Summary
在这里，我们提出了一种替代方案，以积极诱导C57BL / 6小鼠的实验性自身免疫性脑脊髓炎，使用免疫原性表位髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）35-55 悬浮在不完全弗氏佐剂中含有热杀灭的 鸟分枝杆菌 亚种副 结核。
Abstract
由髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白 （MOG） 诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎 （EAE） 需要通过在含有灭活结 核分枝杆菌的完全弗氏佐剂 （CFA） 中乳化的 MOG 肽进行免疫接种。分枝杆菌的抗原成分激活树突状细胞，刺激T细胞产生细胞因子，通过toll样受体 促进 Th1反应。因此，抗原激发期间存在的分枝杆菌的数量和种类与EAE的发展直接相关。该方法论文提出了一种替代方案，使用含有热杀灭的 鸟分枝杆菌 亚种副 结核 菌株K-10的改良的不完全弗氏佐剂在C57BL / 6小鼠中诱导EAE。
副结核分枝杆菌是鸟分枝杆菌复合体的成员，是反刍动物中 Johne 病的病原体，已被确定为几种人类 T 细胞介导的疾病的危险因素，包括多发性硬化症。总体而言，接种副结核分枝杆菌的小鼠比接种含有结核分枝杆菌H37Ra菌株的CFA的小鼠以4mg / mL的相同剂量表现出更早的起病和更大的疾病严重程度。鸟分枝杆菌亚种副结核（MAP）菌株K-10的抗原决定簇能够在效应期诱导强烈的Th1细胞反应，其特征在于T淋巴细胞（CD4+ CD27+）、树突状细胞（CD11c+ I-A/I-E+）和单核细胞（CD11b+ CD115+）的数量显着增加）与用CFA免疫的小鼠相比。此外，副结核分枝杆菌免疫小鼠对MOG肽的增殖性T细胞反应似乎最高。在制剂中使用在含有副结核分枝杆菌的佐剂中乳化的脑炎原（例如，MOG35-55）可能是在EAE诱导阶段激活树突状细胞以启动髓鞘表位特异性CD4 + T细胞的替代和经过验证的方法。
Introduction
实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是研究人类脱髓鞘疾病的常用模型1。EAE有几种模型：使用不同的髓磷脂肽与强效佐剂联合进行主动免疫，通过髓鞘特异性CD4 +淋巴细胞的体外转移进行被动免疫，以及自发EAE2的转基因模型。这些模型中的每一个都有特定的特征，可以研究EAE的不同方面，例如发病期，效应期或慢性期。EAE的髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）模型是研究免疫介导的慢性神经炎症和脱髓鞘机制的良好模型，其特征是单核炎症浸润，外周白质脱髓鞘，疾病高峰后恢复减少1。
MOG-EAE是通过在完全弗氏佐剂（CFA）中用肽MOG35-55 对易感小鼠进行免疫，然后腹膜内注射百日咳毒素来诱导的。这增加了血脑屏障的通透性，并允许在外周激活的髓鞘特异性T细胞到达中枢神经系统（CNS），在那里它们将被重新激活3。CFA通过增强抗原呈递细胞的抗原摄取以及与体液和细胞介导的反应相关的细胞因子的表达，在诱导EAE中起关键作用4。这种机制主要是由于在油中乳化杀死的 结核分枝杆菌 的存在，其成分为免疫系统提供了强烈的刺激5。事实上，EAE的诱导与抗原激发期间存在的分枝杆菌数量直接相关6。
在不完全的弗氏佐剂7中添加其他被杀死的分枝杆菌，例如丁酸分枝杆菌，以及辅助组合8的作用，可以调节EAE的临床过程，从而影响结果的可重复性。 鸟分枝杆菌亚种副结核 （MAP） 是反刍动物中 Johne 病的病原体，与人类 CNS 9 的炎症性疾病有关，因为其抗原成分能够在多发性硬化症和视神经脊髓炎谱系疾病患者中引起强烈的体液和细胞介导反应9。因此，在该协议中，我们展示了一种替代且可重复的方法，通过用副结核分枝杆菌代替CFA中的结核分枝杆菌来诱导MOG-EAE。
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Protocol
所有小鼠实验均由顺天堂大学医学院机构动物护理和使用委员会批准（批准号290238），并按照美国国立卫生研究院动物实验指南进行。
1. 对实验的一般评论
- 在23°C±2°C，50%±10%湿度的受控无病原体条件下，以及12小时光/暗循环， 随意获取食物 和水，将小鼠饲养在动物设施中的单个笼子中。
- 向小鼠注射不含抗原和CFA的磷酸盐缓冲盐水（PBS），并分别将它们用作阴性和阳性对照。
2. 分枝杆菌抗原的制备
