Summary
基因表达由基因启动子与远端调控元件的相互作用调节。在这里，我们解释了低输入捕获Hi-C（liCHi-C）如何允许在稀有细胞类型中鉴定这些相互作用，这些相互作用以前是无法测量的。
Abstract
时空基因转录受到远端调控元件（如增强子和消音器）的严格调控，这些元件依赖于与靶基因启动子的物理接近来控制转录。虽然这些调控元件很容易识别，但它们的靶基因很难预测，因为它们中的大多数是细胞类型特异性的，并且可能在线性基因组序列中被数百个千碱基分开，跳过其他非靶基因。几年来，启动子捕获Hi-C（PCHi-C）一直是远端调控元件与其靶基因关联的黄金标准。然而，PCHi-C依赖于数百万个细胞的可用性，禁止研究稀有细胞群，例如通常从原代组织获得的细胞群。为了克服这一限制，已经开发了低输入捕获Hi-C（liCHi-C），这是一种经济高效且可定制的方法来识别控制基因组每个基因的远端调控元件库。liCHi-C依赖于与PCHi-C类似的实验和计算框架，但通过采用最小的试管更换，修改试剂浓度和体积，以及交换或消除步骤，它可以在文库构建过程中实现最小的材料损失。总的来说，liCHi-C能够在发育生物学和细胞功能的背景下研究基因调控和时空基因组组织。
Introduction
时间基因表达驱动细胞分化，并最终推动生物体发育，其改变与多种疾病密切相关1，2，3，4，5。基因转录受调控元件作用的精细调控，调控元件可分为近端（即基因启动子）和远端（例如增强子或消音器），后者通常位于远离其靶基因的位置，并通过染色质环与它们发生物理相互作用以调节基因表达6，7，8。
基因组中远端调控区域的鉴定是一个被广泛同意的问题，因为这些区域具有特定的组蛋白修饰9，10，11并且包含特定的转录因子识别基序，作为它们的招募平台12，13，14。此外，在增强子和超级增强子15，16的情况下，它们还具有低核小体占用率17，18，并转录为非编码eRNA19，20。
尽管如此，每个远端调控元件的靶基因更难预测。通常情况下，远端调控元件与其靶标之间的相互作用是细胞类型和刺激特异性的21，22，跨越数百千碱基，在任何方向上桥接其他基因23，24，25，甚至可以位于其靶基因或其他非干预基因的内含子区域内26，27.此外，远端调控元件也可以同时控制多个基因，反之亦然28，29。这种位置复杂性阻碍了它们之间的调控关联，因此，每种细胞类型中每个调控元件的大多数靶标仍然是未知的。
近年来，用于研究染色质相互作用的染色体构象捕获（3C）技术的发展出现了显着的繁荣。其中使用最广泛的Hi-C允许生成细胞基因组每个片段之间所有相互作用的图谱30。然而，为了检测限制性片段水平上的显着相互作用，Hi-C依赖于超深度测序，禁止将其用于常规研究单个基因的调控环境。为了克服这种经济限制，已经出现了几种基于富集的3C技术，例如ChIA-PET31，HiChIP 32及其低输入对应物HiCuT33。这些技术依赖于使用抗体来富集由特定蛋白质介导的全基因组相互作用。尽管如此，这些3C技术的独特之处也是其应用的祸根;用户依赖于目标蛋白质的高质量抗体的可用性，并且无法比较蛋白质结合是动态的条件。
启动子捕获Hi-C（PCHi-C）是另一种基于富集的3C技术，可规避这些限制34，35。通过采用生物素化RNA探针富集系统，PCHi-C能够生成全基因组高分辨率基因组区域文库，这些文库与28，650个人类或27，595个小鼠注释的基因启动子（也称为启动子相互作用组）相互作用。这种方法允许人们在活性和非活性启动子的限制性片段水平分辨率下检测显着的长程相互作用，并可靠地比较任何条件之间的启动子相互作用组，而与组蛋白修饰或蛋白质结合的动力学无关。近年来，PCHi-C已被广泛用于鉴定细胞分化过程中的启动子相互作用组重组36，37，鉴定转录因子38，39的作用机制，并发现通过非编码变异40，41，42，43，44，45在疾病中失调的新潜在基因和途径，46，47，48，以及新的驱动程序非编码突变49，50。此外，通过仅修改捕获系统，该技术可以根据生物学问题进行定制，以询问任何相互作用组（例如，增强子相互作用组51或非编码改变的相互作用组41，52）。
然而，PCHi-C依赖于至少2000万个细胞来执行该技术，这阻止了对稀缺细胞群的研究，例如经常用于发育生物学和临床应用的细胞群。出于这个原因，我们开发了低输入捕获Hi-C（liCHi-C），这是一种基于PCHi-C实验框架的具有成本效益和可定制的新方法，用于生成具有低细胞输入的高分辨率启动子相互作用组。通过以最少的试管更换进行实验，交换或消除原始PCHi-C方案中的步骤，大幅减少反应体积并修改试剂浓度，文库复杂性最大化，并且可以生成低至50，000个细胞的高质量文库53。
低输入捕获Hi-C（liCHi-C）已针对PCHi-C进行基准测试，并用于阐明人类造血细胞分化过程中启动子相互作用组重新布线，发现潜在的新疾病相关基因和因非编码改变而失调的途径，并检测染色体异常53。这里详细介绍了分步协议和通过该技术的不同质量控制，直到库的最终生成及其计算分析。
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Protocol
为确保最小的材料损失，（1）使用DNA低结合管和吸头（参见 材料表），（2）将试剂放在管壁上，而不是将吸头引入样品内部，（3）如果可能，通过倒置而不是上下移液样品混合样品，然后向下旋转以回收样品。
1. 细胞固定
- 悬浮生长的细胞
- 收获 50，000 至 100 万个细胞，并将它们放入 DNA 低结合的 1.5 mL 管中。
注意：用于本研究的细胞类型详见代表性结果部分。 - 使用固定角度转子离心机在600× g （4°C）下离心细胞5分钟，并通过移液除去上清液。
- 在室温下将细胞重悬于补充有 10% 胎牛血清 （FBS） 的 1 mL RPMI 1640 中。
- 加入 143 μL 不含甲醇的 16% 甲醛，达到 2% 的浓度并混合。
- 将细胞孵育10分钟，同时在室温下旋转以固定细胞。
