Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Erken Vasküler Gelişim Sırasında Değişen Hemodinamik Yükleme için Bir Model Olarak Kuş Embriyosunda Sol Atriyal Ligasyon

Published: June 16, 2023 doi: 10.3791/65330
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1,2
1Department of Biomedical Sciences and Engineering, Koc University, 2Department of Mechanical Engineering, Koc University
* These authors contributed equally

Summary

Burada, kuş embriyosunda sol atriyal ligasyon (LAL) modelinin yürütülmesi için ayrıntılı bir görsel protokol sunuyoruz. LAL modeli, hipoplastik sol kalp sendromunu taklit ederek duvar kesme gerilimi yükünü değiştiren intrakardiyak akışı değiştirir. Bu zor mikrocerrahi modelinin zorluklarının üstesinden gelmek için bir yaklaşım sunulmaktadır.

Abstract

Dört odacıklı olgun ventriküler konfigürasyonu, kültür kolaylığı, görüntüleme erişimi ve verimliliği nedeniyle, kuş embriyosu kardiyovasküler gelişimi incelemek için tercih edilen bir omurgalı hayvan modelidir. Normal gelişimi ve konjenital kalp defekti prognozunu anlamaya yönelik çalışmalar bu modeli yaygın olarak benimsemektedir. Belirli bir embriyonik zaman noktasında normal mekanik yükleme modellerini değiştirmek ve aşağı akış moleküler ve genetik kaskadı izlemek için mikroskobik cerrahi teknikler tanıtıldı. En sık yapılan mekanik girişimler sol vitellin ven ligasyonu, konorunkal bantlama ve sol atriyal ligasyondur (LAL), intramural vasküler basıncı ve kan akımına bağlı duvar kayma stresini modüle eder. LAL, özellikle ovo'da yapıldığında, son derece ince ardışık mikrocerrahi operasyonlar nedeniyle çok küçük numune verimleri ile en zorlu müdahaledir. Yüksek riskine rağmen in ovo LAL, hipoplastik sol kalp sendromu (HLHS) patogenezini taklit ettiği için bilimsel olarak çok değerlidir. HLHS, insan yenidoğanlarında gözlenen klinik olarak anlamlı, karmaşık bir konjenital kalp hastalığıdır. Bu yazıda in ovo LAL için ayrıntılı bir protokol belgelenmiştir. Kısaca, döllenmiş kuş embriyoları, tipik olarak Hamburger-Hamilton (HH) aşamaları 20 ila 21'e ulaşana kadar 37.5 ° C'de ve% 60 sabit nemde inkübe edildi. Yumurta kabukları kırılarak açıldı ve dış ve iç zarlar çıkarıldı. Embriyo, ortak atriyumun sol atriyal ampulünü ortaya çıkarmak için hafifçe döndürüldü. 10-0 naylon sütürlerden önceden monte edilmiş mikro düğümler nazikçe konumlandırıldı ve sol atriyal tomurcuğun etrafına bağlandı. Son olarak, embriyo orijinal konumuna geri döndürüldü ve LAL tamamlandı. Normal ve LAL aletli ventriküller doku sıkışmasında istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar gösterdi. Verimli bir LAL model üretim hattı, kardiyovasküler bileşenlerin embriyonik gelişimi sırasında senkronize mekanik ve genetik manipülasyona odaklanan çalışmalara katkıda bulunacaktır. Benzer şekilde, bu model doku kültürü araştırmaları ve vasküler biyoloji için bozulmuş bir hücre kaynağı sağlayacaktır.

Introduction

Konjenital kalp defektleri (KKH'ler), anormal embriyonik gelişime bağlı olarak ortaya çıkan yapısal bozukluklardır1. Genetik koşullara ek olarak, patogenez değişen mekanik yüklemedenetkilenir 2,3. Konjenital bir kalp hastalığı olan hipoplastik sol kalp sendromu (HLHS), doğumda az gelişmiş bir ventrikül/aort ile sonuçlanır4 ve yüksek mortaliteoranı 5,6. Klinik yönetimindeki son gelişmelere rağmen, HLHS'nin vasküler büyüme ve gelişme dinamikleri hala belirsizdir7. Normal embriyonik gelişimde, erken embriyonik kalp tüpü oluşumu ilerledikçe sol ventrikül (LV) endokard ve miyokard kardiyak progenitörlerden köken alır. Miyokardiyal trabekülasyon, kalınlaşma tabakaları ve kardiyomiyosit proliferasyonunun kademeli varlığı bildirilmiştir2. HLHS için, anormal kardiyomiyosit göçüne bağlı miyokardiyal hipoplaziye daha fazla katkıda bulunan değişmiş trabeküler yeniden şekillenme ve sol ventrikül düzleşmesi gözlenir 2,8,9,10

Kalp gelişimini incelemek ve hemodinamik durumları anlamak için yaygın olarak kullanılan model organizmalar arasında 11, kuş embriyosu dört odacıklı olgun kalbi ve kültür kolaylığı nedeniyle tercih edilmektedir11,12,13,14. Öte yandan, zebra balığı embriyolarının ve transgenik/nakavt farelerin gelişmiş görüntüleme erişimi belirgin avantajlar sağlar11,12. Gelişmekte olan kardiyovasküler bileşenlerde intramural basıncı ve duvar kesme stresini değiştiren kuş embriyosu için çeşitli mekanik müdahaleler test edilmiştir. Bu modeller arasında sol vitellin ligasyonu, konorunkal bantlama15 ve sol atriyal ligasyon (LAL)11,12,16 bulunur. Değişen mekanik yüklemeye bağlı olarak ortaya çıkan fenotip, erken prognoza odaklanan çalışmalarda cerrahi müdahaleden yaklaşık 24-48 saat sonra gözlenebilir11,13. LAL müdahalesi, atriyoventriküler açıklığın etrafına bir dikiş halkası yerleştirerek sol atriyumun (LA) fonksiyonel hacmini daraltmak için popüler bir tekniktir. Aynı şekilde, sağ atriyal ligasyonu (RAL) hedefleyen mikrocerrahi müdahaleler de gerçekleştirilmiştir17,18. Benzer şekilde, bazı araştırmacılar LA 19,20'nin hacmini azaltmak için mikro klipsler kullanarak sol atriyal apendiksleri (LAA) hedefler. Bazı çalışmalarda, atriyoventriküler düğüme cerrahi bir naylon iplik uygulanır19,21. Kullanılan müdahalelerden biri, HLHS'yi taklit edebilen ancak aynı zamanda yapılması en zor model olan, son derece ince mikrocerrahi operasyonlar nedeniyle çok küçük numune verimleri olan LAL'dir. Laboratuvarımızda LAL, ortak atriyum 6,14,22,23 tam bölünmeden önce, Hamburger-Hamilton (HH) evre 20 ve 21 arasında ovo olarak gerçekleştirilir. LA'nın etrafına, intrakardiyak kan akış akışlarını değiştiren bir cerrahi dikiş yerleştirilir. HLHS'nin LAL modellerinde artmış ventrikül duvar sertliği, değişmiş miyofiber açıları ve azalmış LV kavite boyutu gözlenmiştir14,24.