- 在富含10%OADC（油酸，白蛋白，葡萄糖，过氧化氢酶），0.005%吐温80和2mg / L霉菌素J的Middlebrook液体培养基7H9中培养副 结核分枝杆菌 K-10菌株在37°C的T25组织培养瓶中2周。 通过目视检查定期评估菌落生长。
注意：在生物安全2级（BSL-2）设施中处理 副结核分枝杆菌 。 - 在振荡培养箱中以 200 mL（与步骤 2.1 相同的培养基）的最终体积在 200 mL（与步骤 2.1 相同的培养基）中以 1.7 × 105 个菌 落形成单位 （CFU）/mL 的悬浮液培养富集培养物 500 mL 锥形瓶培养 1 周。
注意：由于污染生物可能会影响结果，因此必须将细菌接种到Middlebrook 7H10固体培养基上，以确定菌落形态并通过常规聚合酶链反应（PCR）检测试剂盒验证副 结核分枝杆菌的纯度。 - 在70°C下灭活细菌悬浮液5-10分钟，并以3，000× g 离心10分钟。将称重的颗粒在PBS中洗涤两次，通过超声处理破碎，并储存在-20°C。
- 将颗粒转移到无菌容器中，并用干冰或液氮冷冻。立即转移到冷冻干燥室。
- 冷冻干燥（在真空下-50°C下4小时）副 结核分枝杆菌 根据机器手册。
- 在冻干结束时，从冷冻干燥机中取出不锈钢容器并将其转移到生物清洁工作台上。使用不锈钢刮刀将粘附在不锈钢容器内壁上的干燥MAP块状物移开，并尽可能细地粉碎它们。
- 使用电子天平称量粉碎的细胞，并手动将其放入浓度为10 mg / mL的无菌10 mL小瓶中。
注意：细胞密度定量为每升样品的干重克数。3周后，1mg（湿重）细菌细胞沉淀含有约2.5×108CFU 。
3.MOG 35-55 乳液的制备
- 用研钵和研杵将一瓶干燥的 副结核分枝杆菌 （10 mg）的内容物研磨成细粉，并向不完整的弗氏佐剂中加入 10 mL，以获得 10 mg/mL 储备溶液。储存在-4°C。
- 免疫接种前，将储备溶液稀释至终浓度为4 mg/mL。
- 将肽MOG35-55 在ddH2O中稀释至终浓度为2mg / mL并储存在-20°C。
- 使用均质器，将MOG35-55 溶液（2mg / mL）与步骤3.2中的等体积佐剂（4mg / mL）在5 mL管中混合，直到形成浓稠的乳液。每混合10秒后，将溶液放在冰上20秒，然后旋转管以回收所有溶液。
- 将乳液转移到 1 mL 注射器中，除去所有空气，然后加入 27 G 针头。乳液现在已准备好注射。
注意。由于在制备过程中会发生MOG35-55 粘性乳液的一些损失，因此最好制备所需量的1.5倍。
4. 动物免疫
- 用吸入异氟醚麻醉动物，以尽量减少对动物的压力。
- 将乳液（200μL含有200μg/小鼠的MOG35-55）皮下注射到下背部。
- 在免疫接种后第 0 天和第 2 天腹膜内施用一定剂量的百日咳毒素（100 μL，含 200 ng/小鼠）。
注意：百日咳毒素对免疫系统具有多重抑制作用;避免摄入和接触眼睛和皮肤。
5. 临床评估
- 每天监测小鼠的体重和临床症状。使用以下评分系统：0 = 无临床症状;1 = 松弛的尾巴;2 = 矫正反射受损和后肢无力;3 = 后肢完全瘫痪;4 =后肢完全瘫痪，前肢部分瘫痪;5 = 奄奄一息。
注意：在初步观察到临床症状后，为动物提供了更多的水和食物。将啮齿动物食物软化并润湿，然后从食物漏斗放在笼子地板上。对于脱水动物，给予皮下补液，或通过口服强饲法给予啮齿动物食物浆。如果小鼠需要这种类型的帮助超过 3 天，将进行安乐死。 - 为了避免或尽量减少动物的疼痛和痛苦，请使用以下人类终点：体重减轻大于20%，临床评分≥4.0，得分3时没有扶正反射，以及当动物无法获得饲料或水时24小时。
注意：小鼠在EAE诱导后第30天通过腹膜内注射戊巴比妥（≥150mg / kg）实施安乐死。
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Representative Results
C57BL / 6小鼠组（总n = 15 /组）在含有副结核分枝杆菌的乳剂中或通过CFA的常用方法用MOG35-55免疫。所有组小鼠都表现出急性单相疾病，其特征在于在14-17天观察到的单个残疾高峰，随后在接下来的10天内症状部分恢复（图1A）。用含有副结核分枝杆菌的佐剂免疫的小鼠，无论性别如何，在免疫后8至9天显示出更早的起病，并且在急性期比接种CFA的小鼠更严重（图1B）。两组之间的体重没有显着差异（图1C）。对EAE小鼠的脾细胞进行细胞荧光分析，并通过3H-胸苷掺入评估T淋巴细胞的增殖活性，如先前发表的11所示。无论使用何种佐剂，EAE小鼠的所有脾细胞都对肽MOG35-55表现出强烈的增殖反应，而它们对对照肽卵清蛋白没有增殖反应（图1D）。副结核分枝杆菌免疫EAE小鼠在EAE急性期与CFA免疫小鼠相比，脾脏中T淋巴细胞（CD4 + CD27 +），树突状细胞（CD11c + I-A / I-E +）和单核细胞（CD11b + CD115 +）的比例增加（图1E）。苏木精-伊红的组织学分析显示脑和脊髓中典型的血管周围和脑膜单核炎浸润（图1F）。
图1：具有代表性的EAE结果。 （A）每天评估的小鼠临床评分;（二）病程差异;（三）体重;（D）T细胞对MOG35-55 肽的增殖反应;（E）急性期脾细胞中的免疫细胞群;（F）急性期用苏木精-伊红（比例尺= 200μm）染色的脊髓切片（4倍放大）的组织学图像。箭头表示炎症浸润。数据显示三个独立实验（n = 5只小鼠/组/实验）的综合结果。数据表示为使用单因素方差分析计算的平均值±标准差，然后是邦弗朗尼事后检验或曼-惠特尼 U 检验。缩写：EAE =实验性自身免疫性脑脊髓炎;MOG = 髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白;PBS = 磷酸盐缓冲盐水;CFA = 完全弗氏佐剂。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
我们展示了一种强大的替代方案，使用在含有副结核分枝杆菌10的佐剂中乳化的肽MOG35-55在C57BL / 6J小鼠中积极诱导严重的EAE。通过这种方法诱导EAE导致比CFA共同方案诱导的疾病更严重。这种差异可能是由于分枝杆菌11细胞壁中的脂质成分不同。事实上，与其他分枝杆菌不同，副结核分枝杆菌在细胞壁表面产生脂质肽抗原，而不是糖质脂质11。这种脂质戊肽不与其他密切相关的物种发生交叉反应，并且已被证明是自身免疫性疾病患者中强烈特异性体液反应的靶标12。分枝杆菌具有病原体相关的分子模式，在免疫反应中发挥不同的作用9。例如，我们最近表明，副结核分枝杆菌口服免疫会增加MOG-EAE13的严重程度，而接种卡介苗（BCG）-Tokyo-172似乎在活跃和自发EAE模型的进展中具有保护作用14。
该方案的潜在局限性包括EAE的自限性单相病程，如果佐剂和百日咳毒素中的分枝杆菌浓度加倍，则可能变成慢性病程。这方面非常重要，特别是在使用敲除小鼠研究EAE的神经退行性方面时，因为恢复阶段的缺失可能是由所用试剂的高剂量引起的，而不是由于某些基因的功能缺乏。此外，尽管上述方案可以通过改变小鼠的菌株和年龄或蛋白质的类型和数量应用于其他EAE方案，但为了确保EAE实验以方法学上正确的方式进行，实验组必须匹配年龄和性别。
由于疾病的发病率可能有所不同，因此故障排除建议是：最佳副 结核分枝杆菌 浓度范围为 2 至 4 mg/mL，并且可以使用三通连接器在水相中混合少量抗原。我们已经描述了一种使用均质机制备乳液的方法;然而，在水相，油相中混合少量抗原的替代和简单方法涉及使用三通连接器配件，其中两个玻璃注射器连接到该接头。总之，我们确定 副结核分枝杆菌 是诱导活动性EAE的有效佐剂候选者。对不同动物物种诱导的作用方式和免疫类型的进一步研究将增加采用这种替代方法来了解神经炎症机制的可能性的信心。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要披露。
Acknowledgments
这项工作得到了日本科学促进会的资助（资助号。JP 23K14675）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-mouse CD115 antibody | Biolegend, USA | 135505 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD11b antibody | Biolegend, USA | 101215 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD11c antibody | Biolegend, USA | 117313 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD16/32 antibody | Biolegend, USA | 101302 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD4 antibody | Biolegend, USA | 116004 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD8a antibody | Biolegend, USA | 100753 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse I-A/I-E antibody | Biolegend, USA | 107635 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse Ly-6C antibody | Biolegend, USA | 128023 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| BBL Middlebrook OADC Enrichment | Thermo Fisher Scientific, USA | BD 211886 | for isolation and cultivation of mycobacteria |
| C57BL/6J mice | Charles River Laboratory, Japan | 3 weeks old, male and female | |
| FBS 10279-106 | Gibco Life Techologies, USA | 42F9155K | for cell culture, warm at 37 °C before use |
| Freeze Dryer machine | Eyela, Tokyo, Japan | FDU-1200 | for bacteria lyophilization |
| incomplete e Freund’s adjuvant | Difco Laboratories, MD, USA | 263810 | for use in adjuvant |
| Middlebrook 7H9 Broth | Difco Laboratories, MD, USA | 90003-876 | help in the growth of Mycobacteria |
| Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10 | ATCC, USA | BAA-968 | bacteria from bovine origin |
| Mycobacterium tuberculosis H37 Ra, Desiccated | BD Biosciences, USA | 743-26880-EA | for use in adjuvant |
| Mycobactin J | Allied Laboratory, MO, USA | growth promoter | |
| Myelin Oligodendrocyte Glycolipid (MOG) 35-55 | AnaSpec, USA | AS-60130-10 | encephalotigenic peptide |
| Ovalbumin (257-264) | Sigma-Aldrich, USA | S7951-1MG | negative control antigen for proliferative assay |
| pertussis toxin solution | Fujifilm Wako, Osaka Japan | 168-22471 | From gram-negative bacteria Bordetella pertussi, increases blood-brain barrier permeability |
| Polytron homogenizer PT 3100 | Kinematica | for mixing the antigen with the adjuvant | |
| RPMI 1640 with L-glutamine | Gibco Life Techologies, USA | 11875093 | For cell culture |
| Thymidine, [Methyl-3H], in 2% ethanol, 1 mCi | PerkinElmer, Waltham, MA, USA | NET027W001MC | for proliferation assay, use (1 μCi/well) |
| Zombie NIR Fixable Viability Kit | Biolegend, USA | 423105 | cytofluorimetry, for cell viability |
References
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