Summary
Hier presenteren we een gedetailleerd visueel protocol voor het uitvoeren van het linker atriale ligatiemodel (LAL) in het vogelembryo. Het LAL-model verandert de intracardiale stroom, waardoor de belasting van de wandschuifspanning verandert, waardoor het hypoplastische linkerhartsyndroom wordt nagebootst. Er wordt een aanpak gepresenteerd om de uitdagingen van dit moeilijke microchirurgische model te overwinnen.
Abstract
Vanwege de volwassen ventriculaire configuratie met vier kamers, het gemak van kweek, toegang tot beeldvorming en efficiëntie, is het vogelembryo een geprefereerd diermodel voor gewervelde dieren voor het bestuderen van cardiovasculaire ontwikkeling. Studies die gericht zijn op het begrijpen van de normale ontwikkeling en de prognose van aangeboren hartafwijkingen maken op grote schaal gebruik van dit model. Microscopische chirurgische technieken worden geïntroduceerd om de normale mechanische belastingspatronen op een specifiek embryonaal tijdstip te veranderen en de stroomafwaartse moleculaire en genetische cascade te volgen. De meest voorkomende mechanische ingrepen zijn ligatie van de linker vitelline ader, conotruncale banding en ligatie van de linker atriale (LAL), waarbij de intramurale vasculaire druk en wandschuifspanning als gevolg van de bloedstroom worden gemoduleerd. LAL, vooral als het in ovo wordt uitgevoerd, is de meest uitdagende ingreep, met zeer kleine monsteropbrengsten als gevolg van de extreem fijne sequentiële microchirurgische ingrepen. Ondanks het hoge risico is in ovo LAL wetenschappelijk zeer waardevol omdat het de pathogenese van het hypoplastische linkerhartsyndroom (HLHS) nabootst. HLHS is een klinisch relevante, complexe aangeboren hartziekte die wordt waargenomen bij menselijke pasgeborenen. Een gedetailleerd protocol voor in ovo LAL is gedocumenteerd in dit document. In het kort werden bevruchte vogelembryo's geïncubeerd bij 37,5 °C en een constante luchtvochtigheid van 60%, meestal totdat ze Hamburger-Hamilton (HH) stadia 20 tot 21 bereikten. De eierschalen werden opengebroken en de buiten- en binnenmembranen werden verwijderd. Het embryo werd voorzichtig gedraaid om de linker atriale bol van het gemeenschappelijke atrium bloot te leggen. Voorgemonteerde microknopen van 10-0 nylon hechtingen werden voorzichtig gepositioneerd en rond de linker boezemknop gebonden. Uiteindelijk werd het embryo teruggebracht naar zijn oorspronkelijke positie en werd LAL voltooid. Normale en LAL-geïnstrumenteerde ventrikels vertoonden statistisch significante verschillen in weefselverdichting. Een efficiënte pijplijn voor het genereren van LAL-modellen zou bijdragen aan studies die zich richten op gesynchroniseerde mechanische en genetische manipulatie tijdens de embryonale ontwikkeling van cardiovasculaire componenten. Evenzo zal dit model een verstoorde celbron bieden voor weefselkweekonderzoek en vasculaire biologie.
Introduction
Aangeboren hartafwijkingen (CHD's) zijn structurele aandoeningen die optreden als gevolg van abnormale embryonale ontwikkeling1. Naast genetische aandoeningen wordt de pathogenese beïnvloed door veranderde mechanische belasting 2,3. Hypoplastisch linkerhartsyndroom (HLHS), een aangeboren hartafwijking, resulteert in een onderontwikkeld ventrikel/aorta bij de geboorte4 met een hoog sterftecijfer 5,6. Ondanks de recente vooruitgang in de klinische behandeling ervan, is de vasculaire groei en ontwikkelingsdynamiek van HLHS nog steeds onduidelijk7. Bij een normale embryonale ontwikkeling zijn het endocardium en het myocardium van de linker ventrikel (LV) afkomstig van cardiale voorlopercellen naarmate de vroege embryonale vorming van de hartbuis vordert. De geleidelijke aanwezigheid van myocardiale trabeculatie, verdikkende lagen en proliferatie van cardiomyocyten wordt gerapporteerd2. Voor HLHS worden veranderde trabeculaire remodellering en linkerventrikelafplatting waargenomen, wat verder bijdraagt aan myocardiale hypoplasie als gevolg van abnormale migratie van cardiomyocyten 2,8,9,10
Van de veelgebruikte modelorganismen om de ontwikkeling van het hart te bestuderen en hemodynamische omstandigheden te begrijpen 11, heeft het vogelembryo de voorkeur vanwege het volwassen hart met vier kamers en het gemak waarmee het kan worden gekweekt11,12,13,14. Aan de andere kant biedt geavanceerde beeldvormingstoegang van zebravisembryo's en transgene/knock-out muizen duidelijke voordelen11,12. Er zijn verschillende mechanische ingrepen getest voor het vogelembryo die de intramurale druk en wandschuifspanning veranderen bij het ontwikkelen van cardiovasculaire componenten. Deze modellen omvatten ligatie van de linkervitelline, conotruncale banding15 en ligatie van het linker atrium (LAL)11,12,16. Het resulterende fenotype als gevolg van de veranderde mechanische belasting kan ongeveer 24-48 uur na de chirurgische ingreep worden waargenomen in onderzoeken die zich richten op vroege prognose11,13. De LAL-interventie is een populaire techniek om het functionele volume van het linker atrium (LA) te verkleinen door een hechtlus rond de atrioventriculaire opening te plaatsen. Evenzo zijn er ook microchirurgische ingrepen uitgevoerd die gericht zijn op het afbinden van het rechter atrium (RAL)17,18. Evenzo richten sommige onderzoekers zich op het linker hartoor (LAA) met behulp van microclips om het volume van de LA19,20 te verminderen. In sommige onderzoeken wordt een chirurgische nylondraad aangebracht op de atrioventriculaire knoop19,21. Een van de gebruikte interventies is LAL, dat HLHS kan nabootsen, maar ook het moeilijkste model is om uit te voeren, met zeer kleine monsteropbrengsten vanwege de extreem fijne microchirurgische ingrepen die nodig zijn. In ons laboratorium wordt LAL uitgevoerd in ovo tussen Hamburger-Hamilton (HH) stadia 20 en 21, voordat het gemeenschappelijke atrium volledig septaat 6,14,22,23 is. Rond de LA wordt een chirurgische hechting geplaatst, die de intracardiale bloedstroomstromen verandert. In LAL-modellen van HLHS worden verhoogde stijfheid van de ventrikelwand, veranderde myofiberhoeken en verminderde LV-holtegrootte waargenomen14,24.
In dit video-artikel wordt een gedetailleerd protocol en aanpak voor in ovo LAL gegeven. In het kort werden de bevruchte vogelembryo's uitgebroed voor microchirurgie, werd de eierschaal opengebroken en werden de buiten- en binnenmembranen vrijgemaakt. Het embryo werd vervolgens langzaam gedraaid zodat de LA toegankelijk was. Een 10-0 nylon chirurgische hechting werd aan de atriale knop vastgemaakt en het embryo werd teruggebracht naar zijn oorspronkelijke oriëntatie, waarmee de LAL-procedure werd voltooid25. LAL en normale ventrikels worden vergeleken voor weefselverdichting en ventrikelvolume via optische coherentietomografie en basale histologie.
Een succesvol uitgevoerde LAL-modelpijplijn, zoals hier beschreven, zal bijdragen aan basisstudies die zich richten op de embryonale ontwikkeling van cardiovasculaire componenten. Dit model kan ook worden gebruikt in combinatie met genetische manipulaties en geavanceerde beeldvormingsmodaliteiten. Evenzo is het acute LAL-model een stabiele bron van zieke vasculaire cellen voor weefselkweekexperimenten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Vruchtbare witte Leghorn-eieren worden verkregen van vertrouwde leveranciers en uitgebroed volgens door de universiteit goedgekeurde richtlijnen. Kuikenembryo's, stadia 18 (dag 3) tot 24 (dag 4) (de stadia die in dit artikel worden gepresenteerd) worden niet beschouwd als levende gewervelde dieren volgens de richtlijn 2010/63/EU van de Europese Unie (EU) en de richtlijnen van de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) in de VS. Kuikenembryo's worden volgens de Amerikaanse wetgeving na dag 19 van de incubatie als "levende dieren" beschouwd, maar niet voor de EU. Elk ei is gelabeld met de startdatum van het uitkomen en zal uiterlijk op de 10edag van incubatie uitkomen. Nadat de eieren zijn uitgekomen, worden de kuikens uit de broedmachine gehaald. Het protocol wordt uitgevoerd in twee bench-top operationele stations (Station 1 en Station 2), gericht op gespecialiseerde modelgeneratiefasen.
1. Voorbereiding voor microchirurgie
- Verkrijg bevruchte eieren van een vaccinontwikkelingscentrum met een specifieke pathogeenvrije (SPF) klasse of via een vertrouwde commerciële leveranciersboerderij door een kwetsbare bezorgkoerier in droge polystyreencontainers. Reinig de eierschaal vóór het incuberen voorzichtig met pluisvrije doekjes gedrenkt in 70% ethanol om verontreiniging te verwijderen.
- Criteria voor inclusie/uitsluiting van embryo's
- Broed geen eieren uit die tijdens het transport zijn gebarsten of beschadigd.
- Als er een bloeding wordt geconstateerd tijdens de LAL-procedure of na herincubatie, gebruik het embryo dan niet.
- Gebruik geen embryo's die zich met de linkerkant naar boven ontwikkelen, aangezien de hemodynamische bloedstroom kan afwijken van de normale oriëntatie.
- Dıscard-embryo's die zich ontwikkelen met aangeboren afwijkingen in zowel pre- als postoperatieve ingrepen.
- Voeg embryo's toe die het beoogde stadium bereiken en zich op hun oorspronkelijke locatie ontwikkelen, waarbij HLHS wordt nagebootst als een LAL-model.
- Broed de bevruchte witte leghorn-kippeneieren (Gallus gallus domesticus L.), stomp uit, tot het gewenste stadium, meestal bij HH20-2115 (37,5 °C, 60% luchtvochtigheid, 3,5 dagen) (Figuur 1).
OPMERKING: Het is belangrijk om de eieren op een constante temperatuur en vochtigheid te houden om de opbrengst te verhogen. Afhankelijk van het model incubator zorgt de toevoeging van een pan gevuld met gedestilleerd water voor een stabiele luchtvochtigheid. Blauwdrukken van een extra/hulpsysteem voor temperatuur- en vochtigheidsregeling dat op de meeste couveuses zou passen, zijn door de auteurs ontwikkeld en aanbevolen. De elektronica, hardware en codedetails van deze in eigen huis gebouwde sensor/besturingseenheid worden geleverd in een gegevensopslagplaats26. Continu voorzichtig schudden (roteren) van de eieren tijdens het broeden kan een optimale positionering van het embryo mogelijk maken en zo leiden tot een hoger percentage "operabele" embryo's. Schudden kan ook werken met incubators met deze capaciteit en de productiviteit verder verhogen. - Voordat u met de procedure begint, bereidt u het vereiste aantal knopen voor door een losse platte knoop in een 1,5 cm lange 10-0 hechting te leggen. Zorg ervoor dat de knoop niet strak zit en groot genoeg is om tijdens de operatie gemakkelijk over de boezems te passen (Figuur 2).
NOTITIE: Leg de knopen van tevoren en bewaar ze voor gebruik in een steriele kuikenringeroplossing. Het knopen vereist het gebruik van twee handen om het pincet synchroon te bedienen. Aangezien dit een kritieke fase in het protocol is, kan van stopverf een model van het atrium worden gemaakt om deze stap te oefenen (Figuur 3). Dit zal de driedimensionale microchirurgische vaardigheden verbeteren die nodig zijn om stap 3.2.3 op Station 2 uit te voeren (Figuur 4).
2. Werkzaamheden in station 1 (figuur 4A)
- Open een venster vanaf het stompe uiteinde van het ei en verwijder zowel het buitenste als het binnenste membraan15 (Figuur 5A-D).
- Open de eierschaal door voorzichtig te kraken met het achterste uiteinde van het pincet, waarbij de vrije vingers het ei stevig ondersteunen om ongewenste doorbraak van scheuren te verminderen.
- Aangezien LAL een lange procedure is, moet u de temperatuur en vochtigheid van het embryo behouden, aangezien de hartslag afhankelijk is van de temperatuur. Zorg er dus voor dat het eerste shell-venster zo klein mogelijk wordt gemaakt, net genoeg om de bewerkingen uit te voeren.
NOTITIE: Er worden geen vochtigheids- of temperatuurregelingssystemen gebruikt tijdens het gebruik, maar deze systemen, indien beschikbaar, zouden de opbrengst ten goede komen. Indien mogelijk wordt het airconditioningsysteem in het laboratorium uitgeschakeld en wordt de procedure uitgevoerd bij de hoogst mogelijke kamertemperatuur (RT). Optimalisatie van de embryonale hartslag, die kan worden geregeld door de temperatuur, tijdens de operatie wordt ook aanbevolen. Sommige laboratoria houden de hartslag op iets lagere snelheden dan 120 bpm via temperatuurregeling tijdens de LAL-werking. Als zodanig zou vochtigheidsregeling rond de chirurgische zone de opbrengst verder verhogen. De eierschaalvensters zijn zo klein mogelijk gemaakt, net groot genoeg om chirurgische toegang mogelijk te maken. Dit is ook van toepassing op het dikke buitenmembraan, dat doorgaans alleen kleiner is dan de eierschaal in de mate van de omtrek van het embryo. Deze zorgen ervoor dat de temperatuur en vochtigheid van het embryo op peil blijft. Bij het openen van een venster vanaf het stompe uiteinde van het ei, worden de kleine schaalfragmenten schoongemaakt, zodat deze stukjes de vasculaire integriteit van vitelline niet beschadigen of tot ongewenste artefacten leiden. Daarnaast gebruiken andere laboratoria gebogen microgekartelde scharen voor het maken van ramen. Ook kunnen twee breedtes plakband worden gebruikt om de eierschaal te stabiliseren om barsten te voorkomen. - Verwijder alleen het benodigde vitelline-membraan met een microschaar (aanvullende video 1).
- De normale embryonale ontwikkeling is met de goede kant naar boven. Zodra het embryo vrij is van het vitellinemembraan, plaatst u het pincet met gesloten uiteinden onder het dorsale segment van het embryo en draait u het embryo voorzichtig om om de linkerkant bloot te leggen (d.w.z. configuratie met de linkerkant naar boven) (Figuur 6A,B; Aanvullende video 2).
- Zorg ervoor dat de linker boezemknop nu bloot ligt, maar nog steeds bedekt is met een complex membraansysteem, meestal bestaande uit een dubbele laag van het hartzakje.
- Verwijder de vliezen, inclusief de fijne, direct rond de atriale knop. Dit is een andere kritieke fase; Voer membraanverwijdering uit van grove membranen en ga verder met de fijne membranen rond de linker boezemknop. Bewaar het fijnste pincet voor het verwijderen van het fijne membraan (aanvullende video 3).
- Oriënteer het embryo tijdens het verwijderen van het membraan met de linkerkant naar boven, zodat het plaatsen van de knoop in stap 3.2 kan worden uitgevoerd zonder verdere herpositionering. Om dit te bereiken, tilt u het embryo op met behulp van de vliezen in stap 2.6 en hangt u het aan de eierschaal, waarbij u ervoor zorgt dat de linkerkant naar boven wijst.
OPMERKING: Sommige embryo's kunnen zich dicht bij de periferie van de eierschaal bevinden en kunnen een uitdaging zijn om te bedienen. Toch zullen deze embryo's hoogstwaarschijnlijk met de goede kant naar boven worden georiënteerd en normaal gedrag vertonen, en kunnen ze in het onderzoek worden opgenomen. In deze gevallen kan, indien nodig, het verduisterde atrium toegankelijker worden gemaakt door het pericardiale membraan voorzichtig schoon te maken met #4 een fijn pincet en de eierschaal in omgekeerde richting te verwijderen (in de richting van de schaalopening). Deze embryo's kunnen ook worden opgetild met behulp van delen van de extraembryonale membranen en op de gewenste positie worden gefixeerd door het ene uiteinde van het membraan (het pincetuiteinde) aan de eierschaal te bevestigen, met behulp van de natuurlijke plakkerigheid. Bovendien kan de ruimte tussen het hoofd en het ruggenmerggebied van het embryo worden vergroot met behulp van een pincet om het verduisterde atrium te onthullen.
3. Werkzaamheden in station 2 (figuur 4B)
- Plaats de voorgeprepareerde knoop uit stap 1.4 onder de stereomicroscoop dicht bij het embryo op een toegankelijke plaats (Figuur 6B). De boezemknop is nu klaar om te worden afgebonden (aanvullende video 4).
- Pak de vooraf voorbereide open knoop en oriënteer deze op de linker boezemknop. Om LAL te laten werken, plaatst u het ei in een uniek hellende driedimensionale oriëntatie.
- Oriënteer de knoop correct om het aanhaalproces uit te voeren zonder de embryo's te beschadigen.
- Maak in stap 2.7 de fijne slijmvliezen optimaal schoon om het effect van een kloppend hart te verminderen.
- Draai de hechting vast (Figuur 6C). Voor deze stap is oefenen met de stopverf erg handig. Voor schijnembryo's trekt u de knoop net genoeg aan om de knoop vast te houden.
- Gebruik vervolgens de microschaar om de overtollige uiteinden van de hechtdraad zo dicht mogelijk bij de knop af te knippen (aanvullende video 5).
- Wees heel voorzichtig dat de pas afgesneden uiteinden van de vastgebonden hechting niet in staat zijn om nabijgelegen bloedvaten te doorboren tijdens rotatie of als gevolg van de hartslag.
- Verwijder met behulp van het pincet de overtollige hechtdraadstukken die in stap 3.3 zijn weggesneden.
- Breng ten slotte met een gesloten pincet het embryo terug naar zijn oorspronkelijke positie, zoals in stap 2.5 (aanvullende video 6).
- Bedek het ei na voltooiing van het LAL-proces met een dubbele laag parafilm en broed het opnieuw uit. Een strakke en steriele sluiting van de eieren is van het grootste belang om te overleven, vooral na 24 uur incubatie. Als visuele toegang ook gewenst is, gebruik dan paraffine met glasplaatjes.
OPMERKING: Aangezien de vroege embryonale periode wordt bestudeerd, worden de eieren meestal 24-48 uur uitgebroed totdat ze ongeveer HH25 of HH27 bereiken. Er is echter geen limiet en latere stadia kunnen worden bestudeerd, zoals door andere onderzoekers wordt geprobeerd. Voor hoge werksnelheden wordt ten minste een team van twee personen aanbevolen. Eén persoon moet worden getraind voor en is verantwoordelijk voor het openen van eieren, het eerste opruimen van het membraan, de rotatie en het opruimen van het membraan rond de linker boezemknop. De andere persoon is alleen verantwoordelijk voor de eerste knoopvoorbereiding, het plaatsen van de knoop en het aandraaien. De laatste embryorotatie kan worden uitgevoerd door persoon 1. De chirurgische ingreep voor een enkel embryo duurt ongeveer 4-5 minuten. - Reinig voor/na chirurgische ingrepen de tafeloppervlakken en instrumenten met ethanol. Zorg ervoor dat u verse kuikenringeroplossing (NaCl, KCl, CaCl2 en NaHCO3)16,27 aanbrengt op de metalen instrumenten die de embryonale weefsels raken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Geavanceerde tijdopgeloste beeldvormingstechnieken kunnen worden gebruikt om de structurele en morfologische veranderingen als gevolg van LAL-interventie10 waar te nemen. Bovendien zijn LAL-monsters ook vatbaar voor moleculaire en biologische methoden19,28. In tabel 1 worden steekproeven gegeven waarbij gebruik is gemaakt van de resultaten van het LAL-model. In deze context werd LAL-interventie uitgevoerd in kuikenembryo's die HH20-21 bereikten. Zowel de controle- (gezonde) als de LAL-harten werden bij HH25-26 uit het embryo verwijderd. Vervolgens werden de monsters gefixeerd in 4% paraformaldehyde (PFA) bij 4 °C 6,15. De verwijderde hartmonsters werden vervolgens gedehydrateerd in ethanoloplossingen met toenemende concentraties (70%, 96% en 100%) gedurende elk 1 uur. Ten slotte werden de monsters gedurende 0,5 uur in xyleen bij RT bewaard en werd paraffine-inbedding uitgevoerd voordat ze werden doorgesneden met een dikte van 10 μm. De monsters die op het glasplaatje werden overgebracht, werden gekleurd met Elastica van Gieson-beits. De coupes werden onderzocht onder een stereomicroscoop, waarbij de dwarsdiameter van het ventrikel werd gemeten. We voerden ook een driedimensionale niet-invasieve methode uit, optische coherentietomografiescanning (OCT), in sommige monsters11,29. Zowel de controle- als de LAL-harten bij HH25-26 werden weggesneden en hun dwarslumendiameters werden gemeten onder OCT.
De resultaten toonden aan dat voor LAL een compactere myocardiale structuur wordt bereikt met significante morfologische veranderingen in vergelijking met de normale ontwikkeling (Figuur 7). Bovendien wordt de afzetting van extracellulaire matrixcomponenten, zoals collageen, waargenomen rond het cardiale interstitium, wat lijkt op myocardiale fibrose vergelijkbaar met de HLHS30. Om myocardiale verdikking en trabeculaire verdichting beter te begrijpen, werden morfometrische porositeitsmetingen uitgevoerd in zowel controle- als LAL-monsters. Zoals verwacht resulteerde de LAL-interventie in een kleinere linkerventrikelholte en trabeculaire verdichting door de intertrabeculaire uitsparingen aan te spannen. Deze bevindingen bevestigen de hypothese dat LAL de gezonde ventriculaire architectuur verandert en het trabeculaire aspect heroriënteert22. Evenzo resulteerde het LAL-model bij HH29 in een vergrote rechterventrikelholte, veranderde trabeculaire architectuur en myocardvolume24.
Ter ondersteuning van de resultaten van deze studie werd OCT-beeldvorming gebruikt om de dwarsoppervlakte en axiale lengte van het ventriculaire lumen te meten (Figuur 8). LAL toonde een significante vermindering van de grootte en diameter van de linkerventrikel in vergelijking met de controlegroep. Hoewel hier alleen de ventrikels zijn geconcentreerd, wordt ook de invloed van LAL op de ontwikkeling van de aortaboog gerapporteerd31. Een recente studie waaraan we hebben bijgedragen, meldde in 3D dat de myocardiale spanningen in de middenwand in beide ventrikels waren toegenomen na LAL bij HH2532. Bovendien vertoonden LAL-groepen een toename van de wanddikte in vergelijking met controlegroepen bij HH25. Deze studie komt overeen met de eerdere studie van Tobita et al.25, die een significante toename van piek systolische epicardiale circumferentiële spanningen in de LAL LV bij HH27 aantoonde.
Figuur 1: Incubatiesysteem voor embryonale groei. Bevruchte witte Leghorn-kippeneieren (Gallus gallus) werden uitgebroed in een broedmachine bij een constante luchtvochtigheid (60%) en temperatuur (37,5 °C). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Voorbereiding van de LAL-knoop. Meerdere knopen met een diameter van ~ 0,5-1 mm en stukken van 1-2 cm lang werden bereid met behulp van 10-0 nylon chirurgische hechtingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Replica van het embryonale linker atrium gemaakt van stopverf. Er wordt een replica van het linker boezemgedeelte gemaakt om de oriëntatie van de knopen en de stappen voor het sluiten van de knoop te trainen en te oefenen met behulp van een pincet. Dit stelde ons in staat om veel proeven te doen en deze stappen te perfectioneren voordat we deze vaardigheid in het eigenlijke embryo implementeerden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Voorbereiding van het station. (A,B) Alle materialen en oplossingen voor microchirurgie werden in de schone ruimte voor Station 1 en Station 2 geplaatst. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Het openen van een venster vanaf het stompe uiteinde van het ei en het verwijderen van zowel de buiten- als de binnenste vliezen. (A,B) Een klein venster werd geopend met behulp van microchirurgische instrumenten op de eierschaal en omvatte het hele embryo in HH20-21. (C) Fragmenten van de eierschaal werden verwijderd in de eerste kraakstap. (D,E) Extra-embryonale membranen werden ook onder de microscoop ontleed. (F) Nadat het LAL-proces was voltooid, werd het ei bedekt met een dubbele laag parafilm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Een momentopname van de in ovo linker atriale ligatie (LAL) operatie . (A) Dorsaal aanzicht van het kuikenembryo in zijn normale oriëntatie. Het embryonale ventrikel dat HH20-21 bereikt, heeft een primitief gemeenschappelijk atrium (a), ventrikel (v) en het uitstroomkanaal (ot). (B) Er wordt een close-up dorsale weergave van het omgedraaide, met de linkerkant naar boven levende embryo en de locatie van de knoop weergegeven. (C) LA met de hechtknoop. Afkortingen: LA = linker atrium; AA = aortaboog. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Verwijdering en onderzoek van de controle- en LAL-harten. Zowel (A) controle- als (B) LAL-harten die het HH25-26-stadium bereikten, werden uit het embryo verwijderd en onder een stereomicroscoop onderzocht. Het staafdiagram toont de verschillen in transversale hartdiameter tussen de LAL-groep en de controlegroep, en de gemiddelde ± standaarddeviatie (SD) van ten minste vier replicaten. Schaalbalk = 100 μM. Histologisch onderzoek van hartweefsels in (C) controle- en (D) LAL-monsters met behulp van de Elastica van Gieson-kleuringstechniek. Het staafdiagram toont de verschillen in porositeit (%) om myocardiale compressie tussen de LAL en de controlegroep te laten zien, en de gemiddelde ± SD van ten minste twee replicaten. **P < 0,01. GraphPad Prism versie 9.5.1 werd gebruikt voor statistische analyse. Schaalbalk = 50 μM. Afkortingen: LAL = ligatie linker atrium; LA = linker atrium; RA = rechter atrium; RV = rechter ventrikel; LV = linker hartkamer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: Optische coherentietomografie. Zowel (A) controle- als (B) LAL-harten die HH25-26 bereikten, werden onderzocht door OCT. (C,D) De grootte en lengte van het lumenkruis van de ventrikels worden aangegeven in respectievelijk panelen (C) en (D). De histogrammen geven het gemiddelde ± SD weer met ten minste drie herhalingen. *p < 0,05; **p < 0,01; GraphPad Prism versie 9.5.1 werd gebruikt voor statistische analyse. Schaalbalk = 100 μM. Afkortingen: LAL = ligatie linker boezem; RV = rechter ventrikel; LV = linker hartkamer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Een overzicht van onderzoeken die gebruik maken van het linker atriale ligatiemodel (LAL) in vogelembryo's 6,10,12,14,22,24,27,30,32,33.
In bijna alle kranten staat de LA op HH21. Het effect van LAL wordt onderzocht in latere HH-stadia (beoordelingsfase). Afkortingen: AVC = atrioventriculair kussen; LAV = linker atrioventriculair kanaal; RAV = rechter atrioventriculair kanaal; RA = rechter boezem; LA = linker boezems; RV = rechter ventrikel; LV = linker ventrikel; SEN = subendocardium; IVS = interventriculair septum; micro-CT = microcomputertomografie. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 2: Typische effectiviteit van het linker atriale ligatiemodel (LAL) gemaakt bij HH21 en geïncubeerd tot HH25. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Aanvullende video 1: Zowel de buitenste als de binnenste membranen van het vogelembryo worden verwijderd. Vervolgens wordt alleen het vitelline-membraan verwijderd, zoals weergegeven met een microschaar. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende video 2: Een pincet wordt onder het dorsale segment van het embryo met de rechterkant naar boven geplaatst en voorzichtig omgedraaid om de linker atriale knop bloot te leggen. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende video 3: De vliezen rond de linker boezemknop worden geleidelijk vrijgemaakt. Het atrium breidt zich iets uit, waardoor het leggen van knopen en het leggen van knopen mogelijk is. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende video 4: Een ongeveer 0,1-0,3 mm lange hechting wordt in de buurt van het embryo geplaatst en er met twee pincetten omheen vastgemaakt. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende video 5: De overtollige hechtdraaduiteinden van de knoop worden voorzichtig geknipt met een microschaar. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende video 6: Het embryo wordt voorzichtig teruggebracht naar zijn normale oriëntatie. LAL is voltooid. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bij HLHS is de bloedstroom veranderd als gevolg van structurele defecten, wat leidt tot abnormale morfologie aan de linkerkant 4,6. Het huidige model biedt een praktisch experimenteel systeem om de progressie van HLHS beter te begrijpen en kan zelfs de pathogenese ervan nabootsen8. Het opzetten van een volledig klinisch gelijkwaardig HLHS-diermodel is echter een uitdagende taak. Naast het hier gepresenteerde LAL-model voor vogels, hebben recente studies bij muizen, foetale schapen en kikkers geprobeerd de morfologische, hemodynamische en pathofysiologische kenmerken van de HLHS-prognose na te bootsen. Bij muizenembryo's wordt de mechanische belasting gewijzigd via een emboliserend middel dat in de LA wordt geïnjecteerd via een foetale interventie op embryonale dag (ED) 14.5 (ongeveer HH40-41 in kuikenembryo's)34. In totaal overleefde 48% van de foetussen die positief werden geëmboliseerd de zwangerschap met kleine LV's en retrograde aortastroom. De lange draagtijd, verdere uitdagingen bij interventies op vroege tijdstippen en uitdagende foetale chirurgie kunnen de haalbaarheid van dit model beperken. LV-hypoplasie werd ook nagebootst in de foetale lamsmodellen door de LA te vullen met siliconenrubber via een ballonkatheter35. In dit grote diermodel is het LV-volume voldoende verminderd, maar de overlevingstijd is niet lang, wat resulteert in een lage ziektepenetratie. Een alternatieve interventiebenadering is het afsluiten van het foramen ovale via percutane transhepatische katheterisatie, zoals geprobeerd bij foetaal lam36, hoewel het richten van de occlusieve stent op het foramen ovale zeer uitdagend is. Schapenmodellen zijn over het algemeen zeer uitdagend vanwege hun reeds bestaande vasculaire morfologieën en ongunstige longfysiologie. Als zodanig beperken de behoefte aan seizoensgebonden fokken, een latere zwangerschapsduur en een kleine steekproefomvang dit model verder. Ten slotte wordt het Xenopus-embryo ook geïntroduceerd als een ander handig model voor het nabootsen van menselijke hartziekten37, ondanks het hart met drie kamers met een enkele ventrikel en verschillen in de neurale topcelpatronen. De beschikbaarheid van micro-injectie en microchirurgische ingrepen met een volledig genoom en de lange overlevingstijd maken dit model ook aantrekkelijk.
In eerdere studies werd de ziektepenetratie van zes van de 39 geopereerde vogelembryo's gepresenteerd als 15% in het LAL-model34. De gemiddelde HLHS-penetratie van het kuikenembryomodel dat we in een vroeg stadium onderzochten (tot HH25 en HH27) was echter 66% (12 van de 18 geopereerde vogelembryo's). Prof. Sedmera meldde dat de gemiddelde overlevingstijd van embryo's HH40 (ED14) zou kunnen zijn19. Andere groepen die deze ligatie regelmatig uitvoeren, hebben hoge slagingspercentages gemeld op vroege tijdstippen (bijv. 75% tot HH29, 50% tot HH34 en 20% tot HH38)30. In latere stadia ontstaat echter een duidelijk fenotype en neemt de mortaliteit toe. Hoewel de ziektepenetratie relatief laag kan zijn in kuikenembryo's, is het doel van dit model om de etiologie en pathologie van prenatale HLHS beter te onderzoeken, vooral in de vroege stadia.
Vanwege de zeer kleine omvang van het kuikenembryo in een vroeg stadium, kan pre- en postoperatieve LAL-interventie tot verschillende complicaties leiden. Om besmetting te voorkomen, worden eierschalen en banken gereinigd met 70% ethanol en kunnen tijdens de hele procedure handschoenen worden gebruikt. Een cruciale stap in het LAL-protocol is het verwijderen van het gehele pericardiale membraan om een goede pasvorm van de knoop rond de linker boezemknop mogelijk te maken. Bovendien hebben we het tweekoppige team als zeer nuttig ervaren, met name bij het trainen en specialiseren in een specifieke vaardigheden die nodig zijn tijdens de protocolstappen. Deze aanpak versnelt de procedure en de leercurve. Het risico op bloedingen en besmetting is dus secundair en weegt zwaarder dan de voordelen van het voorgestelde buddysysteem. Het gebruik van een vooraf voorbereide hechting die wordt bewaard in een steriele kuikenringeroplossing wordt aanbevolen. Bovendien is het handhaven van een lage aanhaalsterkte van de hechting ook van cruciaal belang voor een hogere embryoopbrengst. Strakkere knopen op de atriale knop die in HH21 worden aangebracht, kunnen leiden tot voortijdig falen van de LV die niet in staat is om de klinisch kritische betrokkenheid van geleidings-, coronaire en secundaire myoarchitectuurremodelleringsdefecten, die goed zijn beschreven in eerdere studies, uit te werken22. Met name het gebruik van de fijnste en ongebruikte pincetten en scharen bij bepaalde stappen en relatief botte pincetten en scharen bij andere kan onbedoelde bloedingen verminderen. Ten slotte moet het embryo onmiddellijk na voltooiing van de knoop snel naar zijn oorspronkelijke positie worden gedraaid en moet het eierschaalvenster worden gesloten met een dubbele laag parafilm om de temperatuur en vochtigheid te behouden. De typische opbrengst voor het LAL-model dat HH25 bereikt, wordt weergegeven in tabel 2. Naast de verminderde ventriculaire grootte kunnen zich ook klepmisvormingen ontwikkelen, zoals mitralis-/aorta-atresie. De ernst van deze laesies verhoogt de morbiditeit in de latere stadia, zoals bij HLHS. Vanwege de hier besproken uitdagingen, in vergelijking met andere mechanische ingrepen die worden uitgevoerd in kuikenembryo's, zoals conotruncal banding, resulteert het LAL-model in veel lagere opbrengstniveaus. Wij zijn van mening dat, door de hier gepresenteerde voorzorgsmaatregelen, een opbrengst van 50% haalbaar is.
Het vogelembryo is een ideaal diermodel van gewervelde dieren voor onderzoek naar cardiovasculaire ontwikkeling vanwege de morfologische structuur, grootte, lage kosten, kweekgemak en manipulatie38,39. Dit model biedt ook een natuurlijke bescherming tegen ziekteverwekkers40. Geïnstrumenteerde embryo's kunnen worden gebruikt in geavanceerde in vivo beeldvorming en lokale siRNA-manipulatie. Als zodanig zijn geconserveerde genregio's van de mens en de kip beschikbaar via Sanger-shotgun-sequencing en fysieke mapping39, wat leidt tot geavanceerde mechanosensitieve studies19. Bovendien is de microarray-benadering toegepast door Krejčí et al. gebruikt om het succes te meten met betrekking tot de mogelijke omkeerbaarheid van hemodynamische veranderingen in de myocardiale structuur. De identificatie van genen die differentieel tot expressie worden gebracht tussen de linker- en rechterventrikels kan dus worden gebruikt als criterium voor de ideale interventieperiode wanneer onomkeerbare veranderingen beginnen33.
Concluderend zijn mogelijke toekomstige richtingen voor microchirurgische toepassingen in het kuikenembryomodel het gebruik van cardiovasculaire genbewerkingstechnieken die zich richten op specifieke matrixgenen en moleculaire signaalroutes, ter ondersteuning van vooruitgang in weefselcelkweek en beeldvormingstechnologieën32.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We erkennen de Tubitak 2247A-prijs voor hoofdonderzoeker 120C139 voor het verstrekken van financiering. De auteurs willen ook PakTavuk Gıda bedanken. A. S., Istanbul, Turkije, voor het leveren van bevruchte eicellen en het ondersteunen van het cardiovasculaire onderzoek.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10-0 nylon surgical suture | Ethicon | ||
| Elastica van Gieson staining kit | Sigma-Aldrich | 115974 | For staining connective tissues in histological sections |
| Ethanol absolute | Interlab | 64-17-5 | For the sterilization step, 70% ethanol was obtained by diluting absolute ethanol with distilled water. |
| Incubator | KUHL, Flemington, New Jersey-U.S.A | AZYSS600-110 | |
| Kimwipes | Interlab | 080.65.002 | |
| Microscissors | World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL | 555640S | Vannas STR 82 mm |
| Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | Sealing stage for egg reincubation |
| Paraplast Bulk | Leica Biosystems | 39602012 | Tissue embedding medium |
| Stereo Microscope | Zeiss Stemi 508 | Stemi 508 | Used at station 1 |
| Stereo Microscope | Zeiss Stemi 2000-C | Stemi 2000-C | Used at station 2 |
| Tweezer (Dumont 4 INOX #F4) | Adumont & Fils, Switzerland | Used to return the embryo | |
| Tweezer (Super Fine Dumont #5SF) | World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL | 501985 | Used to remove the membranes on the embryo |
References
- Wang, T., et al. Congenital heart disease and risk of cardiovascular disease: A meta-analysis of cohort studies. Journal of the American Heart Association. 8 (10), e012030 (2019).
- Chaudhry, B., et al. The left ventricular myocardium in hypoplastic left heart syndrome. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (8), 279 (2022).
- Lashkarinia, S. S., Çoban, G., Ermek, E., Çelik, M., Pekkan, K. Spatiotemporal remodeling of embryonic aortic arch: stress distribution, microstructure, and vascular growth in silico. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 19 (5), 1897-1915 (2020).
- Ho, S., Chan, W. X., Yap, C. H. Fluid mechanics of the left atrial ligation chick embryonic model of hypoplastic left heart syndrome. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 20 (4), 1337-1351 (2021).
- Gordon, B. M., Rodriguez, S., Lee, M., Chang, R. K. Decreasing number of deaths of infants with hypoplastic left heart syndrome. The Journal of Pediatrics. 153 (3), 354-358 (2008).
- Salman, H. E., et al. Effect of left atrial ligation-driven altered inflow hemodynamics on embryonic heart development: clues for prenatal progression of hypoplastic left heart syndrome. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 20 (2), 733-750 (2021).
- Fruitman, D. S. Hypoplastic left heart syndrome: Prognosis and management options. Paediatrics & Child Health. 5 (4), 219-225 (2000).
- Rahman, A., Chaturvedi, R. R., Sled, J. G. Flow-mediated factors in the pathogenesis of hypoplastic left heart syndrome. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (5), 154 (2022).
- Henderson, D. J., Anderson, R. H. The development and structure of the ventricles in the human heart. Pediatric Cardiology. 30 (5), 588-596 (2009).
- Kowalski, W. J., Pekkan, K., Tinney, J. P., Keller, B. B. Investigating developmental cardiovascular biomechanics and the origins of congenital heart defects. Frontiers in Physiology. 5, 408 (2014).
- Midgett, M., Rugonyi, S. Congenital heart malformations induced by hemodynamic altering surgical interventions. Frontiers in Physiology. 5, 287 (2014).
- Kowalski, W. J., et al. Left atrial ligation alters intracardiac flow patterns and the biomechanical landscape in the chick embryo. Developmental Dynamics. 243 (5), 652-662 (2014).
- Bruneau, B. G. The developmental genetics of congenital heart disease. Nature. 451 (7181), 943-948 (2008).
- Sedmera, D., et al. Cellular changes in experimental left heart hypoplasia. The Anatomical Record. 267 (2), 137-145 (2002).
- Celik, M., et al. Microstructure of early embryonic aortic arch and its reversibility following mechanically altered hemodynamic load release. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 318 (5), H1208-H1218 (2020).
- Tobita, K., Schroder, E. A., Tinney, J. P., Garrison, J. B., Keller, B. B. Regional passive ventricular stress-strain relations during development of altered loads in chick embryo. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 282 (6), H2386-H2396 (2002).
- Alser, M., Shurbaji, S., Yalcin, H. C. Mechanosensitive pathways in heart development: findings from chick embryo studies. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 8 (4), 32 (2021).
- Alser, M., et al. Blood flow disturbance and morphological alterations following the right atrial ligation in the chick embryo. Frontiers in Physiology. 13, 849603 (2022).
- Sedmera, D.
- Rychter, Z., Rychterová, V., Lemez, L. Formation of the heart loop and proliferation structure of its wall as a base for ventricular septation. Herz. 4 (2), 86-90 (1979).
- Harh, J. Y., Paul, M. H., Gallen, W. J., Friedberg, D. Z., Kaplan, S. Experimental production of hypoplastic left heart syndrome in the chick embryo. The Americal Journal of Cardiology. 31 (1), 51-56 (1973).
- Sedmera, D., Pexieder, T., Rychterova, V., Hu, N., Clark, E. B. Remodeling of chick embryonic ventricular myoarchitecture under experimentally changed loading conditions. The Anatomical Record. 254 (2), 238-252 (1999).
- Karakaya, C., et al. Asymmetry in mechanosensitive gene expression during aortic arch morphogenesis. Scientific Reports. 8 (1), 16948 (2018).
- Trinidad, F., et al. Effect of blood flow on cardiac morphogenesis and formation of congenital heart defects. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (9), 303 (2022).
- Tobita, K., Keller, B. B. Right and left ventricular wall deformation patterns in normal and left heart hypoplasia chick embryos. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 279 (3), H959-H969 (2000).
- Bortecine, S., Merve Nur, C., Faruk, K., Kerem, P. Auxiliary humidifier system design and construction for research grade egg incubators. Zenodo. , (2023).
- Schroder, E. A., Tobita, K., Tinney, J. P., Foldes, J. K., Keller, B. B. Microtubule involvement in the adaptation to altered mechanical load in developing chick myocardium. Circulation Research. 91 (4), 353-359 (2002).
- Rufaihah, A. J., Chen, C. K., Yap, C. H., Mattar, C. N. Z. Mending a broken heart: In vitro, in vivo and in silico models of congenital heart disease. Disease Models & Mechanisms. 14 (3), (2021).
- Siddiqui, H. B., Dogru, S., Lashkarinia, S. S., Pekkan, K. Soft-tissue material properties and mechanogenetics during cardiovascular development. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (2), 64 (2022).
- Pesevski, Z., et al. Endocardial fibroelastosis is secondary to hemodynamic alterations in the chick embryonic model of hypoplastic left heart syndrome. Developmental Dynamics. 247 (3), 509-520 (2018).
- Hu, N., et al. Dependence of aortic arch morphogenesis on intracardiac blood flow in the left atrial ligated chick embryo. Anatomical Record. 292 (5), 652-660 (2009).
- Lashkarinia, S. S., et al. Myocardial biomechanics and the consequent differentially expressed genes of the left atrial ligation chick embryonic model of hypoplastic left heart syndrome. Annals of Biomedical Engineering. 51 (5), 1063-1078 (2023).
- Krejčí, E., et al. Microarray analysis of normal and abnormal chick ventricular myocardial development. Physiological Research. 61, S137-S144 (2012).
- Rahman, A., et al. A mouse model of hypoplastic left heart syndrome demonstrating left heart hypoplasia and retrograde aortic arch flow. Disease Models & Mechanisms. 14 (11), (2021).
- Fishman, N. H., Hof, R. B., Rudolph, A. M., Heymann, M. A. Models of congenital heart disease in fetal lambs. Circulation. 58 (2), 354-364 (1978).
- Wong, F. Y., et al. Induction of left ventricular hypoplasia by occluding the foramen ovale in the fetal lamb. Scientific Reports. 10 (1), 880 (2020).
- Nie, S. Use of frogs as a model to study the etiology of HLHS. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 10 (2), 51 (2023).
- Vilches-Moure, J. G. Embryonic chicken (Gallus gallus domesticus) as a model of cardiac biology and development. Comparative Medicine. 69 (3), 184-203 (2019).
- Kain, K. H., et al. The chick embryo as an expanding experimental model for cancer and cardiovascular research. Developmental Dynamics. 243 (2), 216-228 (2014).
- Sukparangsi, W., Thongphakdee, A., Intarapat, S. Avian embryonic culture: A perspective of in ovo to ex ovo and in vitro studies. Frontiers in Physiology. 13, 903491 (2022).