Bu video makalesinde, in ovo LAL için ayrıntılı bir protokol ve yaklaşım sunulmaktadır. Kısaca, döllenen kuş embriyoları mikrocerrahi için inkübe edildi, yumurta kabuğu çatlatılarak açıldı ve dış ve iç zarlar temizlendi. Embriyo daha sonra LA'ya erişilebilmesi için yavaşça döndürüldü. Atriyal tomurcuğa 10-0 naylon cerrahi sütür bağlandı ve embriyo orijinal oryantasyonuna geri döndürülerek LAL prosedürü25 tamamlandı. LAL ve normal ventriküller, optik koherens tomografi ve temel histoloji ile doku sıkışması ve ventrikül hacmi açısından karşılaştırıldı.

Burada açıklandığı gibi, başarılı bir şekilde yürütülen bir LAL model boru hattı, kardiyovasküler bileşenlerin embriyonik gelişimine odaklanan temel çalışmalara katkıda bulunacaktır. Bu model aynı zamanda genetik manipülasyonlar ve ileri görüntüleme yöntemleri ile birlikte de kullanılabilir. Benzer şekilde, akut LAL modeli, doku kültürü deneyleri için hastalıklı vasküler hücrelerin stabil bir kaynağıdır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Verimli beyaz Leghorn yumurtaları güvenilir tedarikçilerden elde edilir ve üniversite onaylı yönergelere göre kuluçkaya yatırılır. Civciv embriyoları, evre 18 (gün 3) ila 24 (gün 4) (bu yazıda sunulan aşamalar), Avrupa Birliği (AB) direktifi 2010/63/EU ve ABD'deki kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komitesi (IACUC) yönergeleri tarafından canlı omurgalı hayvanlar olarak kabul edilmemektedir. Civciv embriyoları, ABD yasalarına göre kuluçkanın 19. gününden sonra "canlı hayvan" olarak kabul edilir, ancak AB için değildir. Her yumurta, kuluçka başlangıç tarihi ile etiketlenir ve kuluçkanın en geç 10. gününden önce yumurtadan çıkması planlanır. Yumurtalar çatladıktan sonra civcivler kuluçka makinesinden çıkarılır. Protokol, özel model oluşturma aşamalarına odaklanarak iki tezgah üstü operasyon istasyonunda (İstasyon 1 ve İstasyon 2) gerçekleştirilir.

1. Mikrocerrahi öncesi hazırlık

  1. Döllenmiş yumurtaları ya belirli bir patojen içermeyen (SPF) dereceye sahip bir aşı geliştirme merkezinden ya da kuru polistiren kaplarda kırılgan bir teslimat kuryesi ile güvenilir bir ticari tedarikçi çiftliğinden alın. Kuluçkadan önce, kontaminasyonu gidermek için yumurta kabuğunu %70 etanole batırılmış tüy bırakmayan mendillerle nazikçe temizleyin.
  2. Embriyo dahil etme/dışlama kriterleri
    1. Taşıma sırasında çatlamış veya hasar görmüş yumurtaları kuluçkaya yatırmayın.
    2. LAL prosedürü sırasında veya yeniden inkübasyondan sonra kanama görülürse, embriyoyu kullanmayın.
    3. Hemodinamik kan akışı normal oryantasyondan farklı olabileceğinden, sol taraf yukarı pozisyonda gelişen embriyoları kullanmayın.
    4. Hem cerrahi öncesi hem de cerrahi sonrası işlemlerde doğuştan kusurlarla gelişen diş implantları.
    5. HLHS'yi bir LAL modeli olarak taklit ederek, orijinal konumlarında gelişen hedeflenen aşamaya ulaşan embriyoları dahil edin.
  3. Döllenmiş beyaz Leghorn tavuk yumurtalarını (Gallus gallus domesticus L.), kör uç, tipik olarak HH20-2115'te (37.5 °C, %60 nem, 3.5 gün) istenen aşamaya kadar kuluçkaya yatırın (Şekil 1).
    NOT: Verimi artırmak için yumurtaları sabit bir sıcaklık ve nemde tutmak önemlidir. Kuluçka makinesi modeline bağlı olarak, damıtılmış suyla doldurulmuş bir kabın eklenmesi sabit nemi koruyacaktır. Çoğu inkübatöre uyacak ek / yardımcı bir sıcaklık ve nem kontrol sisteminin planları yazarlar tarafından geliştirilmiştir ve tavsiye edilir. Bu şirket içi yerleşik sensör/kontrol ünitesinin elektronik, donanım ve kod ayrıntıları bir veri deposundasağlanır 26. Kuluçka sırasında yumurtaların sürekli olarak hafifçe sallanması (döndürülmesi), embriyonun en uygun şekilde konumlandırılmasına izin verebilir ve böylece daha yüksek oranda "çalıştırılabilir" embriyoya yol açabilir. Çalkalama, bu kapasiteye sahip inkübatörlerle de çalışabilir ve verimliliği daha da artırabilir.
  4. İşleme başlamadan önce, 1,5 cm uzunluğunda 10-0'lık bir dikişe gevşek bir el üstü düğüm atarak gerekli sayıda düğüm hazırlayın. Ameliyat sırasında düğümün sıkı olmadığından ve kulakçıklara kolayca sığacak kadar büyük olduğundan emin olun (Şekil 2).
    NOT: Düğümleri önceden bağlayın ve kullanmadan önce steril bir civciv zil solüsyonunda saklayın. Düğüm atma işlemi, cımbızı eşzamanlı olarak çalıştırmak için iki elin kullanılmasını gerektirir. Bu, protokolde kritik bir aşama olduğundan, bu adımı uygulamak için macundan bir atriyum modeli yapılabilir (Şekil 3). Bu, İstasyon 2'de adım 3.2.3'ü gerçekleştirmek için gereken üç boyutlu mikrocerrahi becerilerini geliştirecektir (Şekil 4).

