Summary
在这里，我们提出了一个详细的视觉方案，用于在禽类胚胎中执行左心房结扎（LAL）模型。LAL模型改变了心内血流，从而改变了壁剪切应力载荷，模仿左心发育不良综合征。提出了一种克服这种困难的显微手术模型挑战的方法。
Abstract
由于其四腔成熟心室结构、易于培养、成像可达性和效率，禽胚胎是研究心血管发育的首选脊椎动物模型。旨在了解先天性心脏缺陷正常发育和预后的研究广泛采用该模型。引入显微手术技术来改变特定胚胎时间点的正常机械负荷模式，并跟踪下游分子和遗传级联。最常见的机械干预是左卵黄静脉结扎术、头丛束带术和左心房结扎术 （LAL），通过血流调节壁内血管压和壁剪切应力。鲎试剂，特别是 卵产中进行的鲎试剂，是最具挑战性的干预措施，由于极其精细的连续显微外科手术，样本产量非常小。尽管风险很高，但 卵 巢鲎试剂在科学上非常有价值，因为它模仿左心发育不良综合征 （HLHS） 的发病机制。HLHS 是一种在人类新生儿中观察到的临床相关的复杂先天性心脏病。本文记录了 卵内 LAL的详细方案。简而言之，受精的禽胚胎通常在37.5°C和60%恒定湿度下孵育，直到它们达到汉堡-汉密尔顿（HH）阶段20至21。将蛋壳裂开，去除外膜和内膜。轻轻旋转胚胎以露出心房的左心房球。将 10-0 尼龙缝合线的预组装微结轻轻定位并系在左心耳芽周围。最后，胚胎回到原来的位置，LAL完成。正常心室和鲎试剂器械化心室在组织压实方面表现出统计学上的显着差异。高效的LAL模型生成管道将有助于研究心血管成分胚胎发育过程中的同步机械和遗传操作。同样，该模型将为组织培养研究和血管生物学提供扰动的细胞源。
Introduction
先天性心脏缺陷 （CHD） 是由于胚胎发育异常而发生的结构性疾病1.除遗传条件外，发病机制还受到机械负荷改变的影响2,3。左心发育不良综合征 （HLHS） 是一种先天性心脏病，导致出生时心室/主动脉发育不全4 死亡率高 5,6。尽管HLHS的临床管理取得了最新进展，但HLHS的血管生长和发育动态仍不清楚7。在正常胚胎发育中，随着早期胚胎心管形成的进展，左心室 （LV） 心内膜和心肌起源于心脏祖细胞。据报道，心肌小梁逐渐形成、增厚层和心肌细胞增生2.对于 HLHS，观察到小梁重塑改变和左心室扁平化，进一步导致心肌细胞异常迁移导致心肌发育不全 2,8,9,10
在广泛用于研究心脏发育和了解血流动力学状况的模式生物中 11，禽胚胎因其四腔成熟心脏和易于培养而受到青睐11,12,13,14。另一方面，斑马鱼胚胎和转基因/敲除小鼠的先进成像通道具有明显的优势11,12。已经对鸟类胚胎进行了各种机械干预测试，这些干预改变了发育心血管成分的壁内压力和壁剪切应力。这些模型包括左卵黄结扎术、髂状结扎术15 和左心房结扎术 （LAL）11、12、16。在以早期预后为重点的研究中，可以在手术干预后约 24-48 小时观察到由于机械负荷改变而产生的表型11,13。鲎试剂介入治疗是一种流行的技术，通过在房室开口周围放置缝合环来缩小左心房 （LA） 的功能容积。同样，还进行了针对右心房结扎 （RAL） 的显微外科干预17,18。同样，一些研究人员使用微夹靶向左心耳 （LAA） 以减少 LA19,20 的体积。在一些研究中，将手术尼龙线应用于房室结19,21。使用的干预措施之一是鲎试剂，它可以模仿HLHS，但也是最难执行的模型，由于需要极其精细的显微外科手术，样本产量非常小。在我们的实验室中，鲎试剂在汉堡-汉密尔顿 （HH） 第 20 期和第 21 期之间以卵形进行，在公共心房完全隔膜6、14、22、23 之前。在LA周围放置手术缝合线，从而改变心内血流。在HLHS的LAL模型中，观察到心室壁硬度增加，肌纤维角度改变和左心室腔大小减小14,24。
在本视频文章中，提供了 卵内 LAL的详细协议和方法。简而言之，将受精的禽胚胎孵育进行显微手术，将蛋壳裂开，并清除外膜和内膜。然后缓慢旋转胚胎，以便可以进入LA。将 10-0 尼龙手术缝合线绑在心房芽上，胚胎恢复到原来的方向，完成 LAL 程序25。 通过 光学相干断层扫描和基础组织学比较鲎试剂和正常心室的组织压实度和心室容积。
如本文所述，成功执行的LAL模型管道将有助于专注于心血管成分胚胎发育的基础研究。该模型还可以与遗传操作和高级成像模式一起使用。同样，急性鲎试剂模型是组织培养实验中病变血管细胞的稳定来源。
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Protocol
受精的白色 Leghorn 卵是从值得信赖的供应商处获得的，并根据大学批准的指南进行孵化。雏鸡胚胎，第 18 阶段（第 3 天）至 24 阶段（第 4 天）（本文介绍的阶段）不被视为欧盟 （EU） 指令 2010/63/EU 和美国机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 指南的活脊椎动物。根据美国法律，雏鸡胚胎在孵化第 19 天后被视为“活体动物”，但不适用于欧盟。每个鸡蛋都标有孵化开始日期，并计划在孵化的第 10 天之前孵化。种蛋孵化后，将雏鸡从孵化器中取出。该协议在两个台式操作站（工作站 1 和工作站 2）中执行，专注于专门的模型生成阶段。
1.显微手术前的准备
- 从具有特定无病原体 （SPF） 等级的疫苗开发中心或通过值得信赖的商业供应商农场获得受精卵，由易碎的快递员装在干燥的聚苯乙烯容器中。孵化前，用浸泡在 70% 乙醇中的无绒湿巾轻轻清洁蛋壳以去除污染物。
- 胚胎纳入/排除标准
- 不要孵化在运输过程中破裂或损坏的鸡蛋。
- 如果在LAL过程中或重新孵育后发现出血，请勿使用胚胎。
- 不要使用以左侧朝上位置发育的胚胎，因为血流动力学血流可能与正常方向不同。
- Dıscard胚胎在术前和术后手术中都存在先天性缺陷。
- 包括达到在其原始位置发育的目标阶段的胚胎，模仿HLHS作为LAL模型。
- 将受精的白角鸡蛋（Gallus gallus domesticus L.）孵化至所需阶段，通常在HH20-2115 （37.5°C，60%湿度，3.5天）（图1）。
注意：重要的是要将鸡蛋保持在恒定的温度和湿度下，以提高产量。根据培养箱型号的不同，添加一个装满蒸馏水的平底锅将保持稳定的湿度。作者开发并推荐了适合大多数培养箱的附加/辅助温度和湿度控制系统的蓝图。该内部构建的传感器/控制单元的电子、硬件和代码详细信息在数据存储库26 中提供。在孵化过程中对卵子进行连续的温和摇晃（旋转）可以使胚胎的最佳定位，从而导致更高比例的“可操作”胚胎。振荡也可以与具有这种能力的培养箱配合使用，并进一步提高生产率。 - 在开始手术之前，通过将松散的反手结绑在 1.5 厘米长的 10-0 缝合线中来准备所需的结数。确保结不紧，并且足够大，可以在手术过程中轻松贴合心房（图 2）。
注意：提前打结，并在使用前将它们保存在无菌的雏鸡铃液中。打结操作需要用两只手同步操作镊子。由于这是协议中的关键阶段，因此可以用腻子制作中庭模型来练习此步骤（图3）。这将提高在2号站执行步骤3.2.3所需的三维显微外科手术技能（图4）。
2. 1号站的运行情况（图4A）
- 从鸡蛋的钝端打开一扇窗户，取出外膜和内膜15（图5A-D）。
- 用镊子的反面轻轻敲开蛋壳，用空出的手指牢牢地支撑鸡蛋，以减少不必要的裂纹扩展。
- 由于LAL是一个漫长的过程，因此要保持胚胎的温度和湿度，因为心率取决于温度。因此，请确保创建初始 shell 窗口尽可能小，刚好足以执行操作。
注意：操作过程中不采用湿度或温度控制系统，但这些系统（如果可用）将有利于产量。如果可能，关闭实验室中的空调系统，并在尽可能高的室温 （RT） 下进行该过程。还建议在手术过程中优化胚胎心率，该心率可以通过温度控制。一些实验室在鲎试剂手术期间通过温度控制 将 心率保持在略低于 120 bpm 的速率。因此，在手术区域周围采用的湿度控制将进一步提高产量。蛋壳窗被设计得尽可能小，刚好足够大，可以进行手术。这也适用于厚的外膜，它通常比蛋壳小，仅在胚胎周长的范围内。这些确保保持胚胎的温度和湿度。当从鸡蛋的钝端打开窗户时，清洁小壳碎片，使这些碎片不会损坏卵黄血管完整性或导致不必要的伪影。此外，其他实验室使用弯曲的微锯齿剪刀来制作窗户。此外，可以使用两种宽度的透明胶带来稳定蛋壳以控制开裂。 - 仅使用微型剪刀去除必要的卵黄膜（补充视频1）。
- 正常的胚胎发育是正面朝上的。一旦胚胎脱离卵黄膜，将尖端闭合的镊子放在胚胎背段下方，轻轻翻转胚胎以露出左侧（即左侧朝上配置）（图6A，B;补充视频2）。
- 确保左心房芽现在暴露在外，但仍被复杂的膜系统覆盖，通常由双层心包组成。
- 立即去除心房芽周围的膜，包括细膜。这是另一个关键阶段;从粗膜上去除膜，并进展到左心房芽周围的细膜。保留最细的镊子以去除细膜（补充视频3）。
- 在膜去除过程中，将胚胎定向在左侧朝上的位置，以便可以执行步骤3.2中的结放置操作，而无需进一步重新定位。为此，使用步骤2.6中的膜提起胚胎并将其挂在蛋壳上，确保左侧朝上。
注意：有些胚胎可能位于蛋壳外围附近，操作起来可能具有挑战性。尽管如此，这些胚胎很可能是正面朝上的，并表现出正常的行为，并且可以被纳入研究。在这些情况下，如果需要，可以通过用 #4 细镊轻轻清洁心包膜并以相反方向（朝向蛋壳开口）去除蛋壳来使被遮盖的心房更容易接近。这些胚胎也可以使用部分胚外膜提起，并通过利用其天然粘性将膜的一端（镊子端）连接到蛋壳上来固定在所需位置。此外，胚胎头部和脊髓区域之间的空间可以在镊子的帮助下扩大，以显示被遮挡的心房。
3. 2号站的操作（图4B）
- 在立体显微镜下，将步骤1.4中预先准备好的结放置在靠近胚胎的可触及位置（图6B）。心房芽现在可以被绑住了（补充视频4）。
- 取回预先准备好的开放结并将其定向在左心房芽上。要使鲎试剂起作用，请将鸡蛋置于独特的倾斜三维方向。
- 正确定位结以执行收紧过程，而不会损坏胚胎。
- 在步骤 2.7 中以最佳方式清除细膜，以减少心脏跳动的影响。
- 拧紧缝合线（图6C）。对于这一步，用腻子练习非常有用。对于假胚胎，将结拧紧到足以保持结的程度。
- 接下来，使用微型剪刀将缝合线的多余端剪得尽可能靠近花蕾（补充视频5）。
- 要非常小心，在旋转过程中或由于心跳，新切割的缝合线末端无法刺穿附近的血管。
- 使用镊子，取出在步骤3.3中切掉的多余缝合片。
- 最后，使用闭合的镊子，将胚胎放回其原始位置，如步骤2.5（补充视频6）所示。
- 完成鲎试剂过程后，用双层封口膜覆盖鸡蛋并再次孵化。鸡蛋的紧密和无菌关闭对于存活至关重要，尤其是孵化超过 24 小时。如果还需要视觉访问，请使用石蜡和载玻片。
注：随着早期胚胎期的研究，卵子通常孵育24-48小时，直到它们达到大约HH25或HH27。然而，没有限制，可以像其他研究人员所尝试的那样研究后期阶段。为了快速操作，建议至少两人一组。应由一人接受培训，负责左心房芽周围的卵子打开、初始膜清理、旋转和膜清理。对方只负责最初的打结准备、打结放置和收紧。最后的胚胎旋转可以由人 1 执行。单个胚胎的手术大约需要4-5分钟。 - 手术前/手术后，用乙醇清洁台面和器械。确保将新鲜的雏鸡林格溶液（NaCl、KCl、CaCl2 和 NaHCO3）16,27 应用于接触胚胎组织的金属器械。
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Representative Results
先进的时间分辨成像技术可用于观察由于LAL干预引起的结构和形态变化10。此外，鲎试剂样品也适用于分子和生物学方法19,28。在表1中，提供了采用LAL模型结果的样本研究。在这种情况下，对达到 HH20-21 的雏鸡胚胎进行鲎试剂干预。对照（健康）和鲎试尔组织心脏均在HH25-26时从胚胎中取出。然后，将样品在4°C下固定在4%多聚甲醛（PFA）中6,15。然后将去除的心脏样品在浓度递增（70%，96%和100%）的乙醇溶液中脱水1小时。最后，将样品在室温下在二甲苯中保存0.5 h，并在10 μm厚度切片前进行石蜡包埋。转移到载玻片上的样品用 Elastica van Gieson 染色剂染色。在立体显微镜下检查切片，测量心室的横径。我们还在一些样本中进行了三维非侵入性方法，即光学相干断层扫描 （OCT）11,29。切除HH25-26处的对照和LAL心脏，并在OCT下测量其交叉管腔直径。
结果表明，与正常发育相比，LAL实现了更紧凑的心肌结构，并发生了显着的形态变化（图7）。此外，在心脏间质周围观察到细胞外基质成分（如胶原蛋白）的沉积，类似于类似于HLHS30的心肌纤维化。为了更好地了解心肌增厚和小梁压实，对对照标本和鲎试样进行了形态学孔隙度测量。正如预期的那样，LAL干预通过收紧小梁间凹槽导致左心室腔变小和小梁压实。这些发现证实了LAL改变健康心室结构并重新定位小梁方面的假设22。同样，HH29 的 LAL 模型导致右心室腔扩大、小梁结构改变和心肌容积24。
为了支持本研究获得的结果，OCT成像用于测量心室腔交叉面积和轴向长度（图8）。与对照组相比，LAL显示左心室大小和直径显着减小。虽然这里只关注心室，但鲎试尔对主动脉弓发育的影响也有报道31。我们最近参与的一项研究以 3D 形式报道，在 HH2532 时，LAL 后双侧心室的中壁心肌应变增加。此外，与对照组相比，鲎试剂组在HH25处的壁厚有所增加。这项研究与 Tobita 等人之前的研究一致25，该研究表明 HH27 时 LAL LV 收缩期心外膜周应变峰值显着增加。
图1：胚胎生长的培养系统。 将受精的白色Leghorn鸡蛋（Gallus gallus）在恒定湿度（60%）和温度（37.5°C）的培养箱中孵育。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：鲎试剂结的制备。 使用 10-0 尼龙手术缝合线制备直径 ~0.5-1 毫米、长 1-2 厘米的多个结。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：由腻子制成的胚胎左心房复制品。 创建左心房部分的复制品，以使用两把镊子训练和练习打结定向和打结步骤。这使我们能够在实际胚胎中实施这项技能之前进行许多试验并完善这些步骤。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 4：站点准备 。 （A，B） 所有显微外科手术材料和溶液均放置在 1 号站和 2 号站的洁净区。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 5：从鸡蛋的钝端打开一个窗口并去除外膜和内膜。 （A，B）使用显微手术器械在蛋壳上打开一个小窗口，包括HH20-21中的整个胚胎。（C） 在第一个裂解步骤中去除蛋壳碎片。（D，E）胚外膜也在显微镜下解剖。（F）鲎试剂工艺完成后，鸡蛋上覆盖有双层封口膜。请点击这里查看此图的较大版本.
图 6：卵内左心房结扎 （LAL） 手术的快照。 （A） 正常方向的雏鸡胚胎背视图。到达HH20-21的胚胎脑室具有原始的心房（a）、心室（v）和流出道（ot）。（B） 显示翻转的左侧向上胚胎的特写背视图和结位置。（C） LA 与缝合结。缩写：LA = 左心房;AA = 主动脉弓. 请点击这里查看此图的较大版本.
图 7：对照和鲎试剂心脏的取出和检查。 从胚胎中取出达到HH25-26阶段的（A）对照和（B）LAL心脏，并在立体显微镜下检查。条形图显示了鲎试剂组和对照组之间心脏横径的差异，以及至少四次重复的平均值±标准差 （SD）。比例尺 = 100 μM。 使用 Elastica van Gieson 染色技术对 （C） 对照和 （D） LAL 样品中的心脏组织进行组织学检查。条形图显示了鲎试剂组和对照组之间的孔隙率差异（%），以及至少两个重复的平均值±SD。**p < 0.01。使用GraphPad Prism版本9.5.1进行统计分析。比例尺 = 50 μM。 缩写：LAL=左心房结扎;LA = 左心房;RA = 右心房;RV = 右心室;左心室 = 左心室。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 8：光学相干断层扫描。（C，D）心室管腔交叉的大小和长度分别显示在图（C）和（D）中，分别检查了达到HH25-26的（A）对照和（B）鲎试尔伤心脏。直方图表示至少重复三次的 SD ±平均值。*p < 0.05;**p < 0.01;使用GraphPad Prism版本9.5.1进行统计分析。比例尺 = 100 μM。 缩写：LAL=左心房结扎;RV = 右心室;左心室 = 左心室。请点击这里查看此图的较大版本.
表1：在禽类胚胎中采用左心房结扎（LAL）模型的研究综述6,10,12,14,22,24,27,30,32,33。
在几乎所有的论文中，LA都与HH21并列。在后期 HH 阶段（评估阶段）研究 LAL 的影响。缩写：AVC = 房室垫;LAV = 左房室管;RAV = 右房室管;RA = 右心房;LA = 左心房;RV = 右心室;左心室 = 左心室;SEN = 心内膜下;IVS = 室间隔;micro-CT = 显微计算机断层扫描。 请按此下载此表格。
表 2：在 HH21 创建并孵育至 HH25 的左心房结扎 （LAL） 模型的典型有效性。请按此下载此表格。
补充视频1：去除禽胚胎的外膜和内膜。然后，仅去除卵黄膜，如使用微型剪刀所示。请点击这里下载此文件。
补充视频2：将镊子放在右侧向上胚胎的背侧下方，并小心地翻转以露出其左心房芽。请点击这里下载此文件。
补充视频3：左心房芽周围的膜逐渐清除。心房略微扩大，这使得打结和打结成为可能。请点击这里下载此文件。
补充视频4：将一条约0.1-0.3毫米长的缝合线放置在胚胎附近，并用两根镊子将其收紧。请点击这里下载此文件。
补充视频5：用微型剪刀小心地剪掉结的多余缝合线末端。请点击这里下载此文件。
补充视频6：胚胎被轻轻地恢复到正常方向。LAL完成。请点击这里下载此文件。
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Discussion
在 HLHS 中，由于结构缺陷导致血流改变，导致左侧形态异常 4,6。本模型提供了一个实用的实验系统，以更好地了解HLHS的进展，甚至可以模拟其发病机制8。然而，建立一个完全临床等效的HLHS动物模型是一项具有挑战性的任务。除了本文介绍的禽鲎模型外，最近对小鼠、胎羊和青蛙的研究还试图复制HLHS预后的形态学、血流动力学和病理生理学特征。在小鼠胚胎中，通过胚胎日（ED）14.5（在雏鸡胚胎中约为HH40-41）的胎儿干预将栓塞剂注射到LA中来改变机械负荷34。共有 48% 的阳性栓塞胎儿存活至妊娠期，左心室较小，主动脉逆行。妊娠期长、早期干预的进一步挑战以及具有挑战性的胎儿手术可能限制了该模型的可行性。左心室发育不全也通过胎羔模型模拟，通过球囊导管35 用硅橡胶填充 LA。在这种大型动物模型中，左心室体积充分缩小，但存活时间不长，导致疾病渗透率低。另一种干预方法是通过经皮经肝导管插入术封堵卵圆孔，如胎儿羔羊36 所尝试的那样，尽管将闭塞支架引导至卵圆孔非常具有挑战性。一般来说，绵羊模型非常具有挑战性，因为它们预先存在血管形态和不利的肺部生理学。因此，季节性育种、胎龄较晚和样本量小的需求进一步限制了该模型。最后，非洲爪蟾胚胎也被引入作为模仿人类心脏病的另一种方便的模型37，尽管它的三腔心脏只有一个心室，并且神经嵴细胞模式存在差异。全基因组建立的显微注射和显微外科手术的可用性以及较长的生存时间也使该模型具有吸引力。
在之前的研究中，在LAL模型34中，39个操作的禽类胚胎中有6个的疾病渗透率为15%。然而，我们在早期阶段检查的雏鸡胚胎模型的平均HLHS渗透率（达到HH25和HH27）为66%（18个手术禽胚胎中的12个）。Sedmera教授报告说，胚胎的平均存活时间可能为HH40（ED14）19。其他定期进行这种连接的小组报告了早期时间点的高成功率（例如，在HH29之前为75%，在HH34之前为50%，在HH38之前为20%）30。然而，在后期阶段，出现了明显的表型，死亡率增加。尽管雏鸡胚胎的疾病渗透率相对较低，但该模型的目标是更好地检查产前HLHS的病因和病理学，特别是在早期阶段。
由于早期雏鸡胚胎的尺寸非常小，术前和术后鲎试剂干预可能导致多种并发症。作为防止污染的补救措施，蛋壳和长凳用 70% 乙醇清洁，并可在整个过程中使用手套。鲎试剂方案中的一个关键步骤是切除整个心包膜，以使结很好地贴合在左心房芽周围。此外，我们发现两人团队非常有用，特别是在培训和专注于协议步骤所需的特定技能方面。这种方法加快了该过程及其学习曲线。因此，出血和污染的风险是次要的，超过了拟议的伙伴系统的好处。建议使用储存在无菌雏鸡林格溶液中的预制缝合线。此外，保持缝合线的低紧固强度对于提高胚胎产量也至关重要。在 HH21 中应用心房芽上更紧密的结可能导致左心室过早衰竭，无法详细说明传导、冠状动脉和继发性肌结构重塑缺陷的临床关键参与，这在以前的研究中已经很好地描述了22。具体来说，在某些步骤中使用最细的和未使用的镊子和剪刀，在其他步骤中使用相对钝的镊子和剪刀可以减少意外出血。最后，在打结完成后，应立即将胚胎迅速转动到原来的位置，并用双层封口膜封闭蛋壳窗，以保持其温度和湿度。达到HH25的LAL模型的典型产率如 表2所示。除了心室缩小外，还可能发生瓣膜畸形，例如二尖瓣/主动脉闭锁。这些病变的严重程度会增加晚期的发病率，如HLHS。由于这里讨论的挑战，与在雏鸡胚胎中进行的其他机械干预（如雏骨带）相比，LAL模型导致的产量水平要低得多。我们相信，通过这里介绍的预防措施，可以实现 50% 的产量。
禽胚胎是研究心血管发育的理想脊椎动物模型，因为它具有形态结构、大小、低成本、易于培养和操作38,39。该模型还提供针对病原体的天然保护40。仪器化胚胎可用于先进的体内成像和局部siRNA操作。因此，人类和鸡的保守基因区域可以通过桑格鸟枪法测序和基于物理的定位获得39，从而导致先进的机械敏感性研究19。此外，Krejčí 等人应用的微阵列方法已被用于衡量心肌结构血流动力学变化的潜在可逆性的成功。因此，当不可逆的变化开始时，在左心室和右心室之间差异表达的基因的鉴定可以用作理想干预期的标准33。
总之，显微外科在鸡胚模型中的潜在未来应用方向包括使用专注于特定基质基因和分子信号通路的心血管基因编辑技术，支持组织细胞培养和成像技术的进步32。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢 Tubitak 2247A 首席研究员奖 120C139 提供资金。作者还要感谢 PakTavuk Gıda。A. S.，土耳其伊斯坦布尔，提供受精卵并支持心血管研究。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10-0 nylon surgical suture | Ethicon | ||
| Elastica van Gieson staining kit | Sigma-Aldrich | 115974 | For staining connective tissues in histological sections |
| Ethanol absolute | Interlab | 64-17-5 | For the sterilization step, 70% ethanol was obtained by diluting absolute ethanol with distilled water. |
| Incubator | KUHL, Flemington, New Jersey-U.S.A | AZYSS600-110 | |
| Kimwipes | Interlab | 080.65.002 | |
| Microscissors | World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL | 555640S | Vannas STR 82 mm |
| Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | Sealing stage for egg reincubation |
| Paraplast Bulk | Leica Biosystems | 39602012 | Tissue embedding medium |
| Stereo Microscope | Zeiss Stemi 508 | Stemi 508 | Used at station 1 |
| Stereo Microscope | Zeiss Stemi 2000-C | Stemi 2000-C | Used at station 2 |
| Tweezer (Dumont 4 INOX #F4) | Adumont & Fils, Switzerland | Used to return the embryo | |
| Tweezer (Super Fine Dumont #5SF) | World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL | 501985 | Used to remove the membranes on the embryo |
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