Summary
Her presenterer vi en detaljert visuell protokoll for å utføre modellen for venstre atrieligering (LAL) i fugleembryoet. LAL-modellen endrer den intrakardiale strømmen, noe som endrer belastningen på veggskjærspenningen, og etterligner hypoplastisk venstre hjertesyndrom. En tilnærming for å overvinne utfordringene i denne vanskelige mikrokirurgimodellen presenteres.
Abstract
På grunn av sin firekammerede modne ventrikkelkonfigurasjon, enkle kultur, bildetilgang og effektivitet, er fugleembryoet en foretrukket virveldyrmodell for å studere kardiovaskulær utvikling. Studier som tar sikte på å forstå normal utvikling og medfødt hjertefeilprognose vedtar i stor grad denne modellen. Mikroskopiske kirurgiske teknikker blir introdusert for å endre de normale mekaniske lastemønstrene på et bestemt embryonalt tidspunkt og spore nedstrøms molekylær og genetisk kaskade. De vanligste mekaniske inngrepene er venstre vitelline veneligering, conotruncal banding og venstre atrieligering (LAL), modulerende intramuralt vaskulært trykk og veggskjærspenning på grunn av blodstrøm. LAL, spesielt hvis det utføres i ovo, er det mest utfordrende inngrepet, med svært små prøveutbytter på grunn av de ekstremt fine sekvensielle mikrokirurgiske operasjonene. Til tross for sin høye risiko, i ovo LAL er svært verdifull vitenskapelig som det etterligner hypoplastisk venstre hjerte syndrom (HLHS) patogenese. HLHS er en klinisk relevant, kompleks medfødt hjertesykdom observert hos nyfødte mennesker. En detaljert protokoll for in ovo LAL er dokumentert i denne artikkelen. Kort fortalt ble befruktede fugleembryoer inkubert ved 37,5 °C og 60 % konstant fuktighet vanligvis til de nådde Hamburger-Hamilton (HH) stadium 20 til 21. Eggeskallene ble sprukket åpne, og ytre og indre membraner ble fjernet. Embryoet ble forsiktig rotert for å eksponere venstre atriepære i det felles atriumet. Ferdigmonterte mikroknuter fra 10-0 nylonsuturer ble forsiktig plassert og bundet rundt venstre atrieknopp. Til slutt ble embryoet returnert til sin opprinnelige posisjon, og LAL ble fullført. Normale og LAL-instrumenterte ventrikler viste statistisk signifikante forskjeller i vevskomprimering. En effektiv rørledning for generering av LAL-modeller vil bidra til studier som fokuserer på synkronisert mekanisk og genetisk manipulasjon under den embryonale utviklingen av kardiovaskulære komponenter. På samme måte vil denne modellen gi en forstyrret cellekilde for vevskulturforskning og vaskulær biologi.
Introduction
Medfødte hjertefeil (CHD) er strukturelle lidelser som oppstår på grunn av unormal embryonal utvikling1. I tillegg til genetiske forhold påvirkes patogenesen av endret mekanisk belastning 2,3. Hypoplastisk venstre hjerte syndrom (HLHS), en medfødt hjertesykdom, resulterer i en underutviklet ventrikkel / aorta ved fødselen4 med høy dødelighet 5,6. Til tross for de siste fremskrittene i den kliniske ledelsen, er den vaskulære veksten og utviklingsdynamikken til HLHS fortsatt uklar7. Ved normal embryonal utvikling stammer venstre ventrikkel (LV) endokard og myokard fra hjerteprogenitorer etter hvert som den tidlige embryonale hjerterørsdannelsen utvikler seg. Gradvis tilstedeværelse av myokardtrabekulasjon, fortykkelseslag og kardiomyocyttproliferasjon er rapportert2. For hemofagocytisk lymfohistiocytose observeres endret trabekulær remodellering og venstre ventrikkelavflatning, noe som ytterligere bidrar til myokardhypoplasi på grunn av unormal kardiomyocyttmigrasjon 2,8,9,10
Blant de mye brukte modellorganismer for å studere hjerteutvikling og forstå hemodynamiske forhold 11, er fugleembryoet foretrukket på grunn av dets firekammerede modne hjerte og dets enkle kultur11,12,13,14. På den annen side gir avansert bildetilgang av sebrafiskembryoer og transgene/knockout-mus klare fordeler11,12. Ulike mekaniske inngrep har blitt testet for fugleembryoet som endrer det intramurale trykket og veggskjærspenningen ved utvikling av kardiovaskulære komponenter. Disse modellene inkluderer venstre vitelline ligering, conotruncal banding15 og venstre atrieligering (LAL) 11,12,16. Den resulterende fenotypen på grunn av den endrede mekaniske belastningen kan observeres ca. 24-48 timer etter kirurgisk inngrep i studier med fokus på tidlig prognose11,13. LAL-intervensjonen er en populær teknikk for å begrense det funksjonelle volumet av venstre atrium (LA) ved å plassere en sutursløyfe rundt den atrioventrikulære åpningen. På samme måte er det også utført mikrokirurgiske inngrep som retter seg mot høyre atrieligering (RAL)17,18. På samme måte retter noen forskere seg mot venstre atrievedheng (LAA) ved hjelp av mikroklipp for å redusere volumet av LA19,20. I noen studier påføres en kirurgisk nylontråd på den atrioventrikulære noden19,21. Et av inngrepene som brukes er LAL, som kan etterligne HLHS, men som også er den vanskeligste modellen å utføre, med svært små prøveutbytter på grunn av de ekstremt fine mikrokirurgiske operasjonene som kreves. I vårt laboratorium utføres LAL i ovo mellom Hamburger-Hamilton (HH) trinn 20 og 21, før det felles atriumet er fullt septat 6,14,22,23. En kirurgisk sutur er plassert rundt LA, som endrer de intrakardiale blodstrømstrømmene. I LAL-modeller av HLHS observeres økt ventrikkelveggstivhet, endrede myofibervinkler og redusert LV-hulromsstørrelse14,24.
I denne videoartikkelen er det gitt en detaljert protokoll og tilnærming for in ovo LAL. Kort fortalt ble de befruktede fugleembryoene inkubert for mikrokirurgi, eggeskallet ble sprukket åpent, og ytre og indre membraner ble ryddet. Embryoet ble deretter sakte rotert slik at LA var tilgjengelig. En 10-0 nylon kirurgisk sutur ble bundet til atrieknoppen, og embryoet ble returnert til sin opprinnelige orientering, og fullførte LAL-prosedyren25. LAL og normale ventrikler sammenlignes for vevskomprimering og ventrikkelvolum via optisk koherenstomografi og basal histologi.
En vellykket utført LAL-modellrørledning, som beskrevet her, vil bidra til grunnleggende studier med fokus på embryonal utvikling av kardiovaskulære komponenter. Denne modellen kan også brukes sammen med genetiske manipulasjoner og avanserte avbildningsmodaliteter. På samme måte er den akutte LAL-modellen en stabil kilde til syke vaskulære celler for vevskultureksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Fruktbare hvite leghornegg er hentet fra pålitelige leverandører og inkuberes i henhold til universitetsgodkjente retningslinjer. Chick embryoer, stadier 18 (dag 3) til 24 (dag 4) (stadiene presentert i denne artikkelen) anses ikke som levende virveldyr av EU-direktiv 2010/63 / EU og retningslinjene for institusjonell dyrepleie og bruk (IACUC) i USA. Kyllingembryoer regnes som "levende dyr" etter dag 19 av inkubasjon i henhold til amerikanske lover, men ikke for EU. Hvert egg er merket med startdato for klekking og er planlagt å klekkes senest den 10. dagen av inkubasjonen. Etter at eggene klekkes, fjernes kyllingene fra inkubatoren. Protokollen utføres i to stasjoner (stasjon 1 og stasjon 2), med fokus på spesialiserte modellgenereringstrinn.
1. Forberedelse før mikrokirurgi
- Få befruktede egg enten fra et vaksineutviklingssenter med en spesifikk patogenfri (SPF) klasse eller gjennom en pålitelig kommersiell leverandørgård av en skjøre leveringskurer i tørre polystyrenbeholdere. Før inkubering, rengjør eggeskallet forsiktig med lofrie kluter dynket i 70% etanol for å fjerne forurensning.
- Embryo inklusjon/eksklusjonskriterier
- Ikke inkuber egg som ble sprukket eller skadet under transport.
- Hvis blødning oppdages under LAL-prosedyren eller etter re-inkubasjon, må du ikke bruke embryoet.
- Ikke bruk embryoer som utvikler seg i venstre side opp-stilling, da hemodynamisk blodstrøm kan avvike fra normal orientering.
- Dıscard embryoer utvikler seg med medfødte defekter i både pre- og post-kirurgiske prosedyrer.
- Inkluder embryoer som når det målrettede stadiet som utvikler seg på sin opprinnelige plassering, og etterligner HLHS som en LAL-modell.
- Inkuber de befruktede hvite leghornkyllingeggene (Gallus gallus domesticus L.), stump ende, til ønsket stadium typisk ved HH20-2115 (37,5 °C, 60 % fuktighet, 3,5 dager) (figur 1).
MERK: Det er viktig å holde eggene ved konstant temperatur og fuktighet for å øke utbyttet. Avhengig av inkubatormodellen vil tilsetningen av en panne fylt med destillert vann opprettholde stabil fuktighet. Tegninger av et ekstra / hjelpetemperatur- og fuktighetskontrollsystem som passer til de fleste inkubatorer, er utviklet av forfatterne og anbefales. Elektronikken, maskinvaren og kodedetaljene til denne internbygde sensoren/kontrollenheten leveres i et datalager26. Kontinuerlig lett risting (rotering) av eggene under inkubering kan tillate optimal posisjonering av embryoet og dermed føre til en høyere prosentandel av "operable" embryoer. Risting kan også arbeide med inkubatorer med denne kapasiteten og øke produktiviteten ytterligere. - Før du starter prosedyren, må du forberede det nødvendige antall knuter ved å binde en løs overhåndsknute i en 1,5 cm lang 10-0 sutur. Pass på at knuten ikke er stram og er stor nok til å passe lett over atriene under operasjonen (figur 2).
NOTAT: Bind knutene på forhånd og hold dem i en steril kyllingringerløsning før bruk. Knutebindingsoperasjonen krever bruk av to hender for å betjene pinsetten synkront. Siden dette er et kritisk stadium i protokollen, kan det lages en modell av atriet av kitt for å øve på dette trinnet (figur 3). Dette vil forbedre de tredimensjonale mikrokirurgiske ferdighetene som trengs for å utføre trinn 3.2.3 på stasjon 2 (figur 4).
2. Drift på stasjon 1 (figur 4A)
- Åpne et vindu fra den stumpe enden av egget og fjern både ytre og indre membraner15 (figur 5A-D).
- Åpne eggeskallet ved å knekke forsiktig med den bakre enden av pinsetten, med de frie fingrene som støtter egget godt for å redusere uønsket sprekkutbredelse.
- Siden LAL er en lang prosedyre, må du bevare temperaturen og fuktigheten til embryoet, da hjertefrekvensen avhenger av temperaturen. Sørg derfor for at det første skallvinduet er opprettet så lite som mulig, akkurat nok til å utføre operasjonene.
MERK: Ingen fuktighets- eller temperaturkontrollsystemer brukes under driften, men disse systemene, hvis de er tilgjengelige, vil være til nytte for utbyttet. Hvis det er mulig, slås klimaanlegget i laboratoriet av, og prosedyren utføres ved høyest mulig romtemperatur (RT). Optimalisering av embryonal hjertefrekvens, som kan styres av temperaturen, under operasjonen anbefales også. Noen laboratorier opprettholder hjertefrekvensen med litt lavere hastigheter enn 120 bpm via temperaturkontroll under LAL-operasjonen. Som sådan vil fuktighetskontroll som brukes rundt den kirurgiske sonen øke utbyttet ytterligere. Eggeskallvinduene er laget så små som mulig, akkurat store nok til å tillate kirurgisk tilgang. Dette gjelder også for den tykke ytre membranen, som vanligvis er mindre enn eggeskallet bare i omfanget av embryoets omkrets. Disse sørger for å opprettholde temperaturen og fuktigheten til embryoet. Mens du åpner et vindu fra den stumpe enden av egget, blir de små skallfragmentene rengjort slik at disse bitene ikke skader den vitelline vaskulære integriteten eller fører til uønskede gjenstander. I tillegg bruker andre laboratorier buede mikro-serrated saks for å lage vinduer. Også to bredder av Scotch tape kan brukes til å stabilisere eggeskallet for å kontrollere sprekker. - Fjern bare den nødvendige vitellinemembranen med mikrosaks (tilleggsvideo 1).
- Normal embryonal utvikling er høyre side opp. Når embryoet er fri for vitellinemembranen, plasser pinsetten med lukkede spisser under det dorsale segmentet av embryoet og vend forsiktig embryoet for å eksponere venstre side (dvs. konfigurasjon med venstre side opp) (figur 6A, B; Supplerende video 2).
- Sørg for at venstre atrieknopp nå er eksponert, men fortsatt dekket av et komplekst membransystem, vanligvis bestående av et dobbeltlag av perikardiet.
- Fjern membranene, inkludert de fine, umiddelbart rundt atriell knopp. Dette er et annet kritisk stadium; Utfør membranfjerning fra grove membraner og gå videre til de fine rundt venstre atrieknopp. Reserver den fineste pinsetten for fjerning av den fine membranen (tilleggsvideo 3).
- Under membranfjerningsprosessen, orienter embryoet i venstre side opp, slik at knuteplasseringsoperasjonen i trinn 3.2 kan utføres uten ytterligere reposisjonering. For å oppnå dette, løft embryoet ved hjelp av membranene i trinn 2.6 og heng det fra eggeskallet, slik at venstre side vender opp.
MERK: Noen embryoer kan være lokalisert nær eggeskallets periferi og kan være utfordrende å operere. Likevel vil disse embryoene mest sannsynlig være orientert høyre side opp og vise normal oppførsel, og kan inkluderes i studien. I disse tilfellene, om nødvendig, kan det skjulte atriumet gjøres mer tilgjengelig ved å forsiktig rengjøre perikardmembranen med #4 fin pinsett og fjerne eggeskallet i motsatt retning (mot skallåpningen). Disse embryoene kan også løftes ved hjelp av deler av de ekstraembryonale membranene og festes i ønsket posisjon ved å feste den ene enden av membranen (pinsettenden) til eggeskallet, ved hjelp av sin naturlige klebrighet. I tillegg kan rommet mellom hodet og ryggmargsområdet i embryoet utvides ved hjelp av pinsett for å avsløre det skjulte atriumet.
3. Drift på stasjon 2 (figur 4B)
- Under stereomikroskopet plasserer du den forhåndsforberedte knuten fra trinn 1.4 nær embryoet på et tilgjengelig sted (figur 6B). Atriellknoppen er nå klar til å knytes (tilleggsvideo 4).
- Hent den ferdig forberedte åpne knuten og orienter den over venstre atrieknopp. For at LAL skal fungere, plasser egget i en unikt skrånende tredimensjonal orientering.
- Orienter knuten riktig for å utføre strammeprosessen uten å skade embryoene.
- Fjern de fine membranene optimalt i trinn 2.7 for å redusere effekten av et bankende hjerte.
- Stram suturen (figur 6C). For dette trinnet er det veldig nyttig å øve med kitt. For falske embryoer, stram knuten akkurat nok til å holde knuten.
- Deretter bruker du mikrosaksen til å kutte overflødige ender av suturen så nær knoppen som mulig (tilleggsvideo 5).
- Vær veldig forsiktig med at de nylig kuttede endene av den bundne suturen ikke er i stand til å punktere nærliggende fartøy under rotasjon eller på grunn av hjerteslag.
- Bruk pinsetten til å fjerne overflødige suturbiter som er skåret bort i trinn 3.3.
- Til slutt, ved hjelp av lukket pinsett, returner embryoet til sin opprinnelige posisjon, som i trinn 2.5 (tilleggsvideo 6).
- Etter å ha fullført LAL-prosessen, dekk egget med et dobbeltlag parafilm og inkuber det igjen. En tett og steril lukking av eggene er avgjørende for overlevelse, spesielt etter 24 timer med inkubasjon. Hvis visuell tilgang også er ønskelig, bruk parafinvoks med glasslysbilder.
MERK: Når den tidlige embryonale perioden studeres, ruges eggene vanligvis i 24-48 timer til de når omtrent HH25 eller HH27. Det er imidlertid ingen grense, og senere stadier kan studeres, som forsøkt av andre forskere. For raske driftshastigheter anbefales minst et tomannsteam. En person bør trenes for og er ansvarlig for eggåpning, innledende membranopprydding, rotasjon og membranopprydding rundt venstre atrieknopp. Den andre personen er bare ansvarlig for innledende knuteforberedelse, knuteplassering og stramming. Den endelige embryorotasjonen kan utføres av person 1. Den kirurgiske operasjonen for et enkelt embryo tar ca 4-5 minutter. - Rengjør benkflatene og instrumentene med etanol før / etter kirurgiske operasjoner. Sørg for å bruke fersk kyllingringerløsning (NaCl, KCl, CaCl2 og NaHCO3) 16,27 til metallinstrumentene som berører det embryonale vevet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Avanserte tidsoppløste avbildningsteknikker kan brukes til å observere strukturelle og morfologiske endringer på grunn av LAL-intervensjon10. Videre er LAL-prøver også egnet til molekylære og biologiske metoder19,28. I tabell 1 er utvalgsstudier som benyttet LAL-modellresultater gitt. I denne sammenheng ble LAL-intervensjon utført i kyllingembryoer som nådde HH20-21. Både kontroll- (friske) og LAL-hjerter ble fjernet fra embryoet ved HH25-26. Deretter ble prøvene fiksert i 4 % paraformaldehyd (PFA) ved 4 °C 6,15. De fjernede hjerteprøvene ble deretter dehydrert i etanoloppløsninger med økende konsentrasjoner (70%, 96% og 100%) i 1 time hver. Til slutt ble prøvene oppbevart i xylen ved RT i 0,5 timer, og parafinembedding ble utført før snitting ved en tykkelse på 10 μm. Prøvene som ble overført til glassglasset ble farget med Elastica van Gieson-flekk. Snittene ble undersøkt med stereomikroskop, der ventrikkelens tverrdiameter ble målt. Vi utførte også en tredimensjonal ikke-invasiv metode, optisk koherenstomografiskanning (OCT), i noen prøver11,29. Både kontroll- og LAL-hjerter ved HH25-26 ble skåret ut, og tverrlumendiameteren ble målt under OCT.
Resultatene viste at for LAL oppnås en mer kompakt myokardstruktur med signifikante morfologiske endringer sammenlignet med normal utvikling (figur 7). I tillegg observeres avsetning av ekstracellulære matrikskomponenter, som kollagen, rundt hjerteinterstitium, som ligner myokardfibrose lik HLHS30. For bedre å forstå myokardfortykkelse og trabekulær komprimering ble morfometriske porøsitetsmålinger utført både i kontroll- og LAL-prøver. Som forventet resulterte LAL-intervensjonen i et mindre venstre ventrikkelhulrom og trabekulær komprimering ved å stramme de intertrabekulære recessene. Disse funnene bekrefter hypotesen om at LAL endrer den sunne ventrikulære arkitekturen og reorienterer det trabekulære aspektet22. Likeledes resulterte LAL-modellen ved HH29 i forstørret høyre ventrikkelhule, endret trabekulær arkitektur og myokardvolum24.
For å støtte resultatene i denne studien ble OCT-avbildning brukt til å måle ventrikkellumentverrarealet og aksiallengden (figur 8). LAL viste en signifikant reduksjon i venstre ventrikkels størrelse og diameter sammenlignet med kontrollen. Mens bare ventriklene er fokusert her, er LALs innflytelse på aortabueutvikling også rapportert31. En nylig studie vi bidro til rapporterte i 3D at midtveggmyokardstammene ble økt i begge ventriklene etter LAL ved HH2532. I tillegg viste LAL-grupper en økning i veggtykkelse sammenlignet med kontrollgrupper ved HH25. Denne studien stemmer overens med den tidligere studien av Tobita et al.25, som viste en signifikant økning i maksimale systoliske epikardiale omkretsstammer i LAL LV ved HH27.
Figur 1: Inkubasjonssystem for embryonal vekst. Befruktede hvite leghornkyllingegg (Gallus gallus) ble inkubert i en inkubator ved konstant fuktighet (60%) og temperatur (37,5 °C). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Klargjøring av LAL-knuten. Flere knuter ~ 0,5-1 mm i diameter og 1-2 cm lange stykker ble tilberedt ved hjelp av 10-0 nylon kirurgiske suturer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Replika av det embryonale venstre atrium laget av kitt. En kopi av venstre atrieseksjon er opprettet for å trene og øve knuteorientering og knutelukkingstrinn ved hjelp av to pinsett. Dette tillot oss å gjøre mange forsøk og perfeksjonere disse trinnene før vi implementerte denne ferdigheten i selve embryoet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Klargjøring av stasjonen . (A,B) Alle materialer og løsninger for mikrokirurgi ble plassert i det rene området for stasjon 1 og stasjon 2. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Åpne et vindu fra den stumpe enden av egget og fjerning av både ytre og indre membraner. (A,B) Et lite vindu ble åpnet ved hjelp av mikrokirurgiske instrumenter på eggeskallet og inkluderte hele embryoet i HH20-21. (C) Fragmenter av eggeskallet ble fjernet i det første sprekketrinnet. (D,E) Ekstraembryonale membraner ble også dissekert under mikroskopet. (F) Etter at LAL-prosessen var fullført, ble egget dekket med et dobbeltlag parafilm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6 Et øyeblikksbilde av in ovo venstre atrieligering (LAL) kirurgi. (A) Dorsal visning av kyllingembryoet i sin normale orientering. Den embryonale ventrikkelen som når HH20-21 har et primitivt felles atrium (a), ventrikkel (v) og utstrømningskanalen (ot). (B) Et nærbilde av det vendte, venstre side-opp-embryoet og knuteplasseringen vises. (C) LA med suturknuten. Forkortelser: LA = venstre atrium; AA = aortabue. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Fjerning og undersøkelse av kontroll- og LAL-hjertet. Både (A) kontroll og (B) LAL-hjerter som nådde HH25-26-stadiet ble fjernet fra embryoet og undersøkt under et stereomikroskop. Søylediagrammet viser forskjellene i tverrgående hjertediameter mellom LAL-gruppen og kontrollgruppen, og gjennomsnittlig ± standardavvik (SD) på minst fire replikater. Skalastang = 100 μM. Histologisk undersøkelse av hjertevev i (C) kontroll og (D) LAL-prøver ved bruk av Elastica van Gieson-fargeteknikk. Søylediagrammet viser forskjeller i porøsitet (%) for å vise myokardkompresjon mellom LAL og kontrollgruppen, og gjennomsnittlig ± SD på minst to replikater. **p < 0,01. GraphPad Prism versjon 9.5.1 ble brukt til statistisk analyse. Skala bar = 50 μM. Forkortelser: LAL = venstre atrieligering; LA = venstre atrium; RA = høyre atrium; RV = høyre ventrikkel; LV = venstre ventrikkel. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Optisk koherenstomografi. Både (A) kontroll og (B) LAL-hjerter som nådde HH25-26 ble undersøkt av OCT. (C,D) Størrelsen og lengden på lumenkrysset i ventriklene er angitt i henholdsvis panelene (C) og (D). Histogrammene representerer gjennomsnittet ± SD med minst tre repetisjoner. *p < 0,05; **p < 0,01; GraphPad Prism versjon 9.5.1 ble brukt til statistisk analyse. Skala bar = 100 μM. Forkortelser: LAL = venstre atrieligering; RV = høyre ventrikkel; LV = venstre ventrikkel. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tabell 1: En gjennomgang av forskningsstudier som benytter modellen for venstre atrieligering (LAL) i fugleembryoer 6,10,12,14,22,24,27,30,32,33.
I nesten alle aviser er LA bundet på HH21. Effekten av LAL undersøkes på senere HH-stadier (vurderingsstadiet). Forkortelser: AVC = atrioventrikulær pute; LAV = venstre atrioventrikulær kanal; RAV = høyre atrioventrikulær kanal; RA = høyre atria; LA = venstre atria; RV = høyre ventrikkel; LV = venstre ventrikkel; SEN = subendokardium; IVS = interventrikulær septum; micro-CT = mikrocomputertomografi. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 2: Typisk effektivitet av venstre atriell ligering (LAL) modell opprettet ved HH21 og inkubert til HH25. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tilleggsvideo 1: Både den ytre og indre membranen til fugleembryoet fjernes. Deretter fjernes bare vitellinemembranen, som vist ved bruk av mikrosaks. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsvideo 2: Pinsett plasseres under dorsalsegmentet av embryoet med høyre side opp og vendes forsiktig for å eksponere venstre atrieknopp. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsvideo 3: Membranene rundt venstre atrieknopp fjernes gradvis. Atriet utvides litt, noe som gjør knuteplassering og binding mulig. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsvideo 4: En ca. 0,1-0,3 mm lang sutur plasseres nær embryoet og strammes rundt den ved hjelp av to pinsett. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsvideo 5: De overflødige suturendene av knuten kuttes forsiktig ved hjelp av mikrosaks. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsvideo 6: Embryoet returneres forsiktig til normal orientering. LAL er fullført. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ved hemofagocytisk lymfohistiocytose endres blodstrømmen på grunn av strukturelle defekter, noe som fører til unormal morfologi på venstre side 4,6. Den nåværende modellen gir et praktisk eksperimentelt system for bedre å forstå utviklingen av HLHS og kan til og med etterligne patogenesen8. Det er imidlertid utfordrende å etablere en fullt klinisk ekvivalent dyremodell for hemofagocytisk lymfohistiocytose. I tillegg til den aviære LAL-modellen som presenteres her, har nyere studier på mus, fostersau og frosker forsøkt å gjenskape de morfologiske, hemodynamiske og patofysiologiske egenskapene til HLHS-prognosen. I musembryoer endres mekanisk belastning via et emboliseringsmiddel injisert i LA gjennom en fosterintervensjon ved embryonal dag (ED) 14,5 (omtrent HH40-41 i kyllingembryoer)34. Totalt 48% av fostrene som var positivt embolisert, overlevde til svangerskap med små LVer og retrograd aortastrøm. Den lange svangerskapstiden, ytterligere utfordringer med intervensjoner på tidlige tidspunkter og utfordrende fosterkirurgi kan begrense gjennomførbarheten av denne modellen. LV-hypoplasi ble også etterlignet i fosterlammemodellene ved å fylle LA med silikongummi gjennom et ballongkateter35. I denne store dyremodellen reduseres LV-volumet tilstrekkelig, men overlevelsestiden er ikke lang, noe som resulterer i lav sykdomspenetrasjon. En alternativ intervensjonstilnærming er å okkludere foramen ovale via perkutan transhepatisk kateterisering, slik man forsøker hos fosterlam36, selv om det er svært utfordrende å lede den okklusive stenten til foramen ovale. Sauemodeller generelt er svært utfordrende på grunn av deres eksisterende vaskulære morfologier og ugunstige lungefysiologi. Som sådan begrenser behovet for sesongavl, en senere svangerskapsalder og liten prøvestørrelse denne modellen ytterligere. Endelig blir Xenopus-embryoet også introdusert som en annen praktisk modell for å etterligne menneskelig hjertesykdom37, til tross for sitt trekammerhjerte med en enkelt ventrikkel og forskjeller i nevrale kamcellemønstre. Tilgjengeligheten av fullgenometablerte mikroinjeksjons- og mikrokirurgiske inngrep og den lange overlevelsestiden gjør også denne modellen attraktiv.
I tidligere studier ble sykdomspenetrasjonen til seks av 39 opererte fugleembryoer presentert som 15% i LAL-modellen34. Den gjennomsnittlige HLHS-penetrasjonen av kyllingembryomodellen som vi undersøkte tidlig (nådde HH25 og HH27) var imidlertid 66% (12 av 18 opererte fugleembryoer). Prof. Sedmera rapporterte at gjennomsnittlig overlevelsestid for embryoer kunne være HH40 (ED14) 19. Andre grupper som regelmessig utfører denne ligasjonen har rapportert høye suksessrater på tidlige tidspunkter (f.eks. 75% til HH29, 50% til HH34 og 20% til HH38) 30. Men i senere stadier oppstår en distinkt fenotype og dødeligheten øker. Selv om sykdomspenetrasjonen kan være relativt lav hos kyllingembryoer, er målet med denne modellen å bedre undersøke etiologien og patologien til prenatal hemofagocytisk lymfohistiocytose, spesielt i de tidlige stadiene.
På grunn av den svært små størrelsen på kyllingembryoet i tidlig stadium, kan pre- og postoperativ LAL-intervensjon føre til flere komplikasjoner. Som et middel for å forhindre forurensning rengjøres eggeskall og benker med 70% etanol, og hansker kan brukes gjennom hele prosedyren. Et kritisk trinn i LAL-protokollen er fjerning av hele perikardmembranen for å tillate en god passform av knuten rundt venstre atrieknopp. I tillegg har vi funnet tomannsteamet å være ekstremt nyttig, spesielt i trening og spesialisering i et spesifikt ferdighetssett som trengs under protokolltrinnene. Denne tilnærmingen fremskynder prosedyren og dens læringskurve. Som sådan er risikoen for blødning og forurensning sekundær og oppveier fordelene med det foreslåtte kompissystemet. Bruk av en ferdig forberedt sutur lagret i en steril kyllingringerløsning anbefales. I tillegg er opprettholdelse av en lav tiltrekkingsstyrke av suturen også kritisk for høyere embryoutbytte. Strammere knuter på atrieknoppen som brukes i HH21 kan føre til for tidlig svikt i LV som ikke er i stand til å utdype det klinisk kritiske engasjementet av lednings-, koronar- og sekundære myoarkitekturremodelleringsdefekter, som er godt beskrevet i tidligere studier22. Spesielt kan bruk av den fineste og ubrukte pinsetten og saksen på visse trinn og relativt stumpe på andre redusere utilsiktet blødning. Til slutt, umiddelbart etter at knuten er fullført, skal embryoet raskt vendes til sin opprinnelige posisjon, og eggeskallvinduet skal lukkes med et dobbeltlag parafilm for å bevare temperatur og fuktighet. Det typiske utbyttet for LAL-modellen som når HH25 er presentert i tabell 2. I tillegg til den reduserte ventrikkelstørrelsen, kan valvulære misdannelser også utvikles, for eksempel mitral / aortaatresi. Alvorlighetsgraden av disse lesjonene øker sykeligheten i senere stadier, som ved hemofagocytisk lymfohistiocytose. På grunn av utfordringene som diskuteres her, sammenlignet med andre mekaniske inngrep utført i kyllingembryoer, som conotruncal banding, resulterer LAL-modellen i mye lavere avkastningsnivåer. Vi tror, gjennom forholdsreglene som presenteres her, at en 50% avkastning er oppnåelig.
Fugleembryoet er en ideell virveldyrmodell for å undersøke kardiovaskulær utvikling på grunn av sin morfologiske struktur, størrelse, lave kostnader, enkel kultur og manipulering38,39. Denne modellen gir også naturlig beskyttelse mot patogener40. Instrumenterte embryoer kan benyttes i avansert in vivo avbildning og lokal siRNA-manipulasjon. Som sådan er konserverte genregioner av menneske og kylling tilgjengelig gjennom Sanger-haglesekvensering og fysisk-basert kartlegging39, noe som fører til avanserte mekanosensitive studier19. Videre har mikroarray-tilnærmingen som brukes av Krejčí et al. blitt brukt til å måle suksessen angående potensiell reversibilitet av hemodynamiske endringer i myokardstruktur. Dermed kan identifisering av gener differensielt uttrykt mellom venstre og høyre ventrikler brukes som et kriterium for den ideelle intervensjonsperioden når irreversible endringer begynner33.
Avslutningsvis inkluderer potensielle fremtidige retninger for mikrokirurgiske applikasjoner i kyllingembryomodellen bruk av kardiovaskulære genredigeringsteknikker med fokus på spesifikke matriksgener og molekylære signalveier, som støtter fremskritt innen vevscellekultur og bildebehandlingsteknologier32.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi anerkjenner Tubitak 2247A lead researcher award 120C139 som gir finansiering. Forfatterne vil også takke PakTavuk Gıda. AS, Istanbul, Tyrkia, for å gi fruktbare egg og støtte kardiovaskulær forskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10-0 nylon surgical suture | Ethicon | ||
| Elastica van Gieson staining kit | Sigma-Aldrich | 115974 | For staining connective tissues in histological sections |
| Ethanol absolute | Interlab | 64-17-5 | For the sterilization step, 70% ethanol was obtained by diluting absolute ethanol with distilled water. |
| Incubator | KUHL, Flemington, New Jersey-U.S.A | AZYSS600-110 | |
| Kimwipes | Interlab | 080.65.002 | |
| Microscissors | World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL | 555640S | Vannas STR 82 mm |
| Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | Sealing stage for egg reincubation |
| Paraplast Bulk | Leica Biosystems | 39602012 | Tissue embedding medium |
| Stereo Microscope | Zeiss Stemi 508 | Stemi 508 | Used at station 1 |
| Stereo Microscope | Zeiss Stemi 2000-C | Stemi 2000-C | Used at station 2 |
| Tweezer (Dumont 4 INOX #F4) | Adumont & Fils, Switzerland | Used to return the embryo | |
| Tweezer (Super Fine Dumont #5SF) | World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL | 501985 | Used to remove the membranes on the embryo |
References
- Wang, T., et al. Congenital heart disease and risk of cardiovascular disease: A meta-analysis of cohort studies. Journal of the American Heart Association. 8 (10), e012030 (2019).
- Chaudhry, B., et al. The left ventricular myocardium in hypoplastic left heart syndrome. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (8), 279 (2022).
- Lashkarinia, S. S., Çoban, G., Ermek, E., Çelik, M., Pekkan, K. Spatiotemporal remodeling of embryonic aortic arch: stress distribution, microstructure, and vascular growth in silico. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 19 (5), 1897-1915 (2020).
- Ho, S., Chan, W. X., Yap, C. H. Fluid mechanics of the left atrial ligation chick embryonic model of hypoplastic left heart syndrome. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 20 (4), 1337-1351 (2021).
- Gordon, B. M., Rodriguez, S., Lee, M., Chang, R. K. Decreasing number of deaths of infants with hypoplastic left heart syndrome. The Journal of Pediatrics. 153 (3), 354-358 (2008).
- Salman, H. E., et al. Effect of left atrial ligation-driven altered inflow hemodynamics on embryonic heart development: clues for prenatal progression of hypoplastic left heart syndrome. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 20 (2), 733-750 (2021).
- Fruitman, D. S. Hypoplastic left heart syndrome: Prognosis and management options. Paediatrics & Child Health. 5 (4), 219-225 (2000).
- Rahman, A., Chaturvedi, R. R., Sled, J. G. Flow-mediated factors in the pathogenesis of hypoplastic left heart syndrome. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (5), 154 (2022).
- Henderson, D. J., Anderson, R. H. The development and structure of the ventricles in the human heart. Pediatric Cardiology. 30 (5), 588-596 (2009).
- Kowalski, W. J., Pekkan, K., Tinney, J. P., Keller, B. B. Investigating developmental cardiovascular biomechanics and the origins of congenital heart defects. Frontiers in Physiology. 5, 408 (2014).
- Midgett, M., Rugonyi, S. Congenital heart malformations induced by hemodynamic altering surgical interventions. Frontiers in Physiology. 5, 287 (2014).
- Kowalski, W. J., et al. Left atrial ligation alters intracardiac flow patterns and the biomechanical landscape in the chick embryo. Developmental Dynamics. 243 (5), 652-662 (2014).
- Bruneau, B. G. The developmental genetics of congenital heart disease. Nature. 451 (7181), 943-948 (2008).
- Sedmera, D., et al. Cellular changes in experimental left heart hypoplasia. The Anatomical Record. 267 (2), 137-145 (2002).
- Celik, M., et al. Microstructure of early embryonic aortic arch and its reversibility following mechanically altered hemodynamic load release. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 318 (5), H1208-H1218 (2020).
- Tobita, K., Schroder, E. A., Tinney, J. P., Garrison, J. B., Keller, B. B. Regional passive ventricular stress-strain relations during development of altered loads in chick embryo. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 282 (6), H2386-H2396 (2002).
- Alser, M., Shurbaji, S., Yalcin, H. C. Mechanosensitive pathways in heart development: findings from chick embryo studies. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 8 (4), 32 (2021).
- Alser, M., et al. Blood flow disturbance and morphological alterations following the right atrial ligation in the chick embryo. Frontiers in Physiology. 13, 849603 (2022).
- Sedmera, D.
- Rychter, Z., Rychterová, V., Lemez, L. Formation of the heart loop and proliferation structure of its wall as a base for ventricular septation. Herz. 4 (2), 86-90 (1979).
- Harh, J. Y., Paul, M. H., Gallen, W. J., Friedberg, D. Z., Kaplan, S. Experimental production of hypoplastic left heart syndrome in the chick embryo. The Americal Journal of Cardiology. 31 (1), 51-56 (1973).
- Sedmera, D., Pexieder, T., Rychterova, V., Hu, N., Clark, E. B. Remodeling of chick embryonic ventricular myoarchitecture under experimentally changed loading conditions. The Anatomical Record. 254 (2), 238-252 (1999).
- Karakaya, C., et al. Asymmetry in mechanosensitive gene expression during aortic arch morphogenesis. Scientific Reports. 8 (1), 16948 (2018).
- Trinidad, F., et al. Effect of blood flow on cardiac morphogenesis and formation of congenital heart defects. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (9), 303 (2022).
- Tobita, K., Keller, B. B. Right and left ventricular wall deformation patterns in normal and left heart hypoplasia chick embryos. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 279 (3), H959-H969 (2000).
- Bortecine, S., Merve Nur, C., Faruk, K., Kerem, P. Auxiliary humidifier system design and construction for research grade egg incubators. Zenodo. , (2023).
- Schroder, E. A., Tobita, K., Tinney, J. P., Foldes, J. K., Keller, B. B. Microtubule involvement in the adaptation to altered mechanical load in developing chick myocardium. Circulation Research. 91 (4), 353-359 (2002).
- Rufaihah, A. J., Chen, C. K., Yap, C. H., Mattar, C. N. Z. Mending a broken heart: In vitro, in vivo and in silico models of congenital heart disease. Disease Models & Mechanisms. 14 (3), (2021).
- Siddiqui, H. B., Dogru, S., Lashkarinia, S. S., Pekkan, K. Soft-tissue material properties and mechanogenetics during cardiovascular development. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (2), 64 (2022).
- Pesevski, Z., et al. Endocardial fibroelastosis is secondary to hemodynamic alterations in the chick embryonic model of hypoplastic left heart syndrome. Developmental Dynamics. 247 (3), 509-520 (2018).
- Hu, N., et al. Dependence of aortic arch morphogenesis on intracardiac blood flow in the left atrial ligated chick embryo. Anatomical Record. 292 (5), 652-660 (2009).
- Lashkarinia, S. S., et al. Myocardial biomechanics and the consequent differentially expressed genes of the left atrial ligation chick embryonic model of hypoplastic left heart syndrome. Annals of Biomedical Engineering. 51 (5), 1063-1078 (2023).
- Krejčí, E., et al. Microarray analysis of normal and abnormal chick ventricular myocardial development. Physiological Research. 61, S137-S144 (2012).
- Rahman, A., et al. A mouse model of hypoplastic left heart syndrome demonstrating left heart hypoplasia and retrograde aortic arch flow. Disease Models & Mechanisms. 14 (11), (2021).
- Fishman, N. H., Hof, R. B., Rudolph, A. M., Heymann, M. A. Models of congenital heart disease in fetal lambs. Circulation. 58 (2), 354-364 (1978).
- Wong, F. Y., et al. Induction of left ventricular hypoplasia by occluding the foramen ovale in the fetal lamb. Scientific Reports. 10 (1), 880 (2020).
- Nie, S. Use of frogs as a model to study the etiology of HLHS. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 10 (2), 51 (2023).
- Vilches-Moure, J. G. Embryonic chicken (Gallus gallus domesticus) as a model of cardiac biology and development. Comparative Medicine. 69 (3), 184-203 (2019).
- Kain, K. H., et al. The chick embryo as an expanding experimental model for cancer and cardiovascular research. Developmental Dynamics. 243 (2), 216-228 (2014).
- Sukparangsi, W., Thongphakdee, A., Intarapat, S. Avian embryonic culture: A perspective of in ovo to ex ovo and in vitro studies. Frontiers in Physiology. 13, 903491 (2022).
