Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Venstre atriel ligering i fugleembryoet som model for ændret hæmodynamisk belastning under tidlig vaskulær udvikling

Published: June 16, 2023 doi: 10.3791/65330
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1,2
1Department of Biomedical Sciences and Engineering, Koc University, 2Department of Mechanical Engineering, Koc University
* These authors contributed equally

Summary

Her præsenterer vi en detaljeret visuel protokol til udførelse af venstre atriel ligation (LAL) model i fugleembryoet. LAL-modellen ændrer den intrakardiale strømning, som ændrer vægforskydningsspændingsbelastning, efterligner hypoplastisk venstre hjertesyndrom. En tilgang til at overvinde udfordringerne ved denne vanskelige mikrokirurgiske model præsenteres.

Abstract

På grund af sin firekammerede modne ventrikulære konfiguration, lette kultur, billeddannelsesadgang og effektivitet er fugleembryoet en foretrukken hvirveldyrmodel til undersøgelse af kardiovaskulær udvikling. Undersøgelser, der sigter mod at forstå den normale udvikling og medfødt hjertefejlprognose, vedtager i vid udstrækning denne model. Mikroskopiske kirurgiske teknikker introduceres for at ændre de normale mekaniske belastningsmønstre på et specifikt embryonalt tidspunkt og spore den nedstrøms molekylære og genetiske kaskade. De mest almindelige mekaniske indgreb er venstre vitelline veneligering, conotruncal banding og venstre atriel ligering (LAL), modulering af det intramurale vaskulære tryk og vægforskydningsspænding på grund af blodgennemstrømning. LAL, især hvis det udføres i ovo, er den mest udfordrende intervention med meget små prøveudbytter på grund af de ekstremt fine sekventielle mikrokirurgiske operationer. På trods af sin høje risiko er in ovo LAL meget værdifuld videnskabeligt, da det efterligner hypoplastisk venstre hjertesyndrom (HLHS) patogenese. HLHS er en klinisk relevant, kompleks medfødt hjertesygdom observeret hos nyfødte. En detaljeret protokol for in ovo LAL er dokumenteret i dette papir. Kort fortalt blev befrugtede fugleembryoner inkuberet ved 37,5 °C og 60% konstant fugtighed, typisk indtil de nåede Hamburger-Hamilton (HH) trin 20 til 21. Æggeskallerne blev revnet op, og de ydre og indre membraner blev fjernet. Embryoet blev forsigtigt drejet for at udsætte den venstre atriale pære i det fælles atrium. Formonterede mikroknuder fra 10-0 nylonsuturer blev forsigtigt placeret og bundet rundt om venstre atriefnop. Endelig blev embryoet returneret til sin oprindelige position, og LAL blev afsluttet. Normale og LAL-instrumenterede ventrikler viste statistisk signifikante forskelle i vævskomprimering. En effektiv LAL-modelgenereringspipeline vil bidrage til undersøgelser, der fokuserer på synkroniseret mekanisk og genetisk manipulation under embryonal udvikling af kardiovaskulære komponenter. Ligeledes vil denne model give en forstyrret cellekilde til vævskulturforskning og vaskulær biologi.

Introduction

Medfødte hjertefejl (CHD'er) er strukturelle lidelser, der opstår på grund af unormal embryonal udvikling1. Ud over genetiske tilstande påvirkes patogenesen af ændret mekanisk belastning 2,3. Hypoplastisk venstre hjertesyndrom (HLHS), en medfødt hjertesygdom, resulterer i en underudviklet ventrikel / aorta ved fødslen4 med en høj dødelighed 5,6. På trods af de seneste fremskridt i den kliniske styring er den vaskulære vækst og udviklingsdynamik i HLHS stadig uklar7. I normal embryonal udvikling stammer endokardiet i venstre ventrikel (LV) og myokardiet fra hjerteforfædre, efterhånden som dannelsen af det tidlige embryonale hjerte skrider frem. Den gradvise tilstedeværelse af myokardietrabekulation, fortykkelseslag og kardiomyocytproliferation rapporteres2. For HLHS observeres ændret trabekulær remodellering og fladning af venstre ventrikel, hvilket yderligere bidrager til myokardiehypoplasi på grund af unormal kardiomyocytmigration 2,8,9,10

Blandt de meget anvendte modelorganismer til at studere hjerteudvikling og forstå hæmodynamiske forhold 11 foretrækkes fugleembryoet på grund af dets modne hjerte med fire kamre og dets lette dyrkning11,12,13,14. På den anden side giver avanceret billeddannelse af zebrafiskembryoner og transgene / knockout-mus klare fordele11,12. Forskellige mekaniske indgreb er blevet testet for fugleembryoet, der ændrer det intramurale tryk og vægforskydningsspænding ved udvikling af kardiovaskulære komponenter. Disse modeller omfatter venstre vitelline ligation, conotruncal banding15 og venstre atriel ligation (LAL) 11,12,16. Den resulterende fænotype på grund af den ændrede mekaniske belastning kan observeres ca. 24-48 timer efter det kirurgiske indgreb i studier med fokus på tidlig prognose11,13. LAL-interventionen er en populær teknik til at indsnævre det funktionelle volumen af venstre atrium (LA) ved at placere en sutursløjfe omkring den atrioventrikulære åbning. Ligeledes er der også udført mikrokirurgiske indgreb, der er målrettet mod højre atriel ligering (RAL)17,18. På samme måde målretter nogle forskere det venstre atriale vedhæng (LAA) ved hjælp af mikroklip for at reducere volumenet af LA19,20. I nogle undersøgelser påføres en kirurgisk nylontråd på den atrioventrikulære knude19,21. Et af de anvendte indgreb er LAL, som kan efterligne HLHS, men som også er den sværeste model at udføre, med meget små prøveudbytter på grund af de ekstremt fine mikrokirurgiske operationer, der kræves. I vores laboratorium udføres LAL i ovo mellem Hamburger-Hamilton (HH) trin 20 og 21, før det fælles atrium er fuldt septat 6,14,22,23. En kirurgisk sutur er placeret omkring LA, som ændrer de intrakardiale blodgennemstrømningsstrømme. I LAL-modeller af HLHS observeres øget ventrikelvægsstivhed, ændrede myofibervinkler og nedsat LV-hulrumsstørrelse14,24.