2. İstasyon 1'deki Operasyonlar (Şekil 4A)

  1. Yumurtanın kör ucundan bir pencere açın ve hem dış hem de iç zarları15 çıkarın (Şekil 5A-D).
  2. İstenmeyen çatlak yayılımını azaltmak için serbest parmaklar yumurtayı sıkıca destekleyecek şekilde cımbızın ters ucuyla hafifçe çatlatarak yumurta kabuğunu açın.
  3. LAL uzun bir prosedür olduğundan, kalp atış hızı sıcaklığa bağlı olduğundan embriyonun sıcaklığını ve nemini koruyun. Bu nedenle, ilk kabuk penceresinin mümkün olduğunca küçük, işlemleri yürütmeye yetecek kadar oluşturulduğundan emin olun.
    NOT: Çalışma sırasında nem veya sıcaklık kontrol sistemleri kullanılmaz, ancak bu sistemler varsa verime fayda sağlar. Mümkünse, laboratuvardaki klima sistemi kapatılır ve prosedür mümkün olan en yüksek oda sıcaklığında (RT) gerçekleştirilir. Operasyon sırasında sıcaklıkla kontrol edilebilen embriyonik kalp atış hızının optimizasyonu da önerilir. Bazı laboratuvarlar, LAL işlemi sırasında sıcaklık kontrolü yoluyla kalp atış hızını 120 bpm'den biraz daha düşük oranlarda tutar. Bu nedenle, cerrahi bölge çevresinde uygulanan nem kontrolü, verimi daha da artıracaktır. Yumurta kabuğu pencereleri mümkün olduğunca küçük, sadece cerrahi erişime izin verecek kadar büyük oluşturulur. Bu aynı zamanda, tipik olarak yumurta kabuğundan sadece embriyonun çevresi kadar daha küçük olan kalın dış zar için de geçerlidir. Bunlar embriyonun sıcaklığını ve nemini korumayı sağlar. Yumurtanın küt ucundan bir pencere açılırken, küçük kabuk parçaları temizlenir, böylece bu parçalar vitellin damar bütünlüğüne zarar vermez veya istenmeyen artefaktlara yol açmaz. Ek olarak, diğer laboratuvarlar pencere yapmak için kavisli mikro tırtıklı makaslar kullanır. Ayrıca, çatlamayı kontrol etmek için yumurta kabuğunu stabilize etmek için iki genişlikte Scotch bant kullanılabilir.
  4. Mikro makas kullanarak sadece gerekli vitellin membranını çıkarın (Ek Video 1).
  5. Normal embriyonik gelişim sağ taraf yukarıdadır. Embriyo vitellin zarından kurtulduktan sonra, cımbızı kapalı uçlu olarak embriyonun dorsal segmentinin altına yerleştirin ve sol tarafı ortaya çıkarmak için embriyoyu hafifçe çevirin (yani, sol taraf yukarı konfigürasyonu) (Şekil 6A, B; Ek Video 2).
  6. Sol atriyal tomurcuğun şimdi açıkta kaldığından, ancak yine de tipik olarak perikardın çift katmanından oluşan karmaşık bir zar sistemi ile kaplandığından emin olun.
  7. İnce olanlar da dahil olmak üzere zarları atriyal tomurcuğun hemen çevresinden çıkarın. Bu başka bir kritik aşamadır; Kaba zarlardan zar çıkarma işlemini gerçekleştirin ve sol atriyal tomurcuk çevresindeki ince zarlara ilerleyin. İnce zarın çıkarılması için en iyi cımbızları ayırın (Ek Video 3).
  8. Membran çıkarma işlemi sırasında, embriyoyu sol taraf yukarı doğru yönlendirin, böylece adım 3.2'deki düğüm yerleştirme işlemi daha fazla yeniden konumlandırma olmadan gerçekleştirilebilir. Bunu başarmak için, adım 2.6'daki zarları kullanarak embriyoyu kaldırın ve sol tarafı yukarı bakacak şekilde yumurta kabuğundan asın.
    NOT: Bazı embriyolar yumurta kabuğu çevresine yakın yerleştirilebilir ve çalıştırılması zor olabilir. Yine de, bu embriyolar büyük olasılıkla sağ tarafa yönlendirilecek ve normal davranış sergileyecek ve çalışmaya dahil edilebilir. Bu durumlarda, gerekirse, perikardiyal membranı #4 ince cımbızla nazikçe temizleyerek ve yumurta kabuğunu ters yönde (kabuk açıklığına doğru) çıkararak gizlenmiş atriyum daha erişilebilir hale getirilebilir. Bu embriyolar ayrıca ekstraembriyonik zarların parçaları kullanılarak kaldırılabilir ve zarın bir ucu (cımbız ucu) yumurta kabuğuna tutturularak doğal yapışkanlığı kullanılarak istenen pozisyonda sabitlenebilir. Ek olarak, embriyonun baş ve omurilik bölgesi arasındaki boşluk, gizlenmiş kulakçıkları ortaya çıkarmak için cımbız yardımıyla genişletilebilir.

