到远端调控元件（如增强子和沉默子）的严格调控，这些元件依赖于与靶基因启动子的物理邻近来控制转录。尽管这些调控元件易于识别，但其靶基因却难以预测，因为大多数调控元件具有细胞类型特异性，并且在线性基因组序列中可能与靶基因相距数十万碱基对，中间跨越了多个非靶基因。多年来，启动子捕获高通量染色体构象捕获技术（Promoter Capture Hi-C, PCHi-C）一直是将远端调控元件与其靶基因关联的金标准。然而，PCHi-C 需要数百万个细胞，限制了其在稀有细胞群体（例如常从原代组织中获得的细胞）研究中的应用。为了克服这一限制，已开发出一种低成本且可定制的低起始量捕获 Hi-C 技术（low input Capture Hi-C, liCHi-C），用于鉴定调控基因组中每个基因的远端调控元件谱。liCHi-C 采用与 PCHi-C 相似的实验和计算框架，但通过尽量减少管转移步骤、调整 试剂浓度和体积，以及替换或省略某些步骤，最大限度地减少了文库构建过程中的样本损失。 总体而言，liCHi-C 使得在发育生物学和细胞功能背景下研究基因调控及基因组的时空组织成为可能。

引言

基因的时间特异性表达驱动细胞分化，并最终影响生物体的发育，其表达模式的改变与多种疾病密切相关^1,2,3,4,5。基因转录受到调控元件的精细调控，这些元件可分为近端调控元件（如基因启动子）和远端调控元件（如增强子或沉默子），后者通常位于其靶基因较远的位置，并通过染色质成环结构与靶基因发生物理相互作用，从而调控基因表达^6,7,8。

基因组中远端调控区域的鉴定是一个广受认可的研究方向，因为这些区域含有特定的组蛋白修饰^9,10,11，并包含特定的转录因子识别基序，可作为转录因子的招募平台^12,

方案

为尽量减少材料损失，（1）使用低吸附DNA的离心管和吸头（参见材料表）；（2）将试剂加至管壁，避免将吸头插入样品内部；（3）如有可能，通过倒置混匀样品而非反复吹打，随后离心收集样品。

1. 细胞固定

1. 悬浮生长的细胞
   1. 收集 50,000 至一百万个细胞，并将其置于一个 DNA 低吸附性的 1.5 mL 离心管中。
      注意：本研究所用的细胞类型详见代表性结果部分。
   2. 使用固定角转子离心机在 4 °C 条件下以 600 x g 离心 5 分钟，并用移液器吸除上清液。
   3. 在室温下，用 1 mL 添加了 10% 胎牛血清（FBS）的 RPMI 1640 培养基重悬细胞。
   4. 加入 143 µL 无甲醇的 16% 甲醛，使终浓度达到 2%，并混匀。
   5. 在室温下旋转孵育 10 分钟，以固定细胞。
      注意：请尽可能准确控制 10 分钟的孵育时间。细胞固定过度或不足均可能导致文库质量下降。
   6. 加入 164 µL 冰冷的 1 M 甘氨酸以终止反应，并混匀。在室温下旋转孵育 5 分钟。
   7. 将细胞进一步在冰上孵育 15 分钟，每隔约 5 分钟轻轻颠倒混匀一次。
   8. 使用固定角转子离心机在 4 °C 条件下以....

结果

liCHi-C 能够以低至 50,000 个细胞生成高质量、高分辨率的全基因组启动子互作图谱文库⁵³。这不仅通过大幅降低反应体积并在整个实验流程中使用低吸附 DNA 塑料耗材实现，还通过从原始方案中去除若干导致显著材料损失的非必要步骤达成。这些步骤包括交联逆转后的苯酚纯化、生物素去除，以及后续的苯酚-氯仿纯化和乙醇沉淀。此外，重新组织 Hi-C 文库构建步骤（包括生物素下拉、A 尾修饰、接头连接、PCR 扩增和双端磁珠筛选，以及 PCR 产物纯化）使我们能够进一步去除另一个不必要的 DNA 纯化步骤。实验流程概览见图 1A。

为评估文库质量，需在整个实验流程中进行多项质控，其中第一项为计算基因组消化效率；通常认为超过 80% 的数值是可接受的（表 3）。建议在独立实验中检测特定细胞类型的消化效率，以避免在单次 liCHi-C 实验中损失大量样本材料。第二，在超声破碎与末端修复之前，建议通过常规 PCR 扩增细胞类型不变的染色质相互作用，以检测.......

讨论

liCHi-C 能够利用与 PCHi-C 相似的实验框架，但所需细胞数量显著减少，从而生成高分辨率的启动子互作组图谱文库。这一优势主要通过省略不必要的步骤实现，例如苯酚纯化和生物素去除。在经典的细胞核内连接 Hi-C 协议⁵⁷ 及其衍生技术 PCHi-C 中，需将未连接的限制性酶切片段上的生物素去除，以避免富集后续无信息价值的 DNA 片段。跳过该步骤及其后续的 DNA 纯化过程，并不会显著降低有效读段的比例（图 3A），同时避免了可能造成 DNA 损失的纯化步骤。在超声破碎后的 Hi-C 文库构建过程中重新设计流程，可通过双端筛选直接作为纯化步骤，从而省去另一次不必要的纯化。所有这些改进通过最大限度减少离心管转移操作，结合反应体系体积的缩小、试剂浓度的优化以及低吸附 DNA 塑料耗材的使用，使得仅用 50,000 个细胞即可构建高质量文库成为可能。需要谨记的是，起始细胞数量在一定程度上决定了文库复杂性，从而影响显著互作的数量。尽管使用 50,000 个细胞构建的文库仍保留了细胞类型特异性和稳定的拓扑结构特征

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.4 mM 生物素-14-dATP	Invitrogen	19524-016
0.5 M EDTA pH 8.0	Invitrogen	AM9260G
1 M Tris pH 8.0	Invitrogen	AM9855G
10x NEBuffer 2	New England Biolabs	B7002S	在文稿中称为限制性酶切缓冲液2
10x PBS	Fisher Scientific	BP3994
10x T4 DNA连接酶反应缓冲液	New England Biolabs	B0202S
16% 甲醛溶液（w/v），无甲醇	Thermo Scientific	28908
20 mg/mL 牛血清白蛋白	New England Biolabs	B9000S
5 M NaCl	Invitrogen	AM9760G
5PRIME Phase Lock Gel Light 管	Qiuantabio	2302820	用于第4节中的酚-氯仿纯化（DNA纯化）。Phase Lock Gel管是一种商业化的专用离心管，设计用于在酚-氯仿纯化后最大化DNA回收率，同时通过含有中等密度的树脂将有机相与水相分隔开来，防止有机相中的污染物残留。使用前应以12,000 × g离心30秒，确保树脂充分沉降至管底
文库扩增用接头和PCR引物	Integrated DNA Technologies	-	作为单个引物购买，经PAGE纯化用于NGS
细胞刮刀	Nunc	179693	或任何其他品牌
离心机（适用于1.5 mL离心管的固定角转子）	任何品牌
CHiCAGO R软件包	1.14.0
CleanNGS磁珠	CleanNA	CNGS-0050
dATP、dCTP、dGTP、dTTP	Promega	U120A, U121A, U122A, U123A	或任何其他品牌
DNA LoBind管，1.5 mL	Eppendorf	30108051
DNA LoBind管，2 mL	Eppendorf	30108078
DNA聚合酶I大片段（Klenow）5000单位/mL	New England Biolabs	M0210L
Dynabeads MyOne 链霉亲和素C1磁珠	Invitrogen	65002	用于第8节中预捕获文库的生物素富集（生物素富集）
Dynabeads MyOne 链霉亲和素T1磁珠	Invitrogen	65602	用于第11节中后捕获文库的生物素富集（生物素富集和PCR扩增）
DynaMag-2	Invitrogen	12321D	或任何适用于1.5 mL离心管的磁力架
无水乙醇	VWR	20821.321
经认证的胎牛血清（FBS）	Gibco	10270-106	或任何其他品牌
甘氨酸	Fisher BioReagents	BP381-1
GlycoBlue共沉淀剂	Invitrogen	AM9515	用于第4节中的DNA共沉淀（DNA纯化）
HiCUP	0.8.2
HindIII，100 U/µL	New England Biolabs	R0104T
IGEPAL CA-630	Sigma-Aldrich	I8896-50ML
Klenow EXO- 5000单位/mL	New England Biolabs	M0212L
低吸附滤芯吸头 (10 µL, 20 µL, 200 µL 和 1000 µL)	ZeroTip	PMT233010, PMT252020, PMT231200, PMT252000
M220 聚焦超声破碎仪	Covaris	500295
Micro TUBE AFA Fiber 预切裂口卡扣盖 6 x 16 mm 管	Covaris	520045	用于第6节中的超声处理（超声处理）
NheI-HF，100 U/µL	New England Biolabs	R3131M
无核酸酶分子生物学级水	Sigma-Aldrich	W4502
用于质量控制的PCR引物	Integrated DNA Technologies	-
PCR排管 和管盖	Agilent Technologies	410022, 401425
酚:氯仿:异戊醇 25:24:1，用含10 mM Tris（pH 8.0）、1 mM EDTA的溶液饱和	Sigma-Aldrich	P3803
Phusion 高保真PCR预混液（含HF缓冲液）	New England Biolabs	M0531L	用于第9节中文库扩增（dATP加尾、接头连接和PCR扩增） 和第11节（生物素富集和PCR扩增）
蛋白酶抑制剂混合物（无EDTA）	Roche	11873580001
重组蛋白酶K，PCR级	Roche	3115836001
Qubit 1x dsDNA 高灵敏度检测试剂盒	Invitrogen	Q33230	用于第4节中沉淀后DNA的定量（DNA纯化）
Qubit检测管	Invitrogen	Q32856
rCutsmart缓冲液	New England Biolabs	B6004S
RPMI 1640培养基 1x + GlutaMAX	Gibco	61870-010	或任何其他品牌
SDS - 分子生物学用10%溶液	PanReac AppliChem	A0676
乙酸钠 pH 5.2	Sigma-Aldrich	S7899-100ML
SureSelect 定制3-5.9 Mb文库	Agilent Technologies	5190-4831	定制的小鼠或人源捕获系统，用于靶向捕获
SureSelect 靶向富集试剂盒Box 1	Agilent Technologies	5190-8645	用于靶向捕获
SureSelect 靶向富集试剂盒 ILM PE 全接头	Agilent Technologies	931107	用于靶向捕获
T4 DNA连接酶 1 U/µL	Invitrogen	15224025	用于第3节中的连接反应（连接与去交联）
T4 DNA连接酶 2000000/mL	New England Biolabs	M0202T	用于第9节中的连接反应（dATP加尾、接头连接和PCR扩增）
T4 DNA聚合酶 3000单位/mL	New England Biolabs	M0203L
T4 PNK 10000单位/mL	New England Biolabs	M0201L
Tapestation 4200仪器	Agilent Technologies		用于第9节中的自动化电泳（dATP加尾、接头连接和PCR扩增）和 第11节（生物素富集和PCR扩增）。任何其他自动化电泳系统均可使用
Tapestation试剂	Agilent Technologies	5067-5582, 5067-5583, 5067-5584, 5067-5585,	用于第9节中的自动化电泳（dATP加尾、接头连接和PCR扩增）和 第11节（生物素富集和PCR扩增）。任何其他自动化电泳系统均可使用
分子生物学级Triton X-100	PanReac AppliChem	A4975
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416-50ML