I denne videoartikel gives en detaljeret protokol og tilgang til in ovo LAL. Kort fortalt blev de befrugtede fugleembryoner inkuberet til mikrokirurgi, æggeskallen blev revnet åben, og de ydre og indre membraner blev ryddet. Embryoet blev derefter langsomt roteret, så LA var tilgængeligt. En 10-0 nylonkirurgisk sutur blev bundet til atrieknoppen, og embryoet blev returneret til sin oprindelige orientering og afsluttede LAL-proceduren25. LAL og normale ventrikler sammenlignes for vævskomprimering og ventrikelvolumen via optisk kohærenstomografi og grundlæggende histologi.

En succesfuldt udført LAL-modelpipeline, som beskrevet her, vil bidrage til grundlæggende studier med fokus på embryonal udvikling af kardiovaskulære komponenter. Denne model kan også bruges sammen med genetiske manipulationer og avancerede billeddannelsesmetoder. Ligeledes er den akutte LAL-model en stabil kilde til syge vaskulære celler til vævskulturforsøg.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Frugtbare hvide leghorn æg fås fra pålidelige leverandører og inkuberes i henhold til universitetets godkendte retningslinjer. Chick embryoner, stadier 18 (dag 3) til 24 (dag 4) (stadierne præsenteret i denne artikel) betragtes ikke som levende hvirveldyr i henhold til Den Europæiske Unions (EU) direktiv 2010/63 / EU og retningslinjerne fra Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) i USA. Chick embryoner betragtes som "levende dyr" efter dag 19 af inkubation i henhold til amerikansk lovgivning, men ikke for EU. Hvert æg er mærket med rugestartdatoen og er planlagt til at klække senest den 10. inkubationsdag. Efter æggene lukker, fjernes kyllingerne fra inkubatoren. Protokollen udføres i to stationære driftsstationer (Station 1 og Station 2) med fokus på specialiserede modelgenereringsfaser.

1. Forberedelse før mikrokirurgi

  1. Få befrugtede æg enten fra et vaccineudviklingscenter med en specifik patogenfri (SPF) klasse eller gennem en betroet kommerciel leverandørgård af en skrøbelig leveringskurer i tørre polystyrenbeholdere. Før inkubation skal du forsigtigt rengøre æggeskallen med fnugfri klude gennemblødt i 70% ethanol for at fjerne forurening.
  2. Kriterier for inklusion/udelukkelse af embryoner
    1. Inkuber ikke æg, der blev revnet eller beskadiget under transport.
    2. Hvis der ses blødning under LAL-proceduren eller efter reinkubation, må embryoet ikke anvendes.
    3. Brug ikke embryoner, der udvikler sig i venstre side-opad-position, da hæmodynamisk blodgennemstrømning kan afvige fra normal orientering.
    4. Dıscard-embryoner udvikler sig med medfødte defekter i både præ- og postkirurgiske procedurer.
    5. Inkluder embryoner, der når det målrettede stadium, der udvikler sig på deres oprindelige placering, efterligner HLHS som en LAL-model.
  3. De befrugtede hvidhornede kyllingæg (Gallus gallus domesticus L.), stump ende, inkuberes til det ønskede stadium, typisk ved HH20-2115 (37,5 °C, 60% fugtighed, 3,5 dage) (figur 1).
    BEMÆRK: Det er vigtigt at holde æggene ved en konstant temperatur og fugtighed for at øge udbyttet. Afhængigt af inkubatormodellen vil tilsætningen af en pande fyldt med destilleret vand opretholde stabil fugtighed. Blueprints af et ekstra / ekstra temperatur- og fugtighedskontrolsystem, der passer til de fleste inkubatorer, er udviklet af forfatterne og anbefales. Elektronik, hardware og kodedetaljer for denne internt byggede sensor/styreenhed findes i et datalager26. Kontinuerlig forsigtig omrystning (rotation) af æggene under inkubation kan muliggøre optimal placering af embryoet og dermed føre til en højere procentdel af "funktionsdygtige" embryoner. Rystelse kan også arbejde med inkubatorer med denne kapacitet og øge produktiviteten yderligere.
  4. Før du starter proceduren, skal du forberede det nødvendige antal knuder ved at binde en løs overhåndsknude i en 1,5 cm lang 10-0 sutur. Sørg for, at knuden ikke er stram og er stor nok til let at passe over atrierne under operationen (figur 2).
    BEMÆRK: Bind knuderne på forhånd og opbevar dem i en steril kyllingeringopløsning inden brug. Knudebindingsoperationen kræver brug af to hænder til at betjene pincetten synkront. Da dette er et kritisk stadium i protokollen, kan en model af atriumet laves af kitt til at øve dette trin (figur 3). Dette vil forbedre de tredimensionelle mikrokirurgiske færdigheder, der er nødvendige for at udføre trin 3.2.3 på station 2 (figur 4).

