Summary
In dieser Arbeit stellen wir ein detailliertes visuelles Protokoll für die Durchführung des Modells der linksatrialen Ligatur (LAL) im Vogelembryo vor. Das LAL-Modell verändert den intrakardialen Fluss, was die Belastung durch Wandscherspannung verändert und das hypoplastische Linksherzsyndrom nachahmt. Es wird ein Ansatz vorgestellt, um die Herausforderungen dieses schwierigen mikrochirurgischen Modells zu bewältigen.
Abstract
Aufgrund seiner vierkammerigen reifen ventrikulären Konfiguration, der einfachen Kultur, des Zugangs zur Bildgebung und der Effizienz ist der Vogelembryo ein bevorzugtes Wirbeltiermodell für die Untersuchung der kardiovaskulären Entwicklung. Studien, die darauf abzielen, die normale Entwicklung und die Prognose von angeborenen Herzfehlern zu verstehen, übernehmen dieses Modell in großem Umfang. Mikroskopische Operationstechniken werden eingeführt, um die normalen mechanischen Belastungsmuster zu einem bestimmten embryonalen Zeitpunkt zu verändern und die nachgeschaltete molekulare und genetische Kaskade zu verfolgen. Die häufigsten mechanischen Eingriffe sind die Ligatur der linken Vitellinvene, das konotrunkale Band und die linksatriale Ligatur (LAL), die den intramuralen Gefäßdruck und die Wandscherbelastung aufgrund des Blutflusses moduliert. Die LAL ist, insbesondere wenn sie in ovo durchgeführt wird, der anspruchsvollste Eingriff, mit sehr geringen Probenausbeuten aufgrund der extrem feinen sequentiellen mikrochirurgischen Eingriffe. Trotz seines hohen Risikos ist LAL in ovo wissenschaftlich sehr wertvoll, da es die Pathogenese des hypoplastischen Linksherzsyndroms (HLHS) nachahmt. HLHS ist ein klinisch relevanter, komplexer angeborener Herzfehler, der bei menschlichen Neugeborenen beobachtet wird. Ein detailliertes Protokoll für in ovo LAL ist in diesem Artikel dokumentiert. Kurz gesagt, befruchtete Vogelembryonen wurden bei 37,5 °C und 60 % konstanter Luftfeuchtigkeit inkubiert, typischerweise bis sie die Hamburger-Hamilton (HH)-Stadien 20 bis 21 erreichten. Die Eierschalen wurden aufgebrochen und die äußere und innere Membran entfernt. Der Embryo wurde vorsichtig gedreht, um den linken Vorhofkolben des gemeinsamen Vorhofs freizulegen. Vormontierte Mikroknoten aus 10-0 Nylonnähten wurden vorsichtig positioniert und um die linke Vorhofknospe gebunden. Schließlich wurde der Embryo in seine ursprüngliche Position zurückgebracht und die LAL war abgeschlossen. Normale und LAL-instrumentierte Ventrikel zeigten statistisch signifikante Unterschiede in der Gewebeverdichtung. Eine effiziente Pipeline zur Generierung von LAL-Modellen würde zu Studien beitragen, die sich auf synchronisierte mechanische und genetische Manipulation während der embryonalen Entwicklung kardiovaskulärer Komponenten konzentrieren. Ebenso wird dieses Modell eine gestörte Zellquelle für die Gewebekulturforschung und die Gefäßbiologie darstellen.
Introduction
Angeborene Herzfehler (KHK) sind strukturelle Störungen, die aufgrund einer abnormen Embryonalentwicklung auftreten1. Neben genetischen Gegebenheiten wird die Pathogenese durch veränderte mechanische Belastung beeinflusst 2,3. Das hypoplastische Linksherzsyndrom (HLHS), ein angeborener Herzfehler, führt zu einer unterentwickelten Herzkammer/Aorta bei der Geburt4 mit einer hohen Mortalitätsrate 5,6. Trotz der jüngsten Fortschritte in der klinischen Behandlung sind das Gefäßwachstum und die Entwicklungsdynamik des HLHS noch unklar7. In der normalen Embryonalentwicklung stammen das Endokard und das Myokard des linken Ventrikels (LV) von kardialen Vorläuferzellen ab, während die frühe embryonale Herzröhrenbildung fortschreitet. Das allmähliche Vorhandensein von myokardialer Trabekulation, Verdickungsschichten und Kardiomyozytenproliferation wird berichtet2. Beim HLHS werden ein verändertes trabekuläres Remodeling und eine linksventrikuläre Abflachung beobachtet, was aufgrund einer abnormen Kardiomyozytenmigration weiter zur myokardialen Hypoplasie beiträgt 2,8,9,10