3. İstasyon 2'deki Operasyonlar (Şekil 4B)

  1. Stereomikroskop altında, önceden hazırlanmış düğümü adım 1.4'ten embriyoya yakın erişilebilir bir yere yerleştirin (Şekil 6B). Atriyal tomurcuk artık bağlanmaya hazırdır (Ek Video 4).
  2. Önceden hazırlanmış açık düğümü alın ve sol atriyal tomurcuğun üzerine yönlendirin. LAL'in çalışması için, yumurtayı benzersiz bir şekilde eğimli üç boyutlu bir yöne yerleştirin.
    1. Embriyolara zarar vermeden sıkma işlemini gerçekleştirmek için düğümü doğru şekilde yönlendirin.
    2. Atan bir kalbin etkisini azaltmak için 2.7. adımda ince zarları en uygun şekilde temizleyin.
    3. Sütürü sıkın (Şekil 6C). Bu adım için macunla pratik yapmak çok faydalıdır. Sahte embriyolar için, düğümü tutacak kadar sıkın.
  3. Ardından, dikişin fazla uçlarını tomurcuğa mümkün olduğunca yakın kesmek için mikro makası kullanın (Ek Video 5).
  4. Bağlanan dikişin yeni kesilen uçlarının, rotasyon sırasında veya kalp atışı nedeniyle yakındaki damarları delecek konumda olmamasına çok dikkat edin.
  5. Cımbız kullanarak, adım 3.3'te kesilen fazla dikiş parçalarını çıkarın.
  6. Son olarak, kapalı cımbız kullanarak, embriyoyu adım 2.5'teki gibi orijinal konumuna getirin (Ek Video 6).
  7. LAL işlemini tamamladıktan sonra, yumurtayı çift kat parafilm ile kaplayın ve tekrar inkübe edin. Yumurtaların sıkı ve steril bir şekilde kapatılması, özellikle 24 saatlik kuluçka döneminden sonra hayatta kalmak için çok önemlidir. Görsel erişim de isteniyorsa, cam slaytlarla parafin mumu kullanın.
    NOT: Erken embriyonik dönem incelendiğinde, yumurtalar tipik olarak yaklaşık HH25 veya HH27'ye ulaşana kadar 24-48 saat kuluçkaya yatırılır. Bununla birlikte, herhangi bir sınır yoktur ve diğer araştırmacılar tarafından denendiği gibi daha sonraki aşamalar incelenebilir. Yüksek çalışma hızları için en az iki kişilik bir ekip önerilir. Bir kişi yumurta açma, ilk membran temizliği, rotasyon ve sol atriyal tomurcuk etrafındaki membran temizliği için eğitilmeli ve bundan sorumludur. Diğer kişi sadece ilk düğüm hazırlığından, düğüm yerleştirmeden ve sıkmadan sorumludur. Son embriyo rotasyonu Kişi 1 tarafından yapılabilir. Tek bir embriyo için cerrahi operasyon yaklaşık 4-5 dakika sürer.
  8. Cerrahi operasyonlardan önce/sonra tezgah üstü yüzeyleri ve aletleri etanol ile temizleyin. Embriyonik dokulara dokunan metal aletlere taze civciv zil solüsyonu (NaCl, KCl, CaCl2 ve NaHCO3)16,27 uyguladığınızdan emin olun.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

LAL müdahalesine bağlı yapısal ve morfolojik değişiklikleri gözlemlemek için ileri zaman çözümlü görüntüleme teknikleri kullanılabilir10. Ayrıca, LAL numuneleri moleküler ve biyolojik yöntemlerede uygundur 19,28. Tablo 1'de, LAL modeli sonuçlarının kullanıldığı örnek çalışmalar verilmiştir. Bu kapsamda HH20-21'e ulaşan civciv embriyolarına LAL müdahalesi yapıldı. Hem kontrol (sağlıklı) hem de LAL kalpleri HH25-26'da embriyodan çıkarıldı. Daha sonra numuneler 4 °C'de %4 paraformaldehit (PFA) içindesabitlendi 6,15. Çıkarılan kalp örnekleri daha sonra her biri 1 saat boyunca artan konsantrasyonlarda (%70, %96 ve %100) etanol çözeltilerinde kurutuldu. Son olarak, numuneler RT'de 0.5 saat ksilen içinde tutuldu ve 10 μm kalınlığında kesit alınmadan önce parafin gömme işlemi gerçekleştirildi. Cam lam üzerine aktarılan numuneler Elastica van Gieson boyası ile boyandı. Kesitler, ventrikülün enine çapının ölçüldüğü bir stereomikroskop altında incelendi. Ayrıca bazı örneklerde üç boyutlu non-invaziv bir yöntem olan optik koherens tomografi taraması (OCT) gerçekleştirdik11,29. HH25-26'da hem kontrol hem de LAL kalpleri eksize edildi ve çapraz lümen çapları OCT altında ölçüldü.

Sonuçlar, LAL için normal gelişime kıyasla önemli morfolojik değişikliklerle daha kompakt bir miyokardiyal yapı elde edildiğini göstermiştir (Şekil 7). Ek olarak, kollajen gibi hücre dışı matriks bileşenlerinin birikmesi, HLHS30'a benzer miyokardiyal fibrozise benzeyen kardiyak interstisyum çevresinde gözlenir. Miyokardiyal kalınlaşma ve trabeküler kompaksiyonu daha iyi anlamak için hem kontrol hem de LAL örneklerinde morfometrik porozite ölçümleri yapıldı. Beklendiği gibi, LAL müdahalesi daha küçük bir sol ventrikül boşluğu ve trabeküler arası girintileri sıkılaştırarak trabeküler sıkıştırma ile sonuçlandı. Bu bulgular, LAL'in sağlıklı ventriküler mimariyi değiştirdiği ve trabeküler yönü yeniden yönlendirdiği hipotezini doğrulamaktadır22. Benzer şekilde, HH29'daki LAL modeli, genişlemiş bir sağ ventrikül boşluğu, değişmiş trabeküler mimari ve miyokardiyal hacim24 ile sonuçlandı.

Bu çalışmada elde edilen sonuçları desteklemek için, ventriküler lümen çapraz alanını ve aksiyel uzunluğu ölçmek için OCT görüntüleme kullanıldı (Şekil 8). LAL, kontrole kıyasla sol ventrikül boyutunda ve çapında önemli bir azalma gösterdi. Burada sadece ventriküllere odaklanılırken, LAL'in arkus aort gelişimi üzerindeki etkisi de bildirilmektedir31. Katkıda bulunduğumuz yakın tarihli bir çalışma, HH25 32'de LAL'den sonra her iki ventrikülde orta duvar miyokardiyal suşlarının arttığını3D olarak bildirmiştir. Ek olarak, LAL grupları, HH25'teki kontrol gruplarına kıyasla duvar kalınlığında bir artış sergiledi. Bu çalışma, HH27'de LAL LV'de pik sistolik epikardiyal çevresel suşlarda önemli bir artış gösteren Tobita ve ark.25 tarafından yapılan önceki çalışma ile tutarlıdır.