2. Drift på station 1 (figur 4A)

  1. Åbn et vindue fra den stumpe ende af ægget, og fjern både den ydre og den indre membran15 (figur 5A-D).
  2. Åbn æggeskallen ved at revne forsigtigt med pincettens bagende, med de frie fingre fast støtte til ægget for at reducere uønsket revneformering.
  3. Da LAL er en lang procedure, skal du bevare embryoets temperatur og fugtighed, da hjertefrekvensen afhænger af temperaturen. Sørg således for, at det oprindelige shell-vindue oprettes så lille som muligt, lige nok til at udføre operationerne.
    BEMÆRK: Der anvendes ingen fugtigheds- eller temperaturkontrolsystemer under driften, men disse systemer, hvis de er tilgængelige, vil gavne udbyttet. Hvis det er muligt, lukkes klimaanlægget i laboratoriet, og proceduren udføres ved den højest mulige stuetemperatur (RT). Optimering af den embryonale hjertefrekvens, som kan styres af temperaturen, under operationen anbefales også. Nogle laboratorier opretholder pulsen ved lidt lavere hastigheder end 120 bpm via temperaturregulering under LAL-operationen. Som sådan vil fugtighedskontrol, der anvendes omkring den kirurgiske zone, øge udbyttet yderligere. Æggeskalsvinduerne er skabt så små som muligt, lige store nok til at give kirurgisk adgang. Dette gælder også for den tykke ydre membran, som typisk kun er mindre end æggeskallen i omfanget af embryoets omkreds. Disse sikrer at opretholde embryoets temperatur og fugtighed. Mens du åbner et vindue fra den stumpe ende af ægget, rengøres de små skalfragmenter, så disse stykker ikke beskadiger vitellinens vaskulære integritet eller fører til uønskede artefakter. Derudover bruger andre laboratorier buet mikroserrated saks til fremstilling af vinduer. To bredder af skotsk tape kan også bruges til at stabilisere æggeskallen for at kontrollere revner.
  4. Fjern kun den nødvendige vitellinmembran ved hjælp af en mikrosaks (supplerende video 1).
  5. Normal embryonal udvikling er højre side opad. Når embryoet er fri for vitellinmembranen, anbringes pincetten med lukkede spidser under embryonets dorsale segment, og embryoet vendes forsigtigt, så venstre side (dvs. konfigurationen med venstre side opad) (figur 6A, B; Supplerende video 2).
  6. Sørg for, at venstre atrieknop nu er blottet, men stadig dækket af et komplekst membransystem, der typisk består af et dobbeltlag af hjertesækken.
  7. Fjern membranerne, inklusive de fine, umiddelbart omkring atrieknoppen. Dette er en anden kritisk fase; Udfør membranfjernelse fra grove membraner og fremskridt til de fine omkring venstre atrieknopp. Reserver den fineste pincet til fjernelse af finmembranen (supplerende video 3).
  8. Under membranfjernelsesprocessen orienteres embryoet i venstre side opad, så knudeplaceringsoperationen i trin 3.2 kan udføres uden yderligere omplacering. For at opnå dette skal du løfte embryoet ved hjælp af membranerne i trin 2.6 og hænge det fra æggeskallen og sikre, at venstre side vender opad.
    BEMÆRK: Nogle embryoner kan placeres tæt på æggeskallens periferi og kan være udfordrende at betjene. Alligevel vil disse embryoner højst sandsynligt være orienteret højre side op og vise normal adfærd og kan indgå i undersøgelsen. I disse tilfælde kan det skjulte atrium, hvis det er nødvendigt, gøres mere tilgængeligt ved forsigtigt at rengøre perikardiemembranen med #4 fine pincetter og fjerne æggeskallen i modsat retning (mod skalåbningen). Disse embryoner kan også løftes ved hjælp af dele af de ekstraembryonale membraner og fastgøres i den ønskede position ved at fastgøre den ene ende af membranen (pincetenden) til æggeskallen ved hjælp af dens naturlige klæbrighed. Derudover kan mellemrummet mellem embryoets hoved- og rygmarvsregion udvides ved hjælp af pincet for at afsløre det skjulte atrium.

3. Drift på station 2 (figur 4B)

  1. Under stereomikroskopet anbringes den forberedte knude fra trin 1.4 tæt på embryoet på et tilgængeligt sted (figur 6B). Atrieknoppen er nu klar til at blive bundet af (supplerende video 4).
  2. Hent den forberedte åbne knude og orienter den over venstre atrieknopp. For at LAL skal fungere, skal du placere ægget i en unik tilbøjelig tredimensionel orientering.
    1. Orienter knuden korrekt for at udføre tilspændingsprocessen uden at beskadige embryonerne.
    2. Fjern de fine membraner optimalt i trin 2.7 for at reducere effekten af et hjertebankende hjerte.
    3. Stram suturen (figur 6C). Til dette trin er det meget nyttigt at øve med kittet. For falske embryoner skal du stramme knuden lige nok til at holde knuden.
  3. Brug derefter mikrosaksen til at skære de overskydende ender af suturen så tæt som muligt på knoppen (supplerende video 5).
  4. Vær meget forsigtig med, at de nyskårne ender af den bundne sutur ikke er i stand til at punktere nærliggende kar under rotation eller på grund af hjerteslag.
  5. Brug pincetten til at fjerne de overskydende suturstykker, der er skåret væk i trin 3.3.
  6. Til sidst skal embryoet ved hjælp af en lukket pincet bringes tilbage til sin oprindelige position som i trin 2.5 (supplerende video 6).
  7. Efter afslutningen af LAL-processen skal du dække ægget med et dobbelt lag parafilm og inkubere det igen. En tæt og steril lukning af æggene er altafgørende for overlevelse, især efter 24 timers inkubation. Hvis der også ønskes visuel adgang, skal du bruge paraffinvoks med glasskinner.
    BEMÆRK: Da den tidlige embryonale periode undersøges, inkuberes æggene typisk i 24-48 timer, indtil de når ca. HH25 eller HH27. Der er dog ingen grænse, og senere stadier kan studeres, som forsøgt af andre forskere. For hurtige driftshastigheder anbefales mindst et to-personers team. En person skal trænes til og er ansvarlig for ægåbning, indledende membranoprydning, rotation og membranoprydning omkring venstre atrieknopp. Den anden person er kun ansvarlig for indledende knudeforberedelse, knudeplacering og stramning. Den endelige embryorotation kan udføres af person 1. Den kirurgiske operation for et enkelt embryo tager ca. 4-5 min.
  8. Før / efter kirurgiske operationer rengøres bordoverfladerne og instrumenterne med ethanol. Sørg for at anvende frisk kyllingeringeopløsning (NaCl, KCl,CaCl2 og NaHCO3)16,27 på metalinstrumenterne, der berører det embryonale væv.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Avancerede tidsopløste billeddannelsesteknikker kan anvendes til at observere de strukturelle og morfologiske ændringer på grund af LAL-intervention10. Desuden er LAL-prøver også modtagelige for molekylære og biologiske metoder 19,28. I tabel 1 gives stikprøveundersøgelser, der anvendte LAL-modelresultater. I denne sammenhæng blev LAL-intervention udført i kyllingembryoner, der nåede HH20-21. Både kontrol (sund) og LAL hjerter blev fjernet fra embryoet ved HH25-26. Derefter blev prøverne fikseret i 4% paraformaldehyd (PFA) ved 4 °C 6,15. De fjernede hjerteprøver blev derefter dehydreret i ethanolopløsninger med stigende koncentrationer (70%, 96% og 100%) i 1 time hver. Endelig blev prøverne opbevaret i xylen ved RT i 0,5 timer, og paraffinindlejring blev udført før sektionering ved en tykkelse på 10 μm. De prøver, der blev overført til glasrutschebanen, blev farvet med Elastica van Gieson-plet. Sektionerne blev undersøgt under et stereomikroskop, hvor ventriklens tværgående diameter blev målt. Vi udførte også en tredimensionel ikke-invasiv metode, optisk kohærenstomografiscanning (OCT), i nogle prøver11,29. Både kontrol- og LAL-hjerter ved HH25-26 blev udskåret, og deres tværlumendiametre blev målt under OCT.

Resultaterne viste, at for LAL opnås en mere kompakt myokardiestruktur med signifikante morfologiske ændringer sammenlignet med normal udvikling (figur 7). Derudover observeres aflejringen af ekstracellulære matrixkomponenter, såsom kollagen, omkring hjerteinterstitiumet, der ligner myokardiefibrose svarende til HLHS30. For bedre at forstå myokardiefortykkelse og trabekulær komprimering blev morfometriske porøsitetsmålinger udført i både kontrol- og LAL-prøver. Som forventet resulterede LAL-interventionen i et mindre venstre ventrikelhulrum og trabekulær komprimering ved at stramme de intertrabekulære fordybninger. Disse resultater bekræfter hypotesen om, at LAL ændrer den sunde ventrikulære arkitektur og omorienterer det trabekulære aspekt22. Ligeledes resulterede LAL-modellen ved HH29 i et forstørret højre ventrikelhulrum, ændret trabekulær arkitektur og myokardievolumen24.

For at understøtte resultaterne opnået i denne undersøgelse blev OCT-billeddannelse brugt til at måle ventrikulært lumentværareal og aksial længde (figur 8). LAL viste en signifikant reduktion i venstre ventrikels størrelse og diameter sammenlignet med kontrolgruppen. Mens kun ventriklerne er fokuseret her, rapporteres LAL's indflydelse på udviklingen af aortabuenogså 31. En nylig undersøgelse, vi bidrog til, rapporterede i 3D, at myokardiestammerne i midten af væggen blev øget i begge ventrikler efter LAL ved HH2532. Derudover udviste LAL-grupper en stigning i vægtykkelse sammenlignet med kontrolgrupper ved HH25. Denne undersøgelse er i overensstemmelse med den tidligere undersøgelse af Tobita et al.25, som viste en signifikant stigning i peak systoliske epikardiale perifere stammer i LAL LV ved HH27.

Figure 1
Figur 1: Inkubationssystem for embryonal vækst. Befrugtede hvide leghorn kyllingæg (Gallus gallus) blev inkuberet i en inkubator ved konstant fugtighed (60%) og temperatur (37,5 ° C). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Forberedelse af LAL-knuden. Flere knuder ~ 0,5-1 mm i diameter og 1-2 cm lange stykker blev fremstillet ved hjælp af 10-0 nylonkirurgiske suturer. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Kopi af det embryonale venstre atrium lavet af kitt. En kopi af venstre atriale sektion oprettes for at træne og øve knudeorientering og knudelukningstrin ved hjælp af to pincet. Dette gjorde det muligt for os at lave mange forsøg og perfektionere disse trin, før vi implementerede denne færdighed i selve embryoet. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Forberedelse af stationen . (A,B) Alle materialer og opløsninger til mikrokirurgi blev placeret i det rene område for station 1 og station 2. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Åbning af et vindue fra den stumpe ende af ægget og fjernelse af både ydre og indre membraner. (A,B) Et lille vindue blev åbnet ved hjælp af mikrokirurgiske instrumenter på æggeskallen og inklusive hele embryoet i HH20-21. (C) Fragmenter af æggeskallen blev fjernet i det første krakningstrin. (D,E) Ekstraembryonale membraner blev også dissekeret under mikroskopet. (F) Efter LAL-processen var afsluttet, blev ægget dækket med et dobbelt lag parafilm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Et øjebliksbillede af in ovo venstre atriel ligation (LAL) kirurgi. A) Rygbillede af kyllingens embryon i normal retning. Den embryonale ventrikel, der når HH20-21, har et primitivt fælles atrium (a), ventrikel (v) og udstrømningskanalen (ot). (B) Der vises et nærbillede af det spejlvendte embryon med venstre side opad og knudens placering. (C) LA med suturknuden. Forkortelser: LA = venstre atrium; AA = aortabuen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 7
Figur 7: Fjernelse og undersøgelse af kontrol- og LAL-hjerter. Både (A) kontrol- og (B) LAL-hjerter, der nåede HH25-26-stadiet, blev fjernet fra embryoet og undersøgt under et stereomikroskop. Søjlediagrammet viser forskellene i tværgående hjertediameter mellem LAL-gruppen og kontrolgruppen og den gennemsnitlige ± standardafvigelse (SD) på mindst fire replikater. Skalastang = 100 μM. Histologisk undersøgelse af hjertevæv i (C) kontrol- og (D) LAL-prøver ved hjælp af Elastica van Gieson-farvningsteknikken. Søjlediagrammet viser forskellene i porøsitet (%) for at vise myokardiekompression mellem LAL og kontrolgruppen og den gennemsnitlige ± SD for mindst to replikater. **p < 0,01. GraphPad Prism version 9.5.1 blev brugt til statistisk analyse. Skalabjælke = 50 μM. Forkortelser: LAL = venstre atriel ligation; LA = venstre atrium; RA = højre atrium; RV = højre ventrikel; LV = venstre ventrikel. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 8
Figur 8: Optisk kohærenstomografi. Både (A) kontrol og (B) LAL-hjerter, der nåede HH25-26, blev undersøgt af OCT. (C,D) Størrelsen og længden af ventriklernes lumenkryds er angivet i henholdsvis paneler (C) og (D). Histogrammerne repræsenterer den gennemsnitlige ± SD med mindst tre gentagelser. *p < 0,05; **p < 0,01; GraphPad Prism version 9.5.1 blev brugt til statistisk analyse. Skalabjælke = 100 μM. Forkortelser: LAL = venstre atriel ligation; RV = højre ventrikel; LV = venstre ventrikel. Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 1: En gennemgang af forskningsundersøgelser, der anvender venstre atrieligation (LAL) model i fugleembryoner 6,10,12,14,22,24,27,30,32,33.
I næsten alle papirer er LA bundet til HH21. Effekten af LAL undersøges på senere HH-stadier (vurderingsstadiet). Forkortelser: AVC = atrioventrikulær pude; LAV = venstre atrioventrikulær kanal; RAV = højre atrioventrikulær kanal; RA = højre atria; LA = venstre atria; RV = højre ventrikel; LV = venstre ventrikel; SEN = subendokardium; IVS = interventrikulær septum; mikro-CT = mikrocomputertomografi. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 2: Typisk effekt af venstre atriel ligation (LAL) model oprettet ved HH21 og inkuberet indtil HH25. Klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende video 1: Både fugleembryoets ydre og indre membraner fjernes. Derefter fjernes kun vitellinmembranen, som vist ved hjælp af mikrosaks. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende video 2: Pincet placeres under det dorsale segment af højre side-up embryo og vendes forsigtigt for at blotte sin venstre atriale knopp. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende video 3: Membranerne omkring venstre atrieknop ryddes gradvist. Atriet udvider sig lidt, hvilket muliggør knudeplacering og binding. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende video 4: En ca. 0,1-0,3 mm lang sutur placeres nær embryoet og strammes omkring det ved hjælp af to pincetter. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende video 5: Knudens overskydende suturender skæres omhyggeligt med en mikrosaks. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende video 6: Embryoet vender forsigtigt tilbage til sin normale retning. LAL er afsluttet. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I HLHS ændres blodgennemstrømningen på grund af strukturelle defekter, hvilket fører til unormal morfologi på venstre side 4,6. Den nuværende model giver et praktisk eksperimentelt system til bedre at forstå udviklingen af HLHS og kan endda efterligne dets patogenese8. Det er imidlertid en udfordrende opgave at etablere en fuldt klinisk ækvivalent HLHS-dyremodel. Ud over den fugle-LAL-model, der præsenteres her, har nylige undersøgelser hos mus, føtale får og frøer forsøgt at replikere de morfologiske, hæmodynamiske og patofysiologiske træk ved HLHS-prognosen. I museembryoner ændres mekanisk belastning via et emboliseringsmiddel, der injiceres i LA gennem en føtal intervention på embryonal dag (ED) 14,5 (ca. HH40-41 i kyllingembryoner)34. I alt 48% af fostre, der blev positivt emboliseret, overlevede til drægtighed med små LV'er og retrograd aortastrøm. Den lange drægtighedsperiode, yderligere udfordringer i interventioner på tidlige tidspunkter og udfordrende føtal kirurgi kan begrænse gennemførligheden af denne model. LV-hypoplasi blev også efterlignet i føtallammodellerne ved at fylde LA med silikonegummi gennem et ballonkateter35. I denne store dyremodel reduceres LV-volumenet tilstrækkeligt, men overlevelsestiden er ikke lang, hvilket resulterer i lav sygdomspenetration. En alternativ interventionsmetode er at okkludere foramen ovale via perkutan transhepatisk kateterisering, som forsøgt i føtal lam36, selvom det er meget udfordrende at dirigere den okklusive stent til foramen ovale. Fåremodeller generelt er meget udfordrende på grund af deres allerede eksisterende vaskulære morfologier og negative lungefysiologi. Som sådan begrænser behovet for sæsonbestemt avl, en senere drægtighedsalder og lille prøvestørrelse yderligere denne model. Endelig introduceres Xenopus-embryoet også som en anden bekvem model til efterligning af menneskelig hjertesygdom37, på trods af dets trekammerhjerte med en enkelt ventrikel og forskelle i neurale kamcellemønstre. Tilgængeligheden af fuldt genom-etablerede mikroinjektioner og mikrokirurgiske indgreb og den lange overlevelsestid gør også denne model attraktiv.

I tidligere undersøgelser blev sygdomspenetrationen hos seks ud af 39 opererede fugleembryoner præsenteret som 15 % i LAL-model34. Den gennemsnitlige HLHS-penetration af kyllingembryomodellen, som vi undersøgte på det tidlige stadium (nåede HH25 og HH27), var imidlertid 66% (12 ud af 18 opererede fugleembryoner). Professor Sedmera rapporterede, at den gennemsnitlige overlevelsestid for embryoner kunne være HH40 (ED14)19. Andre grupper, der regelmæssigt udfører denne ligering, har rapporteret høje succesrater på tidlige tidspunkter (f.eks. 75% indtil HH29, 50% indtil HH34 og 20% indtil HH38)30. Men i senere stadier opstår en tydelig fænotype, og dødeligheden stiger. Selvom sygdomspenetration kan være relativt lav i kyllingembryoner, er målet med denne model bedre at undersøge ætiologien og patologien af prænatal HLHS, især i de tidlige stadier.

På grund af den meget lille størrelse af det tidlige stadium af kyllingembryoet kan præ- og postoperativ LAL-intervention føre til flere komplikationer. Som et middel mod forurening rengøres æggeskaller og bænke med 70% ethanol, og handsker kan bruges under hele proceduren. Et kritisk trin i LAL-protokollen er fjernelsen af hele perikardiemembranen for at muliggøre en god pasform af knuden omkring venstre atrieknopp. Derudover har vi fundet to-personers teamet yderst nyttigt, især i træning og specialisering i et specifikt færdighedssæt, der er nødvendigt under protokoltrinnene. Denne tilgang fremskynder proceduren og dens indlæringskurve. Som sådan er risikoen for blødning og kontaminering sekundær og opvejer fordelene ved det foreslåede buddy-system. Det anbefales at anvende en forberedt sutur opbevaret i en steril kyllingeringopløsning. Derudover er opretholdelse af en lav stramningsstyrke af suturen også kritisk for højere embryoudbytte. Strammere knuder på atrieknoppen, der anvendes i HH21, kan føre til for tidlig svigt af LV, der ikke er i stand til at uddybe det klinisk kritiske engagement af lednings-, koronar- og sekundær myoarkitektur-remodelleringsdefekter, som er blevet godt beskrevet i tidligere undersøgelser22. Specifikt kan brug af den fineste og ubrugte pincet og saks på visse trin og relativt stump på andre reducere utilsigtet blødning. Endelig, umiddelbart efter afslutningen af knuden, skal embryoet hurtigt vendes til sin oprindelige position, og æggeskalsvinduet skal lukkes med et dobbelt lag parafilm for at bevare dets temperatur og fugtighed. Det typiske udbytte for LAL-modellen, der når HH25, er vist i tabel 2. Ud over den nedsatte ventrikulære størrelse kan valvulære misdannelser også udvikle sig, såsom mitral / aortaatresi. Sværhedsgraden af disse læsioner øger sygeligheden i de senere stadier, som i HLHS. På grund af de udfordringer, der diskuteres her, sammenlignet med andre mekaniske indgreb udført i kyllingembryoner, såsom conotruncal banding, resulterer LAL-modellen i meget lavere udbytteniveauer. Vi mener, gennem de forholdsregler, der præsenteres her, er et udbytte på 50% opnåeligt.

Fugleembryoet er en ideel hvirveldyrmodel til forskning i kardiovaskulær udvikling på grund af dens morfologiske struktur, størrelse, lave omkostninger, lette kultur og manipulation38,39. Denne model giver også naturlig beskyttelse mod patogener40. Instrumenterede embryoner kan anvendes til avanceret in vivo-billeddannelse og lokal siRNA-manipulation. Som sådan er konserverede genregioner hos mennesker og kyllinger tilgængelige gennem Sanger-haglgeværsekventering og fysisk baseret kortlægning39, hvilket fører til avancerede mekanofølsomme undersøgelser19. Desuden er microarray-tilgangen, der anvendes af Krejčí et al., blevet brugt til at måle succesen med hensyn til den potentielle reversibilitet af hæmodynamiske ændringer i myokardiestrukturen. Således kan identifikationen af gener, der udtrykkes forskelligt mellem venstre og højre ventrikler, anvendes som et kriterium for den ideelle interventionsperiode, når irreversible ændringer begynder33.

Afslutningsvis omfatter potentielle fremtidige retninger for mikrokirurgiske anvendelser i kyllingembryomodellen brugen af kardiovaskulære genredigeringsteknikker med fokus på specifikke matrixgener og molekylære signalveje, der understøtter fremskridt inden for vævscellekultur og billeddannelsesteknologier32.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi anerkender Tubitak 2247A lead researcher award 120C139, der yder finansiering. Forfatterne vil også gerne takke PakTavuk Gıda. A. S., Istanbul, Tyrkiet, for at levere frugtbare æg og støtte den kardiovaskulære forskning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10-0 nylon surgical suture Ethicon
Elastica van Gieson staining kit Sigma-Aldrich 115974 For staining connective tissues in histological sections
Ethanol absolute Interlab 64-17-5 For the sterilization step, 70% ethanol was obtained by diluting absolute ethanol with distilled water.
Incubator KUHL, Flemington, New Jersey-U.S.A AZYSS600-110
Kimwipes Interlab 080.65.002
Microscissors World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL 555640S Vannas STR 82 mm
Parafilm M Sigma-Aldrich P7793-1EA Sealing stage for egg reincubation
Paraplast Bulk Leica Biosystems  39602012 Tissue embedding medium
Stereo Microscope Zeiss Stemi 508  Stemi 508 Used at station 1
Stereo Microscope Zeiss Stemi 2000-C Stemi 2000-C Used at station 2
Tweezer (Dumont 4 INOX #F4) Adumont & Fils, Switzerland Used to return the embryo
Tweezer (Super Fine Dumont #5SF)  World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL 501985 Used to remove the membranes on the embryo

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, T., et al. Congenital heart disease and risk of cardiovascular disease: A meta-analysis of cohort studies. Journal of the American Heart Association. 8 (10), e012030 (2019).
  2. Chaudhry, B., et al. The left ventricular myocardium in hypoplastic left heart syndrome. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (8), 279 (2022).
  3. Lashkarinia, S. S., Çoban, G., Ermek, E., Çelik, M., Pekkan, K. Spatiotemporal remodeling of embryonic aortic arch: stress distribution, microstructure, and vascular growth in silico. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 19 (5), 1897-1915 (2020).
  4. Ho, S., Chan, W. X., Yap, C. H. Fluid mechanics of the left atrial ligation chick embryonic model of hypoplastic left heart syndrome. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 20 (4), 1337-1351 (2021).
  5. Gordon, B. M., Rodriguez, S., Lee, M., Chang, R. K. Decreasing number of deaths of infants with hypoplastic left heart syndrome. The Journal of Pediatrics. 153 (3), 354-358 (2008).
  6. Salman, H. E., et al. Effect of left atrial ligation-driven altered inflow hemodynamics on embryonic heart development: clues for prenatal progression of hypoplastic left heart syndrome. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 20 (2), 733-750 (2021).
  7. Fruitman, D. S. Hypoplastic left heart syndrome: Prognosis and management options. Paediatrics & Child Health. 5 (4), 219-225 (2000).
  8. Rahman, A., Chaturvedi, R. R., Sled, J. G. Flow-mediated factors in the pathogenesis of hypoplastic left heart syndrome. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (5), 154 (2022).
  9. Henderson, D. J., Anderson, R. H. The development and structure of the ventricles in the human heart. Pediatric Cardiology. 30 (5), 588-596 (2009).
  10. Kowalski, W. J., Pekkan, K., Tinney, J. P., Keller, B. B. Investigating developmental cardiovascular biomechanics and the origins of congenital heart defects. Frontiers in Physiology. 5, 408 (2014).
  11. Midgett, M., Rugonyi, S. Congenital heart malformations induced by hemodynamic altering surgical interventions. Frontiers in Physiology. 5, 287 (2014).
  12. Kowalski, W. J., et al. Left atrial ligation alters intracardiac flow patterns and the biomechanical landscape in the chick embryo. Developmental Dynamics. 243 (5), 652-662 (2014).
  13. Bruneau, B. G. The developmental genetics of congenital heart disease. Nature. 451 (7181), 943-948 (2008).
  14. Sedmera, D., et al. Cellular changes in experimental left heart hypoplasia. The Anatomical Record. 267 (2), 137-145 (2002).
  15. Celik, M., et al. Microstructure of early embryonic aortic arch and its reversibility following mechanically altered hemodynamic load release. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 318 (5), H1208-H1218 (2020).
  16. Tobita, K., Schroder, E. A., Tinney, J. P., Garrison, J. B., Keller, B. B. Regional passive ventricular stress-strain relations during development of altered loads in chick embryo. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 282 (6), H2386-H2396 (2002).
  17. Alser, M., Shurbaji, S., Yalcin, H. C. Mechanosensitive pathways in heart development: findings from chick embryo studies. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 8 (4), 32 (2021).
  18. Alser, M., et al. Blood flow disturbance and morphological alterations following the right atrial ligation in the chick embryo. Frontiers in Physiology. 13, 849603 (2022).
  19. Sedmera, D. HLHS: Power of the chick model. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (4), 113 (2022).
  20. Rychter, Z., Rychterová, V., Lemez, L. Formation of the heart loop and proliferation structure of its wall as a base for ventricular septation. Herz. 4 (2), 86-90 (1979).
  21. Harh, J. Y., Paul, M. H., Gallen, W. J., Friedberg, D. Z., Kaplan, S. Experimental production of hypoplastic left heart syndrome in the chick embryo. The Americal Journal of Cardiology. 31 (1), 51-56 (1973).
  22. Sedmera, D., Pexieder, T., Rychterova, V., Hu, N., Clark, E. B. Remodeling of chick embryonic ventricular myoarchitecture under experimentally changed loading conditions. The Anatomical Record. 254 (2), 238-252 (1999).
  23. Karakaya, C., et al. Asymmetry in mechanosensitive gene expression during aortic arch morphogenesis. Scientific Reports. 8 (1), 16948 (2018).
  24. Trinidad, F., et al. Effect of blood flow on cardiac morphogenesis and formation of congenital heart defects. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (9), 303 (2022).
  25. Tobita, K., Keller, B. B. Right and left ventricular wall deformation patterns in normal and left heart hypoplasia chick embryos. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 279 (3), H959-H969 (2000).
  26. Bortecine, S., Merve Nur, C., Faruk, K., Kerem, P. Auxiliary humidifier system design and construction for research grade egg incubators. Zenodo. , (2023).
  27. Schroder, E. A., Tobita, K., Tinney, J. P., Foldes, J. K., Keller, B. B. Microtubule involvement in the adaptation to altered mechanical load in developing chick myocardium. Circulation Research. 91 (4), 353-359 (2002).
  28. Rufaihah, A. J., Chen, C. K., Yap, C. H., Mattar, C. N. Z. Mending a broken heart: In vitro, in vivo and in silico models of congenital heart disease. Disease Models & Mechanisms. 14 (3), (2021).
  29. Siddiqui, H. B., Dogru, S., Lashkarinia, S. S., Pekkan, K. Soft-tissue material properties and mechanogenetics during cardiovascular development. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (2), 64 (2022).
  30. Pesevski, Z., et al. Endocardial fibroelastosis is secondary to hemodynamic alterations in the chick embryonic model of hypoplastic left heart syndrome. Developmental Dynamics. 247 (3), 509-520 (2018).
  31. Hu, N., et al. Dependence of aortic arch morphogenesis on intracardiac blood flow in the left atrial ligated chick embryo. Anatomical Record. 292 (5), 652-660 (2009).
  32. Lashkarinia, S. S., et al. Myocardial biomechanics and the consequent differentially expressed genes of the left atrial ligation chick embryonic model of hypoplastic left heart syndrome. Annals of Biomedical Engineering. 51 (5), 1063-1078 (2023).
  33. Krejčí, E., et al. Microarray analysis of normal and abnormal chick ventricular myocardial development. Physiological Research. 61, S137-S144 (2012).
  34. Rahman, A., et al. A mouse model of hypoplastic left heart syndrome demonstrating left heart hypoplasia and retrograde aortic arch flow. Disease Models & Mechanisms. 14 (11), (2021).
  35. Fishman, N. H., Hof, R. B., Rudolph, A. M., Heymann, M. A. Models of congenital heart disease in fetal lambs. Circulation. 58 (2), 354-364 (1978).
  36. Wong, F. Y., et al. Induction of left ventricular hypoplasia by occluding the foramen ovale in the fetal lamb. Scientific Reports. 10 (1), 880 (2020).
  37. Nie, S. Use of frogs as a model to study the etiology of HLHS. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 10 (2), 51 (2023).
  38. Vilches-Moure, J. G. Embryonic chicken (Gallus gallus domesticus) as a model of cardiac biology and development. Comparative Medicine. 69 (3), 184-203 (2019).
  39. Kain, K. H., et al. The chick embryo as an expanding experimental model for cancer and cardiovascular research. Developmental Dynamics. 243 (2), 216-228 (2014).
  40. Sukparangsi, W., Thongphakdee, A., Intarapat, S. Avian embryonic culture: A perspective of in ovo to ex ovo and in vitro studies. Frontiers in Physiology. 13, 903491 (2022).

Tags

Venstre atriel ligering fugleembryo ændret hæmodynamisk belastning tidlig vaskulær udvikling kardiovaskulær udvikling medfødt hjertefejl mekaniske indgreb venstre vitelline veneligering conotruncal banding i Ovo LAL hypoplastisk venstre hjertesyndrom HLHS mikrokirurgiske operationer prøveudbytter patogenese protokol
Venstre atriel ligering i fugleembryoet som model for ændret hæmodynamisk belastning under tidlig vaskulær udvikling
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sevgin, B., Coban, M. N., Karatas,… More

Sevgin, B., Coban, M. N., Karatas, F., Pekkan, K. Left Atrial Ligation in the Avian Embryo as a Model for Altered Hemodynamic Loading During Early Vascular Development. J. Vis. Exp. (196), e65330, doi:10.3791/65330 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter