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Developmental Biology

La ligature auriculaire gauche chez l’embryon aviaire comme modèle de modification de la charge hémodynamique au cours du développement vasculaire précoce

Published: June 16, 2023 doi: 10.3791/65330
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1,2
1Department of Biomedical Sciences and Engineering, Koc University, 2Department of Mechanical Engineering, Koc University
* These authors contributed equally

Summary

Nous présentons ici un protocole visuel détaillé pour l’exécution du modèle de ligature auriculaire gauche (LAL) dans l’embryon aviaire. Le modèle LAL modifie le flux intracardiaque, ce qui modifie la charge de contrainte de cisaillement de la paroi, imitant le syndrome hypoplasique du cœur gauche. Une approche pour surmonter les défis de ce modèle difficile de microchirurgie est présentée.

Abstract

En raison de sa configuration ventriculaire mature à quatre chambres, de sa facilité de culture, de son accès à l’imagerie et de son efficacité, l’embryon aviaire est un modèle animal vertébré privilégié pour étudier le développement cardiovasculaire. Les études visant à comprendre le développement normal et le pronostic des malformations cardiaques congénitales adoptent largement ce modèle. Des techniques chirurgicales microscopiques sont introduites pour modifier les schémas de charge mécanique normaux à un moment embryonnaire spécifique et suivre la cascade moléculaire et génétique en aval. Les interventions mécaniques les plus courantes sont la ligature de la veine vitelline gauche, la pose de bandes conotruncales et la ligature auriculaire gauche (LAL), modulant la pression vasculaire intra-muros et la contrainte de cisaillement de la paroi due au flux sanguin. La LAL, en particulier si elle est réalisée in ovo, est l’intervention la plus difficile, avec des rendements d’échantillons très faibles en raison des opérations microchirurgicales séquentielles extrêmement fines. Malgré son risque élevé, l’in ovo LAL est très précieux scientifiquement car il imite la pathogenèse du syndrome hypoplasique du cœur gauche (HLHS). Le SHLH est une cardiopathie congénitale complexe cliniquement pertinente observée chez les nouveau-nés humains. Un protocole détaillé pour la LAL in ovo est documenté dans cet article. Brièvement, les embryons aviaires fécondés ont été incubés à 37,5 °C et à 60 % d’humidité constante, généralement jusqu’à ce qu’ils atteignent les stades 20 à 21 de Hamburger-Hamilton (HH). Les coquilles d’œufs ont été ouvertes et les membranes externe et interne ont été retirées. L’embryon a été doucement tourné pour exposer le bulbe auriculaire gauche de l’oreillette commune. Des micro-nœuds pré-assemblés à partir de sutures en nylon 10-0 ont été délicatement positionnés et attachés autour du bourgeon auriculaire gauche. Finalement, l’embryon a été remis dans sa position d’origine et la LAL a été complétée. Les ventricules normaux et instrumentés par LAL ont montré des différences statistiquement significatives dans le compactage des tissus. Un pipeline efficace de génération de modèles LAL contribuerait à des études axées sur les manipulations mécaniques et génétiques synchronisées au cours du développement embryonnaire des composants cardiovasculaires. De même, ce modèle fournira une source de cellules perturbées pour la recherche sur la culture tissulaire et la biologie vasculaire.

Introduction

Les cardiopathies congénitales (CHD) sont des troubles structurels qui surviennent en raison d’un développement embryonnaire anormal1. En plus des conditions génétiques, la pathogenèse est influencée par une altération de la charge mécanique 2,3. Le syndrome hypoplasique du cœur gauche (HLHS), une cardiopathie congénitale, se traduit par un ventricule ou une aorte sous-développés à la naissance4 avec un taux de mortalité élevé 5,6. Malgré les progrès récents dans sa prise en charge clinique, la dynamique de croissance et de développement vasculaire du HLHS n’est toujours pas claire7. Au cours du développement embryonnaire normal, l’endocarde et le myocarde du ventricule gauche (VG) proviennent de progéniteurs cardiaques au fur et à mesure que la formation embryonnaire précoce du tube cardiaque progresse. La présence progressive d’une trabéculation myocardique, de couches d’épaississement et d’une prolifération des cardiomyocytes est rapportée2. Dans le cas du SHHS, une altération du remodelage trabéculaire et un aplatissement du ventricule gauche sont observés, ce qui contribue davantage à l’hypoplasie myocardique due à une migration anormale des cardiomyocytes 2,8,9,10

Parmi les organismes modèles largement utilisés pour étudier le développement du cœur et comprendre les conditions hémodynamiques 11, l’embryon aviaire est préféré en raison de son cœur mature à quatre chambres et de sa facilité de culture11,12,13,14. D’autre part, l’accès avancé à l’imagerie des embryons de poisson-zèbre et des souris transgéniques/knock-out offre des avantages distincts11,12. Diverses interventions mécaniques ont été testées pour l’embryon aviaire qui modifient la pression intra-muros et la contrainte de cisaillement de la paroi dans le développement des composants cardiovasculaires. Ces modèles comprennent la ligature vitelline gauche, la ligature conotruncale15 et la ligature auriculaire gauche (LAL)11,12,16. Le phénotype résultant de l’altération de la charge mécanique peut être observé environ 24 à 48 h après l’intervention chirurgicale dans les études axées sur le pronostic précoce11,13. L’intervention LAL est une technique populaire pour rétrécir le volume fonctionnel de l’oreillette gauche (LA) en plaçant une boucle de suture autour de l’ouverture auriculo-ventriculaire. De même, des interventions microchirurgicales ont également été réalisées pour cibler la ligature auriculaire droite (RAL)17,18. De même, certains chercheurs ciblent l’appendice auriculaire gauche (LAA) à l’aide de micro-clips pour réduire le volume du LA19,20. Dans certaines études, un fil de nylon chirurgical est appliqué sur le nœud auriculo-ventriculaire19,21. L’une des interventions utilisées est le LAL, qui peut imiter le HLHS mais qui est aussi le modèle le plus difficile à réaliser, avec des rendements d’échantillons très faibles en raison des opérations microchirurgicales extrêmement fines requises. Dans notre laboratoire, la LAL est réalisée in ovo entre les stades 20 et 21 de Hamburger-Hamilton (HH), avant que l’oreillette commune ne soit complètement cloisonnée 6,14,22,23. Une suture chirurgicale est placée autour de l’AL, ce qui modifie les flux sanguins intracardiaques. Dans les modèles LAL de HLHS, on observe une augmentation de la rigidité de la paroi ventriculaire, une modification des angles des myofibres et une diminution de la taille de la cavité VG14,24.

Dans cet article vidéo, un protocole et une approche détaillés pour la LAL in ovo sont fournis. Brièvement, les embryons aviaires fécondés ont été incubés pour la microchirurgie, la coquille de l’œuf a été ouverte et les membranes externe et interne ont été dégagées. L’embryon a ensuite été lentement tourné afin que le LA soit accessible. Une suture chirurgicale en nylon 10-0 a été attachée au bourgeon auriculaire et l’embryon a été ramené à son orientation initiale, complétant ainsi la procédure LAL25. Les ventricules LAL et normaux sont comparés pour la compaction tissulaire et le volume du ventricule par tomographie par cohérence optique et histologie de base.

Un pipeline de modèles LAL exécuté avec succès, tel que décrit ici, contribuera à des études fondamentales axées sur le développement embryonnaire des composants cardiovasculaires. Ce modèle peut également être utilisé avec des manipulations génétiques et des modalités d’imagerie avancées. De même, le modèle LAL aiguë est une source stable de cellules vasculaires malades pour les expériences de culture tissulaire.

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Protocol

Les œufs blancs fertiles de Livourne sont obtenus auprès de fournisseurs de confiance et incubés selon les directives approuvées par l’université. Les embryons de poussins des stades 18 (jour 3) à 24 (jour 4) (les stades présentés dans cet article) ne sont pas considérés comme des animaux vertébrés vivants par la directive 2010/63/UE de l’Union européenne (UE) et les lignes directrices de l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) aux États-Unis. Les embryons de poussins sont considérés comme des « animaux vivants » après le 19e jour d’incubation selon les lois américaines, mais pas pour l’UE. Chaque œuf est étiqueté avec la date de début de l’éclosion et l’éclosion est prévue au plus tard le 10ejour d’incubation. Après l’éclosion des œufs, les poussins sont retirés de l’incubateur. Le protocole est exécuté dans deux stations d’exploitation de paillasse (Station 1 et Station 2), en se concentrant sur des étapes spécialisées de génération de modèles.

1. Préparation avant la microchirurgie

  1. Procurez-vous des ovules fécondés soit auprès d’un centre de développement de vaccins avec un grade SPF (Specific Pathogen-Free), soit par l’intermédiaire d’une ferme de fournisseurs commerciaux de confiance par un coursier fragile dans des conteneurs secs en polystyrène. Avant l’incubation, nettoyez délicatement la coquille d’œuf avec des lingettes non pelucheuses imbibées d’éthanol à 70 % pour éliminer toute contamination.
  2. Critères d’inclusion/exclusion des embryons
    1. N’incubez pas les œufs qui ont été fissurés ou endommagés pendant le transport.
    2. Si des saignements sont constatés pendant la procédure LAL ou après la réincubation, n’utilisez pas l’embryon.
    3. N’utilisez pas d’embryons se développant en position côté gauche, car le flux sanguin hémodynamique peut différer de l’orientation normale.
    4. Embryons de Dıscard se développant avec des malformations congénitales lors d’interventions pré et post-chirurgicales.
    5. Inclure les embryons qui atteignent le stade ciblé de développement à leur emplacement d’origine, en imitant HLHS comme modèle LAL.
  3. Incuber les œufs fécondés de Leghorn (Gallus gallus domesticus L.), extrémité émoussée, jusqu’au stade désiré, généralement à HH20-2115 (37,5 °C, 60 % d’humidité, 3,5 jours) (figure 1).
    REMARQUE : Il est important de garder les œufs à une température et une humidité constantes pour augmenter le rendement. Selon le modèle d’incubateur, l’ajout d’une casserole remplie d’eau distillée permettra de maintenir une humidité stable. Les plans d’un système de contrôle de la température et de l’humidité supplémentaire/auxiliaire qui conviendrait à la plupart des incubateurs sont élaborés par les auteurs et recommandés. L’électronique, le matériel et les détails du code de cette unité de capteur/contrôle construite en interne sont fournis dans un référentiel de données26. Une légère agitation continue (rotation) des œufs pendant l’incubation peut permettre un positionnement optimal de l’embryon et ainsi conduire à un pourcentage plus élevé d’embryons « opérables ». L’agitation peut également fonctionner avec des incubateurs de cette capacité et augmenter encore la productivité.
  4. Avant de commencer la procédure, préparez le nombre de nœuds requis en faisant un nœud plat lâche dans une suture 10-0 de 1,5 cm de long. Assurez-vous que le nœud n’est pas serré et qu’il est suffisamment grand pour s’adapter facilement aux oreillettes pendant l’opération (Figure 2).
    REMARQUE : Attachez les nœuds à l’avance et conservez-les dans une solution stérile de sonnerie de poussin avant utilisation. L’opération de nouage nécessite l’utilisation des deux mains pour actionner la pince à épiler de manière synchrone. Comme il s’agit d’une étape critique du protocole, un modèle de l’oreillette peut être fabriqué à partir de mastic pour pratiquer cette étape (Figure 3). Cela permettra d’améliorer les compétences en microchirurgie tridimensionnelle nécessaires pour effectuer l’étape 3.2.3 à la station 2 (Figure 4).

2. Opérations à la station 1 (figure 4A)

  1. Ouvrez une fenêtre à partir de l’extrémité émoussée de l’œuf et retirez les membranes externe et interne15 (figure 5A-D).
  2. Ouvrez la coquille de l’œuf en la fendant doucement avec l’extrémité arrière de la pince à épiler, avec les doigts libres soutenant fermement l’œuf pour réduire la propagation indésirable des fissures.
  3. Étant donné que la LAL est une procédure longue, conservez la température et l’humidité de l’embryon, car la fréquence cardiaque dépend de la température. Ainsi, assurez-vous que la fenêtre shell initiale est créée aussi petite que possible, juste assez pour exécuter les opérations.
    REMARQUE : Aucun système de contrôle de l’humidité ou de la température n’est utilisé pendant l’exploitation, mais ces systèmes, s’ils sont disponibles, seraient bénéfiques pour le rendement. Si possible, le système de climatisation du laboratoire est arrêté et la procédure est effectuée à la température ambiante (RT) la plus élevée possible. L’optimisation de la fréquence cardiaque embryonnaire, qui peut être contrôlée par la température, pendant l’opération est également recommandée. Certains laboratoires maintiennent la fréquence cardiaque à des fréquences légèrement inférieures à 120 bpm via le contrôle de la température pendant l’opération LAL. En tant que tel, le contrôle de l’humidité utilisé autour de la zone chirurgicale augmenterait encore le rendement. Les fenêtres en coquille d’œuf sont créées aussi petites que possible, juste assez grandes pour permettre l’accès chirurgical. Cela s’applique également à la membrane externe épaisse, qui n’est généralement plus petite que la coquille de l’œuf que dans la mesure de la circonférence de l’embryon. Ceux-ci assurent le maintien de la température et de l’humidité de l’embryon. Lors de l’ouverture d’une fenêtre à partir de l’extrémité émoussée de l’œuf, les petits fragments de coquille sont nettoyés afin que ces morceaux n’endommagent pas l’intégrité vasculaire vitelline ou n’entraînent pas d’artefacts indésirables. De plus, d’autres laboratoires utilisent des ciseaux micro-dentelés incurvés pour fabriquer des fenêtres. De plus, deux largeurs de ruban adhésif peuvent être utilisées pour stabiliser la coquille d’œuf afin de contrôler la fissuration.
  4. Retirez uniquement la membrane vitelline nécessaire à l’aide de micro-ciseaux (vidéo supplémentaire 1).
  5. Le développement embryonnaire normal se fait à l’endroit. Une fois que l’embryon est libéré de la membrane vitelline, placez la pince à épiler à pointes fermées sous le segment dorsal de l’embryon et retournez doucement l’embryon pour exposer le côté gauche (c.-à-d. la configuration côté gauche vers le haut) (Figure 6A,B ; Vidéo supplémentaire 2).
  6. Assurez-vous que le bourgeon auriculaire gauche est maintenant exposé mais toujours recouvert d’un système membranaire complexe, généralement constitué d’une double couche de péricarde.
  7. Retirez les membranes, y compris les plus fines, immédiatement autour du bourgeon auriculaire. Il s’agit d’une autre étape cruciale ; Effectuez l’élimination de la membrane des membranes grossières et progressez vers les membranes fines autour du bourgeon auriculaire gauche. Réserver la pince à épiler la plus fine pour retirer la fine membrane (vidéo supplémentaire 3).
  8. Pendant le processus d’ablation de la membrane, orientez l’embryon dans une position à l’endroit gauche, de sorte que l’opération de pose du nœud à l’étape 3.2 puisse être effectuée sans autre repositionnement. Pour ce faire, soulevez l’embryon à l’aide des membranes de l’étape 2.6 et suspendez-le à la coquille de l’œuf, en veillant à ce que le côté gauche soit orienté vers le haut.
    REMARQUE : Certains embryons peuvent être situés près de la périphérie de la coquille d’œuf et peuvent être difficiles à utiliser. Néanmoins, ces embryons seront très probablement orientés à l’endroit et afficheront un comportement normal, et pourront être inclus dans l’étude. Dans ces cas, si nécessaire, l’oreillette obscurcie peut être rendue plus accessible en nettoyant doucement la membrane péricardique avec une pince à épiler fine #4 et en retirant la coquille d’œuf dans le sens inverse (vers l’ouverture de la coquille). Ces embryons peuvent également être soulevés à l’aide de parties des membranes extraembryonnaires et fixés à la position souhaitée en attachant une extrémité de la membrane (l’extrémité de la pince à épiler) à la coquille de l’œuf, en utilisant son adhérence naturelle. De plus, l’espace entre la tête et la moelle épinière de l’embryon peut être élargi à l’aide d’une pince à épiler pour révéler l’oreillette obscurcie.

3. Opérations à la station 2 (figure 4B)

  1. Sous le stéréomicroscope, placez le nœud préparé à l’avance de l’étape 1.4 près de l’embryon à un endroit accessible (Figure 6B). Le bourgeon auriculaire est maintenant prêt à être attaché (vidéo supplémentaire 4).
  2. Récupérez le nœud ouvert préparé à l’avance et orientez-le sur le bourgeon auriculaire gauche. Pour que le LAL fonctionne, placez l’œuf dans une orientation tridimensionnelle inclinée de manière unique.
    1. Orienter correctement le nœud pour exécuter le processus de serrage sans endommager les embryons.
    2. Éliminez les membranes fines de manière optimale à l’étape 2.7 pour réduire l’effet d’un cœur qui bat.
    3. Serrez la suture (Figure 6C). Pour cette étape, s’entraîner avec le mastic est très utile. Pour les embryons fictifs, serrez le nœud juste assez pour maintenir le nœud.
  3. Ensuite, utilisez les micro-ciseaux pour couper les extrémités excédentaires de la suture le plus près possible du bourgeon (vidéo supplémentaire 5).
  4. Faites très attention à ce que les extrémités nouvellement coupées de la suture attachée ne soient pas en mesure de perforer les vaisseaux voisins pendant la rotation ou en raison des battements cardiaques.
  5. À l’aide de la pince à épiler, retirez les morceaux de suture en excès coupés à l’étape 3.3.
  6. Enfin, à l’aide d’une pince à épiler fermée, remettez l’embryon dans sa position initiale, comme à l’étape 2.5 (vidéo supplémentaire 6).
  7. Après avoir terminé le processus LAL, recouvrez l’œuf d’une double couche de parafilm et incubez-le à nouveau. Une fermeture hermétique et stérile des œufs est primordiale pour la survie, en particulier après 24 heures d’incubation. Si vous souhaitez également un accès visuel, utilisez de la cire de paraffine avec des lames de verre.
    REMARQUE : Comme la période embryonnaire précoce est étudiée, les œufs sont généralement incubés pendant 24 à 48 h jusqu’à ce qu’ils atteignent environ HH25 ou HH27. Cependant, il n’y a pas de limite, et les stades ultérieurs peuvent être étudiés, comme le tentent d’autres chercheurs. Pour des vitesses de fonctionnement rapides, il est recommandé d’avoir au moins deux personnes en équipe. Une personne doit être formée et est responsable de l’ouverture de l’œuf, du nettoyage initial de la membrane, de la rotation et du nettoyage de la membrane autour du bourgeon auriculaire gauche. L’autre personne n’est responsable que de la préparation initiale du nœud, de la mise en place du nœud et du serrage. La rotation finale de l’embryon peut être effectuée par la personne 1. L’opération chirurgicale d’un seul embryon dure environ 4 à 5 minutes.
  8. Avant et après les interventions chirurgicales, nettoyez les surfaces de paillasse et les instruments avec de l’éthanol. Assurez-vous d’appliquer une solution fraîche de sonnerie de poussin (NaCl, KCl, CaCl2 et NaHCO3)16,27 sur les instruments métalliques en contact avec les tissus embryonnaires.

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Representative Results

Des techniques avancées d’imagerie résolue en temps peuvent être utilisées pour observer les changements structurels et morphologiques dus à l’intervention LAL10. De plus, les échantillons de LAL se prêtent également à des méthodes moléculaires et biologiques19,28. Le tableau 1 présente des exemples d’études qui ont utilisé les résultats du modèle LAL. Dans ce contexte, l’intervention LAL a été réalisée sur des embryons de poussins qui ont atteint HH20-21. Les cœurs témoins (sains) et LAL ont été retirés de l’embryon à HH25-26. Ensuite, les échantillons ont été fixés dans du paraformaldéhyde (PFA) à 4 % à 4 °C 6,15. Les échantillons cardiaques prélevés ont ensuite été déshydratés dans des solutions d’éthanol à des concentrations croissantes (70 %, 96 % et 100 %) pendant 1 h chacun. Enfin, les échantillons ont été conservés dans du xylène à RT pendant 0,5 h, et l’enrobage de paraffine a été effectué avant la coupe à une épaisseur de 10 μm. Les échantillons transférés sur la lame de verre ont été colorés avec une coloration Elastica van Gieson. Les coupes ont été examinées au stéréomicroscope, où le diamètre transversal du ventricule a été mesuré. Nous avons également réalisé une méthode tridimensionnelle non invasive, la tomographie par cohérence optique (OCT), dans certains échantillons11,29. Les cœurs témoins et LAL à HH25-26 ont été excisés, et leurs diamètres de lumière croisée ont été mesurés sous OCT.

Les résultats ont montré que pour la LAL, une structure myocardique plus compacte est obtenue avec des changements morphologiques significatifs par rapport au développement normal (Figure 7). De plus, le dépôt de composants de la matrice extracellulaire, tels que le collagène, est observé autour de l’interstitium cardiaque, ressemblant à une fibrose myocardique similaire au HLHS30. Pour mieux comprendre l’épaississement myocardique et le compactage trabéculaire, des mesures morphométriques de porosité ont été effectuées dans des échantillons témoins et LAL. Comme on pouvait s’y attendre, l’intervention LAL a entraîné une réduction de la cavité ventriculaire gauche et un compactage trabéculaire en resserrant les cavités intertrabéculaires. Ces résultats confirment l’hypothèse selon laquelle la LAL altère l’architecture ventriculaire saine et réoriente la face trabéculaire22. De même, le modèle LAL à HH29 a entraîné une hypertrophie de la cavité ventriculaire droite, une altération de l’architecture trabéculaire et du volume myocardique24.

Pour étayer les résultats obtenus dans cette étude, l’imagerie OCT a été utilisée pour mesurer la surface transversale de la lumière ventriculaire et la longueur axiale (Figure 8). LAL a montré une réduction significative de la taille et du diamètre du ventricule gauche par rapport au témoin. Bien que seuls les ventricules soient ciblés ici, l’influence de la LAL sur le développement de l’arc aortique est également rapportée31. Une étude récente à laquelle nous avons contribué a rapporté en 3D que les tensions myocardiques de la paroi médiane étaient augmentées dans les deux ventricules après LAL à HH2532. De plus, les groupes LAL ont montré une augmentation de l’épaisseur de paroi par rapport aux groupes témoins à HH25. Cette étude est cohérente avec l’étude précédente de Tobita et al.25, qui a démontré une augmentation significative des tensions circonférentielles épicardiques systoliques maximales dans le LAL LV à HH27.

Figure 1
Figure 1 : Système d’incubation pour la croissance embryonnaire. Les œufs de poule de Leghorn (Gallus gallus) blancs fécondés ont été incubés dans un incubateur à une humidité (60 %) et à une température (37,5 °C) constantes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Préparation du noeud LAL. Plusieurs nœuds de ~0,5 à 1 mm de diamètre et des morceaux de 1 à 2 cm de long ont été préparés à l’aide de sutures chirurgicales en nylon 10-0. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Réplique de l’oreillette gauche embryonnaire en mastic. Une réplique de la section auriculaire gauche est créée pour entraîner et pratiquer les étapes d’orientation et de fermeture des nœuds à l’aide de deux pinces à épiler. Cela nous a permis de faire de nombreux essais et de perfectionner ces étapes avant de mettre en œuvre cette compétence dans l’embryon réel. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Préparation de la station. (A,B) Tous les matériaux et solutions pour la microchirurgie ont été placés dans la zone propre des stations 1 et 2. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Ouverture d’une fenêtre à partir de l’extrémité émoussée de l’œuf et retrait des membranes externe et interne. (A,B) Une petite fenêtre a été ouverte à l’aide d’instruments microchirurgicaux sur la coquille de l’œuf et incluant l’embryon entier dans HH20-21. (C) Des fragments de la coquille d’œuf ont été enlevés lors de la première étape de fissuration. (D,E) Des membranes extraembryonnaires ont également été disséquées au microscope. (F) Une fois le processus LAL terminé, l’œuf a été recouvert d’une double couche de parafilm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Instantané de la ligature auriculaire gauche in ovo (LAL). (A) Vue dorsale de l’embryon de poussin dans son orientation normale. Le ventricule embryonnaire atteignant HH20-21 a une oreillette commune primitive (a), un ventricule (v) et la voie d’écoulement (ot). (B) Une vue dorsale rapprochée de l’embryon retourné, à l’envers vers la gauche, et de l’emplacement du nœud est affichée. (C) LA avec le noeud de suture. Abréviations : LA = oreillette gauche ; AA = arc aortique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : Retrait et examen des cœurs témoins et LAL. Les cœurs (A) témoins et (B) LAL qui ont atteint le stade HH25-26 ont été retirés de l’embryon et examinés au stéréomicroscope. Le graphique à barres montre les différences de diamètre transversal du cœur entre le groupe LAL et le groupe témoin, ainsi que l’écart-type moyen ± (ET) d’au moins quatre répétitions. Barre d’échelle = 100 μM. Examen histologique des tissus cardiaques dans des échantillons (C) témoins et (D) LAL à l’aide de la technique de coloration Elastica van Gieson. Le graphique à barres montre les différences de porosité (%) pour montrer la compression myocardique entre le LAL et le groupe témoin, et le ± SD moyen d’au moins deux répétitions. **p < 0,01. La version 9.5.1 de GraphPad Prism a été utilisée pour l’analyse statistique. Barre d’échelle = 50 μM. Abréviations : LAL = ligature auriculaire gauche ; LA = oreillette gauche ; RA = oreillette droite ; RV = ventricule droit ; LV = ventricule gauche. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 8
Figure 8 : Tomographie par cohérence optique. Les cœurs témoins (A) et (B) LAL atteignant HH25-26 ont été examinés par OCT. (C,D) La taille et la longueur de la croix de lumière des ventricules sont indiquées dans les panneaux (C) et (D), respectivement. Les histogrammes représentent la moyenne ±écart-type avec au moins trois répétitions. *p < 0,05 ; **p < 0,01 ; La version 9.5.1 de GraphPad Prism a été utilisée pour l’analyse statistique. Barre d’échelle = 100 μM. Abréviations : LAL = ligature auriculaire gauche ; RV = ventricule droit ; LV = ventricule gauche. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Revue des études de recherche qui utilisent le modèle de ligature auriculaire gauche (LAL) chez les embryons aviaires 6,10,12,14,22,24,27,30,32,33.
Dans presque tous les journaux, le LA est à égalité à HH21. L’effet de la LAL est étudié aux stades ultérieurs de l’HH (phase d’évaluation). Abréviations : AVC = coussin auriculo-ventriculaire ; LAV = canal auriculo-ventriculaire gauche ; RAV = canal auriculo-ventriculaire droit ; RA = oreillettes droites ; LA = oreillettes gauches ; RV = ventricule droit ; VG = ventricule gauche ; SEN = sous-endocarde ; IVS = septum interventriculaire ; micro-TDM = microtomodensitométrie. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 2 : Efficacité typique du modèle de ligature auriculaire gauche (LAL) créé à HH21 et incubé jusqu’à HH25. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Vidéo supplémentaire 1 : Les membranes externe et interne de l’embryon aviaire sont enlevées. Ensuite, seule la membrane vitelline est retirée, comme indiqué à l’aide de micro-ciseaux. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Vidéo supplémentaire 2 : Une pince à épiler est placée sous le segment dorsal de l’embryon à l’endroit et soigneusement retournée pour exposer son bourgeon auriculaire gauche. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Vidéo supplémentaire 3 : Les membranes autour du bourgeon auriculaire gauche sont progressivement dégagées. L’oreillette se dilate légèrement, ce qui permet de placer et de nouer des nœuds. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Vidéo supplémentaire 4 : Une suture d’environ 0,1 à 0,3 mm de long est positionnée près de l’embryon et serrée autour de celui-ci à l’aide de deux pinces à épiler. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Vidéo supplémentaire 5 : Les extrémités de suture excédentaires du nœud sont soigneusement coupées à l’aide de micro-ciseaux. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Vidéo supplémentaire 6 : L’embryon est doucement ramené à son orientation normale. LAL est terminé. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

Dans le HLHS, le flux sanguin est altéré en raison de défauts structurels, conduisant à une morphologie anormale du côté gauche 4,6. Le présent modèle fournit un système expérimental pratique pour mieux comprendre la progression du HLHS et peut même imiter sa pathogenèse8. Cependant, l’établissement d’un modèle animal HLHS entièrement équivalent sur le plan clinique est une tâche difficile. En plus du modèle LAL aviaire présenté ici, des études récentes chez la souris, le fœtus de mouton et la grenouille ont tenté de reproduire les caractéristiques morphologiques, hémodynamiques et physiopathologiques du pronostic HLHS. Chez les embryons de souris, la charge mécanique est modifiée par un agent embolisant injecté dans l’AL lors d’une intervention fœtale au jour embryonnaire (DE) 14,5 (environ HH40-41 chez les embryons de poussins)34. Au total, 48 % des fœtus embolisés positivement ont survécu à la gestation avec de petits VG et un flux aortique rétrograde. La longue période de gestation, les défis supplémentaires dans les interventions à des moments précoces et la chirurgie fœtale difficile peuvent limiter la faisabilité de ce modèle. L’hypoplasie VG a également été imitée dans les modèles d’agneau fœtal en remplissant le LA avec du caoutchouc de silicone à l’aide d’un cathéter à ballonnet35. Dans ce modèle animal de grande taille, le volume du VG est suffisamment réduit, mais le temps de survie n’est pas long, ce qui entraîne une faible pénétration de la maladie. Une autre approche d’intervention consiste à occlure le foramen ovale par cathétérisme transhépatique percutané, comme on l’a tenté chez l’agneau fœtal36, même s’il est très difficile de diriger l’endoprothèse occlusive vers le foramen ovale. Les modèles moutons en général sont très difficiles en raison de leurs morphologies vasculaires préexistantes et de leur physiologie pulmonaire défavorable. En tant que tel, la nécessité d’une reproduction saisonnière, un âge gestationnel plus tardif et la petite taille de l’échantillon limitent davantage ce modèle. Enfin, l’embryon Xénope est également présenté comme un autre modèle pratique pour imiter les maladies cardiaques humaines37, malgré son cœur à trois chambres avec un seul ventricule et des différences dans les modèles de cellules de la crête neurale. La disponibilité d’interventions de micro-injection et de microchirurgie entièrement établies sur le génome et la longue durée de survie rendent également ce modèle attrayant.

Dans des études antérieures, le taux de pénétration de la maladie de six des 39 embryons aviaires opérés était de 15 % dans le modèle LAL34. Cependant, la pénétration moyenne du HLHS dans le modèle d’embryon de poussin que nous avons examiné au stade précoce (atteignant HH25 et HH27) était de 66% (12 des 18 embryons aviaires opérés). Le professeur Sedmera a rapporté que la durée moyenne de survie des embryons pourrait être de HH40 (ED14)19. D’autres groupes pratiquant régulièrement cette ligature ont signalé des taux de réussite élevés à des moments précoces (par exemple, 75 % jusqu’à HH29, 50 % jusqu’à HH34 et 20 % jusqu’à HH38)30. Cependant, à des stades plus avancés, un phénotype distinct émerge et la mortalité augmente. Bien que la pénétration de la maladie puisse être relativement faible chez les embryons de poussins, l’objectif de ce modèle est de mieux examiner l’étiologie et la pathologie du SHNH prénatal, en particulier aux stades précoces.

En raison de la très petite taille de l’embryon de poussin à un stade précoce, l’intervention LAL pré et postopératoire peut entraîner plusieurs complications. Pour éviter la contamination, les coquilles d’œufs et les bancs sont nettoyés avec 70 % d’éthanol, et des gants peuvent être utilisés tout au long de la procédure. Une étape critique du protocole LAL est l’ablation de l’ensemble de la membrane péricardique pour permettre un bon ajustement du nœud autour du bourgeon auriculaire gauche. De plus, nous avons trouvé que l’équipe de deux personnes était extrêmement utile, en particulier pour la formation et la spécialisation dans un ensemble de compétences spécifiques nécessaires pendant les étapes du protocole. Cette approche accélère la procédure et sa courbe d’apprentissage. Par conséquent, le risque d’hémorragie et de contamination est secondaire et l’emporte sur les avantages du système de jumelage proposé. L’utilisation d’une suture pré-préparée et conservée dans une solution stérile de sonnerie de poussins est recommandée. De plus, le maintien d’une faible force de serrage de la suture est également essentiel pour un rendement embryonnaire plus élevé. Des nœuds plus serrés sur le bourgeon auriculaire appliqués dans HH21 peuvent conduire à une défaillance prématurée du VG qui est incapable d’élaborer l’engagement cliniquement critique des défauts de remodelage de la conduction, de la coronaire et de la myoarchitecture secondaire, qui ont été bien décrits dans des études antérieures22. Plus précisément, l’utilisation de pinces à épiler et de ciseaux les plus fins et inutilisés à certaines étapes et de ciseaux relativement émoussés à d’autres peut réduire les saignements accidentels. Enfin, immédiatement après la fin du nœud, l’embryon doit être rapidement tourné vers sa position d’origine et la fenêtre de la coquille d’œuf doit être fermée avec une double couche de parafilm pour préserver sa température et son humidité. Le rendement typique du modèle LAL atteignant HH25 est présenté dans le tableau 2. En plus de la diminution de la taille du ventriculaire, des malformations valvulaires peuvent également se développer, telles que l’atrésie mitrale/aortique. La sévérité de ces lésions augmente la morbidité aux stades avancés, comme dans le cas du HLHS. En raison des défis discutés ici, par rapport à d’autres interventions mécaniques effectuées sur les embryons de poussins, telles que le cerclage conotruncal, le modèle LAL entraîne des niveaux de rendement beaucoup plus faibles. Nous pensons qu’il est possible d’atteindre un rendement de 50 % grâce aux précautions présentées ici.

L’embryon aviaire est un modèle animal vertébré idéal pour la recherche sur le développement cardiovasculaire en raison de sa structure morphologique, de sa taille, de son faible coût, de sa facilité de culture et de sa manipulation38,39. Ce modèle offre également une protection naturelle contre les agents pathogènes40. Les embryons instrumentés peuvent être utilisés dans l’imagerie in vivo avancée et la manipulation locale de siRNA. En tant que tels, les régions génétiques conservées de l’homme et du poulet sont disponibles grâce au séquençage au fusil de chasse de Sanger et à la cartographie physique39, ce qui conduit à des études mécanosensibles avancées19. De plus, l’approche par puce à ADN appliquée par Krejčí et al. a été utilisée pour mesurer le succès en ce qui concerne la réversibilité potentielle des changements hémodynamiques dans la structure myocardique. Ainsi, l’identification des gènes exprimés différentiellement entre les ventricules gauche et droit peut être utilisée comme critère pour la période idéale d’intervention lorsque des changements irréversibles commencent33.

En conclusion, les orientations futures potentielles pour les applications microchirurgicales dans le modèle d’embryon de poussin comprennent l’utilisation de techniques d’édition de gènes cardiovasculaires axées sur des gènes de matrice spécifiques et des voies de signalisation moléculaire, soutenant les progrès dans les technologies de culture et d’imagerie tissu-cellule32.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Nous reconnaissons le prix Tubitak 2247A pour le chercheur principal 120C139 qui a fourni un financement. Les auteurs tiennent également à remercier PakTavuk Gıda. A. S., Istanbul, Turquie, pour avoir fourni des ovules fertiles et soutenu la recherche cardiovasculaire.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10-0 nylon surgical suture Ethicon
Elastica van Gieson staining kit Sigma-Aldrich 115974 For staining connective tissues in histological sections
Ethanol absolute Interlab 64-17-5 For the sterilization step, 70% ethanol was obtained by diluting absolute ethanol with distilled water.
Incubator KUHL, Flemington, New Jersey-U.S.A AZYSS600-110
Kimwipes Interlab 080.65.002
Microscissors World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL 555640S Vannas STR 82 mm
Parafilm M Sigma-Aldrich P7793-1EA Sealing stage for egg reincubation
Paraplast Bulk Leica Biosystems  39602012 Tissue embedding medium
Stereo Microscope Zeiss Stemi 508  Stemi 508 Used at station 1
Stereo Microscope Zeiss Stemi 2000-C Stemi 2000-C Used at station 2
Tweezer (Dumont 4 INOX #F4) Adumont & Fils, Switzerland Used to return the embryo
Tweezer (Super Fine Dumont #5SF)  World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL 501985 Used to remove the membranes on the embryo

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La ligature auriculaire gauche chez l’embryon aviaire comme modèle de modification de la charge hémodynamique au cours du développement vasculaire précoce
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Sevgin, B., Coban, M. N., Karatas, F., Pekkan, K. Left Atrial Ligation in the Avian Embryo as a Model for Altered Hemodynamic Loading During Early Vascular Development. J. Vis. Exp. (196), e65330, doi:10.3791/65330 (2023).

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