Figure 1
Şekil 1: Embriyonik büyüme için kuluçka sistemi. Döllenmiş beyaz Leghorn tavuk yumurtaları (Gallus gallus) bir inkübatörde sabit nem (% 60) ve sıcaklıkta (37.5 ° C) inkübe edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: LAL düğümünün hazırlanması. 10-0 naylon cerrahi sütürler kullanılarak ~0.5-1 mm çapında ve 1-2 cm uzunluğunda çoklu düğümler hazırlandı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Embriyonik sol atriyumun macundan yapılmış kopyası. İki cımbız kullanarak düğüm oryantasyonu ve düğüm kapatma adımlarını eğitmek ve uygulamak için sol atriyal bölümün bir kopyası oluşturulur. Bu, bu beceriyi gerçek embriyoda uygulamadan önce birçok deneme yapmamıza ve bu adımları mükemmelleştirmemize izin verdi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: İstasyon hazırlığı . (A,B) Mikrocerrahi için tüm malzemeler ve solüsyonlar İstasyon 1 ve İstasyon 2 için temiz alana yerleştirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Yumurtanın kör ucundan bir pencere açılması ve hem dış hem de iç zarların çıkarılması. (A,B) Yumurta kabuğu üzerinde mikrocerrahi aletler kullanılarak ve tüm embriyo HH20-21'e dahil edilerek küçük bir pencere açıldı. (C) Yumurta kabuğunun parçaları ilk çatlama adımında çıkarıldı. (D,E) Ekstraembriyonik membranlar da mikroskop altında diseke edildi. (F) LAL işlemi tamamlandıktan sonra, yumurta çift kat parafilm ile kaplandı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: In ovo sol atriyal ligasyon (LAL) ameliyatının anlık görüntüsü. (A) Civciv embriyosunun normal oryantasyonunda dorsal görünümü. HH20-21'e ulaşan embriyonik ventrikül, ilkel bir ortak atriyum (a), ventrikül (v) ve çıkış yoluna (ot) sahiptir. (B) Ters çevrilmiş, sol tarafı yukarı bakacak embriyonun ve düğüm yerinin yakından dorsal görünümü görüntülenir. (C) Dikiş düğümü ile LA. Kısaltmalar: LA = sol atriyum; AA = aortik ark. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 7
Şekil 7: Kontrol ve LAL kalplerinin çıkarılması ve incelenmesi. HH25-26 evresine ulaşan hem (A) kontrol hem de (B) LAL kalpleri embriyodan çıkarıldı ve stereomikroskop altında incelendi. Çubuk grafik, LAL grubu ile kontrol grubu arasındaki enine kalp çapındaki farklılıkları ve en az dört kopyanın ortalama ± standart sapmasını (SD) gösterir. Ölçek çubuğu = 100 μM. Elastica van Gieson boyama tekniği kullanılarak (C) kontrol ve (D) LAL örneklerinde kalp dokularının histolojik incelemesi. Çubuk grafik, LAL ve kontrol grubu arasındaki miyokardiyal kompresyon ve en az iki kopyanın ortalama ± SD'sini göstermek için gözeneklilikteki farklılıkları (%) gösterir. **p < 0,01. İstatistiksel analizler için GraphPad Prism 9.5.1 sürümü kullanıldı. Ölçek çubuğu = 50 μM. Kısaltmalar: LAL = sol atriyal ligasyon; LA = sol atriyum; RA = sağ atriyum; RV = sağ ventrikül; LV = sol ventrikül. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 8
Şekil 8: Optik koherens tomografi. HH25-26'ya ulaşan hem (A) kontrol hem de (B) LAL kalpleri OCT ile incelendi. (C,D) Ventriküllerin lümen çaprazının boyutu ve uzunluğu sırasıyla (C) ve (D) panellerinde belirtilmiştir. Histogramlar, en az üç tekrarla SD ± ortalamasını temsil eder. *p < 0,05; **p < 0,01; İstatistiksel analizler için GraphPad Prism 9.5.1 sürümü kullanıldı. Ölçek çubuğu = 100 μM. Kısaltmalar: LAL = sol atriyal ligasyon; RV = sağ ventrikül; LV = sol ventrikül. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Kuş embriyolarındasol atriyal ligasyon (LAL) modelini kullanan araştırma çalışmalarının gözden geçirilmesi 6,10,12,14,22,24,27,30,32,33.
Hemen hemen tüm makalelerde, LA HH21'e bağlıdır. LAL'in etkisi daha sonraki HH aşamalarında (değerlendirme aşaması) araştırılır. Kısaltmalar: AVC = atriyoventriküler yastık; LAV = sol atriyoventriküler kanal; RAV = sağ atriyoventriküler kanal; RA = sağ kulakçık; LA = sol kulakçık; RV = sağ ventrikül; LV = sol ventrikül; SEN = subendokard; IVS = interventriküler septum; mikro-BT = mikrobilgisayarlı tomografi. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 2: HH21'de oluşturulan ve HH25'e kadar inkübe edilen sol atriyal ligasyon (LAL) modelinin tipik etkinliği. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video 1: Kuş embriyosunun hem dış hem de iç zarları çıkarılır. Daha sonra, mikro makas kullanılarak gösterildiği gibi sadece vitellin zarı çıkarılır. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video 2: Cımbız, sağ tarafı yukarı bakacak embriyonun dorsal segmentinin altına yerleştirilir ve sol atriyal tomurcuğunu ortaya çıkarmak için dikkatlice çevrilir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video 3: Sol atriyal tomurcuk etrafındaki zarlar yavaş yavaş temizlenir. Atriyum hafifçe genişler, bu da düğüm yerleştirmeyi ve bağlamayı mümkün kılar. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video 4: Yaklaşık 0.1-0.3 mm uzunluğunda bir dikiş embriyonun yakınına yerleştirilir ve iki cımbızla etrafı sıkılır. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video 5: Düğümün fazla dikiş uçları mikro makas kullanılarak dikkatlice kesilir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video 6: Embriyo yavaşça normal oryantasyonuna döndürülür. LAL tamamlandı. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

