Summary
Qui, presentiamo un protocollo visivo dettagliato per l'esecuzione del modello di legatura atriale sinistra (LAL) nell'embrione aviario. Il modello LAL altera il flusso intracardiaco, che modifica il carico di sollecitazione da taglio della parete, imitando la sindrome del cuore sinistro ipoplasico. Viene presentato un approccio per superare le sfide di questo difficile modello di microchirurgia.
Abstract
Grazie alla sua configurazione ventricolare matura a quattro camere, alla facilità di coltura, all'accesso all'imaging e all'efficienza, l'embrione aviario è un modello animale vertebrato preferito per lo studio dello sviluppo cardiovascolare. Gli studi che mirano a comprendere lo sviluppo normale e la prognosi dei difetti cardiaci congeniti adottano ampiamente questo modello. Vengono introdotte tecniche chirurgiche microscopiche per alterare i normali modelli di carico meccanico in uno specifico momento embrionale e tracciare la cascata molecolare e genetica a valle. Gli interventi meccanici più comuni sono la legatura della vena vitellina sinistra, il bendaggio conotruncale e la legatura atriale sinistra (LAL), che modula la pressione vascolare intramurale e lo stress da taglio della parete dovuto al flusso sanguigno. La LAL, in particolare se eseguita in ovo, è l'intervento più impegnativo, con rese di campione molto ridotte a causa delle operazioni microchirurgiche sequenziali estremamente fini. Nonostante il suo alto rischio, in ovo la LAL è molto preziosa dal punto di vista scientifico in quanto imita la patogenesi della sindrome del cuore sinistro ipoplasico (HLHS). L'HLHS è una cardiopatia congenita complessa clinicamente rilevante osservata nei neonati umani. Un protocollo dettagliato per l'in ovo LAL è documentato in questo documento. In breve, gli embrioni aviari fecondati sono stati incubati a 37,5 °C e al 60% di umidità costante fino a quando non hanno raggiunto gli stadi di Hamburger-Hamilton (HH) da 20 a 21. I gusci delle uova sono stati aperti e le membrane esterne e interne sono state rimosse. L'embrione è stato ruotato delicatamente per esporre il bulbo atriale sinistro dell'atrio comune. I micro-nodi pre-assemblati da suture di nylon 10-0 sono stati delicatamente posizionati e legati attorno alla gemma atriale sinistra. Infine, l'embrione è stato riportato nella sua posizione originale e LAL è stato completato. I ventricoli normali e quelli strumentati con LAL hanno dimostrato differenze statisticamente significative nella compattazione dei tessuti. Un'efficiente pipeline di generazione di modelli LAL contribuirebbe a studi incentrati sulla manipolazione meccanica e genetica sincronizzata durante lo sviluppo embrionale delle componenti cardiovascolari. Allo stesso modo, questo modello fornirà una fonte di cellule perturbate per la ricerca sulle colture tissutali e la biologia vascolare.
Introduction
I difetti cardiaci congeniti (CHD) sono disturbi strutturali che si verificano a causa di uno sviluppo embrionale anormale1. Oltre alle condizioni genetiche, la patogenesi è influenzata da un alterato carico meccanico 2,3. La sindrome del cuore sinistro ipoplasico (HLHS), una cardiopatia congenita, provoca un ventricolo/aorta sottosviluppato alla nascita4 con un alto tasso di mortalità 5,6. Nonostante i recenti progressi nella sua gestione clinica, la crescita vascolare e le dinamiche di sviluppo dell'HLHS non sono ancora chiare7. Nel normale sviluppo embrionale, l'endocardio e il miocardio del ventricolo sinistro (LV) originano dai progenitori cardiaci man mano che la formazione precoce del tubo cardiaco embrionale progredisce. Viene segnalata la presenza graduale di trabecolazione miocardica, ispessimento degli strati e proliferazione dei cardiomiociti2. Per l'HLHS, si osserva un alterato rimodellamento trabecolare e un appiattimento ventricolare sinistro, che contribuiscono ulteriormente all'ipoplasia miocardica dovuta a una migrazione anomala dei cardiomiociti 2,8,9,10
Tra gli organismi modello ampiamente utilizzati per studiare lo sviluppo del cuore e comprendere le condizioni emodinamiche 11, l'embrione aviario è preferito per il suo cuore maturo a quattro camere e la sua facilità di coltura11,12,13,14. D'altra parte, l'accesso avanzato all'imaging di embrioni di zebrafish e topi transgenici/knockout offre vantaggi distinti11,12. Per l'embrione aviario sono stati testati vari interventi meccanici che alterano la pressione intramurale e lo stress da taglio della parete nello sviluppo di componenti cardiovascolari. Questi modelli includono la legatura vitellina sinistra, il bendaggio connotruncale15 e la legatura atriale sinistra (LAL)11,12,16. Il fenotipo risultante dovuto all'alterato carico meccanico può essere osservato circa 24-48 ore dopo l'intervento chirurgico in studi incentrati sulla prognosi precoce11,13. L'intervento LAL è una tecnica popolare per restringere il volume funzionale dell'atrio sinistro (LA) posizionando un'ansa di sutura attorno all'apertura atrioventricolare. Allo stesso modo, sono stati eseguiti anche interventi microchirurgici che mirano alla legatura atriale destra (RAL)17,18. Allo stesso modo, alcuni ricercatori prendono di mira l'appendice atriale sinistra (LAA) utilizzando micro clip per ridurre il volume del LA19,20. In alcuni studi, un filo di nylon chirurgico viene applicato al nodo atrioventricolare 19,21. Uno degli interventi utilizzati è il LAL, che può imitare l'HLHS ma è anche il modello più difficile da eseguire, con rese di campione molto ridotte a causa delle operazioni microchirurgiche estremamente fini richieste. Nel nostro laboratorio, la LAL viene eseguita in ovo tra gli stadi 20 e 21 di Hamburger-Hamilton (HH), prima che l'atrio comune sia completamente settato 6,14,22,23. Una sutura chirurgica viene posizionata intorno al LA, che altera i flussi di flusso sanguigno intracardiaco. Nei modelli LAL di HLHS, si osserva un aumento della rigidità della parete ventricolare, angoli alterati della miofibra e una diminuzione delle dimensioni della cavità ventricolare sinistra14,24.
In questo video articolo, viene fornito un protocollo e un approccio dettagliati per in ovo LAL. In breve, gli embrioni aviari fecondati sono stati incubati per la microchirurgia, il guscio dell'uovo è stato aperto e le membrane esterne e interne sono state ripulite. L'embrione è stato poi ruotato lentamente in modo che il LA fosse accessibile. Una sutura chirurgica in nylon 10-0 è stata legata alla gemma atriale e l'embrione è stato riportato al suo orientamento originale, completando la procedura LAL25. I ventricoli LAL e normali vengono confrontati per la compattazione tissutale e il volume del ventricolo tramite tomografia a coerenza ottica e istologia di base.
Una pipeline di modelli LAL eseguita con successo, come descritto qui, contribuirà agli studi di base incentrati sullo sviluppo embrionale delle componenti cardiovascolari. Questo modello può essere utilizzato anche insieme a manipolazioni genetiche e modalità di imaging avanzate. Allo stesso modo, il modello LAL acuto è una fonte stabile di cellule vascolari malate per esperimenti di coltura tissutale.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Le uova di Livorno bianco fertile sono ottenute da fornitori di fiducia e incubate secondo linee guida approvate dall'università. Gli embrioni di pulcino, stadi da 18 (giorno 3) a 24 (giorno 4) (gli stadi presentati in questo articolo) non sono considerati animali vertebrati vivi dalla direttiva dell'Unione Europea (UE) 2010/63/UE e dalle linee guida del comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) negli Stati Uniti. Gli embrioni di pulcino sono considerati "animali vivi" dopo il 19° giorno di incubazione secondo le leggi statunitensi, ma non per l'UE. Ogni uovo è etichettato con la data di inizio della schiusa ed è programmato per schiudersi entro e non oltre il 10° giorno di incubazione. Dopo la schiusa delle uova, i pulcini vengono rimossi dall'incubatrice. Il protocollo viene eseguito in due stazioni operative da banco (Stazione 1 e Stazione 2), concentrandosi su fasi specializzate di generazione del modello.
1. Preparazione prima della microchirurgia
- Ottenere ovuli fecondati da un centro di sviluppo di vaccini con un grado specifico privo di agenti patogeni (SPF) o tramite un'azienda agricola di fornitori commerciali di fiducia da un fragile corriere di consegna in contenitori di polistirolo secco. Prima dell'incubazione, pulisci delicatamente il guscio d'uovo con salviette prive di lanugine imbevute di etanolo al 70% per rimuovere la contaminazione.
- Criteri di inclusione/esclusione degli embrioni
- Non incubare uova che si sono incrinate o danneggiate durante il trasporto.
- Se si nota sanguinamento durante la procedura LAL o dopo la reincubazione, non utilizzare l'embrione.
- Non utilizzare embrioni che si sviluppano nella posizione del lato sinistro rivolto verso l'alto, poiché il flusso sanguigno emodinamico può differire dall'orientamento normale.
- Embrioni di Dıscard che si sviluppano con difetti congeniti sia nelle procedure pre che post-chirurgiche.
- Includi gli embrioni che raggiungono lo stadio di sviluppo mirato nella loro posizione originale, imitando l'HLHS come modello LAL.
- Incubare le uova fecondate di gallina livornese (Gallus gallus domesticus L .), a punta smussata, fino allo stadio desiderato, tipicamente a HH20-2115 (37,5 °C, 60% di umidità, 3,5 giorni) (Figura 1).
NOTA: È importante mantenere le uova a temperatura e umidità costanti per aumentare la resa. A seconda del modello di incubatrice, l'aggiunta di una pentola piena di acqua distillata manterrà stabile l'umidità. Gli autori hanno sviluppato e raccomandato i progetti di un sistema di controllo della temperatura e dell'umidità aggiuntivo/ausiliario che si adatterebbe alla maggior parte delle incubatrici. L'elettronica, l'hardware e i dettagli del codice di questa unità di sensore/controllo costruita internamente sono forniti in un repository di dati26. L'agitazione continua e delicata (rotazione) delle uova durante l'incubazione può consentire un posizionamento ottimale dell'embrione e quindi portare a una maggiore percentuale di embrioni "utilizzabili". L'agitazione può funzionare anche con incubatrici con questa capacità e aumentare ulteriormente la produttività. - Prima di iniziare la procedura, preparare il numero di nodi richiesto legando un nodo sciolto a rovescio in una sutura 10-0 lunga 1,5 cm. Assicurarsi che il nodo non sia stretto e che sia abbastanza grande da adattarsi facilmente agli atri durante l'operazione (Figura 2).
NOTA: Annodare i nodi in anticipo e conservarli in una soluzione sterile per pulcini prima dell'uso. L'operazione di annodatura richiede l'uso di due mani per azionare le pinzette in modo sincrono. Poiché si tratta di una fase critica del protocollo, è possibile creare un modello dell'atrio con lo stucco per esercitarsi in questo passaggio (Figura 3). Ciò migliorerà le competenze di microchirurgia tridimensionale necessarie per eseguire il passaggio 3.2.3 nella Stazione 2 (Figura 4).
2. Operazioni alla stazione 1 (Figura 4A)
- Aprite una finestra dall'estremità smussata dell'uovo e rimuovete sia la membrana esterna che quella interna15 (Figura 5A-D).
- Aprire il guscio d'uovo rompendo delicatamente con l'estremità posteriore delle pinzette, con le dita libere che sostengono saldamente l'uovo per ridurre la propagazione indesiderata delle crepe.
- Poiché la LAL è una procedura lunga, conserva la temperatura e l'umidità dell'embrione, poiché la frequenza cardiaca dipende dalla temperatura. Pertanto, assicurarsi che la finestra della shell iniziale sia creata il più piccola possibile, quanto basta per eseguire le operazioni.
NOTA: Durante l'operazione non vengono utilizzati sistemi di controllo dell'umidità o della temperatura, ma questi sistemi, se disponibili, ne trarrebbero vantaggio dalla resa. Se possibile, il sistema di condizionamento dell'aria nel laboratorio viene spento e la procedura viene eseguita alla massima temperatura ambiente (RT) possibile. Si raccomanda inoltre l'ottimizzazione della frequenza cardiaca embrionale, che può essere controllata dalla temperatura, durante l'operazione. Alcuni laboratori mantengono la frequenza cardiaca a frequenze leggermente inferiori a 120 bpm tramite il controllo della temperatura durante il funzionamento LAL. Pertanto, il controllo dell'umidità impiegato intorno alla zona chirurgica aumenterebbe ulteriormente la resa. Le finestre a guscio d'uovo sono create il più piccole possibile, abbastanza grandi da consentire l'accesso chirurgico. Questo vale anche per la spessa membrana esterna, che è tipicamente più piccola del guscio dell'uovo solo nella misura della circonferenza dell'embrione. Questi assicurano il mantenimento della temperatura e dell'umidità dell'embrione. Durante l'apertura di una finestra dall'estremità smussata dell'uovo, i piccoli frammenti di guscio vengono puliti in modo che questi pezzi non danneggino l'integrità vascolare vitellina o portino ad artefatti indesiderati. Inoltre, altri laboratori utilizzano forbici micro-seghettate curve per realizzare finestre. Inoltre, è possibile utilizzare due larghezze di nastro adesivo per stabilizzare il guscio d'uovo per controllare le screpolature. - Rimuovere solo la membrana vitellina necessaria utilizzando delle microforbici (Video supplementare 1).
- Il normale sviluppo embrionale è rivolto verso l'alto. Una volta che l'embrione è libero dalla membrana vitellina, posizionare la pinzetta con le punte chiuse sotto il segmento dorsale dell'embrione e capovolgere delicatamente l'embrione per esporre il lato sinistro (cioè la configurazione con il lato sinistro rivolto verso l'alto) (Figura 6A,B; Video supplementare 2).
- Assicurarsi che la gemma atriale sinistra sia ora esposta ma ancora coperta da un complesso sistema di membrane, tipicamente costituito da un doppio strato del pericardio.
- Rimuovere le membrane, comprese quelle sottili, immediatamente intorno alla gemma atriale. Questa è un'altra fase critica; Eseguire la rimozione della membrana dalle membrane grossolane e passare a quelle fini intorno alla gemma atriale sinistra. Riservare le pinzette più fini per la rimozione della membrana sottile (Video supplementare 3).
- Durante il processo di rimozione della membrana, orientare l'embrione in posizione con il lato sinistro rivolto verso l'alto, in modo che l'operazione di posizionamento del nodo al punto 3.2 possa essere eseguita senza ulteriori riposizionamenti. Per ottenere ciò, sollevare l'embrione utilizzando le membrane nel passaggio 2.6 e appenderlo al guscio dell'uovo, assicurandosi che il lato sinistro sia rivolto verso l'alto.
NOTA: Alcuni embrioni possono essere localizzati vicino alla periferia del guscio d'uovo e possono essere difficili da operare. Tuttavia, questi embrioni saranno molto probabilmente orientati verso l'alto e mostreranno un comportamento normale, e potranno essere inclusi nello studio. In questi casi, se necessario, l'atrio oscurato può essere reso più accessibile pulendo delicatamente la membrana pericardica con una pinzetta fine #4 e rimuovendo il guscio d'uovo nella direzione inversa (verso l'apertura del guscio). Questi embrioni possono anche essere sollevati utilizzando parti delle membrane extraembrionali e fissati nella posizione desiderata attaccando un'estremità della membrana (l'estremità della pinzetta) al guscio dell'uovo, sfruttando la sua naturale viscosità. Inoltre, lo spazio tra la testa e la regione del midollo spinale dell'embrione può essere ampliato con l'aiuto di una pinzetta per rivelare l'atrio oscurato.
3. Operazioni alla stazione 2 (Figura 4B)
- Sotto lo stereomicroscopio, posizionare il nodo pre-preparato del punto 1.4 vicino all'embrione in una posizione accessibile (Figura 6B). La gemma atriale è ora pronta per essere legata (Video supplementare 4).
- Recuperate il nodo aperto pre-preparato e orientatelo sopra la gemma atriale sinistra. Affinché LAL funzioni, posiziona l'uovo con un orientamento tridimensionale inclinato in modo univoco.
- Orientare correttamente il nodo per eseguire il processo di serraggio senza danneggiare gli embrioni.
- Pulire le membrane sottili in modo ottimale nel passaggio 2.7 per ridurre l'effetto di un cuore che batte.
- Stringete la sutura (Figura 6C). Per questo passaggio, esercitarsi con lo stucco è molto utile. Per gli embrioni fittizi, stringi il nodo quel tanto che basta per tenere il nodo.
- Successivamente, utilizzare le microforbici per tagliare le estremità in eccesso della sutura il più vicino possibile al bocciolo (Video supplementare 5).
- Fare molta attenzione che le estremità appena tagliate della sutura legata non siano in grado di perforare i vasi vicini durante la rotazione o a causa del battito cardiaco.
- Usando le pinzette, rimuovere i pezzi di sutura in eccesso tagliati al punto 3.3.
- Infine, utilizzando una pinzetta chiusa, riportare l'embrione nella sua posizione originale, come nel passaggio 2.5 (Video supplementare 6).
- Dopo aver completato il processo LAL, coprire l'uovo con un doppio strato di parafilm e incubarlo nuovamente. Una chiusura ermetica e sterile delle uova è fondamentale per la sopravvivenza, soprattutto dopo le 24 ore di incubazione. Se si desidera anche l'accesso visivo, utilizzare la cera di paraffina con vetrini.
NOTA: Poiché si studia il primo periodo embrionale, le uova vengono in genere incubate per 24-48 ore fino a raggiungere circa HH25 o HH27. Tuttavia, non c'è limite e le fasi successive possono essere studiate, come tentato da altri ricercatori. Per velocità operative elevate, si consiglia una squadra di almeno due persone. Una persona dovrebbe essere addestrata ed è responsabile dell'apertura delle uova, della pulizia iniziale della membrana, della rotazione e della pulizia della membrana intorno alla gemma atriale sinistra. L'altra persona è responsabile solo della preparazione iniziale del nodo, del posizionamento del nodo e del serraggio. La rotazione finale dell'embrione può essere eseguita dalla Persona 1. L'intervento chirurgico per un singolo embrione dura circa 4-5 minuti. - Prima/dopo le operazioni chirurgiche, pulire le superfici da banco e gli strumenti con etanolo. Assicurarsi di applicare una soluzione fresca di inanellamento per pulcini (NaCl, KCl, CaCl2 e NaHCO3)16,27 sugli strumenti metallici a contatto con i tessuti embrionali.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tecniche avanzate di imaging risolte nel tempo possono essere impiegate per osservare i cambiamenti strutturali e morfologici dovuti all'intervento LAL10. Inoltre, i campioni di LAL sono anche suscettibili di metodi molecolari e biologici19,28. Nella Tabella 1 sono riportati gli studi di esempio che hanno utilizzato i risultati del modello LAL. In questo contesto, l'intervento di LAL è stato eseguito in embrioni di pulcino che hanno raggiunto HH20-21. Sia il cuore di controllo (sano) che quello LAL sono stati rimossi dall'embrione a HH25-26. Successivamente, i campioni sono stati fissati in paraformaldeide (PFA) al 4% a 4 °C 6,15. I campioni di cuore prelevati sono stati quindi disidratati in soluzioni di etanolo a concentrazioni crescenti (70%, 96% e 100%) per 1 ora ciascuno. Infine, i campioni sono stati mantenuti in xilene a RT per 0,5 ore e l'inclusione della paraffina è stata eseguita prima del sezionamento a uno spessore di 10 μm. I campioni trasferiti sul vetrino sono stati colorati con colorante Elastica van Gieson. Le sezioni sono state esaminate al microscopio stereoscopico, dove è stato misurato il diametro trasversale del ventricolo. Abbiamo anche eseguito un metodo tridimensionale non invasivo, la tomografia a coerenza ottica (OCT), in alcuni campioni11,29. Sia i cuori di controllo che quelli LAL a HH25-26 sono stati asportati e i loro diametri del lume incrociato sono stati misurati sotto OCT.
I risultati hanno mostrato che per la LAL, si ottiene una struttura miocardica più compatta con cambiamenti morfologici significativi rispetto allo sviluppo normale (Figura 7). Inoltre, la deposizione di componenti della matrice extracellulare, come il collagene, si osserva intorno all'interstizio cardiaco, simile alla fibrosi miocardica simile all'HLHS30. Per comprendere meglio l'ispessimento miocardico e la compattazione trabecolare, sono state eseguite misurazioni morfometriche della porosità sia nei campioni di controllo che in quelli LAL. Come previsto, l'intervento LAL ha portato a una riduzione della cavità ventricolare sinistra e alla compattazione trabecolare stringendo i recessi intertrabecolari. Questi risultati confermano l'ipotesi che la LAL alteri l'architettura ventricolare sana e riorienti l'aspetto trabecolare22. Allo stesso modo, il modello LAL a HH29 ha provocato un allargamento della cavità ventricolare destra, un'architettura trabecolare alterata e un volume miocardico24.
Per supportare i risultati ottenuti in questo studio, l'imaging OCT è stato utilizzato per misurare l'area trasversale del lume ventricolare e la lunghezza assiale (Figura 8). La LAL ha mostrato una significativa riduzione delle dimensioni e del diametro del ventricolo sinistro rispetto al controllo. Mentre solo i ventricoli sono focalizzati qui, l'influenza di LAL sullo sviluppo dell'arco aortico è anche riportata31. Un recente studio a cui abbiamo contribuito ha riportato in 3D che i ceppi miocardici della parete mediana erano aumentati in entrambi i ventricoli dopo LAL a HH2532. Inoltre, i gruppi LAL hanno mostrato un aumento dello spessore della parete rispetto ai gruppi di controllo a HH25. Questo studio è coerente con il precedente studio di Tobita et al.25, che ha dimostrato un aumento significativo dei ceppi circonferenziali epicardici sistolici di picco nel LV LAL a HH27.
Figura 1: Sistema di incubazione per la crescita embrionale. Le uova fecondate di gallina bianca livornese (Gallus gallus) sono state incubate in un'incubatrice a umidità (60%) e temperatura costanti (37,5 °C). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Preparazione del nodo LAL. Sono stati preparati nodi multipli ~0,5-1 mm di diametro e pezzi lunghi 1-2 cm utilizzando suture chirurgiche in nylon 10-0. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Replica dell'atrio sinistro embrionale realizzata in stucco. Viene creata una replica della sezione atriale sinistra per allenare e praticare l'orientamento del nodo e le fasi di chiusura del nodo utilizzando due pinzette. Questo ci ha permesso di fare molte prove e perfezionare questi passaggi prima di implementare questa abilità nell'embrione vero e proprio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Preparazione della stazione . (A,B) Tutti i materiali e le soluzioni per la microchirurgia sono stati collocati nell'area pulita della Stazione 1 e della Stazione 2. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Apertura di una finestra dall'estremità smussata dell'uovo e rimozione sia della membrana esterna che di quella interna. (A,B) Una piccola finestra è stata aperta utilizzando strumenti microchirurgici sul guscio dell'uovo e includendo l'intero embrione in HH20-21. (C) I frammenti del guscio d'uovo sono stati rimossi nella prima fase di cracking. (D,E) Anche le membrane extraembrionali sono state sezionate al microscopio. (F) Dopo che il processo LAL è stato completato, l'uovo è stato ricoperto con un doppio strato di parafilm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Un'istantanea dell'intervento chirurgico di legatura atriale sinistra in ovo (LAL). (A) Vista dorsale dell'embrione di pulcino nel suo orientamento normale. Il ventricolo embrionale che raggiunge HH20-21 ha un atrio comune primitivo (a), un ventricolo (v) e il tratto di efflusso (ot). (B) Viene visualizzata una vista dorsale ravvicinata dell'embrione capovolto, con il lato sinistro rivolto verso l'alto e la posizione del nodo. (C) LA con il nodo di sutura. Abbreviazioni: LA = atrio sinistro; AA = arco aortico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Rimozione ed esame dei cuori di controllo e LAL. Sia i cuori (A) di controllo che quelli (B) LAL che hanno raggiunto lo stadio HH25-26 sono stati rimossi dall'embrione ed esaminati al microscopio stereoscopico. Il grafico a barre mostra le differenze nel diametro trasversale del cuore tra il gruppo LAL e il gruppo di controllo e la media ± deviazione standard (SD) di almeno quattro repliche. Barra della scala = 100 μM. Esame istologico dei tessuti cardiaci in campioni (C) di controllo e (D) LAL utilizzando la tecnica di colorazione Elastica van Gieson. Il grafico a barre mostra le differenze di porosità (%) per mostrare la compressione miocardica tra il LAL e il gruppo di controllo e la media ± SD di almeno due repliche. **p < 0,01. Per l'analisi statistica è stata utilizzata la versione 9.5.1 di GraphPad Prism. Barra della scala = 50 μM. Abbreviazioni: LAL = legatura atriale sinistra; LA = atrio sinistro; RA = atrio destro; RV = ventricolo destro; LV = ventricolo sinistro. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: Tomografia a coerenza ottica. Sia (A) il controllo che (B) i cuori LAL che raggiungono HH25-26 sono stati esaminati mediante OCT. (C,D) La dimensione e la lunghezza della croce del lume dei ventricoli sono indicate rispettivamente nei pannelli (C) e (D). Gli istogrammi rappresentano la media ± SD con almeno tre ripetizioni. *p < 0,05; **p < 0,01; Per l'analisi statistica è stata utilizzata la versione 9.5.1 di GraphPad Prism. Barra della scala = 100 μM. Abbreviazioni: LAL = legatura atriale sinistra; RV = ventricolo destro; LV = ventricolo sinistro. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: Una revisione degli studi di ricerca che impiegano il modello di legatura atriale sinistra (LAL) negli embrioni aviari 6,10,12,14,22,24,27,30,32,33.
In quasi tutti i giornali, la LA è a pari merito con HH21. L'effetto del LAL viene studiato nelle fasi successive dell'HH (fase di valutazione). Abbreviazioni: AVC = cuscino atrioventricolare; LAV = canale atrioventricolare sinistro; RAV = canale atrioventricolare destro; AR = atri destri; LA = atri sinistri; RV = ventricolo destro; LV = ventricolo sinistro; SEN = subendocardio; IVS = setto interventricolare; micro-CT = tomografia microcomputerizzata. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Tabella 2: Efficacia tipica del modello di legatura atriale sinistra (LAL) creato a HH21 e incubato fino a HH25. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Video supplementare 1: Vengono rimosse sia la membrana esterna che quella interna dell'embrione aviario. Quindi, viene rimossa solo la membrana vitellina, come mostrato utilizzando le microforbici. Fare clic qui per scaricare il file.
Video supplementare 2: Le pinzette vengono posizionate sotto il segmento dorsale dell'embrione destro rivolto verso l'alto e accuratamente capovolte per esporre la gemma atriale sinistra. Fare clic qui per scaricare il file.
Video supplementare 3: Le membrane intorno alla gemma atriale sinistra vengono gradualmente eliminate. L'atrio si espande leggermente, il che rende possibile il posizionamento e la legatura dei nodi. Fare clic qui per scaricare il file.
Video supplementare 4: Una sutura lunga circa 0,1-0,3 mm viene posizionata vicino all'embrione e stretta attorno ad esso con due pinzette. Fare clic qui per scaricare il file.
Video supplementare 5: Le estremità di sutura in eccesso del nodo vengono tagliate con cura utilizzando micro forbici. Fare clic qui per scaricare il file.
Video supplementare 6: L'embrione viene delicatamente riportato al suo orientamento normale. LAL è completato. Fare clic qui per scaricare il file.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nell'HLHS, il flusso sanguigno è alterato a causa di difetti strutturali, che portano a una morfologia anomala sul lato sinistro 4,6. Il presente modello fornisce un sistema sperimentale pratico per comprendere meglio la progressione dell'HLHS e può anche imitare la sua patogenesi8. Tuttavia, stabilire un modello animale HLHS completamente equivalente dal punto di vista clinico è un compito impegnativo. Oltre al modello LAL aviario qui presentato, recenti studi su topi, pecore fetali e rane hanno tentato di replicare le caratteristiche morfologiche, emodinamiche e fisiopatologiche della prognosi HLHS. Negli embrioni di topo, il carico meccanico viene alterato tramite un agente embolizzante iniettato nel LA attraverso un intervento fetale al giorno embrionale (ED) 14,5 (circa HH40-41 negli embrioni di pulcino)34. Un totale del 48% dei feti che sono stati embolizzati positivamente sono sopravvissuti alla gestazione con piccole LV e flusso aortico retrogrado. Il lungo periodo di gestazione, le ulteriori sfide negli interventi nei primi punti temporali e la difficile chirurgia fetale possono limitare la fattibilità di questo modello. L'ipoplasia ventricolare sinistra è stata imitata anche nei modelli di agnello fetale riempiendo il LA con gomma siliconica attraverso un catetere a palloncino35. In questo modello animale di grandi dimensioni, il volume del ventricolo sinistro è sufficientemente ridotto, ma il tempo di sopravvivenza non è lungo, con conseguente bassa penetrazione della malattia. Un approccio di intervento alternativo consiste nell'occludere il forame ovale tramite cateterismo transepatico percutaneo, come tentato nell'agnello fetale36, anche se dirigere lo stent occlusivo verso il forame ovale è molto impegnativo. I modelli di pecora in generale sono molto impegnativi a causa delle loro morfologie vascolari preesistenti e della fisiologia polmonare avversa. Pertanto, la necessità di riproduzioni stagionali, un'età gestazionale più avanzata e le piccole dimensioni del campione limitano ulteriormente questo modello. Infine, l'embrione di Xenopus viene anche introdotto come un altro modello conveniente per imitare la malattia cardiaca umana37, nonostante il suo cuore a tre camere con un singolo ventricolo e le differenze nei modelli delle cellule della cresta neurale. Anche la disponibilità di interventi di microiniezione e microchirurgia basati sul genoma completo e il lungo tempo di sopravvivenza rendono questo modello interessante.
In studi precedenti, la penetrazione della malattia di sei dei 39 embrioni aviari operati è stata presentata come il 15% nel modello LAL34. Tuttavia, la penetrazione media di HLHS nel modello embrionale di pulcino che abbiamo esaminato nella fase iniziale (raggiungendo HH25 e HH27) è stata del 66% (12 su 18 embrioni aviari operati). Il Prof. Sedmera ha riferito che il tempo medio di sopravvivenza degli embrioni potrebbe essere di HH40 (ED14)19. Altri gruppi che eseguono regolarmente questa legatura hanno riportato alte percentuali di successo nei primi momenti (ad esempio, 75% fino a HH29, 50% fino a HH34 e 20% fino a HH38)30. Tuttavia, nelle fasi successive, emerge un fenotipo distinto e la mortalità aumenta. Sebbene la penetrazione della malattia possa essere relativamente bassa negli embrioni di pulcino, l'obiettivo di questo modello è quello di esaminare meglio l'eziologia e la patologia dell'HLHS prenatale, specialmente nelle fasi iniziali.
A causa delle dimensioni molto ridotte dell'embrione di pulcino in fase iniziale, l'intervento LAL pre e postoperatorio può portare a diverse complicazioni. Come rimedio per prevenire la contaminazione, i gusci d'uovo e i banchi vengono puliti con etanolo al 70% e i guanti possono essere utilizzati durante tutta la procedura. Un passaggio fondamentale nel protocollo LAL è la rimozione dell'intera membrana pericardica per consentire un buon adattamento del nodo attorno alla gemma atriale sinistra. Inoltre, abbiamo trovato il team di due persone estremamente utile, in particolare nella formazione e nella specializzazione in un set di competenze specifiche necessarie durante le fasi del protocollo. Questo approccio accelera la procedura e la sua curva di apprendimento. In quanto tale, il rischio di sanguinamento e contaminazione è secondario e supera i benefici del sistema di amicizia proposto. Si raccomanda l'uso di una sutura pre-preparata conservata in una soluzione sterile per pulcini. Inoltre, anche il mantenimento di una bassa forza di serraggio della sutura è fondamentale per una maggiore resa embrionale. Nodi più stretti sulla gemma atriale applicati in HH21 possono portare a un fallimento prematuro del ventricolo sinistro che non è in grado di elaborare l'impegno clinicamente critico dei difetti di rimodellamento della conduzione, coronarici e secondari della mioarchitettura, che sono stati ben descritti in studi precedenti22. In particolare, l'uso delle pinzette e delle forbici più fini e inutilizzate in alcuni passaggi e di quelle relativamente smussate in altri può ridurre il sanguinamento accidentale. Infine, subito dopo il completamento del nodo, l'embrione deve essere girato rapidamente nella sua posizione originale e la finestra del guscio d'uovo deve essere chiusa con un doppio strato di parafilm per preservarne la temperatura e l'umidità. La resa tipica per il modello LAL che raggiunge HH25 è presentata nella Tabella 2. Oltre alla diminuzione delle dimensioni ventricolari, possono svilupparsi anche malformazioni valvolari, come l'atresia mitrale/aortica. La gravità di queste lesioni aumenta la morbilità nelle fasi successive, come nell'HLHS. A causa delle sfide qui discusse, rispetto ad altri interventi meccanici eseguiti negli embrioni di pulcino, come il bando conotruncal, il modello LAL si traduce in livelli di resa molto più bassi. Riteniamo che, attraverso le precauzioni qui presentate, sia possibile ottenere un rendimento del 50%.
L'embrione aviario è un modello animale vertebrato ideale per la ricerca sullo sviluppo cardiovascolare grazie alla sua struttura morfologica, alle dimensioni, al basso costo, alla facilità di coltura e alla manipolazione38,39. Questo modello fornisce anche una protezione naturale contro gli agenti patogeni40. Gli embrioni strumentati possono essere utilizzati nell'imaging avanzato in vivo e nella manipolazione locale dei siRNA. Pertanto, le regioni genetiche conservate dell'uomo e del pollo sono disponibili attraverso il sequenziamento Sanger shotgun e la mappatura basata sulla fisica39, portando a studi meccanosensibili avanzati19. Inoltre, l'approccio microarray applicato da Krejčí et al. è stato utilizzato per misurare il successo per quanto riguarda la potenziale reversibilità dei cambiamenti emodinamici nella struttura miocardica. Pertanto, l'identificazione di geni differenzialmente espressi tra i ventricoli sinistro e destro può essere utilizzata come criterio per il periodo ideale di intervento quando iniziano i cambiamenti irreversibili33.
In conclusione, le potenziali direzioni future per le applicazioni microchirurgiche nel modello di embrione di pulcino includono l'uso di tecniche di editing genetico cardiovascolare incentrate su specifici geni della matrice e sulle vie di segnalazione molecolare, supportando i progressi nella coltura di cellule tissutali e nelle tecnologie di imaging32.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Riconosciamo il premio Tubitak 2247A per il ricercatore principale 120C139 che fornisce finanziamenti. Gli autori desiderano anche ringraziare PakTavuk Gıda. A. S., Istanbul, Turchia, per aver fornito ovuli fertili e aver sostenuto la ricerca cardiovascolare.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10-0 nylon surgical suture | Ethicon | ||
| Elastica van Gieson staining kit | Sigma-Aldrich | 115974 | For staining connective tissues in histological sections |
| Ethanol absolute | Interlab | 64-17-5 | For the sterilization step, 70% ethanol was obtained by diluting absolute ethanol with distilled water. |
| Incubator | KUHL, Flemington, New Jersey-U.S.A | AZYSS600-110 | |
| Kimwipes | Interlab | 080.65.002 | |
| Microscissors | World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL | 555640S | Vannas STR 82 mm |
| Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | Sealing stage for egg reincubation |
| Paraplast Bulk | Leica Biosystems | 39602012 | Tissue embedding medium |
| Stereo Microscope | Zeiss Stemi 508 | Stemi 508 | Used at station 1 |
| Stereo Microscope | Zeiss Stemi 2000-C | Stemi 2000-C | Used at station 2 |
| Tweezer (Dumont 4 INOX #F4) | Adumont & Fils, Switzerland | Used to return the embryo | |
| Tweezer (Super Fine Dumont #5SF) | World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL | 501985 | Used to remove the membranes on the embryo |
References
- Wang, T., et al. Congenital heart disease and risk of cardiovascular disease: A meta-analysis of cohort studies. Journal of the American Heart Association. 8 (10), e012030 (2019).
- Chaudhry, B., et al. The left ventricular myocardium in hypoplastic left heart syndrome. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (8), 279 (2022).
- Lashkarinia, S. S., Çoban, G., Ermek, E., Çelik, M., Pekkan, K. Spatiotemporal remodeling of embryonic aortic arch: stress distribution, microstructure, and vascular growth in silico. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 19 (5), 1897-1915 (2020).
- Ho, S., Chan, W. X., Yap, C. H. Fluid mechanics of the left atrial ligation chick embryonic model of hypoplastic left heart syndrome. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 20 (4), 1337-1351 (2021).
- Gordon, B. M., Rodriguez, S., Lee, M., Chang, R. K. Decreasing number of deaths of infants with hypoplastic left heart syndrome. The Journal of Pediatrics. 153 (3), 354-358 (2008).
- Salman, H. E., et al. Effect of left atrial ligation-driven altered inflow hemodynamics on embryonic heart development: clues for prenatal progression of hypoplastic left heart syndrome. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 20 (2), 733-750 (2021).
- Fruitman, D. S. Hypoplastic left heart syndrome: Prognosis and management options. Paediatrics & Child Health. 5 (4), 219-225 (2000).
- Rahman, A., Chaturvedi, R. R., Sled, J. G. Flow-mediated factors in the pathogenesis of hypoplastic left heart syndrome. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (5), 154 (2022).
- Henderson, D. J., Anderson, R. H. The development and structure of the ventricles in the human heart. Pediatric Cardiology. 30 (5), 588-596 (2009).
- Kowalski, W. J., Pekkan, K., Tinney, J. P., Keller, B. B. Investigating developmental cardiovascular biomechanics and the origins of congenital heart defects. Frontiers in Physiology. 5, 408 (2014).
- Midgett, M., Rugonyi, S. Congenital heart malformations induced by hemodynamic altering surgical interventions. Frontiers in Physiology. 5, 287 (2014).
- Kowalski, W. J., et al. Left atrial ligation alters intracardiac flow patterns and the biomechanical landscape in the chick embryo. Developmental Dynamics. 243 (5), 652-662 (2014).
- Bruneau, B. G. The developmental genetics of congenital heart disease. Nature. 451 (7181), 943-948 (2008).
- Sedmera, D., et al. Cellular changes in experimental left heart hypoplasia. The Anatomical Record. 267 (2), 137-145 (2002).
- Celik, M., et al. Microstructure of early embryonic aortic arch and its reversibility following mechanically altered hemodynamic load release. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 318 (5), H1208-H1218 (2020).
- Tobita, K., Schroder, E. A., Tinney, J. P., Garrison, J. B., Keller, B. B. Regional passive ventricular stress-strain relations during development of altered loads in chick embryo. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 282 (6), H2386-H2396 (2002).
- Alser, M., Shurbaji, S., Yalcin, H. C. Mechanosensitive pathways in heart development: findings from chick embryo studies. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 8 (4), 32 (2021).
- Alser, M., et al. Blood flow disturbance and morphological alterations following the right atrial ligation in the chick embryo. Frontiers in Physiology. 13, 849603 (2022).
- Sedmera, D.
- Rychter, Z., Rychterová, V., Lemez, L. Formation of the heart loop and proliferation structure of its wall as a base for ventricular septation. Herz. 4 (2), 86-90 (1979).
- Harh, J. Y., Paul, M. H., Gallen, W. J., Friedberg, D. Z., Kaplan, S. Experimental production of hypoplastic left heart syndrome in the chick embryo. The Americal Journal of Cardiology. 31 (1), 51-56 (1973).
- Sedmera, D., Pexieder, T., Rychterova, V., Hu, N., Clark, E. B. Remodeling of chick embryonic ventricular myoarchitecture under experimentally changed loading conditions. The Anatomical Record. 254 (2), 238-252 (1999).
- Karakaya, C., et al. Asymmetry in mechanosensitive gene expression during aortic arch morphogenesis. Scientific Reports. 8 (1), 16948 (2018).
- Trinidad, F., et al. Effect of blood flow on cardiac morphogenesis and formation of congenital heart defects. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (9), 303 (2022).
- Tobita, K., Keller, B. B. Right and left ventricular wall deformation patterns in normal and left heart hypoplasia chick embryos. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 279 (3), H959-H969 (2000).
- Bortecine, S., Merve Nur, C., Faruk, K., Kerem, P. Auxiliary humidifier system design and construction for research grade egg incubators. Zenodo. , (2023).
- Schroder, E. A., Tobita, K., Tinney, J. P., Foldes, J. K., Keller, B. B. Microtubule involvement in the adaptation to altered mechanical load in developing chick myocardium. Circulation Research. 91 (4), 353-359 (2002).
- Rufaihah, A. J., Chen, C. K., Yap, C. H., Mattar, C. N. Z. Mending a broken heart: In vitro, in vivo and in silico models of congenital heart disease. Disease Models & Mechanisms. 14 (3), (2021).
- Siddiqui, H. B., Dogru, S., Lashkarinia, S. S., Pekkan, K. Soft-tissue material properties and mechanogenetics during cardiovascular development. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (2), 64 (2022).
- Pesevski, Z., et al. Endocardial fibroelastosis is secondary to hemodynamic alterations in the chick embryonic model of hypoplastic left heart syndrome. Developmental Dynamics. 247 (3), 509-520 (2018).
- Hu, N., et al. Dependence of aortic arch morphogenesis on intracardiac blood flow in the left atrial ligated chick embryo. Anatomical Record. 292 (5), 652-660 (2009).
- Lashkarinia, S. S., et al. Myocardial biomechanics and the consequent differentially expressed genes of the left atrial ligation chick embryonic model of hypoplastic left heart syndrome. Annals of Biomedical Engineering. 51 (5), 1063-1078 (2023).
- Krejčí, E., et al. Microarray analysis of normal and abnormal chick ventricular myocardial development. Physiological Research. 61, S137-S144 (2012).
- Rahman, A., et al. A mouse model of hypoplastic left heart syndrome demonstrating left heart hypoplasia and retrograde aortic arch flow. Disease Models & Mechanisms. 14 (11), (2021).
- Fishman, N. H., Hof, R. B., Rudolph, A. M., Heymann, M. A. Models of congenital heart disease in fetal lambs. Circulation. 58 (2), 354-364 (1978).
- Wong, F. Y., et al. Induction of left ventricular hypoplasia by occluding the foramen ovale in the fetal lamb. Scientific Reports. 10 (1), 880 (2020).
- Nie, S. Use of frogs as a model to study the etiology of HLHS. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 10 (2), 51 (2023).
- Vilches-Moure, J. G. Embryonic chicken (Gallus gallus domesticus) as a model of cardiac biology and development. Comparative Medicine. 69 (3), 184-203 (2019).
- Kain, K. H., et al. The chick embryo as an expanding experimental model for cancer and cardiovascular research. Developmental Dynamics. 243 (2), 216-228 (2014).
- Sukparangsi, W., Thongphakdee, A., Intarapat, S. Avian embryonic culture: A perspective of in ovo to ex ovo and in vitro studies. Frontiers in Physiology. 13, 903491 (2022).