Unter den weit verbreiteten Modellorganismen zur Untersuchung der Herzentwicklung und zum Verständnis hämodynamischer Bedingungen 11 wird der Vogelembryo aufgrund seines vierkammerigen reifen Herzens und seiner einfachen Kultivierbarkeit bevorzugt11,12,13,14. Auf der anderen Seite bietet der erweiterte Zugang zur Bildgebung von Zebrafischembryonen und transgenen/Knockout-Mäusen deutliche Vorteile11,12. Für den Vogelembryo wurden verschiedene mechanische Eingriffe getestet, die den intramuralen Druck und die Wandscherspannung bei der Entwicklung kardiovaskulärer Komponenten verändern. Zu diesen Modellen gehören die linke Vitellin-Ligatur, das konotrunkale Banding15 und die linksatriale Ligatur (LAL)11,12,16. Der resultierende Phänotyp aufgrund der veränderten mechanischen Belastung kann ca. 24-48 h nach dem chirurgischen Eingriff in Studien beobachtet werden, die sich auf die frühe Prognose konzentrieren11,13. Die LAL-Intervention ist eine beliebte Technik, um das funktionelle Volumen des linken Vorhofs (LA) zu verengen, indem eine Nahtschlaufe um die atrioventrikuläre Öffnung gelegt wird. Ebenso wurden mikrochirurgische Eingriffe durchgeführt, die auf die rechtsatriale Ligatur (RAL) abzielen17,18. In ähnlicher Weise zielen einige Forscher mit Mikroclips auf das linke Vorhofohr (LAA) ab, um das Volumen des LA19,20 zu reduzieren. In einigen Studien wird ein chirurgischer Nylonfaden auf den atrioventrikulären Knoten19,21 aufgebracht. Eine der verwendeten Interventionen ist LAL, die HLHS nachahmen kann, aber auch das am schwierigsten durchzuführende Modell ist, mit sehr geringen Probenausbeuten aufgrund der extrem feinen mikrochirurgischen Eingriffe, die erforderlich sind. In unserem Labor wird die LAL in ovo zwischen den Hamburger-Hamilton (HH) Stadien 20 und 21 durchgeführt, bevor der gemeinsame Vorhof vollständig septiert ist 6,14,22,23. Um das LA herum wird eine chirurgische Naht gelegt, die den intrakardialen Blutfluss verändert. In LAL-Modellen des HLHS werden eine erhöhte Ventrikelwandsteifigkeit, veränderte Myofaserwinkel und eine verringerte LV-Hohlraumgröße beobachtet14,24.
In diesem Videoartikel wird ein detailliertes Protokoll und eine Vorgehensweise für in ovo LAL bereitgestellt. Kurz gesagt, die befruchteten Vogelembryonen wurden für die Mikrochirurgie inkubiert, die Eierschale aufgebrochen und die äußere und innere Membran gereinigt. Der Embryo wurde dann langsam gedreht, so dass die LA zugänglich war. Eine chirurgische 10:0-Nylonnaht wurde an die Vorhofknospe gebunden, und der Embryo wurde in seine ursprüngliche Ausrichtung zurückgebracht, wodurch das LAL-Verfahrenabgeschlossen wurde 25. LAL- und Normalventrikel werden mittels optischer Kohärenztomographie und Basishistologie auf Gewebeverdichtung und Ventrikelvolumen verglichen.
Eine erfolgreich durchgeführte LAL-Modellpipeline, wie hier beschrieben, wird zu Grundlagenstudien beitragen, die sich auf die embryonale Entwicklung kardiovaskulärer Komponenten konzentrieren. Dieses Modell kann auch zusammen mit genetischen Manipulationen und fortschrittlichen Bildgebungsmodalitäten verwendet werden. Ebenso ist das akute LAL-Modell eine stabile Quelle für erkrankte Gefäßzellen für Gewebekulturexperimente.
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Protocol
Fruchtbare weiße Leghorn-Eier werden von vertrauenswürdigen Lieferanten bezogen und nach von der Universität genehmigten Richtlinien bebrütet. Kükenembryonen in den Stadien 18 (Tag 3) bis 24 (Tag 4) (die in diesem Artikel vorgestellten Stadien) gelten gemäß der Richtlinie 2010/63/EU der Europäischen Union (EU) und den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) in den USA nicht als lebende Wirbeltiere. Kükenembryonen gelten nach US-Recht nach dem 19. Tag der Inkubation als "lebende Tiere", jedoch nicht für die EU. Jedes Ei ist mit dem Startdatum des Schlüpfens gekennzeichnet und soll spätestens am 10. Tag der Inkubation schlüpfen. Nachdem die Eier geschlüpft sind, werden die Küken aus dem Brutkasten genommen. Das Protokoll wird in zwei Bench-Top-Operationsstationen (Station 1 und Station 2) durchgeführt, wobei der Schwerpunkt auf spezialisierten Modellgenerierungsstufen liegt.
1. Vorbereitung vor der Mikrochirurgie
- Beziehen Sie befruchtete Eizellen entweder von einem Impfstoffentwicklungszentrum mit einem bestimmten pathogenfreien (SPF) Grad oder über eine vertrauenswürdige kommerzielle Lieferantenfarm durch einen zerbrechlichen Lieferkurier in trockenen Styroporbehältern. Reinigen Sie die Eierschale vor der Inkubation vorsichtig mit fusselfreien Tüchern, die in 70%igem Ethanol getränkt sind, um Verunreinigungen zu entfernen.
- Einschluss-/Ausschlusskriterien für Embryonen
- Bebrüten Sie keine Eier, die während des Transports aufgebrochen oder beschädigt wurden.
- Wenn während des LAL-Eingriffs oder nach der Reinkubation Blutungen festgestellt werden, darf der Embryo nicht verwendet werden.
- Verwenden Sie keine Embryonen, die sich mit der linken Seite nach oben entwickeln, da der hämodynamische Blutfluss von der normalen Ausrichtung abweichen kann.
- Dıscard-Embryonen, die sich mit angeborenen Defekten sowohl vor als auch nach chirurgischen Eingriffen entwickeln.
- Embryonen, die das Zielstadium erreichen, entwickeln sich an ihrem ursprünglichen Ort und ahmen HLHS als LAL-Modell nach.
- Die befruchteten Eier des Weißen Leghorn-Huhns (Gallus gallus domesticus L.) werden mit stumpfem Ende bis zum gewünschten Stadium bebrütet, typischerweise bei HH20-2115 (37,5 °C, 60 % Luftfeuchtigkeit, 3,5 Tage) (Abbildung 1).
HINWEIS: Es ist wichtig, die Eier bei einer konstanten Temperatur und Luftfeuchtigkeit aufzubewahren, um den Ertrag zu steigern. Je nach Inkubatormodell sorgt die Zugabe eines mit destilliertem Wasser gefüllten Topfes für eine stabile Luftfeuchtigkeit. Die Autoren entwickeln und empfehlen Entwürfe für ein zusätzliches/zusätzliches Temperatur- und Feuchtigkeitskontrollsystem, das in die meisten Inkubatoren passen würde. Die Elektronik-, Hardware- und Codedetails dieser intern gebauten Sensor-/Steuereinheit werden in einem Datenspeicher26 bereitgestellt. Kontinuierliches sanftes Schütteln (Drehen) der Eier während der Inkubation kann eine optimale Positionierung des Embryos ermöglichen und somit zu einem höheren Prozentsatz an "funktionsfähigen" Embryonen führen. Das Schütteln kann auch mit Inkubatoren mit dieser Kapazität arbeiten und die Produktivität weiter steigern. - Bevor Sie mit dem Eingriff beginnen, bereiten Sie die erforderliche Anzahl von Knoten vor, indem Sie einen losen Überhandknoten in eine 1,5 cm lange 10-0-Naht binden. Achten Sie darauf, dass der Knoten nicht fest sitzt und groß genug ist, um während der Operation problemlos über die Vorhöfe zu passen (Abbildung 2).
HINWEIS: Binden Sie die Knoten im Voraus und bewahren Sie sie vor der Verwendung in einer sterilen Kükenringlösung auf. Das Knotenbinden erfordert den Einsatz von zwei Händen, um die Pinzette synchron zu bedienen. Da es sich hierbei um eine kritische Phase des Protokolls handelt, kann ein Modell des Vorhofs aus Spachtelmasse hergestellt werden, um diesen Schritt zu üben (Abbildung 3). Dadurch werden die dreidimensionalen mikrochirurgischen Fähigkeiten verbessert, die für die Durchführung von Schritt 3.2.3 an Station 2 erforderlich sind (Abbildung 4).
2. Betrieb an Station 1 (Abbildung 4A)
- Öffnen Sie ein Fenster vom stumpfen Ende des Eies und entfernen Sie sowohl die äußere als auch die innere Membran15 (Abbildung 5A-D).
- Öffnen Sie die Eierschale, indem Sie sie vorsichtig mit dem umgekehrten Ende der Pinzette aufschlagen, wobei die freien Finger das Ei fest stützen, um eine unerwünschte Ausbreitung von Rissen zu verhindern.
- Da es sich bei der LAL um eine langwierige Prozedur handelt, sollten Temperatur und Luftfeuchtigkeit des Embryos beibehalten werden, da die Herzfrequenz von der Temperatur abhängt. Stellen Sie daher sicher, dass das anfängliche Shell-Fenster so klein wie möglich erstellt wird, gerade genug, um die Vorgänge auszuführen.
HINWEIS: Während des Betriebs werden keine Feuchtigkeits- oder Temperaturregelungssysteme eingesetzt, aber diese Systeme, falls vorhanden, würden dem Ertrag zugute kommen. Wenn möglich, wird die Klimaanlage im Labor abgeschaltet und der Eingriff bei der höchstmöglichen Raumtemperatur (RT) durchgeführt. Eine Optimierung der embryonalen Herzfrequenz, die durch die Temperatur gesteuert werden kann, während der Operation wird ebenfalls empfohlen. Einige Labore halten die Herzfrequenz während des LAL-Betriebs über die Temperaturregelung auf etwas niedrigeren Raten als 120 Schlägen pro Minute. Daher würde die Feuchtigkeitskontrolle rund um die chirurgische Zone die Ausbeute weiter erhöhen. Die Eierschalenfenster werden so klein wie möglich gestaltet, gerade groß genug, um einen chirurgischen Zugang zu ermöglichen. Dies gilt auch für die dicke äußere Membran, die in der Regel nur im Umfang des Embryos kleiner ist als die Eierschale. Diese sorgen dafür, dass die Temperatur und Luftfeuchtigkeit des Embryos aufrechterhalten werden. Beim Öffnen eines Fensters vom stumpfen Ende des Eies werden die kleinen Schalenfragmente gereinigt, damit diese Stücke die vitelline Gefäßintegrität nicht beschädigen oder zu unerwünschten Artefakten führen. Darüber hinaus verwenden andere Labore gebogene Mikrozahnscheren für die Herstellung von Fenstern. Außerdem können zwei Breiten Tesafilm verwendet werden, um die Eierschale zu stabilisieren und Risse zu kontrollieren. - Entfernen Sie nur die notwendige Vitellinmembran mit einer Mikroschere (Ergänzungsvideo 1).
- Die normale Embryonalentwicklung verläuft mit der rechten Seite nach oben. Sobald der Embryo von der Vitellinmembran befreit ist, legen Sie die Pinzette mit geschlossenen Spitzen unter das dorsale Segment des Embryos und drehen Sie den Embryo vorsichtig um, um die linke Seite freizulegen (d. h. die Konfiguration mit der linken Seite nach oben) (Abbildung 6A,B; Ergänzendes Video 2).
- Stellen Sie sicher, dass die linke Vorhofknospe nun freiliegt, aber immer noch von einem komplexen Membransystem bedeckt ist, das typischerweise aus einer doppelten Schicht des Perikards besteht.
- Entferne die Membranen, einschließlich der feinen, unmittelbar um die Vorhofknospe herum. Dies ist eine weitere kritische Phase; Führen Sie die Entfernung der Membranen von den groben Membranen durch und gehen Sie zu den feinen Membranen um die linke Vorhofknospe vor. Heben Sie die feinste Pinzette für die Entfernung der feinen Membran auf (Ergänzungsvideo 3).
- Während der Membranentfernung wird der Embryo mit der linken Seite nach oben ausgerichtet, so dass die Knotenplatzierung in Schritt 3.2 ohne weitere Neupositionierung durchgeführt werden kann. Um dies zu erreichen, heben Sie den Embryo mit Hilfe der Membranen in Schritt 2.6 an und hängen Sie ihn an die Eierschale, wobei die linke Seite nach oben zeigt.
HINWEIS: Einige Embryonen können sich in der Nähe der Peripherie der Eierschale befinden und es kann schwierig sein, sie zu operieren. Dennoch werden diese Embryonen höchstwahrscheinlich mit der rechten Seite nach oben ausgerichtet sein und ein normales Verhalten zeigen und können in die Studie einbezogen werden. In diesen Fällen kann bei Bedarf der verdeckte Vorhof besser zugänglich gemacht werden, indem die Perikardmembran vorsichtig mit einer feinen Pinzette #4 gereinigt und die Eierschale in umgekehrter Richtung (in Richtung der Schalenöffnung) entfernt wird. Diese Embryonen können auch mit Teilen der extraembryonalen Membranen angehoben und an der gewünschten Position fixiert werden, indem ein Ende der Membran (das Pinzettenende) an der Eierschale befestigt wird, wobei deren natürliche Klebrigkeit genutzt wird. Zusätzlich kann der Raum zwischen Kopf und Rückenmark des Embryos mit Hilfe einer Pinzette erweitert werden, um den verdeckten Vorhof freizulegen.
3. Betrieb an Station 2 (Abbildung 4B)
- Unter dem Stereomikroskop wird der präparierte Knoten aus Schritt 1.4 in der Nähe des Embryos an einer zugänglichen Stelle positioniert (Abbildung 6B). Die Vorhofknospe kann nun abgebunden werden (Ergänzungsvideo 4).
- Holen Sie den vorbereiteten offenen Knoten heraus und richten Sie ihn über die linke Vorhofknospe aus. Damit LAL funktioniert, legen Sie das Ei in einer einzigartig geneigten dreidimensionalen Ausrichtung ab.
- Richten Sie den Knoten richtig aus, um den Straffungsprozess durchzuführen, ohne die Embryonen zu beschädigen.
- Reinigen Sie die feinen Membranen in Schritt 2.7 optimal, um die Wirkung eines schlagenden Herzens zu reduzieren.
- Ziehen Sie die Naht fest (Abbildung 6C). Für diesen Schritt ist das Üben mit der Knete sehr nützlich. Bei Scheinembryonen ziehen Sie den Knoten gerade so fest, dass der Knoten gehalten wird.
- Als nächstes schneidest Du mit der Mikroschere die überschüssigen Enden der Naht so nah wie möglich an der Knospe ab (Zusatzvideo 5).
- Achten Sie darauf, dass die neu durchtrennten Enden der gebundenen Naht während der Rotation oder aufgrund des Herzschlags nicht in der Lage sind, nahe gelegene Gefäße zu punktieren.
- Entfernen Sie mit der Pinzette die überschüssigen Nahtstücke, die in Schritt 3.3 abgeschnitten wurden.
- Zum Schluss wird der Embryo mit einer geschlossenen Pinzette wieder in seine ursprüngliche Position gebracht, wie in Schritt 2.5 (Ergänzendes Video 6).
- Nach Abschluss des LAL-Prozesses wird das Ei mit einer doppelten Schicht Parafilm bedeckt und erneut bebrütet. Ein dichter und steriler Verschluss der Eier ist für das Überleben von größter Bedeutung, insbesondere nach 24 Stunden Inkubation. Wenn auch ein visueller Zugang gewünscht ist, verwenden Sie Paraffinwachs mit Glasobjektträgern.
HINWEIS: Wenn die frühe Embryonalperiode untersucht wird, werden die Eier in der Regel 24-48 Stunden lang bebrütet, bis sie etwa HH25 oder HH27 erreichen. Es gibt jedoch keine Grenze, und spätere Stadien können untersucht werden, wie es andere Forscher versuchen. Für schnelle Betriebsgeschwindigkeiten wird mindestens ein zweiköpfiges Team empfohlen. Eine Person sollte geschult werden und ist für die Eiöffnung, die anfängliche Reinigung der Membran, die Rotation und die Reinigung der Membran um die linke Vorhofknospe herum verantwortlich. Die andere Person ist nur für die anfängliche Knotenvorbereitung, das Setzen des Knotens und das Anziehen des Knotens verantwortlich. Die letzte Embryorotation kann von Person 1 durchgeführt werden. Der chirurgische Eingriff an einem einzelnen Embryo dauert ca. 4-5 Minuten. - Reinigen Sie vor/nach chirurgischen Eingriffen die Tischoberflächen und Instrumente mit Ethanol. Stellen Sie sicher, dass frische Kükenringlösung (NaCl, KCl, CaCl2 und NaHCO3)16,27 auf die Metallinstrumente aufgetragen wird, die das embryonale Gewebe berühren.
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Representative Results
Fortschrittliche zeitaufgelöste bildgebende Verfahren können eingesetzt werden, um die strukturellen und morphologischen Veränderungen aufgrund der LAL-Intervention zu beobachten10. Darüber hinaus sind LAL-Proben auch für molekulare und biologische Methoden geeignet19,28. In Tabelle 1 sind Beispielstudien aufgeführt, bei denen LAL-Modellergebnisse verwendet wurden. In diesem Zusammenhang wurde eine LAL-Intervention an Kükenembryonen durchgeführt, die HH20-21 erreichten. Sowohl das Kontrollherz (gesund) als auch das LAL-Herz wurden dem Embryo bei HH25-26 entfernt. Anschließend wurden die Proben in 4% Paraformaldehyd (PFA) bei 4 °C 6,15 fixiert. Die entnommenen Herzproben wurden dann in Ethanollösungen mit steigenden Konzentrationen (70 %, 96 % und 100 %) für jeweils 1 Stunde dehydriert. Schließlich wurden die Proben 0,5 h lang in Xylol bei RT aufbewahrt und eine Paraffineinbettung durchgeführt, bevor sie bei einer Dicke von 10 μm geschnitten wurden. Die auf den Objektträger übertragenen Proben wurden mit Elastica van Gieson gefärbt. Die Schnitte wurden unter einem Stereomikroskop untersucht, wobei der Querdurchmesser der Herzkammer gemessen wurde. Wir führten auch eine dreidimensionale nicht-invasive Methode, die optische Kohärenztomographie (OCT), in einigen Proben durch 11,29. Sowohl das Kontroll- als auch das LAL-Herz bei HH25-26 wurden herausgeschnitten und ihre Kreuzlumendurchmesser wurden unter OCT gemessen.
Die Ergebnisse zeigten, dass für LAL eine kompaktere myokardiale Struktur mit signifikanten morphologischen Veränderungen im Vergleich zur normalen Entwicklung erreicht wird (Abbildung 7). Darüber hinaus wird die Ablagerung von extrazellulären Matrixkomponenten, wie z. B. Kollagen, um das kardiale Interstitium herum beobachtet, was einer Myokardfibrose ähnelt, die dem HLHS30 ähnelt. Um die myokardiale Verdickung und trabekuläre Verdichtung besser zu verstehen, wurden morphometrische Porositätsmessungen sowohl in Kontroll- als auch in LAL-Proben durchgeführt. Erwartungsgemäß führte die LAL-Intervention zu einer Verkleinerung der linken Ventrikularhöhle und einer trabekulären Verdichtung durch Straffung der intertrabekulären Recessationen. Diese Ergebnisse bestätigen die Hypothese, dass LAL die gesunde Ventrikelarchitektur verändert und den trabekulären Aspekt neu ausrichtet22. Ebenso führte das LAL-Modell bei HH29 zu einer vergrößerten rechtsventrikulären Höhle, einer veränderten Trabekelarchitektur und einem veränderten Myokardvolumen24.
Um die in dieser Studie erzielten Ergebnisse zu untermauern, wurde die OCT-Bildgebung verwendet, um die ventrikuläre Lumenquerfläche und die axiale Länge zu messen (Abbildung 8). LAL zeigte eine signifikante Verringerung der linksventrikulären Größe und des Durchmessers im Vergleich zur Kontrolle. Während hier nur die Ventrikel fokussiert sind, wird auch über den Einfluss von LAL auf die Entwicklung des Aortenbogens berichtet31. Eine aktuelle Studie, an der wir in 3D mitgewirkt haben, berichtete, dass die Mittelwand-Myokardbelastungen in beiden Ventrikeln nach LAL bei HH2532 erhöht waren. Darüber hinaus zeigten die LAL-Gruppen eine Zunahme der Wanddicke im Vergleich zu den Kontrollgruppen bei HH25. Diese Studie steht im Einklang mit der vorherigen Studie von Tobita et al.25, die einen signifikanten Anstieg der maximalen systolischen epikardialen Umfangsbelastungen im LAL LV bei HH27 zeigte.
Abbildung 1: Inkubationssystem für das Embryonalwachstum. Befruchtete weiße Leghorn-Hühnereier (Gallus gallus) wurden in einem Inkubator bei konstanter Luftfeuchtigkeit (60%) und Temperatur (37,5 °C) inkubiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Vorbereitung des LAL-Knotens. Mehrere Knoten mit einem Durchmesser von ~0,5-1 mm und eine Länge von 1-2 cm wurden mit chirurgischen 10-0 Nylonnähten hergestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Nachbildung des embryonalen linken Vorhofs aus Spachtelmasse. Es wird eine Nachbildung des linken Vorhofabschnitts erstellt, um die Knotenorientierung und das Knotenschließen mit zwei Pinzetten zu trainieren und zu üben. Dies ermöglichte es uns, viele Versuche zu machen und diese Schritte zu perfektionieren, bevor wir diese Fähigkeit im eigentlichen Embryo einsetzten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Stationsvorbereitung . (A,B) Alle Materialien und Lösungen für die Mikrochirurgie wurden im Reinraum für Station 1 und Station 2 platziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Öffnen eines Fensters vom stumpfen Ende der Eizelle und Entfernen der äußeren und inneren Membran. (A,B) Ein kleines Fenster wurde mit mikrochirurgischen Instrumenten auf der Eierschale geöffnet und umfasste den gesamten Embryo in HH20-21. (C) Fragmente der Eierschale wurden im ersten Knackschritt entfernt. (D,E) Auch extraembryonale Membranen wurden unter dem Mikroskop präpariert. (F) Nachdem der LAL-Prozess abgeschlossen war, wurde das Ei mit einer doppelten Schicht Parafilm bedeckt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Eine Momentaufnahme der In-ovo-Operation der linksatrialen Ligatur (LAL). (A) Dorsale Ansicht des Kükenembryos in seiner normalen Ausrichtung. Der embryonale Ventrikel, der HH20-21 erreicht, hat einen primitiven gemeinsamen Vorhof (a), einen Ventrikel (v) und den Ausflusstrakt (ot). (B) Eine Nahaufnahme des dorsalen Embryos mit der linken Seite nach oben und der Knotenstelle wird angezeigt. (C) LA mit dem Nahtknoten. Abkürzungen: LA = linker Vorhof; AA = Aortenbogen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 7: Entfernung und Untersuchung des Kontroll- und LAL-Herzens. Sowohl (A) Kontroll- als auch (B) LAL-Herzen, die das HH25-26-Stadium erreichten, wurden aus dem Embryo entnommen und unter einem Stereomikroskop untersucht. Das Balkendiagramm zeigt die Unterschiede im transversalen Herzdurchmesser zwischen der LAL-Gruppe und der Kontrollgruppe sowie die mittlere ± Standardabweichung (SD) von mindestens vier Wiederholungen. Maßstabsbalken = 100 μM. Histologische Untersuchung von Herzgewebe in (C)-Kontroll- und (D) LAL-Proben mit der Elastica-van-Gieson-Färbetechnik. Das Balkendiagramm zeigt die Unterschiede in der Porosität (%) zur Darstellung der myokardialen Kompression zwischen der LAL und der Kontrollgruppe sowie die mittlere ± SD von mindestens zwei Replikaten. **p < 0,01. Für die statistische Analyse wurde GraphPad Prism Version 9.5.1 verwendet. Maßstabsbalken = 50 μM. Abkürzungen: LAL = linksatriale Ligatur; LA = linker Vorhof; RA = rechter Vorhof; RV = rechter Ventrikel; LV = linker Ventrikel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 8: Optische Kohärenztomographie. Sowohl (A) Kontroll- als auch (B) LAL-Herzen, die HH25-26 erreichten, wurden mittels OCT untersucht. (C,D) Die Größe und Länge des Lumenkreuzes der Ventrikel sind in den Panels (C) bzw. (D) angegeben. Die Histogramme stellen den Mittelwert ± SD mit mindestens drei Wiederholungen dar. *p < 0,05; **p < 0,01; Für die statistische Analyse wurde GraphPad Prism Version 9.5.1 verwendet. Maßstabsbalken = 100 μM. Abkürzungen: LAL = linksatriale Ligatur; RV = rechter Ventrikel; LV = linker Ventrikel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Tabelle 1: Ein Überblick über Forschungsstudien, die das Modell der linksatrialen Ligatur (LAL) bei Vogelembryonen 6,10,12,14,22,24,27,30,32,33 verwenden.
In fast allen Zeitungen liegt der LA bei HH21. Die Wirkung von LAL wird in späteren HH-Stadien (Assessment-Phase) untersucht. Abkürzungen: AVC = atrioventrikuläres Kissen; LAV = linker atrioventrikulärer Kanal; RAV = rechter atrioventrikulärer Kanal; RA = rechte Vorhöfe; LA = linker Vorhof; RV = rechter Ventrikel; LV = linker Ventrikel; SEN = Subendokard; IVS = interventrikuläres Septum; Mikro-CT = Mikrocomputertomographie. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 2: Typische Wirksamkeit des Modells der linksatrialen Ligatur (LAL), das bei HH21 entwickelt und bis HH25 inkubiert wurde. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Ergänzendes Video 1: Sowohl die äußere als auch die innere Membran des Vogelembryos werden entfernt. Dann wird nur noch die Vitellinmembran entfernt, wie mit einer Mikroschere gezeigt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzendes Video 2: Die Pinzette wird unter das dorsale Segment des Embryos mit der rechten Seite nach oben gelegt und vorsichtig umgedreht, um die linke Vorhofknospe freizulegen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzungsvideo 3: Die Membranen um die linke Vorhofknospe werden nach und nach gereinigt. Das Atrium dehnt sich leicht aus, was das Knüpfen und Binden von Knoten ermöglicht. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzendes Video 4: Eine ca. 0,1-0,3 mm lange Naht wird in der Nähe des Embryos positioniert und mit zwei Pinzetten um ihn herum festgezogen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzungsvideo 5: Die überschüssigen Nahtenden des Knotens werden vorsichtig mit einer Mikroschere abgeschnitten. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzendes Video 6: Der Embryo wird sanft in seine normale Ausrichtung zurückgebracht. LAL ist abgeschlossen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Beim HLHS ist der Blutfluss aufgrund struktureller Defekte verändert, was zu einer abnormen Morphologie auf der linken Seite führt 4,6. Das vorliegende Modell bietet ein praktisches experimentelles System, um das Fortschreiten des HLHS besser zu verstehen und könnte sogar seine Pathogenese nachahmen8. Die Etablierung eines vollständig klinisch äquivalenten HLHS-Tiermodells ist jedoch eine herausfordernde Aufgabe. Zusätzlich zu dem hier vorgestellten LAL-Modell von Vögeln haben neuere Studien an Mäusen, fötalen Schafen und Fröschen versucht, die morphologischen, hämodynamischen und pathophysiologischen Merkmale der HLHS-Prognose zu replizieren. Bei Mäuseembryonen wird die mechanische Belastung durch ein embolisierendes Mittel verändert, das durch eine fetale Intervention am Embryonaltag (ED) 14,5 (ca. HH40-41 bei Kükenembryonen) in das LA injiziert wird34. Insgesamt 48 % der positiv embolisierten Föten überlebten die Schwangerschaft mit kleinen LVs und retrogradem Aortenfluss. Die lange Schwangerschaftszeit, weitere Herausforderungen bei Eingriffen zu frühen Zeitpunkten und eine schwierige fetale Chirurgie können die Durchführbarkeit dieses Modells einschränken. Die LV-Hypoplasie wurde auch in den fetalen Lammmodellen nachgeahmt, indem das LA durch einen Ballonkatheter mit Silikonkautschuk gefülltwurde 35. In diesem Großtiermodell ist das LV-Volumen ausreichend reduziert, aber die Überlebenszeit ist nicht lang, was zu einer geringen Krankheitsdurchdringung führt. Ein alternativer Interventionsansatz ist der Verschluss des Foramen ovale durch eine perkutane transhepatische Katheterisierung, wie dies beim fötalen Lamm36 versucht wurde, auch wenn die Ausrichtung des okklusiven Stents auf das Foramen ovale sehr schwierig ist. Schafmodelle sind im Allgemeinen aufgrund ihrer bereits bestehenden Gefäßmorphologien und ihrer ungünstigen Lungenphysiologie sehr anspruchsvoll. Die Notwendigkeit einer saisonalen Züchtung, ein späteres Trächtigkeitsalter und eine kleine Stichprobengröße schränken dieses Modell weiter ein. Schließlich wird der Xenopus-Embryo auch als ein weiteres geeignetes Modell für die Nachahmung menschlicher Herzerkrankungenvorgestellt 37, trotz seines Dreikammerherzens mit einem einzigen Ventrikel und Unterschieden in den Neuralleistenzellmustern. Die Verfügbarkeit von vollständig genombasierten Mikroinjektionen und mikrochirurgischen Eingriffen sowie die lange Überlebenszeit machen dieses Modell ebenfalls attraktiv.
In früheren Studien wurde die Krankheitspenetration von sechs von 39 operierten Vogelembryonen im LAL-Modell34 mit 15 % angegeben. Die durchschnittliche HLHS-Penetration des Kükenembryomodells, das wir im Frühstadium untersuchten (HH25 und HH27), betrug jedoch 66% (12 von 18 operierten Vogelembryonen). Prof. Sedmera berichtete, dass die durchschnittliche Überlebenszeit von Embryonen HH40 (ED14)19 betragen könnte. Andere Gruppen, die diese Ligatur regelmäßig durchführen, berichteten von hohen Erfolgsraten zu frühen Zeitpunkten (z. B. 75 % bis HH29, 50 % bis HH34 und 20 % bis HH38)30. In späteren Stadien entsteht jedoch ein ausgeprägter Phänotyp und die Sterblichkeit steigt. Obwohl die Krankheitsdurchdringung bei Kükenembryonen relativ gering sein kann, ist es das Ziel dieses Modells, die Ätiologie und Pathologie des pränatalen HLHS, insbesondere in den frühen Stadien, besser zu untersuchen.
Aufgrund der sehr geringen Größe des Kükenembryos im Frühstadium kann eine prä- und postoperative LAL-Intervention zu verschiedenen Komplikationen führen. Um eine Kontamination zu vermeiden, werden Eierschalen und Bänke mit 70 % Ethanol gereinigt, und während des gesamten Eingriffs können Handschuhe verwendet werden. Ein kritischer Schritt im LAL-Protokoll ist die Entfernung der gesamten Perikardmembran, um einen guten Sitz des Knotens um die linke Vorhofknospe zu ermöglichen. Darüber hinaus haben wir festgestellt, dass das zweiköpfige Team äußerst nützlich ist, insbesondere bei der Schulung und Spezialisierung auf bestimmte Fähigkeiten, die während der Protokollschritte benötigt werden. Dieser Ansatz beschleunigt das Verfahren und seine Lernkurve. Daher ist das Risiko von Blutungen und Kontaminationen zweitrangig und überwiegt die Vorteile des vorgeschlagenen Buddy-Systems. Es wird empfohlen, eine vorbereitete Naht zu verwenden, die in einer sterilen Kükenringlösung aufbewahrt wird. Darüber hinaus ist die Aufrechterhaltung einer niedrigen Spannkraft der Naht auch entscheidend für eine höhere Embryonenausbeute. Engere Knoten an der Vorhofknospe, die bei HH21 angewendet werden, können zu einem vorzeitigen Versagen des LV führen, der nicht in der Lage ist, die klinisch kritische Beteiligung von Leitungs-, Koronar- und sekundären Myoarchitektur-Remodeling-Defekten herauszuarbeiten, die in früheren Studien gut beschrieben wurden22. Insbesondere die Verwendung der feinsten und unbenutzten Pinzette und Schere bei bestimmten Schritten und relativ stumpfen bei anderen Schritten kann versehentliche Blutungen reduzieren. Schließlich sollte der Embryo unmittelbar nach Beendigung des Knotens schnell in seine ursprüngliche Position gedreht und das Eierschalenfenster mit einer doppelten Schicht Parafilm verschlossen werden, um seine Temperatur und Feuchtigkeit zu erhalten. Die typische Ausbeute für das LAL-Modell, die HH25 erreicht, ist in Tabelle 2 dargestellt. Neben der verminderten Ventrikelgröße können sich auch Herzklappenfehlbildungen entwickeln, wie z. B. eine Mitral-/Aortenatresie. Der Schweregrad dieser Läsionen erhöht die Morbidität in späteren Stadien, wie z.B. beim HLHS. Aufgrund der hier diskutierten Herausforderungen führt das LAL-Modell im Vergleich zu anderen mechanischen Eingriffen, die an Kükenembryonen durchgeführt werden, wie z. B. dem konotrunkalen Banding, zu einem viel geringeren Ertrag. Wir glauben, dass durch die hier vorgestellten Vorsichtsmaßnahmen eine Rendite von 50% erreichbar ist.
Der Vogelembryo ist aufgrund seiner morphologischen Struktur, Größe, geringen Kosten, einfachen Kultur und Manipulation ein ideales Wirbeltiermodell für die Erforschung der kardiovaskulären Entwicklung38,39. Dieses Modell bietet auch einen natürlichen Schutz vor Krankheitserregern40. Instrumentierte Embryonen können für fortgeschrittene In-vivo-Bildgebung und lokale siRNA-Manipulation verwendet werden. Daher sind konservierte Genregionen von Mensch und Huhn durch Sanger-Schrotflintensequenzierung und physikalische Kartierung verfügbar39, was zu fortgeschrittenen mechanosensitiven Studien führt19. Darüber hinaus wurde der von Krejčí et al. angewandte Microarray-Ansatz verwendet, um den Erfolg hinsichtlich der potenziellen Reversibilität hämodynamischer Veränderungen der Myokardstruktur zu messen. So kann die Identifizierung von Genen, die zwischen dem linken und dem rechten Ventrikel unterschiedlich exprimiert werden, als Kriterium für den idealen Interventionszeitraum verwendet werden, wenn irreversible Veränderungen beginnen33.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass zu den möglichen zukünftigen Richtungen für mikrochirurgische Anwendungen im Kükenembryomodell der Einsatz kardiovaskulärer Geneditierungstechniken gehört, die sich auf spezifische Matrixgene und molekulare Signalwege konzentrieren, was Fortschritte in der Gewebezellkultur und den Bildgebungstechnologien unterstützt32.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir danken Tubitak 2247A Lead Researcher Award 120C139 für die Bereitstellung von Fördermitteln. Die Autoren bedanken sich auch bei PakTavuk Gıda. A. S., Istanbul, Türkei, für die Bereitstellung befruchteter Eizellen und die Unterstützung der kardiovaskulären Forschung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10-0 nylon surgical suture | Ethicon | ||
| Elastica van Gieson staining kit | Sigma-Aldrich | 115974 | For staining connective tissues in histological sections |
| Ethanol absolute | Interlab | 64-17-5 | For the sterilization step, 70% ethanol was obtained by diluting absolute ethanol with distilled water. |
| Incubator | KUHL, Flemington, New Jersey-U.S.A | AZYSS600-110 | |
| Kimwipes | Interlab | 080.65.002 | |
| Microscissors | World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL | 555640S | Vannas STR 82 mm |
| Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | Sealing stage for egg reincubation |
| Paraplast Bulk | Leica Biosystems | 39602012 | Tissue embedding medium |
| Stereo Microscope | Zeiss Stemi 508 | Stemi 508 | Used at station 1 |
| Stereo Microscope | Zeiss Stemi 2000-C | Stemi 2000-C | Used at station 2 |
| Tweezer (Dumont 4 INOX #F4) | Adumont & Fils, Switzerland | Used to return the embryo | |
| Tweezer (Super Fine Dumont #5SF) | World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL | 501985 | Used to remove the membranes on the embryo |
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