HLHS'de, yapısal kusurlar nedeniyle kan akışı değişir ve sol tarafta anormal morfolojiye yol açar 4,6. Mevcut model, HLHS'nin ilerlemesini daha iyi anlamak için pratik bir deneysel sistem sağlar ve hatta patogenezinitaklit edebilir 8. Bununla birlikte, klinik olarak tamamen eşdeğer bir HLHS hayvan modeli oluşturmak zorlu bir iştir. Burada sunulan kuş LAL modeline ek olarak, farelerde, fetal koyunlarda ve kurbağalarda yapılan son çalışmalar, HLHS prognozunun morfolojik, hemodinamik ve patofizyolojik özelliklerini çoğaltmaya çalışmıştır. Fare embriyolarında, mekanik yükleme, embriyonik günde (ED) 14.5'te (civciv embriyolarında yaklaşık HH40-41) fetal müdahale yoluyla LA'ya enjekte edilen bir embolize edici ajan aracılığıyla değiştirilir34. Pozitif embolize edilen fetüslerin toplam %48'i küçük LV'ler ve retrograd aort akımı ile gebeliğe kadar hayatta kaldı. Uzun gebelik süresi, erken zaman noktalarında müdahalelerde daha fazla zorluk ve zorlu fetal cerrahi bu modelin fizibilitesini sınırlayabilir. Fetal kuzu modellerinde LA'nın bir balon kateter35 aracılığıyla silikon kauçukla doldurulmasıyla LV hipoplazisi de taklit edildi. Bu büyük hayvan modelinde, LV hacmi yeterince azalır, ancak hayatta kalma süresi uzun değildir, bu da düşük hastalık penetrasyonuna neden olur. Alternatif bir müdahale yaklaşımı, tıkayıcı stentin foramen ovaleye yönlendirilmesi çok zor olmasına rağmen, fetal kuzu36'da denendiği gibi foramen ovaleyi perkütan transhepatik kateterizasyon yoluyla tıkamaktır. Genel olarak koyun modelleri, önceden var olan vasküler morfolojileri ve olumsuz pulmoner fizyolojileri nedeniyle çok zordur. Bu nedenle, mevsimsel üreme ihtiyacı, daha sonraki bir gebelik yaşı ve küçük örneklem büyüklüğü bu modeli daha da sınırlamaktadır. Son olarak, Xenopus embriyosu, tek bir ventriküle sahip üç odacıklı kalbine ve nöral krest hücre modellerindeki farklılıklara rağmen, insan kalp hastalığını37 taklit etmek için başka bir uygun model olarak tanıtıldı. Tam genom ile kurulmuş mikroenjeksiyon ve mikrocerrahi girişimlerin mevcudiyeti ve uzun sağkalım süresi de bu modeli çekici kılmaktadır.

Daha önceki çalışmalarda, ameliyat edilen 39 kuş embriyosundan altısının hastalık penetrasyonu LAL modelinde%15 olarak sunulmuştur 34. Bununla birlikte, erken aşamada incelediğimiz civciv embriyo modelinin (HH25 ve HH27'ye ulaşan) ortalama HLHS penetrasyonu% 66 idi (ameliyat edilen 18 kuş embriyosunun 12'si). Prof. Sedmera, embriyoların ortalama hayatta kalma süresinin HH40 (ED14)19 olabileceğini bildirdi. Bu ligasyonu düzenli olarak gerçekleştiren diğer gruplar, erken zaman noktalarında yüksek başarı oranları bildirmiştir (örneğin, HH29'a kadar %75, HH34'e kadar %50 ve HH38'e kadar %20)30. Ancak daha sonraki aşamalarda belirgin bir fenotip ortaya çıkar ve mortalite artar. Civciv embriyolarında hastalık penetrasyonu nispeten düşük olabilse de, bu modelin amacı, özellikle erken evrelerde prenatal HLHS'nin etiyolojisini ve patolojisini daha iyi incelemektir.

Erken evre civciv embriyosunun çok küçük olması nedeniyle, ameliyat öncesi ve sonrası LAL müdahalesi çeşitli komplikasyonlara yol açabilir. Kontaminasyonu önlemek için bir çare olarak, yumurta kabukları ve banklar% 70 etanol ile temizlenir ve prosedür boyunca eldiven kullanılabilir. LAL protokolündeki kritik bir adım, sol atriyal tomurcuk etrafındaki düğümün iyi bir şekilde oturmasını sağlamak için tüm perikardiyal membranın çıkarılmasıdır. Buna ek olarak, iki kişilik ekibin, özellikle protokol adımları sırasında ihtiyaç duyulan belirli bir beceri setinde eğitim ve uzmanlaşma konusunda son derece yararlı olduğunu gördük. Bu yaklaşım, prosedürü ve öğrenme eğrisini hızlandırır. Bu nedenle, kanama ve kontaminasyon riski ikincildir ve önerilen arkadaş sisteminin faydalarından daha ağır basar. Steril bir civciv zil solüsyonunda saklanan önceden hazırlanmış bir sütürün kullanılması tavsiye edilir. Ek olarak, sütürün düşük sıkılaştırma mukavemetinin korunması da daha yüksek embriyo verimi için kritik öneme sahiptir. HH21'de uygulanan atriyal tomurcuk üzerindeki daha sıkı düğümler, önceki çalışmalarda iyi tanımlanmış olan iletim, koroner ve sekonder miyomimari yeniden şekillenme kusurlarının klinik olarak kritik katılımını detaylandıramayan LV'nin erken başarısızlığına yol açabilir22. Özellikle, belirli adımlarda en ince ve kullanılmamış cımbız ve makasları ve diğerlerinde nispeten kör olanları kullanmak, kazara kanamayı azaltabilir. Son olarak, düğümün tamamlanmasından hemen sonra, embriyo hızlı bir şekilde orijinal konumuna döndürülmeli ve yumurta kabuğu penceresi, sıcaklığını ve nemini korumak için çift kat parafilm ile kapatılmalıdır. HH25'e ulaşan LAL modeli için tipik verim Tablo 2'de sunulmaktadır. Azalmış ventrikül boyutuna ek olarak, mitral / aort atrezisi gibi kapak malformasyonları da gelişebilir. Bu lezyonların şiddeti HLHS'de olduğu gibi ileri evrelerde morbiditeyi arttırmaktadır. Burada tartışılan zorluklar nedeniyle, konorunkal bantlama gibi civciv embriyolarında gerçekleştirilen diğer mekanik müdahalelerle karşılaştırıldığında, LAL modeli çok daha düşük verim seviyeleri ile sonuçlanır. Burada sunulan önlemlerle %50'lik bir verim elde edilebileceğine inanıyoruz.

Kuş embriyosu, morfolojik yapısı, büyüklüğü, düşük maliyeti, kültür kolaylığı ve manipülasyonu nedeniyle kardiyovasküler gelişimi araştırmak için ideal bir omurgalı hayvan modelidir38,39. Bu model aynı zamanda patojenlere karşı doğal koruma sağlar40. Aletli embriyolar, gelişmiş in vivo görüntüleme ve lokal siRNA manipülasyonunda kullanılabilir. Bu nedenle, insan ve tavuğun korunmuş gen bölgeleri, Sanger av tüfeği dizilimi ve fiziksel tabanlı haritalama39 yoluyla elde edilebilir ve bu da gelişmiş mekanosensitif çalışmalarayol açar 19. Ayrıca, Krejčí ve arkadaşları tarafından uygulanan mikroarray yaklaşımı, miyokardiyal yapıdaki hemodinamik değişikliklerin potansiyel geri dönüşümlülüğü ile ilgili başarıyı ölçmek için kullanılmıştır. Bu nedenle, sol ve sağ ventriküller arasında diferansiyel olarak eksprese edilen genlerin tanımlanması, geri dönüşü olmayan değişikliklerin başladığı ideal müdahale süresi için bir kriter olarak kullanılabilir33.

Sonuç olarak, civciv embriyo modelinde mikrocerrahi uygulamalar için gelecekteki potansiyel yönelimler, doku-hücre kültürü ve görüntüleme teknolojilerindeki ilerlemeleri destekleyen, spesifik matris genlerine ve moleküler sinyal yolaklarına odaklanan kardiyovasküler gen düzenleme tekniklerinin kullanımını içerir32.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Acknowledgments

Tübitak 2247A Baş Araştırmacı Ödülü 120C139'a fon sağlamayı kabul ediyoruz. Yazarlar ayrıca PakTavuk Gıda'ya da teşekkür eder. ve Tic. A.Ş., İstanbul, Türkiye, döl verimi sağlamak ve kardiyovasküler araştırmaları desteklemek için.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10-0 nylon surgical suture Ethicon
Elastica van Gieson staining kit Sigma-Aldrich 115974 For staining connective tissues in histological sections
Ethanol absolute Interlab 64-17-5 For the sterilization step, 70% ethanol was obtained by diluting absolute ethanol with distilled water.
Incubator KUHL, Flemington, New Jersey-U.S.A AZYSS600-110
Kimwipes Interlab 080.65.002
Microscissors World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL 555640S Vannas STR 82 mm
Parafilm M Sigma-Aldrich P7793-1EA Sealing stage for egg reincubation
Paraplast Bulk Leica Biosystems  39602012 Tissue embedding medium
Stereo Microscope Zeiss Stemi 508  Stemi 508 Used at station 1
Stereo Microscope Zeiss Stemi 2000-C Stemi 2000-C Used at station 2
Tweezer (Dumont 4 INOX #F4) Adumont & Fils, Switzerland Used to return the embryo
Tweezer (Super Fine Dumont #5SF)  World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL 501985 Used to remove the membranes on the embryo

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, T., et al. Congenital heart disease and risk of cardiovascular disease: A meta-analysis of cohort studies. Journal of the American Heart Association. 8 (10), e012030 (2019).
  2. Chaudhry, B., et al. The left ventricular myocardium in hypoplastic left heart syndrome. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (8), 279 (2022).
  3. Lashkarinia, S. S., Çoban, G., Ermek, E., Çelik, M., Pekkan, K. Spatiotemporal remodeling of embryonic aortic arch: stress distribution, microstructure, and vascular growth in silico. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 19 (5), 1897-1915 (2020).
  4. Ho, S., Chan, W. X., Yap, C. H. Fluid mechanics of the left atrial ligation chick embryonic model of hypoplastic left heart syndrome. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 20 (4), 1337-1351 (2021).
  5. Gordon, B. M., Rodriguez, S., Lee, M., Chang, R. K. Decreasing number of deaths of infants with hypoplastic left heart syndrome. The Journal of Pediatrics. 153 (3), 354-358 (2008).
  6. Salman, H. E., et al. Effect of left atrial ligation-driven altered inflow hemodynamics on embryonic heart development: clues for prenatal progression of hypoplastic left heart syndrome. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 20 (2), 733-750 (2021).
  7. Fruitman, D. S. Hypoplastic left heart syndrome: Prognosis and management options. Paediatrics & Child Health. 5 (4), 219-225 (2000).
  8. Rahman, A., Chaturvedi, R. R., Sled, J. G. Flow-mediated factors in the pathogenesis of hypoplastic left heart syndrome. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (5), 154 (2022).
  9. Henderson, D. J., Anderson, R. H. The development and structure of the ventricles in the human heart. Pediatric Cardiology. 30 (5), 588-596 (2009).
  10. Kowalski, W. J., Pekkan, K., Tinney, J. P., Keller, B. B. Investigating developmental cardiovascular biomechanics and the origins of congenital heart defects. Frontiers in Physiology. 5, 408 (2014).
  11. Midgett, M., Rugonyi, S. Congenital heart malformations induced by hemodynamic altering surgical interventions. Frontiers in Physiology. 5, 287 (2014).
  12. Kowalski, W. J., et al. Left atrial ligation alters intracardiac flow patterns and the biomechanical landscape in the chick embryo. Developmental Dynamics. 243 (5), 652-662 (2014).
  13. Bruneau, B. G. The developmental genetics of congenital heart disease. Nature. 451 (7181), 943-948 (2008).
  14. Sedmera, D., et al. Cellular changes in experimental left heart hypoplasia. The Anatomical Record. 267 (2), 137-145 (2002).
  15. Celik, M., et al. Microstructure of early embryonic aortic arch and its reversibility following mechanically altered hemodynamic load release. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 318 (5), H1208-H1218 (2020).
  16. Tobita, K., Schroder, E. A., Tinney, J. P., Garrison, J. B., Keller, B. B. Regional passive ventricular stress-strain relations during development of altered loads in chick embryo. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 282 (6), H2386-H2396 (2002).
  17. Alser, M., Shurbaji, S., Yalcin, H. C. Mechanosensitive pathways in heart development: findings from chick embryo studies. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 8 (4), 32 (2021).
  18. Alser, M., et al. Blood flow disturbance and morphological alterations following the right atrial ligation in the chick embryo. Frontiers in Physiology. 13, 849603 (2022).
  19. Sedmera, D. HLHS: Power of the chick model. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (4), 113 (2022).
  20. Rychter, Z., Rychterová, V., Lemez, L. Formation of the heart loop and proliferation structure of its wall as a base for ventricular septation. Herz. 4 (2), 86-90 (1979).
  21. Harh, J. Y., Paul, M. H., Gallen, W. J., Friedberg, D. Z., Kaplan, S. Experimental production of hypoplastic left heart syndrome in the chick embryo. The Americal Journal of Cardiology. 31 (1), 51-56 (1973).
  22. Sedmera, D., Pexieder, T., Rychterova, V., Hu, N., Clark, E. B. Remodeling of chick embryonic ventricular myoarchitecture under experimentally changed loading conditions. The Anatomical Record. 254 (2), 238-252 (1999).
  23. Karakaya, C., et al. Asymmetry in mechanosensitive gene expression during aortic arch morphogenesis. Scientific Reports. 8 (1), 16948 (2018).
  24. Trinidad, F., et al. Effect of blood flow on cardiac morphogenesis and formation of congenital heart defects. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (9), 303 (2022).
  25. Tobita, K., Keller, B. B. Right and left ventricular wall deformation patterns in normal and left heart hypoplasia chick embryos. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 279 (3), H959-H969 (2000).
  26. Bortecine, S., Merve Nur, C., Faruk, K., Kerem, P. Auxiliary humidifier system design and construction for research grade egg incubators. Zenodo. , (2023).
  27. Schroder, E. A., Tobita, K., Tinney, J. P., Foldes, J. K., Keller, B. B. Microtubule involvement in the adaptation to altered mechanical load in developing chick myocardium. Circulation Research. 91 (4), 353-359 (2002).
  28. Rufaihah, A. J., Chen, C. K., Yap, C. H., Mattar, C. N. Z. Mending a broken heart: In vitro, in vivo and in silico models of congenital heart disease. Disease Models & Mechanisms. 14 (3), (2021).
  29. Siddiqui, H. B., Dogru, S., Lashkarinia, S. S., Pekkan, K. Soft-tissue material properties and mechanogenetics during cardiovascular development. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (2), 64 (2022).
  30. Pesevski, Z., et al. Endocardial fibroelastosis is secondary to hemodynamic alterations in the chick embryonic model of hypoplastic left heart syndrome. Developmental Dynamics. 247 (3), 509-520 (2018).
  31. Hu, N., et al. Dependence of aortic arch morphogenesis on intracardiac blood flow in the left atrial ligated chick embryo. Anatomical Record. 292 (5), 652-660 (2009).
  32. Lashkarinia, S. S., et al. Myocardial biomechanics and the consequent differentially expressed genes of the left atrial ligation chick embryonic model of hypoplastic left heart syndrome. Annals of Biomedical Engineering. 51 (5), 1063-1078 (2023).
  33. Krejčí, E., et al. Microarray analysis of normal and abnormal chick ventricular myocardial development. Physiological Research. 61, S137-S144 (2012).
  34. Rahman, A., et al. A mouse model of hypoplastic left heart syndrome demonstrating left heart hypoplasia and retrograde aortic arch flow. Disease Models & Mechanisms. 14 (11), (2021).
  35. Fishman, N. H., Hof, R. B., Rudolph, A. M., Heymann, M. A. Models of congenital heart disease in fetal lambs. Circulation. 58 (2), 354-364 (1978).
  36. Wong, F. Y., et al. Induction of left ventricular hypoplasia by occluding the foramen ovale in the fetal lamb. Scientific Reports. 10 (1), 880 (2020).
  37. Nie, S. Use of frogs as a model to study the etiology of HLHS. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 10 (2), 51 (2023).
  38. Vilches-Moure, J. G. Embryonic chicken (Gallus gallus domesticus) as a model of cardiac biology and development. Comparative Medicine. 69 (3), 184-203 (2019).
  39. Kain, K. H., et al. The chick embryo as an expanding experimental model for cancer and cardiovascular research. Developmental Dynamics. 243 (2), 216-228 (2014).
  40. Sukparangsi, W., Thongphakdee, A., Intarapat, S. Avian embryonic culture: A perspective of in ovo to ex ovo and in vitro studies. Frontiers in Physiology. 13, 903491 (2022).

Tags

Sol Atriyal Ligasyon Kuş Embriyosu Değişmiş Hemodinamik Yükleme Erken Vasküler Gelişim Kardiyovasküler Gelişim Konjenital Kalp Defekti Mekanik Girişimler Sol Vitellin Ven Ligasyonu Konotrunkal Bantlama In Ovo LAL Hipoplastik Sol Kalp Sendromu HLHS Mikrocerrahi Operasyonlar Örnek Verimleri Patogenez Protokol
Erken Vasküler Gelişim Sırasında Değişen Hemodinamik Yükleme için Bir Model Olarak Kuş Embriyosunda Sol Atriyal Ligasyon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sevgin, B., Coban, M. N., Karatas,… More

Sevgin, B., Coban, M. N., Karatas, F., Pekkan, K. Left Atrial Ligation in the Avian Embryo as a Model for Altered Hemodynamic Loading During Early Vascular Development. J. Vis. Exp. (196), e65330, doi:10.3791/65330 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter