Summary
Här presenterar vi ett detaljerat visuellt protokoll för att utföra modellen för vänster förmaksligering (LAL) i fågelembryot. LAL-modellen förändrar det intrakardiella flödet, vilket förändrar väggskjuvspänningsbelastningen, vilket efterliknar hypoplastiskt vänsterhjärtsyndrom. Ett tillvägagångssätt för att övervinna utmaningarna med denna svåra mikrokirurgiska modell presenteras.
Abstract
På grund av dess fyrkammarformade mogna ventrikulära konfiguration, enkla odling, avbildningsåtkomst och effektivitet är fågelembryot en föredragen ryggradsdjurmodell för att studera kardiovaskulär utveckling. Studier som syftar till att förstå den normala utvecklingen och prognosen för medfödda hjärtfel använder i stor utsträckning denna modell. Mikroskopiska kirurgiska tekniker introduceras för att ändra de normala mekaniska belastningsmönstren vid en specifik embryonal tidpunkt och spåra den molekylära och genetiska kaskaden nedströms. De vanligaste mekaniska ingreppen är vänster vitellinvenligering, conotruncal banding och vänster förmaksligering (LAL), som modulerar det intramurala kärltrycket och väggskjuvspänningen på grund av blodflödet. LAL, särskilt om det utförs i ovo, är det mest utmanande ingreppet, med mycket små provutbyten på grund av de extremt fina sekventiella mikrokirurgiska operationerna. Trots sin höga risk är LAL i ovo mycket värdefullt vetenskapligt eftersom det efterliknar hypoplastiskt vänsterhjärtsyndrom (HLHS) patogenes. HLHS är en kliniskt relevant, komplex medfödd hjärtsjukdom som observeras hos nyfödda människor. Ett detaljerat protokoll för in ovo LAL dokumenteras i detta dokument. I korthet inkuberades befruktade fågelembryon vid 37,5 °C och 60 % konstant luftfuktighet tills de nådde Hamburger-Hamilton (HH) stadierna 20 till 21. Äggskalen sprack upp och de yttre och inre hinnorna togs bort. Embryot roterades försiktigt för att exponera den vänstra förmaksbulben i det gemensamma förmaket. Förmonterade mikroknutar från 10-0 nylonsuturer placerades försiktigt och knöts runt den vänstra förmaksknoppen. Slutligen återställdes embryot till sin ursprungliga position och LAL fullbordades. Normala och LAL-instrumenterade ventriklar visade statistiskt signifikanta skillnader i vävnadspackning. En effektiv LAL-modellgenereringspipeline skulle bidra till studier som fokuserar på synkroniserad mekanisk och genetisk manipulation under den embryonala utvecklingen av kardiovaskulära komponenter. På samma sätt kommer denna modell att utgöra en störd cellkälla för vävnadsodlingsforskning och vaskulär biologi.
Introduction
Medfödda hjärtfel är strukturella störningar som uppstår på grund av onormal embryonal utveckling1. Förutom genetiska förhållanden påverkas patogenesen av förändrad mekanisk belastning 2,3. Hypoplastiskt vänsterhjärtsyndrom (HLHS), en medfödd hjärtsjukdom, resulterar i en underutvecklad kammare/aorta vid födseln4 med hög dödlighet 5,6. Trots de senaste framstegen i den kliniska hanteringen är den vaskulära tillväxt- och utvecklingsdynamiken för HLHS fortfarande oklar7. Vid normal embryonal utveckling härstammar endokardiet och hjärtmuskeln i vänster kammare (LV) från hjärtats stamceller när den tidiga embryonala hjärtrörsbildningen fortskrider. Den gradvisa förekomsten av myokardtrabekulation, förtjockningsskikt och kardiomyocytproliferation har rapporterats2. För HLHS observeras förändrad trabekulär remodellering och vänsterkammartillplattning, vilket ytterligare bidrar till myokardhypoplasi på grund av onormal kardiomyocytmigration 2,8,9,10
Bland de allmänt använda modellorganismerna för att studera hjärtats utveckling och förstå hemodynamiska förhållanden 11 är fågelembryot att föredra på grund av dess mogna hjärta med fyra kammare och dess lätthet att odla11,12,13,14. Å andra sidan ger avancerad avbildningsåtkomst av zebrafiskembryon och transgena/knockout-möss tydliga fördelar11,12. Olika mekaniska ingrepp har testats för fågelembryot som förändrar det intramurala trycket och väggskjuvspänningen vid utveckling av kardiovaskulära komponenter. Dessa modeller inkluderar vänster vitellinligering, conotruncal banding15 och vänster förmaksligering (LAL)11,12,16. Den resulterande fenotypen på grund av den förändrade mekaniska belastningen kan observeras cirka 24-48 timmar efter det kirurgiska ingreppet i studier med fokus på tidig prognos11,13. LAL-interventionen är en populär teknik för att minska den funktionella volymen i vänster förmak (LA) genom att placera en suturslinga runt den atrioventrikulära öppningen. På samma sätt har mikrokirurgiska ingrepp också utförts som riktar sig mot höger förmaksligering (RAL)17,18. På samma sätt riktar vissa forskare in sig på det vänstra förmaksbihanget (LAA) med hjälp av mikroklipp för att minska volymen på LA19,20. I vissa studier appliceras en kirurgisk nylontråd på den atrioventrikulära knutan19,21. En av de interventioner som används är LAL, som kan efterlikna HLHS men som också är den svåraste modellen att utföra, med mycket små provutbyten på grund av de extremt fina mikrokirurgiska operationer som krävs. I vårt laboratorium utförs LAL i ovo mellan Hamburger-Hamilton (HH) steg 20 och 21, innan det gemensamma förmaket är helt septat 6,14,22,23. En kirurgisk sutur placeras runt LA, vilket förändrar blodflödet i hjärtat. I LAL-modeller av HLHS observeras ökad ventrikelväggsstyvhet, förändrade myofibervinklar och minskad LV-kavitetsstorlek14,24.
I den här videoartikeln finns ett detaljerat protokoll och tillvägagångssätt för in ovo LAL. I korthet inkuberades de befruktade fågelembryona för mikrokirurgi, äggskalet sprack upp och de yttre och inre membranen rensades. Embryot roterades sedan långsamt så att LA var tillgängligt. En 10-0 nylon kirurgisk sutur knöts till förmaksknoppen, och embryot återställdes till sin ursprungliga orientering, vilket fullbordade LAL-proceduren25. LAL och normala ventriklar jämförs för vävnadspackning och kammarvolym via optisk koherenstomografi och grundläggande histologi.
En framgångsrikt genomförd LAL-modellpipeline, som beskrivs här, kommer att bidra till grundläggande studier med fokus på embryonal utveckling av kardiovaskulära komponenter. Denna modell kan också användas tillsammans med genetiska manipulationer och avancerade avbildningsmodaliteter. På samma sätt är den akuta LAL-modellen en stabil källa till sjuka kärlceller för vävnadsodlingsexperiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Fertila vita Leghorn-ägg erhålls från pålitliga leverantörer och inkuberas enligt universitetsgodkända riktlinjer. Kycklingembryon, stadierna 18 (dag 3) till 24 (dag 4) (de stadier som presenteras i detta dokument) betraktas inte som levande ryggradsdjur enligt EU-direktivet 2010/63/EU och riktlinjerna från Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) i USA. Kycklingembryon betraktas som "levande djur" efter dag 19 av inkubationen enligt amerikansk lagstiftning, men inte för EU. Varje ägg är märkt med kläckningens startdatum och är planerad att kläckas senast den 10:e ruvningsdagen. När äggen kläcks tas kycklingarna ut ur inkubatorn. Protokollet utförs i två stationära driftstationer (Station 1 och Station 2), med fokus på specialiserade modellgenereringssteg.
1. Förberedelse inför mikrokirurgi
- Skaffa befruktade ägg antingen från ett vaccinutvecklingscenter med en specifik patogenfri (SPF) kvalitet eller genom en betrodd kommersiell leverantörsgård av en ömtålig leveranskurir i torra polystyrenbehållare. Rengör äggskalet försiktigt med luddfria våtservetter indränkta i 70 % etanol för att avlägsna föroreningar.
- Inklusions-/exklusionskriterier för embryon
- Ruva inte ägg som spruckit eller skadats under transporten.
- Om blödning noteras under LAL-ingreppet eller efter återinkubation, använd inte embryot.
- Använd inte embryon som utvecklas med vänster sida uppåt, eftersom det hemodynamiska blodflödet kan skilja sig från den normala orienteringen.
- Dıscard-embryon som utvecklas med medfödda defekter vid både pre- och postoperativa ingrepp.
- Inkludera embryon som når det avsedda stadiet och utvecklas på sin ursprungliga plats, vilket efterliknar HLHS som en LAL-modell.
- Ruva de befruktade äggen från vithornskycklingen (Gallus gallus domesticus L.), med den trubbiga änden uppåt, till önskat stadium, vanligtvis vid HH20-2115 (37,5 °C, 60 % luftfuktighet, 3,5 dagar) (figur 1).
OBS: Det är viktigt att hålla äggen vid en konstant temperatur och luftfuktighet för att öka avkastningen. Beroende på inkubatormodell kommer tillsatsen av en kastrull fylld med destillerat vatten att bibehålla en stabil luftfuktighet. Ritningar av ett extra temperatur- och luftfuktighetskontrollsystem som skulle passa de flesta inkubatorer har utvecklats av författarna och rekommenderas. Elektroniken, hårdvaran och koddetaljerna för denna egenbyggda sensor/styrenhet finns i ett datalager26. Kontinuerlig försiktig skakning (rotation) av äggen under ruvningen kan möjliggöra optimal placering av embryot och därmed leda till en högre andel "opererbara" embryon. Skakning kan också fungera med inkubatorer med denna kapacitet och öka produktiviteten ytterligare. - Innan du påbörjar proceduren, förbered önskat antal knutar genom att knyta en lös överhandsknut till en 1,5 cm lång 10-0 sutur. Se till att knuten inte är spänd och att den är tillräckligt stor för att lätt passa över förmaken under operationen (Figur 2).
OBS: Knyt knutarna i förväg och förvara dem i en steril kycklingringlösning innan du använder dem. Knutknytningen kräver att du använder två händer för att manövrera pincetten synkront. Eftersom detta är ett kritiskt steg i protokollet kan en modell av förmaket göras av kitt för att öva på detta steg (figur 3). Detta kommer att förbättra de tredimensionella mikrokirurgiska färdigheter som behövs för att utföra steg 3.2.3 vid station 2 (figur 4).
2. Verksamhet vid station 1 (figur 4A)
- Öppna ett fönster från den trubbiga änden av ägget och ta bort både de yttre och inre hinnorna15 (Figur 5A-D).
- Öppna äggskalet genom att knäcka försiktigt med den motsatta änden av pincetten, med de fria fingrarna stadigt stödjande ägget för att minska oönskad sprickspridning.
- Eftersom LAL är en lång procedur bör du bevara embryots temperatur och luftfuktighet, eftersom hjärtfrekvensen beror på temperaturen. Se därför till att det första gränssnittsfönstret skapas så litet som möjligt, precis tillräckligt för att utföra åtgärderna.
OBS: Inga fukt- eller temperaturkontrollsystem används under driften, men dessa system, om de finns tillgängliga, skulle gynna avkastningen. Om möjligt stängs luftkonditioneringssystemet i labbet av och proceduren utförs vid högsta möjliga rumstemperatur (RT). Optimering av embryonal hjärtfrekvens, som kan styras av temperaturen, under operationen rekommenderas också. Vissa laboratorier håller hjärtfrekvensen på något lägre nivåer än 120 slag per minut via temperaturkontroll under LAL-operationen. Som sådan skulle fuktkontroll som används runt den kirurgiska zonen öka avkastningen ytterligare. Äggskalsfönstren är skapade så små som möjligt, precis tillräckligt stora för att möjliggöra kirurgisk åtkomst. Detta gäller även för det tjocka yttre membranet, som vanligtvis är mindre än äggskalet endast i den utsträckning som embryot omkretsar. Dessa säkerställer att embryots temperatur och fuktighet bibehålls. När du öppnar ett fönster från den trubbiga änden av ägget rengörs de små skalfragmenten så att dessa bitar inte skadar vitellinkärlens integritet eller leder till oönskade artefakter. Dessutom använder andra laboratorier böjda mikrotandade saxar för att göra fönster. Dessutom kan två bredder tejp användas för att stabilisera äggskalet för att kontrollera sprickbildning. - Ta endast bort det nödvändiga vitellinmembranet med en mikrosax (kompletterande video 1).
- Normal embryonal utveckling är rättvänd. När embryot är fritt från vitellinmembranet, placera pincetten med stängda spetsar under embryots dorsala segment och vänd försiktigt embryot för att exponera vänster sida (dvs. vänster sida uppåt) (Figur 6A,B; Kompletterande video 2).
- Se till att den vänstra förmaksknoppen nu är exponerad men fortfarande täckt av ett komplext membransystem, som vanligtvis består av ett dubbelt lager av hjärtsäcken.
- Ta bort membranen, inklusive de fina, omedelbart runt förmaksknoppen. Detta är ett annat kritiskt skede; Utför membranborttagning från grova membran och gå vidare till de fina membranen runt den vänstra förmaksknoppen. Reservera den finaste pincetten för att ta bort det fina membranet (kompletterande video 3).
- Under membranborttagningsprocessen, orientera embryot i en position med vänster sida uppåt, så att knutplaceringsoperationen i steg 3.2 kan utföras utan ytterligare ompositionering. För att uppnå detta, lyft embryot med hjälp av membranen i steg 2.6 och häng det från äggskalet, se till att vänster sida är vänd uppåt.
OBS: Vissa embryon kan vara belägna nära äggskalets periferi och kan vara utmanande att operera. Ändå kommer dessa embryon med största sannolikhet att vara orienterade med rätt sida upp och uppvisa normalt beteende, och kan inkluderas i studien. I dessa fall, om det behövs, kan det dolda förmaket göras mer tillgängligt genom att försiktigt rengöra hjärtsäcksmembranet med #4 fin pincett och ta bort äggskalet i motsatt riktning (mot skalöppningen). Dessa embryon kan också lyftas med hjälp av delar av de extraembryonala membranen och fixeras i önskad position genom att fästa ena änden av membranet (pincettänden) på äggskalet med hjälp av dess naturliga klibbighet. Dessutom kan utrymmet mellan embryots huvud och ryggmärgsregion utvidgas med hjälp av en pincett för att avslöja det dolda förmaket.
3. Verksamhet vid station 2 (figur 4B)
- Under stereomikroskopet placeras den förberedda knuten från steg 1.4 nära embryot på en åtkomlig plats (figur 6B). Förmaksknoppen är nu redo att knytas av (kompletterande video 4).
- Ta upp den förberedda öppna knuten och orientera den över den vänstra förmaksknoppen. För att LAL ska fungera, placera ägget i en unikt lutande tredimensionell orientering.
- Rikta knuten korrekt för att utföra åtdragningsprocessen utan att skada embryona.
- Rensa de fina membranen optimalt i steg 2.7 för att minska effekten av ett bultande hjärta.
- Dra åt suturen (Figur 6C). För detta steg är det mycket användbart att öva med kittet. För skenembryon, dra åt knuten precis tillräckligt för att hålla knuten.
- Använd sedan mikrosaxen för att klippa de överflödiga ändarna av suturen så nära knoppen som möjligt (kompletterande video 5).
- Var mycket försiktig så att de nyskurna ändarna av den bundna suturen inte är i stånd att punktera närliggande kärl under rotation eller på grund av hjärtslagen.
- Använd pincetten för att ta bort de överflödiga suturbitarna som klipptes bort i steg 3.3.
- Slutligen, använd en stängd pincett, för tillbaka embryot till sin ursprungliga position, som i steg 2.5 (kompletterande video 6).
- Efter avslutad LAL-processen, täck ägget med ett dubbelt lager parafilm och ruva det igen. En tät och steril förslutning av äggen är avgörande för överlevnad, särskilt efter 24 timmars ruvning. Om visuell åtkomst också önskas, använd paraffinvax med glasglas.
OBS: När den tidiga embryonala perioden studeras ruvas äggen vanligtvis i 24-48 timmar tills de når ungefär HH25 eller HH27. Det finns dock ingen gräns, och senare stadier kan studeras, som andra forskare har försökt. För snabba drifthastigheter rekommenderas minst ett team på två personer. En person bör utbildas för och ansvarar för äggöppning, initial membranrengöring, rotation och membranrengöring runt den vänstra förmaksknoppen. Den andra personen är endast ansvarig för inledande knutförberedelse, knutplacering och åtdragning. Den slutliga embryorotationen kan utföras av person 1. Den kirurgiska operationen av ett enda embryo tar cirka 4-5 minuter. - Före/efter kirurgiska ingrepp, rengör bänkytorna och instrumenten med etanol. Se till att applicera färsk kycklingringlösning (NaCl, KCl, CaCl2 och NaHCO3)16,27 på metallinstrumenten som vidrör de embryonala vävnaderna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Avancerade tidsupplösta avbildningstekniker kan användas för att observera de strukturella och morfologiska förändringarna på grund av LAL-intervention10. Dessutom är LAL-prover också mottagliga för molekylära och biologiska metoder19,28. I tabell 1 redovisas stickprovsstudier som använde LAL-modellresultat. I detta sammanhang utfördes LAL-intervention i kycklingembryon som nådde HH20-21. Både kontroll- (friska) och LAL-hjärtan avlägsnades från embryot vid HH25-26. Därefter fixerades proverna i 4 % paraformaldehyd (PFA) vid 4 °C 6,15. De borttagna hjärtproverna dehydrerades sedan i etanollösningar med ökande koncentrationer (70 %, 96 % och 100 %) i 1 timme vardera. Slutligen förvarades proverna i xylen vid RT i 0,5 timmar, och paraffininbäddning utfördes före snittning med en tjocklek på 10 μm. Proverna som överfördes till glasglaset färgades med Elastica van Gieson-bets. Snitten undersöktes i stereomikroskop, där kammarens tvärgående diameter mättes. Vi utförde också en tredimensionell icke-invasiv metod, optisk koherenstomografiskanning (OCT), i några prover11,29. Både kontroll- och LAL-hjärtan vid HH25-26 togs bort, och deras korslumendiametrar mättes under OCT.
Resultaten visade att för LAL uppnås en mer kompakt myokardstruktur med signifikanta morfologiska förändringar jämfört med normal utveckling (Figur 7). Dessutom observeras avsättningen av extracellulära matriskomponenter, såsom kollagen, runt hjärtinterstitium, som liknar myokardfibros som liknar HLHS30. För att bättre förstå myokardförtjockning och trabekulär packning utfördes morfometriska porositetsmätningar i både kontroll- och LAL-prover. Som förväntat resulterade LAL-interventionen i en mindre vänsterkammarhåla och trabekulär komprimering genom att dra åt de intertrabekulära urtagen. Dessa fynd bekräftar hypotesen att LAL förändrar den friska ventrikulära arkitekturen och omorienterar den trabekulära aspekten22. På samma sätt resulterade LAL-modellen vid HH29 i en förstorad högerkammarhåla, förändrad trabekulär arkitektur och myokardvolym24.
För att stödja de resultat som erhölls i denna studie användes OCT-avbildning för att mäta ventrikulära lumentvärarean och axiell längd (Figur 8). LAL visade en signifikant minskning av vänster kammares storlek och diameter jämfört med kontrollgruppen. Även om endast ventriklarna är fokuserade här, rapporteras också LAL:s inflytande på aortabågens utveckling31. En nyligen genomförd studie som vi bidrog till rapporterade i 3D att mittväggsmyokardstammarna ökade i båda kamrarna efter LAL vid HH2532. Dessutom uppvisade LAL-grupperna en ökning av väggtjockleken jämfört med kontrollgrupperna vid HH25. Denna studie överensstämmer med den tidigare studien av Tobita et al.25, som visade en signifikant ökning av maximala systoliska epikardiella perifera stammar i LAL LV vid HH27.
Figur 1: Inkubationssystem för embryonal tillväxt. Befruktade vita Leghorn-hönsägg (Gallus gallus) inkuberades i en inkubator vid konstant luftfuktighet (60 %) och temperatur (37,5 °C). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Förberedelse av LAL-knuten. Flera knutar ~0,5-1 mm i diameter och 1-2 cm långa bitar förbereddes med hjälp av 10-0 nylonkirurgiska suturer. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Kopia av det embryonala vänstra förmaket tillverkat av kitt. En kopia av den vänstra förmaksdelen skapas för att träna och öva på knutorientering och knutstängningssteg med hjälp av två pincetter. Detta gjorde det möjligt för oss att göra många försök och fullända dessa steg innan vi implementerade denna färdighet i själva embryot. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Förberedelse av stationen . (A,B) Allt material och alla lösningar för mikrokirurgi placerades i det rena området för station 1 och station 2. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Öppna ett fönster från den trubbiga änden av ägget och ta bort både de yttre och inre membranen. (A,B) Ett litet fönster öppnades med hjälp av mikrokirurgiska instrument på äggskalet och inkluderade hela embryot i HH20-21. (C) Fragment av äggskalet avlägsnades i det första sprickningssteget. (D,E) Extraembryonala membran dissekerades också under mikroskopet. (F) Efter att LAL-processen var avslutad täcktes ägget med ett dubbelt lager parafilm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: En ögonblicksbild av LAL-kirurgi (vänster förmaksligering) in ovo. A) Ryggvy av kycklingembryot i dess normala orientering. Den embryonala ventrikeln som når HH20-21 har ett primitivt gemensamt förmak (a), ventrikel (v) och utflödeskanalen (ot). (B) En närbild av det vända embryot med vänster sida upp och knutens placering visas. (C) LA med suturknuten. Förkortningar: LA = vänster förmak; AA = aortabågen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Avlägsnande och undersökning av kontroll- och LAL-hjärtan. Både (A) kontroll- och (B) LAL-hjärtan som nådde HH25-26-stadiet togs bort från embryot och undersöktes i stereomikroskop. Stapeldiagrammet visar skillnaderna i tvärgående hjärtdiameter mellan LAL-gruppen och kontrollgruppen, och den genomsnittliga ± standardavvikelsen (SD) för minst fyra replikat. Skalstapel = 100 μM. Histologisk undersökning av hjärtvävnad i (C) kontroll- och (D) LAL-prover med Elastica van Gieson-färgningsteknik. Stapeldiagrammet visar skillnaderna i porositet (%) för att visa myokardkompression mellan LAL och kontrollgruppen, och medelvärdet ± SD för minst två replikat. **p < 0,01. GraphPad Prism version 9.5.1 användes för statistisk analys. Skalstapel = 50 μM. Förkortningar: LAL = vänster förmaksligering; LA = vänster förmak; RA = höger förmak; RV = höger kammare; LV = vänster kammare. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 8: Optisk koherenstomografi. Både (A) kontroll- och (B) LAL-hjärtan som nådde HH25-26 undersöktes med OCT. (C,D) Storleken och längden på ventriklarnas lumenkors anges i panelerna (C) respektive (D). Histogrammen representerar medelvärdet ± SD med minst tre upprepningar. *p < 0,05; **p < 0,01; GraphPad Prism version 9.5.1 användes för statistisk analys. Skalstapel = 100 μM. Förkortningar: LAL = vänster förmaksligering; RV = höger kammare; LV = vänster kammare. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tabell 1: En genomgång av forskningsstudier som använder modellen för vänster förmaksligering (LAL) i fågelembryon 6,10,12,14,22,24,27,30,32,33.
I nästan alla tidningar är LA delad på HH21. Effekten av LAL undersöks i senare HH-stadier (bedömningsstadiet). Förkortningar: AVC = atrioventrikulär kudde; LAV = vänster atrioventrikulär kanal; RAV = höger atrioventrikulär kanal; RA = höger förmak; LA = vänster förmak; RV = höger kammare; LV = vänster kammare; SEN = subendokardiet; IVS = interventrikulär septum; mikro-CT = mikrodatortomografi. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 2: Typisk effektivitet för modellen för vänster förmaksligering (LAL) skapad vid HH21 och inkuberad fram till HH25. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Kompletterande video 1: Både de yttre och inre membranen på fågelembryot avlägsnas. Därefter avlägsnas endast vitellinmembranet, vilket visas med en mikrosax. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande video 2: Pincetten placeras under det dorsala segmentet av det högra embryot och vänds försiktigt för att exponera dess vänstra förmaksknopp. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande video 3: Membranen runt den vänstra förmaksknoppen rensas gradvis. Förmaket expanderar något, vilket gör det möjligt att knyta knutar. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande video 4: En cirka 0,1-0,3 mm lång sutur placeras nära embryot och dras åt runt det med hjälp av två pincetter. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande video 5: De överflödiga suturändarna på knuten klipps försiktigt med en mikrosax. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande video 6: Embryot återställs försiktigt till sin normala orientering. LAL är klar. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vid HLHS förändras blodflödet på grund av strukturella defekter, vilket leder till onormal morfologi på vänster sida 4,6. Den nuvarande modellen ger ett praktiskt experimentellt system för att bättre förstå utvecklingen av HLHS och kan till och med efterlikna dess patogenes8. Att etablera en fullt kliniskt likvärdig HLHS-djurmodell är dock en utmanande uppgift. Förutom den aviära LAL-modellen som presenteras här har nya studier på möss, fårfoster och grodor försökt replikera de morfologiska, hemodynamiska och patofysiologiska egenskaperna hos HLHS-prognosen. I musembryon förändras den mekaniska belastningen via ett emboliseringsmedel som injiceras i LA genom ett fosteringrepp på embryonal dag (ED) 14,5 (ungefär HH40-41 hos kycklingembryon)34. Totalt 48 % av de foster som emboliserades överlevde till graviditet med små LV och retrograd aortaflöde. Den långa dräktighetsperioden, ytterligare utmaningar i ingrepp vid tidiga tidpunkter och utmanande fosterkirurgi kan begränsa genomförbarheten av denna modell. LV hypoplasi efterliknades också i lammfostermodellerna genom att fylla LA med silikongummi genom en ballongkateter35. I denna stordjursmodell är LV-volymen tillräckligt reducerad, men överlevnadstiden är inte lång, vilket resulterar i låg sjukdomspenetration. En alternativ interventionsmetod är att ockludera foramen ovale via perkutan transhepatisk kateterisering, som man försökte med foster36, även om det är mycket utmanande att rikta den ocklusiva stenten mot foramen ovale. Fårmodeller i allmänhet är mycket utmanande på grund av deras redan existerande vaskulära morfologier och negativa lungfysiologi. Behovet av säsongsbetonad avel, en senare gestationsålder och liten urvalsstorlek begränsar därför denna modell ytterligare. Slutligen introduceras Xenopus-embryot också som en annan lämplig modell för att efterlikna mänsklig hjärtsjukdom37, trots dess trekammarhjärta med en enda kammare och skillnader i neuralkamscellmönstren. Tillgången till mikroinjektioner och mikrokirurgiska ingrepp och den långa överlevnadstiden gör också denna modell attraktiv.
I tidigare studier har sjukdomspenetrationen hos sex av 39 opererade fågelembryon presenterats som 15 % i LAL-modell34. Den genomsnittliga HLHS-penetrationen av kycklingembryomodellen som vi undersökte i ett tidigt skede (som nådde HH25 och HH27) var dock 66 % (12 av 18 opererade fågelembryon). Prof. Sedmera rapporterade att den genomsnittliga överlevnadstiden för embryon kan vara HH40 (ED14)19. Andra grupper som regelbundet utför denna ligering har rapporterat höga framgångsfrekvenser vid tidiga tidpunkter (t.ex. 75 % fram till HH29, 50 % till HH34 och 20 % till HH38)30. Men i senare stadier framträder en distinkt fenotyp och dödligheten ökar. Även om sjukdomspenetrationen kan vara relativt låg i kycklingembryon, är målet med denna modell att bättre undersöka etiologin och patologin för prenatal HLHS, särskilt i de tidiga stadierna.
På grund av den mycket lilla storleken på kycklingembryot i ett tidigt stadium kan pre- och postoperativ LAL-intervention leda till flera komplikationer. Som ett botemedel för att förhindra kontaminering rengörs äggskal och bänkar med 70 % etanol, och handskar kan användas under hela proceduren. Ett kritiskt steg i LAL-protokollet är avlägsnandet av hela hjärtsäcksmembranet för att möjliggöra en bra passform av knuten runt den vänstra förmaksknoppen. Dessutom har vi funnit att tvåmannateamet är extremt användbart, särskilt när det gäller utbildning och specialisering på en specifik kompetens som behövs under protokollstegen. Detta tillvägagångssätt påskyndar proceduren och dess inlärningskurva. Risken för blödning och kontaminering är sekundär och uppväger fördelarna med det föreslagna kompissystemet. Användning av en förberedd sutur som förvaras i en steril chick ringer-lösning rekommenderas. Dessutom är det viktigt att bibehålla en låg åtdragningsstyrka hos suturen för högre embryoutbyte. Tätare knutar på förmaksknoppen som appliceras i HH21 kan leda till för tidig svikt av LV som inte kan utveckla det kliniskt kritiska engagemanget av lednings-, koronar- och sekundära myoarkitekturremodelleringsdefekter, som har beskrivits väl i tidigare studier22. Att använda den finaste och oanvända pincetten och saxen i vissa steg och relativt trubbiga i andra kan minska oavsiktlig blödning. Slutligen, omedelbart efter att knuten är klar, ska embryot snabbt vändas till sin ursprungliga position, och äggskalsfönstret ska stängas med ett dubbelt lager parafilm för att bevara dess temperatur och fuktighet. Det typiska utbytet för LAL-modellen som når HH25 presenteras i tabell 2. Förutom den minskade ventrikulära storleken kan även klaffmissbildningar utvecklas, såsom mitralis/aortaatresi. Svårighetsgraden av dessa lesioner ökar morbiditeten i de senare stadierna, som vid HLHS. På grund av de utmaningar som diskuteras här, jämfört med andra mekaniska ingrepp som utförs i kycklingembryon, såsom conotruncal banding, resulterar LAL-modellen i mycket lägre avkastningsnivåer. Vi tror, genom de försiktighetsåtgärder som presenteras här, att en avkastning på 50 % är möjlig.
Fågelembryot är en idealisk modell av ryggradsdjur för forskning om kardiovaskulär utveckling på grund av dess morfologiska struktur, storlek, låga kostnad, enkla odling och manipulation38,39. Denna modell ger också ett naturligt skydd mot patogener40. Instrumenterade embryon kan användas vid avancerad in vivo-avbildning och lokal siRNA-manipulation. Som sådan är bevarade genregioner hos människa och kyckling tillgängliga genom Sanger-shotgun-sekvensering och fysikaliskt baserad kartläggning39, vilket leder till avancerade mekanosensitivitetsstudier19. Dessutom har mikroarraymetoden som tillämpas av Krejčí et al. använts för att mäta framgången när det gäller den potentiella reversibiliteten av hemodynamiska förändringar i myokardstrukturen. Således kan identifieringen av gener som uttrycks på olika sätt mellan vänster och höger kammare användas som ett kriterium för den ideala interventionsperioden när irreversibla förändringar börjar33.
Sammanfattningsvis inkluderar potentiella framtida riktningar för mikrokirurgiska tillämpningar i kycklingembryomodellen användningen av kardiovaskulära genredigeringstekniker med fokus på specifika matrixgener och molekylära signalvägar, vilket stöder framsteg inom vävnadscellodling och avbildningsteknik32.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi uppmärksammar Tubitak 2247A lead researcher award 120C139 som tillhandahåller finansiering. Författarna vill också tacka PakTavuk Gıda. A. S., Istanbul, Turkiet, för tillhandahållande av fertila ägg och stöd till kardiovaskulär forskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10-0 nylon surgical suture | Ethicon | ||
| Elastica van Gieson staining kit | Sigma-Aldrich | 115974 | For staining connective tissues in histological sections |
| Ethanol absolute | Interlab | 64-17-5 | For the sterilization step, 70% ethanol was obtained by diluting absolute ethanol with distilled water. |
| Incubator | KUHL, Flemington, New Jersey-U.S.A | AZYSS600-110 | |
| Kimwipes | Interlab | 080.65.002 | |
| Microscissors | World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL | 555640S | Vannas STR 82 mm |
| Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | Sealing stage for egg reincubation |
| Paraplast Bulk | Leica Biosystems | 39602012 | Tissue embedding medium |
| Stereo Microscope | Zeiss Stemi 508 | Stemi 508 | Used at station 1 |
| Stereo Microscope | Zeiss Stemi 2000-C | Stemi 2000-C | Used at station 2 |
| Tweezer (Dumont 4 INOX #F4) | Adumont & Fils, Switzerland | Used to return the embryo | |
| Tweezer (Super Fine Dumont #5SF) | World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL | 501985 | Used to remove the membranes on the embryo |
References
- Wang, T., et al. Congenital heart disease and risk of cardiovascular disease: A meta-analysis of cohort studies. Journal of the American Heart Association. 8 (10), e012030 (2019).
- Chaudhry, B., et al. The left ventricular myocardium in hypoplastic left heart syndrome. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (8), 279 (2022).
- Lashkarinia, S. S., Çoban, G., Ermek, E., Çelik, M., Pekkan, K. Spatiotemporal remodeling of embryonic aortic arch: stress distribution, microstructure, and vascular growth in silico. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 19 (5), 1897-1915 (2020).
- Ho, S., Chan, W. X., Yap, C. H. Fluid mechanics of the left atrial ligation chick embryonic model of hypoplastic left heart syndrome. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 20 (4), 1337-1351 (2021).
- Gordon, B. M., Rodriguez, S., Lee, M., Chang, R. K. Decreasing number of deaths of infants with hypoplastic left heart syndrome. The Journal of Pediatrics. 153 (3), 354-358 (2008).
- Salman, H. E., et al. Effect of left atrial ligation-driven altered inflow hemodynamics on embryonic heart development: clues for prenatal progression of hypoplastic left heart syndrome. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 20 (2), 733-750 (2021).
- Fruitman, D. S. Hypoplastic left heart syndrome: Prognosis and management options. Paediatrics & Child Health. 5 (4), 219-225 (2000).
- Rahman, A., Chaturvedi, R. R., Sled, J. G. Flow-mediated factors in the pathogenesis of hypoplastic left heart syndrome. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (5), 154 (2022).
- Henderson, D. J., Anderson, R. H. The development and structure of the ventricles in the human heart. Pediatric Cardiology. 30 (5), 588-596 (2009).
- Kowalski, W. J., Pekkan, K., Tinney, J. P., Keller, B. B. Investigating developmental cardiovascular biomechanics and the origins of congenital heart defects. Frontiers in Physiology. 5, 408 (2014).
- Midgett, M., Rugonyi, S. Congenital heart malformations induced by hemodynamic altering surgical interventions. Frontiers in Physiology. 5, 287 (2014).
- Kowalski, W. J., et al. Left atrial ligation alters intracardiac flow patterns and the biomechanical landscape in the chick embryo. Developmental Dynamics. 243 (5), 652-662 (2014).
- Bruneau, B. G. The developmental genetics of congenital heart disease. Nature. 451 (7181), 943-948 (2008).
- Sedmera, D., et al. Cellular changes in experimental left heart hypoplasia. The Anatomical Record. 267 (2), 137-145 (2002).
- Celik, M., et al. Microstructure of early embryonic aortic arch and its reversibility following mechanically altered hemodynamic load release. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 318 (5), H1208-H1218 (2020).
- Tobita, K., Schroder, E. A., Tinney, J. P., Garrison, J. B., Keller, B. B. Regional passive ventricular stress-strain relations during development of altered loads in chick embryo. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 282 (6), H2386-H2396 (2002).
- Alser, M., Shurbaji, S., Yalcin, H. C. Mechanosensitive pathways in heart development: findings from chick embryo studies. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 8 (4), 32 (2021).
- Alser, M., et al. Blood flow disturbance and morphological alterations following the right atrial ligation in the chick embryo. Frontiers in Physiology. 13, 849603 (2022).
- Sedmera, D.
- Rychter, Z., Rychterová, V., Lemez, L. Formation of the heart loop and proliferation structure of its wall as a base for ventricular septation. Herz. 4 (2), 86-90 (1979).
- Harh, J. Y., Paul, M. H., Gallen, W. J., Friedberg, D. Z., Kaplan, S. Experimental production of hypoplastic left heart syndrome in the chick embryo. The Americal Journal of Cardiology. 31 (1), 51-56 (1973).
- Sedmera, D., Pexieder, T., Rychterova, V., Hu, N., Clark, E. B. Remodeling of chick embryonic ventricular myoarchitecture under experimentally changed loading conditions. The Anatomical Record. 254 (2), 238-252 (1999).
- Karakaya, C., et al. Asymmetry in mechanosensitive gene expression during aortic arch morphogenesis. Scientific Reports. 8 (1), 16948 (2018).
- Trinidad, F., et al. Effect of blood flow on cardiac morphogenesis and formation of congenital heart defects. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (9), 303 (2022).
- Tobita, K., Keller, B. B. Right and left ventricular wall deformation patterns in normal and left heart hypoplasia chick embryos. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 279 (3), H959-H969 (2000).
- Bortecine, S., Merve Nur, C., Faruk, K., Kerem, P. Auxiliary humidifier system design and construction for research grade egg incubators. Zenodo. , (2023).
- Schroder, E. A., Tobita, K., Tinney, J. P., Foldes, J. K., Keller, B. B. Microtubule involvement in the adaptation to altered mechanical load in developing chick myocardium. Circulation Research. 91 (4), 353-359 (2002).
- Rufaihah, A. J., Chen, C. K., Yap, C. H., Mattar, C. N. Z. Mending a broken heart: In vitro, in vivo and in silico models of congenital heart disease. Disease Models & Mechanisms. 14 (3), (2021).
- Siddiqui, H. B., Dogru, S., Lashkarinia, S. S., Pekkan, K. Soft-tissue material properties and mechanogenetics during cardiovascular development. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (2), 64 (2022).
- Pesevski, Z., et al. Endocardial fibroelastosis is secondary to hemodynamic alterations in the chick embryonic model of hypoplastic left heart syndrome. Developmental Dynamics. 247 (3), 509-520 (2018).
- Hu, N., et al. Dependence of aortic arch morphogenesis on intracardiac blood flow in the left atrial ligated chick embryo. Anatomical Record. 292 (5), 652-660 (2009).
- Lashkarinia, S. S., et al. Myocardial biomechanics and the consequent differentially expressed genes of the left atrial ligation chick embryonic model of hypoplastic left heart syndrome. Annals of Biomedical Engineering. 51 (5), 1063-1078 (2023).
- Krejčí, E., et al. Microarray analysis of normal and abnormal chick ventricular myocardial development. Physiological Research. 61, S137-S144 (2012).
- Rahman, A., et al. A mouse model of hypoplastic left heart syndrome demonstrating left heart hypoplasia and retrograde aortic arch flow. Disease Models & Mechanisms. 14 (11), (2021).
- Fishman, N. H., Hof, R. B., Rudolph, A. M., Heymann, M. A. Models of congenital heart disease in fetal lambs. Circulation. 58 (2), 354-364 (1978).
- Wong, F. Y., et al. Induction of left ventricular hypoplasia by occluding the foramen ovale in the fetal lamb. Scientific Reports. 10 (1), 880 (2020).
- Nie, S. Use of frogs as a model to study the etiology of HLHS. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 10 (2), 51 (2023).
- Vilches-Moure, J. G. Embryonic chicken (Gallus gallus domesticus) as a model of cardiac biology and development. Comparative Medicine. 69 (3), 184-203 (2019).
- Kain, K. H., et al. The chick embryo as an expanding experimental model for cancer and cardiovascular research. Developmental Dynamics. 243 (2), 216-228 (2014).
- Sukparangsi, W., Thongphakdee, A., Intarapat, S. Avian embryonic culture: A perspective of in ovo to ex ovo and in vitro studies. Frontiers in Physiology. 13, 903491 (2022).