注意：尝试在10分钟的孵育中尽可能准确。细胞的过度固定或固定不足会导致文库质量下降。 - 通过加入 164 μL 冰冷的 1 M 甘氨酸并混合来淬灭反应。孵育细胞5分钟，在室温下旋转。
- 进一步将细胞在冰上孵育15分钟，每~5分钟倒置混合一次。
- 使用固定角度转子离心机在1，000× g （4°C）下离心细胞10分钟并除去上清液。
- 通过将沉淀重悬于1 mL冰冷的1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）中来洗涤细胞。
- 将细胞在1，000× g （4°C）下离心10分钟并除去上清液。
注意：沉淀的细胞可以在液氮或干冰中快速冷冻并储存在-80°C。
- 收获 50，000 至 100 万个细胞，并将它们放入 DNA 低结合的 1.5 mL 管中。
- 贴壁细胞
- 用1x PBS洗涤培养皿中的细胞。
- 在室温下准备足够的补充有10%FBS和无甲醇2%甲醛的RPMI 1640以覆盖培养皿。
- 将补充的培养基与细胞一起添加到培养皿中，孵育10分钟，在室温下摇动以固定细胞。
注意：尝试在10分钟的孵育中尽可能准确。细胞的过度固定或固定不足会导致文库质量下降。 - 通过加入1M甘氨酸至0.125M并通过摇摆混合来淬灭反应。
- 将细胞孵育5分钟，在室温下摇摆。
- 进一步将细胞在4°C孵育15分钟，每3-4分钟摇动混合一次。
- 取出培养基并用冷的1x PBS洗涤细胞。
- 刮取细胞并将其转移到 1.5 mL DNA 低结合管中。用 0.5-1 mL 冷的 1x PBS 擦拭培养皿。
- 使用固定角度转子离心机在1，000× g （4°C）下离心细胞10分钟并除去上清液。颗粒细胞可以在液氮或干冰中快速冷冻并储存在-80°C。
2. 裂解和消化
- 将细胞重悬于1 mL冷裂解缓冲液（表1）中以破坏细胞膜。单独添加缓冲液就足以重悬细胞，但如有必要，可以通过光涡旋进一步重悬。
- 在冰上孵育30分钟，每~5分钟倒置混合一次。将细胞核在1，000× g （4°C）下离心10分钟并除去上清液。用 500 μL 冷 1.25x 限制性缓冲液 2 重悬细胞核（参见 材料表）。
- 将细胞核在1，000× g （4°C）下离心10分钟并除去上清液。将细胞核重悬于 179 μL 的 1.25x 限制性缓冲液 2 中。
- 加入 5.5 μL 10% 十二烷基硫酸钠 （SDS;参见 材料表） 并混合。细胞可能形成团块;这是正常的，需要通过涡旋尽可能多地分解。将样品在37°C下在热块中孵育1小时，以950rpm振荡。
- 通过加入 37.5 μL 10% Triton X-100 并混合来淬灭 SDS。将样品在37°C下在热块中孵育1小时，以950rpm振荡。
- 通过加入 7.5 μL HindIII（100 U/μL;参见 材料表）并混合来消化染色质。将样品在37°C的热块中孵育过夜，以950rpm振荡。
- 第二天早上，加入额外的2.5μLHindIII（100U / μL），并将样品在37°C的热块中进一步孵育1小时，以950rpm振荡以确保适当的染色质消化。
注意：作为消化效率对照的一部分（见步骤5.1），将相当于20，000至40，000个细胞核转移到另一个管中以表示未消化的对照。消化后，再次将相同数量的细胞转移到另一个管中以表示消化的对照。如果起始材料的可用性稀缺，建议将消化效率作为单独的实验进行测试。
3. 连接和去交联
- 将样品放在冰上冷却。制备预混液并加入以下试剂以填充和生物素化限制性切酶片段突出部：3 μL 10x 限制性缓冲液 2、1 μL 无核酸酶水、0.75 μL 10 mM dCTP、0.75 μL 10 mM dTTP、0.75 μL 10 mM dGTP、18.75 μL 0.4 mM 生物素-14-dATP 和 5 μL 5 U/μL Klenow（参见 材料表）。将样品在37°C孵育75分钟，每~15分钟倒置混合一次。
- 将样品放在冰上冷却。制备预混液并加入以下试剂以连接填充的 DNA 末端：50 μL 10x 连接缓冲液、2.5 μL 20 mg/mL 牛血清白蛋白 （BSA）、12.5 μL 1 U/μL T4 DNA 连接酶和 173 μL 无核酸酶水（参见 材料表）。
- 将样品在16°C孵育4-6小时，每~1小时倒置混合一次。此外，将样品在室温下孵育30分钟。通过加入 30 μL 10 mg/mL 蛋白酶 K 并混合来去交联染色质。将样品在65°C孵育过夜。
- 第二天早上，加入额外的 15 μL 10 mg/mL 蛋白酶 K，并将样品在 65 °C 下进一步孵育 2 小时，以确保染色质脱联。
4. 脱氧核糖核酸纯化
- 将样品冷却至室温，并将其转移到合适的管中进行苯酚-氯仿纯化。
- 加入 1 体积 （545 μL） 苯酚：氯仿：异戊醇 （25：24：1） 纯化 DNA 并通过剧烈摇动混合。
- 在室温下以 12，000 x g 离心样品 5 分钟，并将上层水相 （545 μL） 转移到 2 mL DNA 低结合管中。
- 加入以下试剂以沉淀DNA：1，362.5 μL 冷却至 -20 °C 的 100% 乙醇、54.5 μL 3 M 乙酸钠 （pH 5.2） 和 2 μL 15 mg/mL 糖原作为共沉淀剂。
- 在-80°C孵育1小时或在-20°C孵育过夜。
- 将样品在4°C下以16，000-21，000× g 离心30分钟，并除去上清液。DNA沉淀必须是可见的。
- 通过加入 1 mL 70% 乙醇、涡旋并在室温下以 16，000-21，000 x g 离心 10 分钟来洗涤沉淀。
- 除去上清液，让沉淀风干。将 DNA 沉淀重悬于 130 μL 无核酸酶水中。
- 通过荧光定量评估浓度（见 材料表）。将纯化的3C材料在-20°C下储存数月，然后再继续该方案。
5. 可选的质量控制
- 评估消化效率。如前所述，对步骤2.13中获得的未消化和消化的对照进行去交联和苯酚：氯仿DNA纯化。将 DNA 沉淀重悬于 10 μL 无核酸酶水中。定量浓度，如有必要，将获得的DNA稀释至4 ng / μL。
- 使用未消化和消化对照的 4 ng DNA 进行定量 PCR，引物跨越具有和不具有 HindIII 靶标的开放染色质位点（引物设计参见 表 2 ）。根据先前发表的报告35 计算消化效率。
注意：连接效率使用以下公式以百分比计算：消化（%）= 100 -100/（2^[（Ct用HindIII消化 - Ct消化没有HindIII）-（Ct未消化与HindIII一起 - Ct未消化没有HindIII）]）（ 见 表3），其中考虑了未消化和消化对照中每个引物对获得的不同Ct的差异。 - 通过执行常规聚合酶链反应 （PCR）（0.2 mM dNTP、0.4 μm F + R 引物、0.1 和 U/μL 热启动聚合酶）评估相互作用检测的灵敏度，引物跨越长距离和短程细胞不变相互作用（引物设计参见 表 2 ）。使用50-100ng的3C材料（分别用于短程和长程相互作用）并使用以下条件扩增：98°C15分钟，然后37个循环，98°C30秒，60°C1分钟，72°C1分钟，最后72°C10分钟。保持在4°C。
注意：如果获得的DNA量小于2μg，则仅检查长程和短程相互作用，而不是整个相互作用面板。 - 使用1.6%琼脂糖凝胶在1x 三硼酸盐-EDTA（TBE）上运行产品，并寻找相应的PCR扩增子54的存在。
注意：由于基因组不可预测的“剪切和粘贴”，可能会出现非特异性条带。只要观察到正确的波段大小，它就被视为正确。 - 通过用HindIII，NheI（参见 材料表），两种酶或无酶（水）差异消化短程PCR产物，并在1x TBE 1.6%琼脂糖凝胶上运行产品，评估生物素填充和连接的效率。正确的填充和连接消除了先前的HindIII靶标并创建新的NheI靶标，因此只有在存在NheI的情况下才能切割扩增子。
注意：为最大程度地减少材料损失，请从相互作用对照中取出 2.5 μL 短程 PCR 产物并将其重新扩增五次以执行填充和连接对照。
6. 超声处理
- 将 130 μL 样品（如果使用一些无核酸酶的水用于对照，则加满无核酸酶的水）转移到适合超声处理的比色皿中。
- 设置水浴超声仪并使用以下参数进行超声处理（针对 材料表中描述的模型和比色皿进行了优化）： 占空比：20%;峰值入射功率：50;每次突发周期：200;时间： 65 秒;温度范围：6-10°C（最佳8°C）。
- 将样品转移到新的 1.5 mL DNA 低结合管中。
7. 端部维修
- 制备预混液并加入以下试剂以修复超声处理过程中产生的DNA片段不均匀末端：18 μL 10x 连接缓冲液、18 μL 2.5 mM dNTP 混合物、6.5 μL 3 U/μL T4 DNA 聚合酶、6.5 μL 10 U/μL T4 PNK 和 1.3 μL 5 U/μL Klenow（参见 材料表）。
- 将样品在20°C孵育30分钟，并加入Tris-low EDTA （TLE）缓冲液（见 表1）至300μL。
8. 生物素下拉
- 将每个样品的 150 μL C1 链霉亲和素磁珠（参见 材料表）转移到 1.5 mL 管中，将它们放在 1.5 mL 管磁铁上，等待 2-3 分钟或直到所有磁珠粘在壁上。取出上清液，留下珠子。
- 用 400 μL 1x 吐温缓冲液 （TB;见 表 1） 洗涤珠子。要清洗珠子，请添加缓冲液并通过软涡旋重悬。将管子放回磁铁中，等待2-3分钟或直到所有珠子都粘在墙上。取出上清液，留下珠子。
- 用 300 μL 1x 无吐温缓冲液 （NTB;见 表 1） 洗涤磁珠。将磁珠重悬于300 μL 2x NTB中（见 表1）。
注意：用不含清洁剂的缓冲液洗涤时，珠子可能会在管壁周围形成灰尘层。这是正常的，不会影响协议的结果。 - 将 2x NTB 中的 300 μL 珠子与 300 μL 样品混合。孵育15分钟，在室温下旋转以用生物素拉下信息DNA片段。该文库现在粘在 C1 链霉亲和素珠子上。
- 用 400 μL 1x NTB 洗涤珠子。用 100 μL TLE 缓冲液洗涤磁珠，然后将其重悬于 35.7 μL TLE 缓冲液中。
9. dATP 拖尾、接头连接和 PCR 扩增
- 制备预混液并将以下试剂添加到样品中，以对修复的 DNA 片段末端进行 dATP 尾部：5 μL 10x 限制性缓冲液 2、2.3 μL 10 mM dATP 和 7 μL 5 U/μL Klenow exo-。将样品在37°C孵育30分钟。
- 通过在65°C下进一步孵育样品10分钟来灭活Klenow外显源。 在冰上冷却样品。用 300 μL 1x TB 洗涤珠子。用 300 μL 1x NTB 洗涤珠子。
- 用 100 μL 1x 连接缓冲液洗涤珠子，然后将其重悬于 50 μL 1x 连接缓冲液中。向样品中加入 4 μL 15 μM 预退火适配器混合物（见表 2）和 1 μL 2，000 U/μL T4 DNA 连接酶（参见 材料表）。
- 在室温下孵育2小时。用 400 μL 1x TB 洗涤珠子。用 200 μL 1x NTB 洗涤珠子。用100μl1x限制性缓冲液2洗涤珠子。
- 用 50 μL 1x 限制性缓冲液 2 洗涤磁珠，然后将其重悬于 50 μL 1x 限制性缓冲液 2 中。
- 混合以下试剂以制备PCR反应以扩增文库：50 μL带文库的珠子，250 μL含酶的2x PCR预混液，12 μL F + R引物（每个25 μM;见 表2）和188 μL无核酸酶水。
- 在以下条件下进行PCR（将PCR试剂混合物分成50μL反应）：98°C40秒，然后X循环98°C10秒，65°C30秒，72°C30秒，最后72°C10分钟。保持在4°C。
注意：使用以下循环数作为起点，优化二倍体细胞中的实验方案，目标是在文库捕获之前获得 500-1，000 ng 的输出：100 万个细胞，用于 8 个周期;250，000个细胞10个周期;50，000 个细胞，12 个周期。 - 将来自同一样品的所有 50 μL 反应汇集到 1.5 mL DNA 低结合管中，将其放在 1.5 mL 管磁铁上，等待 2-3 分钟或直到所有磁珠粘在壁上。
- 将含有文库 （500 μL） 的上清液转移到新的 1.5 mL DNA 低结合管中。如果一些上清液丢失，则用TLE缓冲液加满至500 μL。不再需要C1链霉亲和素珠。
- 使用顺磁珠纯化（0.4-1体积）进行双面选择55 。这允许选择性地消除过大（>1，000 bp）和过小的片段或PCR引物（<200 bp），具体取决于添加的顺磁珠的聚乙二醇和盐的浓度。
- 向库中加入 200 μL（0.4 体积）的原液珠，并通过涡旋混合。孵育10分钟，在室温下旋转。
- 放在磁铁上，等待2-3分钟或直到所有珠子都粘在墙上，并将含有文库的上清液（没有较大的片段）转移到新的1.5 mL DNA低结合管中。
- 通过取 750 μL 储备珠来浓缩磁珠，将它们放入磁铁上的 1.5 mL 管中，等待 2-3 分钟或直到所有磁珠粘在壁上，除去上清液，并通过涡旋在 300 μL 新储备珠中重悬磁珠。
- 将此 300 μL 浓缩珠子添加到样品（1 体积）中并通过涡旋混合。孵育10分钟，在室温下旋转。放在磁铁上，等待2-3分钟或直到所有珠子都粘在墙上，然后除去上清液（包含较小的片段和PCR引物）。
- 用 1 mL 70% 乙醇洗涤珠子三次。为此，在带有珠子的管仍在磁铁上时加入乙醇，尽量不要干扰珠子，然后等待 30-60 秒。之后，在不干扰珠子的情况下去除上清液。
- 让磁珠风干，并通过涡旋将其重悬于 21 μL TLE 缓冲液中。
注意：在洗脱DNA时，磁珠过度干燥会降低产量。目标是在它们不再因乙醇而“发亮”后立即将它们重悬于TLE缓冲液中。 - 将样品在37°C热块中孵育10分钟，以从珠子中洗脱文库。将试管放入磁铁中，并将含有文库的上清液转移到新的 1.5 mL DNA 低结合管中。
- 通过自动电泳定量大小和浓度（见 材料表）。纯化的Hi-C材料可以在-20°C下储存数月，然后再进行实验方案。
10. 库捕获
- 使用 500-1，000 ng 的库。通过使用真空浓缩器干燥 DNA 并将材料重悬于 3.4 μL 无核酸酶水中来浓缩文库。
- 将目标富集试剂盒中的以下阻断剂（参见 材料表）添加到样品中：2.5 μL 阻断剂 1、2.5 μL 阻断剂 2 和 0.6 μL 用于适配器的定制寡核苷酸阻断剂。
- 彻底重悬，将溶液转移到0.2mL PCR条中，并在95°C的热循环仪中孵育5分钟，然后在65°C下用加热的盖子孵育5分钟。将管在65°C孵育。
- 通过合并每个样品（13 μL）中目标富集试剂盒（参见 材料表）中的以下试剂来制备杂交溶液。在室温下放在工作台上：6.63 μL Hyb 1、0.27 μL Hyb 2、2.65 μL Hyb 3 和 3.45 μL Hyb 4。
- 从目标富集试剂盒中稀释 0.5 μL RNase 块，每个样品中加入 1.5 μL 无核酸酶水。每个样品在冰上解冻 5 μL 生物素化 RNA，并向其中添加 2 μL 稀释的 RNase 块。在室温下放在工作台上。
- 将 13 μL 杂交溶液加入 7 μL 具有 RNase 的生物素化 RNA 中，并充分混合。
- 在65°C的热循环仪上，将杂交溶液与生物素化的RNA（20μL）转移到封闭的文库中。牢固地关闭管盖并在65°C的热循环仪中孵育过夜。
注意：为了在同时进行多个样品时最大限度地减少样品蒸发（这可能导致次优的RNA-DNA杂交），请使用多通道移液器将生物素化的RNA同时转移到每个文库。
11. 生物素下拉和PCR扩增
- 将每个样品的 50 μL T1 链霉亲和素珠转移到 1.5 mL DNA 低结合管中，将它们放在 1.5 mL 管磁铁上，等待 2-3 分钟或直到所有磁珠粘在壁上。取出上清液，留下珠子。用目标富集试剂盒中的 200 μL 结合缓冲液洗涤磁珠 3 次。
- 将磁珠重悬于 200 μL 结合缓冲液中。在65°C的热循环仪上，将样品转移到重悬的T1链霉亲和素珠中，并在室温下旋转孵育30分钟。
- 用目标富集试剂盒中的 200 μL 洗涤缓冲液 1 洗涤磁珠。孵育15分钟，在室温下旋转。用加热至65°C的目标富集试剂盒中的200 μL洗涤缓冲液2洗涤珠子3次。 在65°C的热块中孵育10分钟，在洗涤之间以300rpm振荡。
- 用 200 μL 1x 限制性缓冲液 2 洗涤磁珠，然后将其重悬于 30 μL 1x 限制性缓冲液 2 中。
- 混合以下试剂以制备PCR反应以扩增文库：30 μL带文库的微球，150 μL含酶的2x PCR预混液，7.2 μL F + R引物（每个25 μM;见 表2）和112.8 μL无核酸酶水。
- 按照以下条件进行PCR（将PCR试剂混合物分成50μL反应）：98°C40秒，然后四个循环，98°C持续10秒，65°C持续30秒，72°C持续30秒，最后以72°C结束10分钟。保持在4°C。
- 将来自同一样品的所有 50 μL 反应汇集到 1.5 mL DNA 低结合管中，将其放在 1.5 mL 管磁铁上，等待 2-3 分钟或直到所有磁珠粘在壁上。
- 将含有文库（300 μL）的上清液转移到新的1.5 mL DNA低结合管中。如果一些上清液丢失，则用TLE缓冲液加满至300 μL。不再需要 T1 链霉亲和素珠。
- 使用顺磁珠进行DNA纯化（0.9体积;见 材料表）。向样品中加入 270 μL 储备珠，并通过涡旋混合。
- 孵育10分钟，在室温下旋转。
- 放在磁铁上，等待2-3分钟或直到所有珠子都粘在墙上，然后除去上清液。
- 用 1 mL 70% 乙醇洗涤珠子三次。为此，在带有珠子的管仍在磁铁上时加入乙醇，尽量不要干扰磁珠，然后等待 30-60 秒。之后，在不干扰珠子的情况下去除上清液。
- 让磁珠风干，并通过涡旋将其重悬于 21 μL TLE 缓冲液中。
注意：在洗脱DNA时，磁珠过度干燥会降低产量。目标是在它们不再因乙醇而“发亮”后立即将它们重悬于TLE缓冲液中。 - 将样品在37°C热块中孵育10分钟，以从珠子中洗脱文库。
- 将试管放入磁铁中，并将含有文库的上清液转移到新的 1.5 mL DNA 低结合管中。
- 通过自动电泳定量大小和浓度。
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Representative Results
liCHi-C提供了生成高质量和分辨率的全基因组启动子相互作用组文库的可能性，只需50，000个细胞53。这是通过 - 除了大幅减少反应体积和在整个方案中使用DNA低结合塑料器皿 - 从原始方案中消除不必要的步骤来实现的，在这些步骤中会发生显着的材料损失。这些包括脱钩后的苯酚纯化，生物素去除以及随后的苯酚-氯仿纯化和乙醇沉淀。除此之外，重新组织Hi-C文库制备的步骤（生物素下拉，A尾，接头连接，PCR扩增和双面顺磁珠选择（也称为PCR产物纯化）使我们能够消除另一个不必要的DNA纯化步骤。实验工作流程的概述如图 1A所示。
为了评估文库质量，在整个方案中执行了几种对照，其中第一个是计算基因组消化效率;超过80%的值被认为是可以接受的（表3）。建议在单独的实验中检查细胞类型的消化效率，以免在单个liCHi-C实验中损失大量物质。其次，在超声处理和末端修复之前，建议通过常规PCR扩增细胞型不变染色质相互作用来检查相互作用检测的灵敏度（图1B）。如果检测到特异性产物，则应进行第三种对照，重点是通过用HindIII和NheI差异消化先前获得的PCR产物之一来生物素化和连接的效率（图1C，D）。当填充一个消化的HindIII限制性位点并将其与另一个钝端连接时，会产生一个新的NheI限制性位点，而不是再生原来的HindIII限制性位点。因此，PCR扩增子的消化应仅在NheI存在时观察。最后，在整个捕获之前和之后，应使用自动电泳检查浓度和尺寸分布。捕获前文库扩增必须旨在获得 500-1，000 ng 的 Hi-C 材料，这是执行 RNA 探针捕获所需的确切量，因为捕获前和捕获后文库的过度扩增会导致高比例的 PCR 重复，从而导致分析过程中测序读数丢失。如果在第一次保守PCR扩增过程中没有获得足够的材料，则可以在相同条件下再次扩增文库。捕获后的图书馆资料数量可能会有所不同，但根据经验，它应该比捕获前少大约 10 到 20 倍。文库的大小分布应在 450-550 bp 左右（图 2A，B），在捕获前和捕获后文库之间保持不变。总的来说，这些对照的正确结果可确保生成出色的 liCHi-C 文库。
然后（至少）对完成的liCHi-C文库进行100 bp配对端测序和分析。原始测序数据53 使用HiCUP流水线56 进行处理，用于映射和过滤掉工件。理想的HiCUP报告显示，与反式（不同染色体之间）配对末端读段相比，顺式（在同一染色体内）的分布增加了五倍到十倍，如前所述核内连接Hi-C 57 （图3B）。在去除PCR重复项后，获得超过1亿个唯一有效读段足以进行分析的下一步（图3B），即评估捕获效率。配对末端读段，其中其末端均未映射到RNA探针富集系统捕获的限制性切合片段中，仅保留代表细胞启动子相互作用组的读段（即，至少一个末端映射到包含一个或多个基因启动子的限制性片段的读段[图3C]， 理想情况下超过60%）。
最后，与CHiCAGO管道进行重要交互，如58，59中所述。最终一组显着的启动子相互作用需要两个或多个生物学重复。数据质量也可以使用主成分分析（PCA）来验证，因为生物重复必须聚集在一起，并且必须分离细胞类型。例如，通过分析来自人类造血树的四种不同原代细胞类型（普通髓系祖细胞、单核细胞、巨核细胞和成红细胞）的 liCHi-C 数据集，我们可以在 PCA 中观察到 liCHi-C 文库以反映发育轨迹的方式聚集（图 3D）。仔细检查四种细胞类型检测到的显着相互作用表明，启动子相互作用组在细胞发育过程中具有细胞类型特异性和动态性。例如，AHSP基因是在红系前体中合成的关键伴侣，可监督血红蛋白60，61，62的正确折叠，显示出与成红细胞中潜在活性调节元件（即H3K27ac和H3K4me1富集区域）的相互作用增益，但在其他细胞类型中则没有（图4）。这表明liCHi-C方法可以揭示稀有细胞类型中潜在的调节相互作用。
图1：超声处理前样品的方案概述和质量控制 。 （A）按天划分的liCHi-C协议的示意图。B和蓝色的手分别代表生物素分子和步骤，在这些步骤中，人们可以安全地停止协议很长一段时间。（二）3C交互控制的代表性结果。显示了人类（左）和鼠标（右）的交互集。预期的波段标记为深蓝色，而非特定波段标记为浅蓝色。（C）使用“Dekker”人机交互引物对进行代表性填充和连接对照。该频段仅在添加了 NheI 的车道 2 和 3 中切割。（D）在HindIII限制性位点的填充和连接过程中产生新的NheI限制性位点的示意图。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：来自库的代表性自动电泳图谱 捕获前和捕获后。 （A） 捕获前来自文库的自动电泳图谱。获得的DNA总量为994纳克（20微升为49.7纳克/微升）。（B）来自成品liCHi-C文库的高灵敏度自动电泳图谱。样品被半稀释上样，以保留尽可能多的材料。获得的DNA总量为61.2ng（20μL x2中的1.53ng/μL，以说明稀释）。请点击此处查看此图的大图。
图 3：代表性 HiCUP 流水线输出和 PCA 的样本重复聚类 。 （A） 按百分比和总数对读取对的有效性进行分类。无效的读取对按实验项目类型进行子分类。（B） 重复数据删除百分比和交互类型的分类。顺式相互作用进一步细分为顺式接近（小于10 kb）和顺式远（大于10 kb）。（C） 捕获效率的百分比。捕获的读取对进一步细分，无论一端、另一端还是两端都包含一个或多个启动子。（D）来自普通髓系祖细胞（CMP）、成红细胞、巨核细胞和单核细胞的liCHi-C文库两个重复的CHiCAGO显著相互作用评分的主成分分析。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：人原代造血细胞中的 AHSP 相互作用景观。AHSP启动子为中心的相互作用景观在普通髓系祖细胞（CMP），成红细胞（Ery），巨核细胞（MK）和单核细胞（Mon）中的代表性示例，如WashU表观基因组浏览器63所示。弧表示重要的相互作用。深蓝色阴影显示AHSP基因启动子，而浅蓝色阴影重叠与成红细胞中AHSP启动子特异性相互作用的潜在活性调节元件。请点击此处查看此图的大图。
表1：缓冲液组成和制备。请按此下载此表格。
表2：PCR引物和接头序列。请按此下载此表格。
表3：消解效率的计算示例。请按此下载此表格。
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Discussion
liCHi-C提供了使用PCHi-C的类似实验框架生成高分辨率启动子相互作用组库的能力，但细胞数量大大减少。通过消除不必要的步骤，例如苯酚纯化和生物素去除，可以极大地实现这一点。在经典的核内连接Hi-C方案57 及其随后的衍生技术PCHi-C中，生物素从非连接的限制性内切性片段中去除，以避免拉下随后没有信息的DNA片段。跳过这部分及其随后的DNA纯化不会显着降低有效读数的百分比（图3A），同时减少潜在的DNA浪费步骤，即DNA纯化。超声处理后Hi-C文库制备的重组允许通过使用双面选择作为纯化步骤本身来跳过另一个不必要的纯化。所有这些都通过采用最少的试管更换来增强整个方案的性能，再加上反应体积的减少、试剂浓度的变化以及DNA低结合塑料器皿的使用，使得使用低至50，000个细胞即可生成高质量的文库。重要的是要记住，由于文库的复杂性，起始细胞数部分决定了重要相互作用的数量。尽管用50，000个细胞生成的文库保留了更复杂的文库53的细胞类型特异性和不变拓扑特征，但我们的建议是，如果可能的话，每个生物重复使用超过100，000个细胞，以捕获更多数量的显着启动子相互作用。
在3C技术中检测到的相互作用的分辨率基本上由所使用的限制性内切酶给出。在这里，liCHi-C的应用使用HindIII描述，HindIII是一种6 bp切割酶，其理论平均分辨率为4，096 bp.liCHi-C允许限制性内切酶被替换，例如，向4 bp切割酶甚至微球菌核酸酶，从而提高检测到的显着相互作用的分辨率。据报道，liCHi-C文库的产生，将HindIII限制性内切酶切换为4 bp切割MboI酶，可提供出色的结果，检测到的相互作用几乎是总相互作用的两倍，尽管检测到的相互作用的平均线性距离偏移到距离的一半53。
关于实际的RNA探针富集系统，使用这种类型的捕获方法与基于抗体的捕获（例如HiChIP32 或HiCuT33等）相比，其主要优势之一是能够独立于蛋白质的结合来比较条件，并且不必依赖于目标蛋白质的工作抗体的可用性。此外，RNA富集系统可以定制以捕获全基因组的任何特定区域，以满足每个研究人员的需求（该设计在35，64中讨论）。
除了基于抗体的捕获方法外，近年来还开发了几种出色的单细胞（如scHi-C 65，Dip-C 66或Sci-Hi-C 67等）或低输入方法（例如Low-C 68或Easy Hi-C 69）来研究3D基因组结构。然而，这些会产生低分辨率的稀疏接触图，无法识别远端调控元件和靶基因之间的接触。liCHi-C是一种能够克服这一限制的方法，为研究稀缺细胞类型中以启动子为中心的基因组结构提供了可能性，并为进一步了解细胞和发育生物学以及疾病发展提供了机会。
尽管具有所有功能，但liCHi-C也不能免除限制。首先，处理原始测序数据并非易事，需要公平的计算技能来分析数据并解释其结果。此外，liCHi-C不区分功能和结构相互作用;需要将liCHi-C数据与表观遗传数据和/或功能分析相结合，以验证基因启动子与其靶调控元件的潜在功能相互作用。最后，在处理细胞数的低端时，牺牲了文库的复杂性。这反映在与更高单元数的 liCHi-C 库相比检测到的独特交互数量及其重复数据删除率（最高可达 80%）。然而，低细胞数liCHi-C文库以更集中的方式保留了高细胞数文库的拓扑特征53，这表明执行liCHi-C文库是可行的，这些文库概括了细胞的启动子与少至50，000个细胞的相互作用组。
总体而言，liCHi-C是一种经济高效且可定制的方法，可在稀缺细胞类型中生成高质量和高分辨率的启动子相互作用组文库。它是第一种在限制性片段分辨率下映射启动子相互作用组并要求显著环路的低输入方法。我们预计，这个新工具，作为其前身PCHi-C，将为健康和疾病的细胞分化和生物体发育提供新的见解。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢哈维尔实验室的其他成员对手稿的反馈。我们感谢CERCA计划，加泰罗尼亚将军和Josep Carreras基金会的机构支持。这项工作由FEDER/西班牙科学与创新部（RTI2018-094788-A-I00），欧洲血液学协会（4823998）和西班牙抗癌协会（AECC）LABAE21981JAVI资助。BMJ由La Caixa银行基金会青年领袖项目（LCF/BQ/PI19/11690001）资助，LR由AGAUR FI奖学金（2019FI-B00017）资助，LT-D由FPI奖学金（PRE2019-088005）资助。我们感谢巴塞罗那自治大学的生物化学和分子生物学博士课程的支持。没有一个资助者在实验设计或手稿写作的任何时候都参与其中。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4 mM Biotin-14-dATP | Invitrogen | 19524-016 | |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Invitrogen | AM9260G | |
| 1 M Tris pH 8.0 | Invitrogen | AM9855G | |
| 10x NEBuffer 2 | New England Biolabs | B7002S | Referenced as restriction buffer 2 in the manuscript |
| 10x PBS | Fisher Scientific | BP3994 | |
| 10x T4 DNA ligase reaction buffer | New England Biolabs | B0202S | |
| 16% formaldehyde solution (w/v), methanol-free | Thermo Scientific | 28908 | |
| 20 mg/mL Bovine Serum Albumin | New England Biolabs | B9000S | |
| 5 M NaCl | Invitrogen | AM9760G | |
| 5PRIME Phase Lock Gel Light tubes | Qiuantabio | 2302820 | For phenol-chloroform purification in section 4 (DNA purification). Phase Lock Gel tubes are a commercial type of tubes specially designed to maximize DNA recovery after phenol-chloroform purifications while avoiding carryover of contaminants in the organic phase by containing a resin of intermediate density which settles between the organic and aqueous phase and isolates them. PLG tubes should be spun at 12,000 x g for 30 s before use to ensure that the resin is well-placed at the bottom of the tube |
| Adapters and PCR primers for library amplification | Integrated DNA Technologies | - | Bought as individual primers with PAGE purification for NGS |
| Cell scrappers | Nunc | 179693 | Or any other brand |
| Centrifuge (fixed-angle rotor for 1.5 mL tubes) | Any brand | ||
| CHiCAGO R package | 1.14.0 | ||
| CleanNGS beads | CleanNA | CNGS-0050 | |
| dATP, dCTP, dGTP, dTTP | Promega | U120A, U121A, U122A, U123A | Or any other brand |
| DNA LoBind tube, 1.5 mL | Eppendorf | 30108051 | |
| DNA LoBind tube, 2 mL | Eppendorf | 30108078 | |
| DNA polymerase I large (Klenow) fragment 5000 units/mL | New England Biolabs | M0210L | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 beads | Invitrogen | 65002 | For biotin pull-down of the pre-captured library in section 8 (biotin pull-down) |
| Dynabeads MyOne Streptavidin T1 beads | Invitrogen | 65602 | For biotin pull-down of the post-captured library in section 11 (biotin pull-down and PCR amplification) |
| DynaMag-2 | Invitrogen | 12321D | Or any other magnet suitable for 1.5 ml tubeL |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.321 | |
| FBS, qualified | Gibco | 10270-106 | Or any other brand |
| Glycine | Fisher BioReagents | BP381-1 | |
| GlycoBlue Coprecipitant | Invitrogen | AM9515 | Used for DNA coprecipitation in section 4 (DNA purification) |
| HiCUP | 0.8.2 | ||
| HindIII, 100 U/µL | New England Biolabs | R0104T | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I8896-50ML | |
| Klenow EXO- 5000 units/mL | New England Biolabs | M0212L | |
| Low-retention filter tips (10 µL, 20 µL, 200 µL and 1000 µL) | ZeroTip | PMT233010, PMT252020, PMT231200, PMT252000 | |
| M220 Focused-ultrasonicator | Covaris | 500295 | |
| Micro TUBE AFA Fiber Pre-slit snap cap 6 x 16 mm vials | Covaris | 520045 | For sonication in section 6 (sonication) |
| NheI-HF, 100 U/µL | New England Biolabs | R3131M | |
| Nuclease-free molecular biology grade water | Sigma-Aldrich | W4502 | |
| PCR primers for quality controls | Integrated DNA Technologies | - | |
| PCR strips and caps | Agilent Technologies | 410022, 401425 | |
| Phenol: Chloroform: Isoamyl Alcohol 25:24:1, Saturated with 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA | Sigma-Aldrich | P3803 | |
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | New England Biolabs | M0531L | For amplification of the library in sections 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification) and 11 (biotin pull-down and PCR amplification) |
| Protease inhibitor cocktail (EDTA-free) | Roche | 11873580001 | |
| Proteinase K, recombinant, PCR grade | Roche | 3115836001 | |
| Qubit 1x dsDNA High Sensitivity kit | Invitrogen | Q33230 | For DNA quantification after precipitation in section 4 (DNA purification) |
| Qubit assay tubes | Invitrogen | Q32856 | |
| rCutsmart buffer | New England Biolabs | B6004S | |
| RPMI Medium 1640 1x + GlutaMAX | Gibco | 61870-010 | Or any other brand |
| SDS - Solution 10% for molecular biology | PanReac AppliChem | A0676 | |
| Sodium acetate pH 5.2 | Sigma-Aldrich | S7899-100ML | |
| SureSelect custom 3-5.9 Mb library | Agilent Technologies | 5190-4831 | Custom designed mouse or human capture system, used for the capture |
| SureSelect Target Enrichment Box 1 | Agilent Technologies | 5190-8645 | Used for the capture |
| SureSelect Target Enrichment Kit ILM PE Full Adapter | Agilent Technologies | 931107 | Used for the capture |
| T4 DNA ligase 1 U/µL | Invitrogen | 15224025 | For ligation in section 3 (ligation and decrosslink) |
| T4 DNA ligase 2000000/mL | New England Biolabs | M0202T | For ligation in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification) |
| T4 DNA polymerase 3000 units/mL | New England Biolabs | M0203L | |
| T4 PNK 10000 units/mL | New England Biolabs | M0201L | |
| Tapestation 4200 instrument | Agilent Technologies | For automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and section 11 (Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid |
|
| Tapestation reagents | Agilent Technologies | 5067-5582, 5067-5583, 5067-5584, 5067-5585, | For automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and section 11 (Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid |
| Triton X-100 for molecular biology | PanReac AppliChem | A4975 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML |
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